TWI680986B - 細胞毒性藥物之共軛物、包含其之醫藥組成物及其用途 - Google Patents
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Abstract
一種細胞毒性藥物之共軛物,包括重組蛋白複合物及共軛連接於該重組蛋白複合物之細胞毒性藥物,該重組蛋白複合物由一結合區和一膠原蛋白支架區所構成,該膠原蛋白支架區包括至少一個GEKGDP胺基酸序列。
Description
本發明關於一種細胞毒性藥物之共軛物,特別是關於在具有膠原蛋白支架區的融合多胜肽所構成的重組蛋白複合物上,共軛連結細胞毒性藥物,可應用於癌症、自體免疫、代謝疾病、或心血管疾病之治療及老年化之減緩。
抗體-藥物複合體(Antibody-drug conjugates;ADCs)被視為新世代標靶治療癌症新趨勢。ADC是將小分子藥物利用化學反應將其以共價鍵的方式結合在抗體分子上。ADC不但具有癌細胞表面標靶專一性,被結合之癌細胞會藉由細胞內噬化作用將小分子藥物攜入至癌細胞的核內體(endosome)內。之後抗體-藥物複合體進行分解,再將藥物自核內體中釋出,並殺死癌細胞。
早期的ADC發展有許多失敗經驗,原因例如,(1)抗體連結藥物的連接物(linker)的鍵結太穩定,進而導致藥物無法在核內體(endosome)內有效釋放,降低療效;或者,抗體連結藥物的連接物(linker)的鍵結太不穩定,導致藥物在循環系統中脫落而產生毒性。(2)由於抗體分子所攜帶小分子藥物進入癌細胞內的數量過低,沒有產生足夠的細胞毒性的效力。(3)細胞內噬化不佳,
並非所有的抗體與標的細胞之標靶分子結合後皆能有效誘導內噬化(internalization),造成所攜帶的藥物無法被帶入癌細胞內;或是抗體-藥物複合體進入核內體(endosome)後無法有效與溶酶體(lysosome)融合,進而將抗體-藥物複合體被溶酶體又釋放出,而無法造成細胞毒性的效力。(4)癌細胞標靶分子數量不足,低密度的標靶分子無法與抗體有效產生有效交互(crosslinking)效應,誘導內噬化不佳。(5)嵌合小鼠(部分基因是人類)的單株抗體,導致免疫反應。
因此,開發抗體-藥物複合體(ADC)仍然有許多進步空間。
本發明提供一種細胞毒性藥物之共軛物,包括重組蛋白複合物及共軛連接於該重組蛋白複合物之細胞毒性藥物,其中,該重組蛋白複合物係由:(1)一結合區,其係專一性結合至一配體(ligand);及(2)一膠原蛋白支架區,其係由(GPP)或(GPO)重複序列及至少一個GXKGE(D)模體(motif)所構成的多胜肽胺基酸序列,該膠原蛋白支架區包括至少一個GEKGDP胺基酸序列(X表示任意胺基酸,G表示甘胺酸(glycine),P表示脯胺酸(proline),K表示離胺酸(lysine),E表示麩胺酸(glutamic acid),D表示天冬胺酸(aspartic acid),O表示羥基脯胺酸(hydroxyproline))。
本發明更提供一種細胞毒性藥物之共軛物,包括重組蛋白複合物及共軛連接於該重組蛋白複合物之細胞毒性藥物,其中,該重組蛋白複合物係由三條相同的多胜肽所組成之三聚體複合蛋白質,其中每一條多胜肽包含:(1)一結合區,其係專一性結合至一配體;及(2)一膠原蛋白支架區,其係由(GPP)或(GPO)
重複序列及至少一個GXKGE(D)模體所構成的多胜肽胺基酸序列,X表示任意胺基酸,該膠原蛋白支架區包括至少一個GEKGDP胺基酸序列。
本發明更提供一種醫藥組成物,包含如上述之細胞毒性藥物之共軛物作為活性成分。
本發明更提供一種上述細胞毒性藥物之共軛物之用途,其係用於在製備治療癌症、自體免疫、代謝疾病或心血管疾病之治療之藥物。
本發明更提供一種上述細胞毒性藥物之共軛物之用途,其係用於在製備減緩老年化之藥物。
第1圖顯示763scFvCS5與763scFvCS5-MMAE在非還原狀態及還原狀態的電泳結果,還原狀態樣本是以50mM的DTT在90℃處理10分鐘。
第2圖顯示EG2dAb-m1及EG2dAb-m2在非還原條件下的電泳結果。
第3A~3E圖顯示763scFvCS5、763scFvCS5m1、763scFvCS5m2、EG2dAb-m1與EG2dAb-m2的分子結構示意圖,所列胺基酸序列為蛋白支架區間的氨基酸序列,其中字母「K」表示離胺酸(lysine;K)的位點。
第4圖顯示763scFvCS5和763scFvCS5-MMAE在波長220nm~320nm的UV光譜掃描疊合圖,以波長280nm做為基準點相互
疊合。
第5圖顯示763scFv-CS5鍵結不同藥物後在非還原狀態及還原狀態的電泳結果。還原狀態的樣本是以50mM的DTT在90℃處理10分鐘。
第6圖顯示EG2dAb-m2與化學分子Hydrazide Alexa 594接合後的螢光(A)及Instant Blue染色(B)圖。
第7圖顯示763scFvCS5與763scFvCS5-MMAE的內噬化作用測試結果。
第8圖顯示以ELISA評估763scFv-CS5血清中的穩定度,其係將塗有EGFRvIII-hFc的96孔滴定盤,與不同時間點取樣的763scFv-CS5培養,以CS5的抗體及辣根過氧化酶標記的山羊抗人類IgG Lκ片段偵測,測定在450nm的吸光度。
第9A~9E圖顯示不同濃度之測試物包括763scFvCS5、763scFvCS5-MMAE、763scFvCS5-MMAF、763scFvCS5-Doxorubcin、MMAE、MMAF、和Doxorubcin與腫瘤細胞F98及HCT116於37℃下培養48小時後,以PrestoBlueTM分析法分析細胞的存活率。第9A~9E圖中,黑色實心圓線表示763scFvCS5鍵結不同藥物,白色空心圓線表示小分子藥物MMAE、MMAF或Doxorubcin,黑色實心三角形線表示763scFvCS5。
第10A~10F圖顯示腫瘤細胞HCT116和MDA-MB-231與不同濃度之測試物包括763scFvCS5、763scFvCS5-Apicidin、763scFvCS5-Cytochalasin D、763scFvCS5-D-64131於37℃下培養
48小時後,以PrestoBlueTM分析法分析細胞的存活率。圖中,黑色實心圓線表示763scFvCS5鍵結不同藥物,白色空心三角形線表示小分子藥物Apicidin、Cytochalasin D或D-64131,灰色實心圓線表示763scFvCS5。
第11圖顯示763scFvCS5-MMAE在小鼠體內異體移植腫瘤細胞HCT116之療效測試結果。
第12圖顯示763scFvCS5-MMAE在小鼠體內異體移植腫瘤細胞A431之療效測試結果。
本發明提供一種新穎的細胞毒性藥物之共軛物,包括重組蛋白複合物及共軛連接於該重組蛋白複合物之細胞毒性藥物,其中,該重組蛋白複合物係由:(1)一結合區,其係專一性結合至一配體(ligand);及(2)一膠原蛋白支架區,其係由(GPP)或(GPO)重複序列及至少一個GXKGE(D)模體(motif)所構成的多胜肽胺基酸序列,該膠原蛋白支架區包括至少一個GEKGDP胺基酸序列(X表示任意胺基酸,G表示甘胺酸(glycine),P表示脯胺酸(proline),O表示羥基脯胺酸(hydroxyproline),K表示離胺酸(lysine),E表示麩胺酸(glutamic acid),D表示天冬胺酸(aspartic acid))。
根據本發明,在膠原蛋白支架區的GEKGDP胺基酸序列中的離胺酸(K)在哺乳動物細胞株合成時,可藉由轉譯後修飾(post-translational modification),經過羥基化(hydroxylation)及醣基化(glycosylation),形成醣基化羥基離胺酸(glycosylated
hydroxylysine)。經過羥基化和醣基化的離胺酸藉由醣基上的醛基(aldehyde)與細胞毒性藥物的胺基(amino group)形成肼(hydrazide)而共軛連接(conjugation)。在一實施例中,該醣基為葡萄糖基。在另一實施例中,該醣基為半乳糖基。在另一實施例中,該醣基為葡萄糖基和半乳糖基。但是,本發明不限於此。
在本發明一實施例中,細胞毒性藥物之共軛化學反應是利用過碘酸鈉(NaIO4)將上述葡萄糖基、半乳糖基、或其組合結構開環而得到醛基化,再藉由細胞毒性藥物分子結構中的第一級胺或第二級胺進行Schiff-base反應而形成肼(hydrazide),使細胞毒性藥物共軛鍵結於膠原蛋白支架區。反應後加入硼氰化鈉(NaCNBH4)以還原Schiff-base的鍵結,使其穩定。
本發明之細胞毒性藥物之共軛物,與習知的抗體-藥物複合體(ADCs)的不同點主要在於,本發明所包含的細胞毒性藥物不鍵結於例如抗體等的與標靶細胞結合的區域上,而是鍵結於膠原蛋白胜肽所構成的支架區上的特定胺基酸區段,使細胞毒性藥物共軛連接於膠原蛋白支架區。由於細胞毒性藥物共軛鍵結於膠原蛋白支架區,可完全避開與標靶細胞的標靶結合區域,進而減少因鍵結藥物而導致與標靶結合區域的結合能力降低的問題。
本發明所述之重組蛋白複合物包括專一性結合至一配體的結合區、以及由(GPP)或(GPO)重複序列及至少一個GXKGE(D)模體所構成的多胜肽胺基酸序列之膠原蛋白支架區。
本發明所述之結合區可包括一細胞激素區、一細胞激素受器區或一抗體區等,具有專一性結合至一配體之能力。本發明所述之細胞激素區及細胞激素受器區表示可專一性連接至特
定細胞激素及細胞激素區受器之區域,所述之細胞激素及細胞激素區受器例如串命名法3(Cluster Designation 3,CD3)、上皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)、HER2/neu、或腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)等,但不限於此。所述之配體可包括例如串命名法3(CD3)、上皮生長因子受體(EGFR)、HER2/neu、或腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等,但不限於此。
本發明所述之抗體區包括一個或多個免疫球蛋白(immunoglobulin)的互補決定區(complementary-determining region;CDR)、Fab片段、單鏈抗體(scFv)、單域抗體(sdAb)、或其片段。在一實施例中,抗體區為單域抗體(sdAb)之序列。在另一實施例中,抗體區為單鏈抗體(scFv)之序列。
本發明所述之重組蛋白複合物也可包括一酵素區或一螢光蛋白質。螢光蛋白質例如綠螢光蛋白質(green fluorescent protein,GFP)、珊瑚紅螢光蛋白(dsRed)、或其變異等,酵素區例如麩胺基硫轉移酶(glutathione S-transferase)、螢光酵素(luciferase)、β-半乳糖苷酶、或β-內醯胺酶(β-lactamase)等,但本發明不限於此。
為了偵測或純化本發明之重組蛋白複合物,重組蛋白複合物可包括或排除親合標記(affinity tag)。親合標記的例子包括多組胺酸-標記(polyhistidine-tag)、myc-標記、Strep-標記、FLAG、E-標記、血球凝集素標記(hemagglutinin tag)、T7、S-標記、HSV、VSV-G、抗-Xpress(anti-Xpress)與VS-標記。
本發明所述之膠原蛋白支架區為膠原蛋白或一類膠原蛋白區,允許其本身形成三重螺旋結構。本發明人等根據實驗
發現,當一抗體區讀框(in-frame)融合至一膠原蛋白支架區,支架區之三聚體化可催生一三聚體抗體。此抗體之結合親合力,與二價抗體IgG及單價的單鏈抗體(scFv)相比,要來得優異。所述“三重螺旋結構”為三個次單位之共價或非共價結合之複合物。此述“膠原蛋白支架區”指膠原蛋白或一類膠原蛋白區其驅動支架區之自身三聚體化。
因此,本發明更提供一種細胞毒性藥物之共軛物,包括重組蛋白複合物及共軛連接於該重組蛋白複合物之細胞毒性藥物,其中,該重組蛋白複合物係由三條相同的多胜肽所組成之三聚體複合蛋白質,其中每一條多胜肽包含:(1)一結合區,其係專一性結合至一配體;及(2)一膠原蛋白支架區,其係由(GPP)或(GPO)重複序列及至少一個GXKGE(D)模體所構成的多胜肽胺基酸序列,X表示任意胺基酸,該膠原蛋白支架區包括至少一個GEKGDP胺基酸序列。
本發明之三聚體複合蛋白質以讀框融合之方式結合至結合蛋白(binding protein),而且其中的膠原蛋白支架區具有驅動融合多胜肽形成三聚體化之能力。上述重組蛋白複合物經三聚體化後,仍保有結合至其配體之能力,而且與二價抗體IgG及單價的單鏈抗體(scFv)相比,此重組蛋白複合物的結合親合力更為優異。
再者,如前所述,在膠原蛋白支架區的GEKGDP胺基酸序列中的離胺酸(K)在哺乳動物細胞株合成時,可藉由轉譯後修飾(post-translational modification),經過羥基化(hydroxylation)及醣基化(glycosylation),形成醣基化羥基離胺酸(glycosylated
hydroxylysine)。經過羥基化和醣基化的離胺酸(K)藉由醣基上的醛基(aldehyde)與細胞毒性藥物的胺基(amino group)形成肼(hydrazide)而共軛連接(conjugation)。由於細胞毒性藥物共軛鍵結於膠原蛋白支架區,可完全避開與標靶細胞的標靶結合區域,進而減少因鍵結藥物而導致與標靶結合區域的結合能力降低的問題。
本發明所述之細胞毒性藥物之共軛物,由於具有由三條相同的多胜肽所組成之三聚體複合蛋白質,可自體形成熱穩定三重螺旋結構,而且每一條多胜肽皆具有一結合區,因此可促進標靶結合強度,並且對低密度的標靶分子能產生有效的交聯(crosslinking)效應,解決誘導內噬化(internalization)不佳的問題。
在本發明一實施例中,該三聚體複合蛋白質可以具有平衡結合常數(equilibrium association constant)KA至少為107M-1之親合力專一性結合至配體。在另一實施例中,該三聚體複合蛋白質對其配體之親合力大於108M-1。在另一實施例中,該三聚體複合蛋白質對其配體之親合力大於109M-1。在某些實施例中,該三聚體複合蛋白質對其配體之親合力介於107M-1至1010M-1之間、107M-1至109M-1之間、107M-1至108M-1之間、108M-1至1010M-1之間、108M-1至109M-1之間,以及109M-1至1010M-1之間。
在本發明一實施例中,藉由在一具有充足脯胺酸-4-羥化酶(prolyl-4-hydroxylase,P4H)活性之系統中表現一融合構築物(fusion construct),以一熱穩定短類膠原蛋白胜肽,例如(Gly-Pro-Pro)作為一支架區,以驅使抗體之三聚體化。
此方法促使穩定之三重螺旋結構之採用,其在動物
體內(in vivo)影響蛋白質價數(valency)、穩定度與功能。
本發明包含使用一膠原蛋白序列,例如迷你膠原蛋白XII或XXI型,或一類膠原蛋白序列,例如(Gly-Pro-Pro)10或(GPP)5GKPGKP(GPP)6做為一膠原蛋白支架區,具有不論從C端或N端方向將異源融合蛋白自身集結(self-nucleation)與自身延展(self-propagation)之能力。本發明不需任何其他三聚體化結構區。
藉由在一包含脯胺酸-4-羥化酶之系統中表現融合構築,膠原蛋白支架區融合蛋白形成一熱穩定三重螺旋結構。本發明之三聚體複合蛋白質允許在任一末端或是同時兩個末端附加融合伙伴(fusion partners),因此可使用自身三聚體化的膠原蛋白支架來構築可同時與兩個龐大之結合搭檔互相作用(各末端具有上至3或6之結合數價)之分子。此三聚體複合蛋白質也已被證實可正確折疊且顯示出高溶解度、親合力與穩定度(例如US 20080176247 A1、EP2065402 A1等)。
本發明所述之膠原蛋白支架區,每個支架區包括一個或多個三重螺旋重複序列,各重複序列包括一(G-X-Y)n序列,其中G為一甘胺酸,X與Y可為任何胺基酸,較佳為脯胺酸(P)或羥基脯胺酸(O),又n大於等於5。此處所使用之“重複”指兩個或多個連續之G-X-Y序列。
膠原蛋白支架區並非一定得由連續的完美G-X-Y重複序列所構成。試舉許多天然膠原蛋白或包含類膠原蛋白之蛋白質為例,常見兩個G-X-Y重複序列之間,摻插少了第一個G或第三個Y之序列片段(亦即G-X-Y-X-Y-G-X-Y或G-X-Y-G-X-G-X-Y)。本發明中由人類第XXI型迷你膠原蛋白所構成之膠原蛋白支架
區,即包含兩個不完美的序列片段GF與KE。
在某些實施例中,膠原蛋白支架區為一膠原蛋白支架包括至少8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個或20個G-X-Y重複序列,其中G為一甘胺酸,X與Y可為任何胺基酸。在某些實施例中,至少5個、6個、7個、8個、9個或10個G-X-Y重複序列為G-P-P或G-P-O。在某些實施例中,至少5個、6個、7個、8個、9個或10個G-X-Y重複序列為G-P-O,其中P為脯胺酸,O為羥基脯胺酸。膠原蛋白支架區可驅動自身三聚體化之形成。
在一實施例中,膠原蛋白支架區包括(G-P-P/O)10之序列。在一實施例中,膠原蛋白支架區包括10個G-X-Y重複序列。在某些實施例中,膠原蛋白支架區包括小於10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、25、27、30、35、40、45或50個G-X-Y重複序列。在某些實施例中,膠原蛋白支架之長度短於150、125、100、90、80、70、60、50或40個胺基酸。在一實施例中,膠原蛋白支架含有可驅動自身形成三聚體化之10-30個G-X-Y重複序列。
在一實施例中,大於1/3的G-X-Y重複序列為G-P-P或G-P-O。在一實施例中,大於1/2的G-X-Y重複序列為G-P-P或G-P-O。在一實施例中,大於2/3的G-X-Y重複序列為G-P-P或G-P-O。在一實施例中,大於3/4的G-X-Y重複序列為G-P-P或G-P-O。在一實施例中,所有的G-X-Y重複序列為G-P-P或G-P-O。在一實施例中,支架區包括(G-P-P/O)5GKPGKP(G-P-P/O)6之序列。在一實施例中,支架區包括(G-P-P/O)10,其中P/O指在Y位置
之胺基酸為P或O。
在一較佳實施例中,膠原蛋白支架包括至少10個G-X-Y重複序列,其中至少5、6、7、8、9或10個Y為羥基脯胺酸。此膠原蛋白支架可驅動驅動自身三聚體化之形成。
在一較佳實施例中,膠原蛋白支架包括至少5、6、7、8、9或10個G-P-O重複序列與一抗體區,其中該膠原蛋白支架之三條多胜肽可交互作用而形成三聚體可溶抗體,此三聚體可溶抗體以至少107M-1之親合力,專一性結合至一配體。在一較佳實施例中,膠原蛋白支架含有6或7個G-P-O重複序列,且此些G-P-O重複序列彼此之間可為緊鄰或不緊鄰。例如,G-P-P重複序列可被分開成兩個讀框胺基酸序列,其包括藉由1、2、3、4或5個G-X-Y重複序列來分離之3、4或5個G-P-O重複序列。在一實施例中,膠原蛋白支架包括(G-P-O)3GXY(G-P-O)4。
在一實施例中,膠原蛋白支架為一非纖維狀具中斷之三重螺旋之纖維伴隨性膠原蛋白(fibril-associated collagen with interrupted triple-helices,以下稱FACIT)的膠原蛋白(COL1)區。在較佳的情況下,三聚體抗體含有FACIT之COL1區,但不含非膠原蛋白(noncollagenous,NC1)區。在一較佳實施例中,COL1可由第IX、XII、XIV、XVI、XIX、XX、XXI或XXII型膠原蛋白而來。在一較佳實施例中,由一結合區和一膠原蛋白支架區所構成的一條多胜肽之重組蛋白複合物包括序列辨識號:15或16。在另一較佳實施例中,由三條相同的多胜肽所組成之三聚體複合蛋白質包括序列辨識號:6、7、或9。
在一實施例中,膠原蛋白支架至少與從第IX、XII、
XIV、XVI、XIX、XX、XXI或XXII型膠原蛋白而來之COL1區具有75%、80%、85%、90%或95%之相同度。在一實施例中,膠原蛋白支架至少與從第IX、XII、XIV、XVI、XIX、XX、XXI或XXII型膠原蛋白而來之COL1區的G-X-Y重複序列具有75%、80%、85%、90%或95%之相同度。
在一較佳實施例中,膠原蛋白支架區至少與從第IX、XII、XIV、XVI、XIX、XX、XXI或XXII型膠原蛋白而來之COL1區的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或30個G-X-Y重複序列具有75%、80%、85%、90%或95%之相同度。在一特別較佳實施例中,膠原蛋白支架至少與從第XXII型膠原蛋白而來之COL1區的10個G-X-Y重複序列具有75%、80%、85%、90%或95%之相同度。
在一較佳實施例中,膠原蛋白支架區之G-X-Y重複序列,包括至少5、6、7、8、9或10個G-X-Y重複序列之Y位置是被羥基脯胺酸化。
上述之序列相同度,可藉由得自威斯康辛州大學基因體電腦小組(University of Wisconsin Genetics Computer Group,UWGCG)之GAP電腦程式(版本6.0,Devereux等人發表於Nucl.Acids Res.12:387,1984)來判定。GAP電腦程式利用經由Smith與Waterman(Adv.Appl.Math 2:482,1981)所修訂之Needleman與Wunsch的比對方法(J.Mol.Biol.48:443,1970)。GAP程式之預定參數包括:(1)一對於核苷酸之比較陣列(包括對於相同的1之值與對於不同的0之值)與經Schwartz與Dayhoff,eds(Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,
pp.353-358,1979)所敘述之Gribskov與Burgess的加權比較陣列(weighted comparison matrix)(Nucl.Acids Res.14:6745,1986);(2)每個差距扣分3.0且在各差距中之各符號額外扣分0.10;與(3)末端差距無扣分。
在一實施例中,上述三條相同的多胜肽為實質相同,彼此具有至少75%(即任何介於75%與100%之間的數字,包括75%與100%)的序列相同度。由三個相同的融合多胜肽形成之複合物為一同源三聚體(homotrimer)。三個融合多胜肽可為功能性等同。“功能性等同”指一共同多胜肽的一多胜肽衍生物,即一蛋白質具有一或多個點突變、插入、刪除、截斷、一融合蛋白質或上述之組合,且其實質上維持形成三重螺旋之能力與異源區之親合力,例如與一配體結合。
一異源多胜肽、核酸或基因為一多肚肽、核酸或基因其與其他多胜肽、核酸或基因連結,且其並非自然連結。兩個融合區或序列若其在天然發生之蛋白質或核酸中並非為鄰接,則彼此為異源。
為了製造本發明之融合多胜肽,在准許一多胜肽表現的情況下培養一宿主細胞於培養基中,其中上述多胜肽是藉由本發明核酸所編碼,以及從被培養的細胞或該細胞的培養基中純化上述多胜肽。或者,於in vitro可轉錄與轉譯本發明之核酸,例如使用T7啟動子調控序列與T7聚合酶。
為了製造本發明之重組蛋白複合物,可於准許多胜肽表現與一三重螺旋線圈形成的情況下培養一宿主細胞,宿主細胞包括一第一、第二與第三核酸分別編碼出上述第一、第二與第
三融合多胜肽,其中上述多胜肽是藉由該三個核酸所編碼,以及從被培養的細胞或該細胞的培養基中純化上述蛋白質複合物。而較佳的是上述宿主細胞為一真核細胞(eukaryotic cell),其包括使一脯胺酸殘基羥基化(hydroxylate)的酵素活性。
為了於人類體內(in vivo)使用,本發明之三聚體抗體為人源(human origin)較佳。例如,其可包括一人源化單鏈抗體序列讀框融合至人源的膠原蛋白支架。由於許多具有膠原蛋白區之類膠原蛋白在血液中相當穩定,支架區融合蛋白也同樣應可在血液中保持結構完整。
序列Gly-Pro-Hyp對於形成與穩定三重螺旋結構貢獻良多,且Gly-Pro-Hyp三胜肽重複序列可自身配裝(self-assemble)成一高穩定度之三重螺旋結構。因此,本發明以一呈熱穩定之短鏈類膠原蛋白胜肽(Gly-Pro-Pro)10,取代迷你膠原蛋白第XXI型的膠原蛋白區,來作為此處敘述之膠原蛋白支架抗體的支架模版。上述之穩定三重螺旋結構,可透過具有充足脯胺酸-4-羥化酶(prolyl-4-hydroxylase,P4H)活性的哺乳動物系統所取得。的確,根據這樣的方式,erb_scFv-Col與OKT3_scFv-Col皆可被配裝成為三聚體之結構,且erb_scFv-Col可能藉由在兩個三聚體中之兩個C端半胱胺酸殘基之鏈內雙硫鍵交聯(interchain disulfide crosslinking)更進一步被聚合(oligomerized)成為六聚體。將erb_scFv-Col從三聚體變為六具體之過程為一細胞內步驟,由於在濃度超過一般發現之erb_scFv-Col六聚體形式時,減低之三聚體結構並不會配裝成較高階結構。
小鼠骨髓瘤(myeloma)NS0細胞對於重組之膠原蛋白
或類膠原蛋白蛋白質之製造為較好的表現系統。在重組erb_scFv-Col中,在膠原蛋白GXY三個為一組之(Gly-Pro-Pro)10序列之Y位置中之脯胺酸總數的近61%為被羥基化。因此在此系統中,至少6個Gly-Pro-Pro重複序列被羥基化。丙烷基羥基化之(Gly-Pro-Pro)10對於膠原蛋白支架抗體分子之三聚體化配裝的貢獻為顯著的,因為藉由西方墨點(Western blot)分析,幾乎沒有單體形式之膠原蛋白支架抗體出現於培養基中。在血清穩定度測定中,將各種erb抗體形式在37℃培養於人類血清中達7天後,進行酵素連結免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),相對於二價erb_scFv-Fv之次微莫耳濃度(sub-micromolar)與單價erb_scFv之微莫耳濃度(micromolar),erb_scFv-Col之抗體濃度為在十億分之一莫耳濃度(nanomolar)nM範圍。因此,一膠原蛋白支架抗體在生理環境下可保持其多價標的結合形式。
膠原蛋白支架抗體的熱穩定三聚體結構符合於未來動物體內(in vivo)使用之多目的多聚體化系統(multi-purpose multimerizing system)。許多具有膠原蛋白區之類膠原蛋白蛋白質表現於人類血清中且扮演一先天免疫系統在保護免於感染性生物體中。這些包括補體蛋白C1q、凝集素家族、膠凝素家族蛋白質-甘露醣結合凝集素(mannose binding lectin,MBL)、纖維膠凝蛋白(ficolin)、界面活性蛋白質(surfactant protein)A與D(SP-A與SP-D)。而這些“防禦膠原蛋白”共同的結構特徵為多蛋白質單位,具有在C端之目標結合區。形成這些多三聚體化結構之驅動力與形成纖維狀膠原蛋白之驅動力相似。首先以三多胜肽鏈之捲曲螺旋頸區將此三多胜肽鏈三聚體化,捲曲螺旋頸區為緊鄰著標的結
合區之N端,在最後以此三多胜肽鏈之N端半胱胺酸殘基堆疊或鏈內雙硫鍵交聯三聚體分子前,從C到N端以一類似拉鍊之方式(zipper-like fashion)將捲曲螺旋頸區進行三重螺旋折疊(Hakansson et al.,(1999)Structure 7:255-264;Hakansson and Reid,(2000)Protein Sci 9:1607-1617;Sheriff et al.,(1994)Nat Struct Biol 1:789-794;Weis and Drickamer,(1994)Structure 2:1227-1240)。因此多聚體化顯著增加這些防禦膠原蛋白之結合區的功能性親合力。
藉由表面電漿子共振(surface plasmon resonance,SPR)與競爭流式細胞(competition flow cytometry)來分析比較各種erb與OKT3抗體時,標的結合親合力之改變顯得顯著。結合親合力的數據證明,當膠原蛋白支架抗體分子的價數增加,會增進抗體與標的之間的標靶(targeting)強度與專一性。在混合淋巴細胞反應中,三價OKT3膠原蛋白支架抗體之免疫抑制T細胞活化的有效劑量小於OKT3 IgG。
在人類週邊血液單核細胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中OKT3_scFv-Col不會誘導T-細胞增殖或IL-2製造,大量減少OKT3第一劑量症狀之影響是由於短暫之T細胞活化產生之細胞激素(cytokine)釋放。此新的抗-CD3形式可提供一強而有力免疫抑制藥物,其具有減低之劑量、毒性與治療之花費。藉由具有或不具有結構設計之CDR嫁接以從鼠科至人源轉移CDR之鼠科mAb抗體的人源化通常導致結合親合力之降低或損失(Queen et al.,(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-10033;Riechmann et al.;(1988)Nature 332:323-327)。在一較佳實施例
中,三聚體複合蛋白質不包括一Fc區。
藉由使用噬菌體展現scFv系統(Phage display scFv library)篩選高親合力結合物之鏈改組(chain-shuffling)的親合力熟成是一冗長的步驟;然而改善親合力的結果並不確定。因此,人源化後對於標的抗原之低親合力會妨礙許多治療的抗體。在一些例子中,應進一步推敲抗體之特徵。抗原結合搭檔之多聚體化明顯增加了在非常接近標的細胞時結合至特定相同之配體群組之可得性。可提議不同之方法以獲得多價分子以改善功能性親合力。包括設計替代結合蛋白質,其根據具有免疫球蛋白之支架(Holliger and Hudson,(2005)Nat Biorechnol 23:1126-1136)或根據完全不同之蛋白質拓撲學(topology)(Binz et al.,(2005)Nat Biotechnol 23:1257-1268)。例如,已報導了使用與蛋白質A Fc結合區之Fv片段(Ito and Kurosawa,(1993)J Biol Chem 268:20668-20675)、用以形成四聚合體複合物之核心鏈黴抗生物素蛋白(core-streptavidin)(Dubel et al.,(1995)J Immunol Methods 178:201-209)或轉錄因子p53之人類四聚體化區(Rheinnecker et al.,(1996)J Immunol 157:2989-2997)。最近已採用非IgG蛋白質支架片段,例如“抗運載蛋白(anticalin)”(Skerra,(2000)Biochim Biophys Acta 1482:337-350)、“錨蛋白重複序列(ankyrin repeat)”(Binz et al.,(2904)Nat Biotechnoil 22:575-582)、“親合體(affibody)分子”(Nord et al.,(1997)Nat Biotechnol 15:772-777)與四結合素(tetranectin)之C型類凝集素區(Christian et al.International Publication No.WO98/56906;Graversen et al.,(2000)J Biol Chem 275:37390-37396)來增加標的結合之親合力、熱穩定
性與敏感度。然而這些分子之一些為異抗原片段或非血漿之自然成分且與免疫反應之風險相關,其嚴重限制了潛在治療性應用。
用以形成一熱穩定多價蛋白質結合物之三重體形式(triplex-forming)類膠原蛋白胜肽融合支架,被用於證明膠原蛋白支架抗體為一新的平台,可改善治療性抗體之功能性親合力與有絲分裂(mitogenicity)(例如US 20080176247 A1、EP2065402 A1等)。更重要的是,已證明scFv與膠原蛋白支架抗體中之類膠原蛋白支架區的融合使各區正確折疊,而不損害標的結合之活性或三重螺旋結構之三聚體配裝(例如US 20080176247 A1、EP2065402 A1等)。此三重體形式之類膠原蛋白區,可做為一現存的支架或新的蛋白質藥物,藉由在融合蛋白質接近的情況下,對以下物質進行三聚體化(甚或寡合化(oligomerizing),其中此寡合化係由膠原蛋白纖維間之堆疊、或三聚體分子間之鏈間雙硫交聯而來):活性蛋白質,活性蛋白質包括蛋白質荷爾蒙、細胞激素、淋巴激素(lymphokine)、生長因子、凝集素、酵素與可溶受體片段;或附著分子(adhesion molecule),例如選擇素(selectin)與整合素(integrin)。
可藉由重組技術獲得本發明之蛋白質複合物或多胜肽。可將編碼出複合物之多胜肽的核酸引入適合之宿主細胞中,並且在允許表現藉由上述核酸所編碼出之多胜肽與在多胜肽間形成三重螺旋的情況下來表現上述多胜肽。為了促進三重螺旋支架的形成,可在宿主細胞中共表現脯胺酸-4-羥化酶,其為在生物合成膠原蛋白時一關鍵酵素。
異源性蛋白質區域可包括一“結合區”,其包括但不限
於抗體或一其片段(例如一其抗原結合片段)。在此處所使用“抗體”意指一免疫球蛋白分子或其免疫活性部分,即一抗原結合部分。其指一蛋白質包括最少一個,較佳為兩個重(heavy,H)鏈變異區域(VH),以及至少一個較佳為兩個輕(light,L)鏈變異區域(VL)。因此,在此處所使用之“抗體區”指一抗體或一抗體之抗原結合部分,且包括VH、VL或Fab區、單鏈抗體(single-chain antibody,scFv)之Fv片段與VHH區(參見WO 94/4678)。
可將VH與VL區域更進一步細分為超變異區,稱為“互補決定區(complementarity determining region)”“(CDR)”與散佈區域,其較保守,稱為架構區域(framework region)。已經確定義互補決定區與架構區域的範圍(參閱Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242,and Chothia et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。每個VH與VL一般由三個CDR與四個FR(framework region)組成,從胺基端到羧基端排列的順序為:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗體可更包括一重與輕鏈固定區域(constant region),由此分別形成一重與輕鏈免疫球蛋白鏈。重鏈固定區域包括三個區域,CH1、CH2與CH3。輕鏈固定區域包括一區域,CL。重與輕鏈的變異區域包括一結合區域其與抗原反應。抗體的固定區域通常協調抗體結合至宿主組織或因子,因子包括免疫系統的多種細胞(例如效應細胞(effector cell))與典型補體系統的第一補體C1q。
此處使用之“免疫球蛋白”指一蛋白質包括一個或多
個胜肽,其本質上是由免疫球蛋白基因所編碼。經認可的人類免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1與IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3與IgG4)、δ與μ固定區域基因與無數的免疫球蛋白變異區域基因。全長免疫球蛋白“輕鏈”(約25KDa或214個胺基酸)在NH2端(約110個胺基酸)藉由一變異區域基因所編碼,與在COOH端藉由一κ或λ固定區域基因所編碼。而全長免疫球蛋白“重鏈”(約50KDa或446個胺基酸)相似地藉由一變異區域基因(約116個胺基酸),與其他上述的固定區域基因,例如γ(編碼出約330個胺基酸)所編碼。
抗體(或“抗體部分”或“片段”)的“抗原結合片段”指一全長抗體的一個或多個片段,其保留專一性結合至其配體或抗原(例如EGFR或CD3多胜肽或其片段)的能力。
抗體的抗原結合片段的例子包括,但不限定為:(i)一Fab片段,一單價片段包括VL、VH、CL與CH1區域;(ii)一F(ab’)2片段,一二價片段包括兩個Fab片段藉由一雙硫鍵橋在其樞紐區域(hinge region)連結;(iii)一Fd片段包括VH與CH1區域;(iv)一Fv片段包括一抗體單股的VL與VH區域;(v)一dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature 341:544-546),其包括一VH區域;(vi)一分離的CDR以及(vii)VL或VH區域。更進一步,雖然Fv片段的兩個區域VL與VH是由分開的基因所編碼,但使用重組方法可將它們連接,藉由一人造連結器可將它們做成一單鏈蛋白質,於其中VL與VH區域配對形成一單價分子(已知如單鏈Fv(scFv),參閱,例如Bird et al.(1988)Science 242:423-426;and Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此種單鏈抗體也包含在一抗體的
“抗原結合片段”。這些抗體片段可藉由本技術領域常見的技術獲得,並以跟完整抗體相同的方式來篩選應用。
抗體可以是單株抗體。在一實施例中,抗體可以以重組製造,例如藉由噬菌體展示或組合方法(combinatorial method)來製造。以噬菌體展示與組合方法產生抗體為本技術領域所熟已知(參閱,例如Ladner et al.U.S.Patent No.5,223,409;Kang et al.International Publication No.WO 92/18619;Dower et al.International Publication No.WO 91/17271;Winter et al.International Publication WO 92/20791;Markland et al.International Publication No.WO 92/15679;Breitling et al.International Publication WO 93/01288;McCafferty et al.International Publication No.WO 92/01047;Garrard et al.International Publication No.WO 92/09690;Ladner et al.International Publication No.WO 90/02809;Fuchs et al.(1991)Bio/Technology 9:1370-1372;Hay et al.(1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81-85;Huse et al.(1989)Science 246:1275-1281;Griffths et al.(1993)EMBO J 12:725-734;Hawkins et al.(1992)J Mol Biol 226:889-896;Clackson et al.(1991)Nature 352:624-628;Gram et al.(1992)PNAS 89:3576-3580;Garrad et al.(1991)Bio/Technology 9:1373-1377;Hoogenboom et al.(1991)Nuc Acid Res 19:4133-4137;and Barbas et al.(1991)PNAS 88:7978-7982)。
在一實施例中,抗體為一完全人類抗體(例如,一抗體在一小鼠中製造,此小鼠為經基因工程改造,製造從人類免疫球蛋白序列而來的抗體)或非人類抗體,例如一齧齒類動物(小
鼠或大鼠)、山羊、靈長類動物(例如猴子)、駱駝抗體。非人類抗體較佳為齧齒類動物(小鼠或大鼠抗體)。製造齧齒類動物抗體的方法已為本技術領域所周知。
可以藉由使用遺傳工程小鼠執行人類基因來製造人類單株抗體,而不是使用小鼠的系統。使用經感興趣之抗原免疫的遺傳工程小鼠脾臟細胞(splenocytes)來製造融合瘤(hybridoma),其分泌對一人類蛋白質之抗原決定位(epitope)具有專一性親合力的mAbs(參閱,例如Wood et al.International Application WO 91/00906,Kucherlapati et al.PCT publication WO 91/10741;Lonberg et al.International Application WO 92/03918;Kay et al.International Application 92/03917;Lonberg,N.et al.1994 Nature 368:856-859;Green,L.L.et al.1994 Nature Genet.7:13-21;Morrison et al.1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855;Bruggeman et al.1993 Year Immunol 7:33-40;Tuaillon et al.1993 PNAS 90:3720-3724;Bruggeman et al.1991 Eur J Immunol 21:1323-1326)。
抗體的變異區域或其一部份,例如CDR,可在非人類物種(例如,大鼠或小鼠)中產生。可使用轉植、CDR移植與人源化抗體。本發明中在非人類物種(例如,大鼠或小鼠)產生的抗體,經過修飾(例如在變化架構(variable framework)或固定區域),以降低在人類的抗原性(antigenicity)。
可藉由本發明技術領域周知的基因重組DNA技術來製造轉殖抗體(chimeric antibody)。例如一基因,其編碼出鼠科動物(或其他物種)單株抗體分子的Fc固定區域,以限制酶將其編
碼出鼠科動物Fc的區域移除,然在相同位置以編碼出人類Fc固定區域的基因取代(見,Robinson et al.,International Patent Publication PCT/US86/02269;Akira,et al.,European Patent Application 184,187;Taniguchi,M.,European Patent Application 171,496;Morrison et al.,European Patent Application 173,494;Neuberger et al.,International Application WO 86/01533;Cabilly et al.U.S.Patent No.4,816,567;Cabilly et al.,European Patent Application 125,023;Better et al.(1988 Science 240:1041-1043);Liu et al.(1987)PNAS 84:3439-3443;Liu et al.,1987,J.Immunol.139:3521-3526;Sun et al.(1987)PNAS 84:214-218;Nishimura et al.,1987,Canc.Res.47:999-1005;Wood et al.et al(1985)Nature 314:446-449;and Shaw et al.,1988,J.Natl Cancer Inst.80:1553-1559)。
人源化或CDR移植抗體具有至少一個或兩個但一般為全部三個接受者(recipient)CDR(重或輕免疫球蛋白鏈的)被以一貢獻者CDR取代。抗體可被至少一部份的非人類CDR取代或只有CDR中的一些被以非人類的CDR取代。只需取代對於人源化抗體或人源化抗體片段的結合所須數量的CDR。較佳之貢獻者為一齧齒類動物抗體,例如一大鼠或小鼠抗體,以及接受者為一人類架構(framework)或一人類保留架構(consensus framework)。一般而言,提供CDR的免疫球蛋白稱為“貢獻者”以及提供架構稱的免疫球蛋白為“接受者(acceptor)”。在一實施例中,貢獻者免疫球蛋白是一非人類(例如大鼠)。接受者架構是一自然發生(例如人類)或一保留架構,或依序列約85%或更高,較佳為90%、95%、99
%或更高相同程度。此處所使用的“保留序列(consensus sequence)”指一序列,其從一相關序列的家族中最常發生的胺基酸(或核苷酸)形成(參閱,例如Winnaker,From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany 1987)。一蛋白質家族中在保留序列中的每個位置,由此家族於那個位置最常發生的胺基酸所佔據。若兩個胺基酸發生的頻率相同,兩者中的任一個皆可包含於保留序列。“保留架構”指架構區域在保留免疫球蛋白序列之中。
可藉由本技術領域已知的方法將一抗體進行人源化。藉由取代Fv變異區域的序列可產生人源化抗體,其中Fv變異區域不直接包含於抗原與人類Fv變異區域之相同序列結合的作用中。對於產生人源化抗體的方法由Morrison,S.L.,1985,Science 229:1202-1207、Oi et al.,1986,BioTechniques 4:214、Queen et al.US 5,585,089、US 5,693,761與US 5,693,762所提供。那些方法包括分離、操作與表現核酸序列,其中核酸序列從至少一重或輕鏈之一編碼出免疫球蛋白Fv變異區域的全部或一部份。此種核酸的來源於本技術領域中已眾所周知,以及例如可從一融合瘤中獲得,其中此融合瘤製造一抗體抵抗一感興趣的多胜肽或其片段。可轉殖(clone)一重組DNA至一適當的表現載體,其中此重組DNA編碼出人源化抗體或其片段。
可將人源化抗體融合至支架,於人源化抗體中,特定胺基酸已被取代、刪除或增加。較佳的人化抗體具有胺基酸替代於架構區域中,如此以改善對抗原的結合。例如一人源化抗體具有架構殘基相同於貢獻者的架構殘基或其他胺基酸除了接受者
的架構殘基。為了產生此種抗體,藉由對應的貢獻者胺基酸可取代一經過選擇之少數接受者人源化免疫球蛋白鏈的架構殘基。較佳的取代位置包括胺基酸殘基鄰接於CDR或其具有與CDR反應的能力。從貢獻者選擇胺基酸的標準敘述於US 5,585,089。將抗體人源化的其他技術敘述於Padlan et al.EP 519596 A1。
在一實施例中,三聚體複合蛋白質之各多胜肽不包括一膠原蛋白NC1區。在一實施例中,三聚體複合蛋白質之各多胜肽不包括一雙硫鍵結(disulfide knot)。在一實施例中,三聚體複合蛋白質之各多胜肽不包括一噬菌體T4 fibritin折疊區。
三聚體複合蛋白質之支架為最小大小較佳。在一實施例中,類膠原蛋白區包括(G-P-P/O)10之序列。在一實施例中,各多胜肽包括少於13個G-X-Y重複序列。在某些實施例中,三聚體複合蛋白質包括少於11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、25、27、30、35、40、45或50個G-X-Y重複序列。在某些實施例中,三聚體複合蛋白質之各多胜肽的分子量小於35、37、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50kD。在一實施例中,三聚體複合蛋白質的分子量小於105、110、115、120、125、130、135、140、145或150kD。
在一較佳實施例中,三聚體可溶抗體,包括三條多胜肽,其中各多胜肽包括:一膠原蛋白支架區包括至少10個G-X-Y重複序列,且至少5、6、7、8、9或10個Y為羥基脯胺酸;以及一抗體區,其中該三條多胜肽之類膠原蛋白支架區互相作用以形成該三聚體可溶抗體,該三聚體可溶抗體以至少107M-1之親合力專一性結合至一配體。
本發明也包括一核酸其編碼出一融合多胜肽形成本發明之一蛋白質複合物。核酸可從噬菌體展示篩選出或從表現上述適合的抗體或抗體衍生物的細胞株中分離(例如RT-PCR)。可功能性連接核酸至一表現載體。可使用經核酸或載體轉植的細胞來製造本發明之融合多胜肽或蛋白質複合物。用以製造抗體之有用的細胞包括昆蟲細胞與哺乳類動物細胞。這些細胞包括,但不限於骨髓瘤NS0細胞、CHO細胞或淋巴細胞(lymphatic cell)。
本發明包括產生三聚體複合蛋白質的方法,其藉由將一編碼出一膠原蛋白支架區之核酸與包括一抗體區之核酸連結,例如使用一般分子技術。可直接將膠原蛋白支架區連接與抗體區連接,或可藉由額外之序列將其分離,例如編碼出樞紐(hinge)區之核苷酸序列。可在允許羥基脯胺酸化之細胞系統中表現上述核酸,例如NS0細胞。
在一實施例中,本發明包括產生三聚體複合蛋白質之方法,其藉由將一編碼出一類膠原蛋白區之核酸讀框與一編碼出抗體區之核酸連結。在一較佳實施例中,類膠原蛋白區包括大於10個G-X-Y重複序列。在一實施例中,類膠原蛋白區包括10-30個G-X-Y重複序列,G為甘胺酸,X為任何胺基酸且Y為任何胺基酸,且至少10個G-X-Y重複序列為G-P-P。在一實施例中,類膠原蛋白區之核酸讀框與一編碼出對應於一配體之抗體的核酸連結;以及表現上述編碼出之多胜肽於一細胞中,其於至少羥基脯胺酸化5、6、7、8、9或10個G-P-P重複序列的Y位置;其中三條多胜肽之羥基脯胺酸化的膠原蛋白支架區互相反應以形成該三聚體複合蛋白質,以至少107M-1之親合力專一性結合至一配體。
在一實施例中,三聚體複合蛋白質對其配體之親合力大於107M-1。在一實施例中,三聚體複合蛋白質對其配體之親合力大於108M-1。在一實施例中,三聚體複合蛋白質對其配體之親合力大於109M-1。在某些實施例中,三聚體複合蛋白質對其配體之親合力介於107M-1至1010M-1之間、107M-1至109M-1之間、107M-1至108M-1之間、108M-1至1010M-1之間、108M-1至109M-1之間,以及109M-1至1010M-1之間。
在一實施例中,三聚體複合蛋白質所對應之配體為人類上皮生長因子受體。在一實施例中,三聚體複合蛋白質所對應之配體為人類CD3。在一實施例中,三聚體複合蛋白質所對應之配體為人類HER2/neu。在一實施例中,三聚體複合蛋白質所對應之配體為人類TNF-α。
可從包括編碼出本發明多胜肽之核酸的載體,較佳為表現載體來表現支架區蛋白質與支架區融合蛋白質。此處所使用之“載體”指核酸分子,其具有轉植另一核酸至其連接處的能力可包括一質體(plasimd)、噬菌粒(cosmid)或一病毒載體(viral vector)。載體具有自主性複製(autonomous replication)或插入至一宿主DNA的能力。病毒載體包括複製有缺陷之反轉錄病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)與腺相關病毒(adeno-associated virus)。在原核細胞中之蛋白質表現最長於具有載體之大腸桿菌中執行,而此載體包括基本的或可誘導的啟動子,其驅動融合或非融合蛋白的表現。
融合載體可加入一些至胺基酸在此編碼出蛋白質,通常至重組蛋白之胺基端。此種融合載體提供三種用途:1)增加
重組蛋白之表現;2)增加重組蛋白之穩定性與;3)在一親合性純化中,藉由做為一配體來幫助重組蛋白之純化。通常在融合部分與重組蛋白之交接處引入一蛋白質切割位以使重組蛋白在融合蛋白純化之後可從融合部分分離。此種酵素與其同源識別之序列,包括因子Xa、凝血蛋白酵素(thrombin)與腸激酶(enterokinase)。
一般融合表現載體包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc;Smith,D.B.and Johnson,K.S.(1988)Gene 67:31-40)、pMAL(New England Biolabs,Beverly,Mass.)與pRIT5(Pharmacia,Piscataway,N.J.)其對目標融合蛋白分別融合了穀胱甘肽轉化酶(glutathione S-transferase,GST)、麥芽糖E結合蛋白(maltose E binding protein)或蛋白質A。
在大腸桿菌中將重組蛋白之表現最大化為在一宿主細菌中表現蛋白質,而此宿主細菌之蛋白質裂解重組蛋白之能力受損(Gottesman,S.,(1990)Gene Expression Technology:Method in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.119 128)。另一策略為,在將一核酸插入表現載體之前,改變此核酸之序列,使後續製造出來之胺基酸,會為大腸桿菌所優先使用(Wada et al.,(1992)Nucleic Acids Res.20:2111-2118)。本發明此種核酸序列之改變可藉由標準DNA合成技術實行。
宿主細胞可為任何原核細胞或真核細胞。可將本發明之蛋白質表現於細菌細胞(例如大腸桿菌)、昆蟲細胞、酵母菌或哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cells,CHO cell))或COS細胞(非洲綠猴腎細胞CV-1起源之SV40細胞;Gluzman(1981)Cell 23:175 182))中。其他適合之細胞為
此技術領域之人士所周知。
經由一般轉形(transformation)或轉染(transfection)技術可將載體DNA引入宿主細胞中。此處所使用之“轉形”與“轉染”為指各種本技術領域中所認定用來將外來核酸(例如DNA)引入宿主細胞中,包括磷酸鈣或氯化鈣共沈澱法(co-precipitation)、DEAE-葡聚糖轉染法(DEAE-dextran-mediated transfection)、粒遞送法(lipofection)或電洞法(electroporation)。
本發明之細胞毒性藥劑之共軛物可用於治療癌症、自體免疫、代謝疾病或心血管疾病,也可用於減緩老年化。例如,藉由投予所需病患有效量的本發明之細胞毒性藥劑之共軛物,可認定被治療的病患具有以失調為特徵的情況或是處於此風險中。此方法可單獨表現或與其他藥物或治療結合。
由於本發明所述之三聚體複合蛋白質具有多重專一的特色,可以使用重組蛋白複合物來連接於一般情況下不互相結合的分子或細胞。此特徵特別有用於細胞療法(cell-based therapy)。在一實施例中,蛋白質複合物中的異源性區域具有活化細胞毒素性細胞(cytotoxic cell)(例如毒殺性T細胞(cytotoxic T cell))的能力,藉由與位於細胞毒素性細胞上的反應因子抗原(effector antigen)專一性結合,而其他異源性區域則專一性結合至位於將被破壞的病原體或有害細胞的目標抗原。在此方法中,蛋白質複合物可用來治療因病原體或有害細胞所導致的失調。
本發明之細胞毒性藥物之共軛物中,該細胞毒性藥物包括MMAE(monomethyl auristain E)、MMAF(monomethyl auristin F)、艾黴素(Doxorubicin)、阿比西定(Apicidin)、細胞鬆
弛素D(cytochalasin D)、D-64131((5-Methoxy-1H-indol-2-yl)phenylmethanone)、太平洋紫杉醇(taxol)、細胞鬆弛素B(cytochalasin B)、短桿菌素D(gramicidin D)、溴化乙錠(ethidium bromide)、吐根鹼(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、滅必治(etoposide)、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、維克思丁(vincristine)、敏伯斯登(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicin)、阿霉素多柔比星(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、(dihydroxy anthracin dione)、米托(mitoxantrone)、普卡黴素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycin D)、去氫睪丸素(1-dehydrotestosterone)、糖皮質素(glucocorticoids)、普魯卡因(procaine)、得特卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、恩特來(propranolol)、嘌呤黴素核苷酸(puromycin)、美登素(maytansinoids)、美登醇(maytansinol)、滅殺除癌(methotrexate)、胇嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鳥嘌呤核苷(6-thioguanine)、賽達命(cytarabine)、(5-fluorouracil decarbazine)、氮芥氣(mechlorethamine)、thioepa chlorambucil、CC-1065、美法崙(melphalan)、卡莫司汀(carmustine,BSNU)、洛莫司汀(lomustine,CCNU)、(cyclothosphamide)、補束剋(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈脲佐菌素(streptozotocin)、絲裂黴素C(mitomycin C)、順鉑帝爾(cis-dichlorodiamine platinum(II)(DDP)cisplatin))、四環黴素(anthracyclines)、可美淨(dactinomycin;actinomycin)、撲類惡(bleomycin)、普卡黴素(mithramycin)、氨茴黴素(anthramycin,AMC))、維克思丁(vincristine)、敏伯斯登(vinblastine)、雞母珠毒
蛋白(abrin)、蓖麻蛋白A(ricin A)、綠膿桿菌外毒素(pseudomonas exotoxin)或白喉毒素(diphtheria toxin)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor)、α-干擾素(α-interferon)、β-干擾素(β-interferon)、神經生長因子(nerve growth factor)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor)、組織胞漿素原激活素(tissue plasminogen activator)、淋巴激素(lymphokines)、細胞白介素-1(interleukin-1;IL-1)、細胞白介素-2(interleukin-2;IL-2),細胞白介素-6(interleukin-6;IL-6)、顆粒球-巨噬細胞之聚落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor;GM-CSF)、或顆粒球聚落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor;G-CSF)等。
本發明之細胞毒性藥物與重組蛋白複合物共軛鍵結之方法為,在膠原蛋白支架區的GEKGDP胺基酸序列中的離胺酸(K)在哺乳動物細胞株合成時,可藉由轉譯後修飾(post-translational modification),經過羥基化(hydroxylation)及醣基化(glycosylation),形成醣基化羥基離胺酸(glycosylated hydroxylysine)。經過羥基化和醣基化的離胺酸(K)藉由醣基上的醛基(aldehyde)與細胞毒性藥物的胺基(amino group)形成肼(hydrazide)而共軛連接(conjugation)。在一實施例中,該醣基為葡萄糖基。在另一實施例中,該醣基為半乳糖基。在另一實施例中,該醣基為葡萄糖基和半乳糖基。但是,本發明不限於此。
在本發明一實施態樣中,細胞毒性藥物之共軛化學反應是利用過碘酸鈉(NaIO4)將上述葡萄糖基、半乳糖基、或其組合結構開環而得到醛基化,再藉由細胞毒性藥物分子結構中的
第一級胺或第二級胺進行Schiff-base反應而形成肼(hydrazide),使細胞毒性藥物共軛鍵結於膠原蛋白支架區。反應後加入硼氰化鈉(NaCNBH4)以還原Schiff-base的鍵結,使其穩定。
本發明之細胞毒性藥物之共軛物,與習知的抗體-藥物複合體(ADCs)的不同點主要在於,本發明所包含的細胞毒性藥物不鍵結於例如抗體等的與標靶細胞結合的區域上,而是藉由膠原蛋白胜肽所構成的支架區上的特定胺基酸區段,使細胞毒性藥物共軛連接於膠原蛋白支架區。由於細胞毒性藥物共軛鍵結於膠原蛋白支架區,可完全避開與標靶細胞的標靶結合區域,進而減少因鍵結藥物而導致與標靶結合區域的結合能力降低的問題。
再者,當本案所述之重組蛋白複合物為由三條相同的多胜肽所組成之三聚體複合蛋白質時,其中的膠原蛋白支架區具有驅動融合多胜肽形成三聚體化之能力,並仍保有結合至其配體之能力,因此可促進標靶結合強度、對低密度的標靶分子產生有效的交聯(crosslinking)效應、誘導內噬化(internalization),與習知的二價IgG及單價scFv相比,此三聚體複合蛋白質的結合親合力更為優異。
再一方面,本發明提供一種醫藥組成物,包含上述之細胞毒性藥物之共軛物作為活性成分。
又本發明之醫藥組成物,可用於治療癌症、自體免疫、代謝疾病或心血管疾病。本發明之醫藥組成物,亦可用於減緩老年化。
本發明更提供如上所述之細胞毒性藥物之共軛物之醫療用途,用於在製備治療癌症、自體免疫、代謝疾病或心血管
疾病之藥物,以及用於在製備減緩老年化之藥物。
在此,“治療”定義為將一組合物投予病患,以治癒、減輕、緩和、治療、避免或改善失調、失調的症狀、對於失調的疾病狀態第二期或傾向於疾病的體質為目的。”減緩”定義為降低、減輕或緩和因逐漸老化所出現的狀態。投予有效劑量(effective dose)的本發明之醫藥組成物可產生醫藥上令人滿意的結果。
體內(in vivo)投藥的方式為將有療效的組合物(例如,包含本發明之細胞毒性藥物之共軛物)給予病患。一般而言,將複合物懸浮於一藥學上可接受的載體(carrier)(例如生理食鹽水)與將其以口服給藥或藉由靜脈內(intravenous)注入或注射或灌入皮下(subcutaneous)、肌肉內(intramuscular)、蜘蛛膜下腔(intrathecal)、腹腔內(intraperitoneal)、直腸內(intrarectal)、陰道內(intravaginal)、鼻內(intranasal)、胃內(intragastrical)、氣管內(intratracheal)或肺內(intrapulmonary)。
劑量要求是依據所選擇的給藥途徑;配方性質;病患疾病的性質;病患體型、體重、表面積、年紀與性別;病患被給予的其他藥物與主治醫師的判斷。適當的劑量範圍在0.01-100.0mg/kg,更明確為0.1-100、0.1-75、0.1-50、0.1-25、0.1-10、0.5-100、0.5-75、0.5-50、0.5-25、0.5-10、1-100、1-75、1-50或1-25mg/kg。較佳劑量包括1-10、10-100、10-75、10-50、10-25、25-50、50-75、25-100、50-100或75-100mg/kg。劑量範圍為1-2、3-4、5-6、7-8或9-10mg/kg更佳。本發明之治療性組合物在1-10個星期,較佳為2-8星期,更佳為3-7星期,甚至更佳為4-5或6星期間被每天、
一次、兩次、三次或每星期給予。在可得成分的多樣化與多種給藥途徑的不同功效的觀點下,劑量需求的多樣性是被期待的。例如,口服給藥比靜脈內注射給藥被期待為需要較高的劑量。可調整這些劑量程度的多樣性利用標準經驗程序(standard empirical routines)以最佳化,而此為本發明領域所周知。概括成分於一適當的傳送運載工具(vehicle)(例如聚合微粒子(polymeric microparticles)或植入裝置(implantable devices)),可增加傳送的效率,特別是對於口服傳送而言。
藥學上可接受之載體包括一溶劑、一分散媒(dispersion medium)、一套膜(coating)、一抗菌與抗真菌試劑與一等滲透壓與吸收延遲(absorption delaying)試劑。具體而言,這些試劑可包括生理食鹽水(saline solution)、不揮發油(fixed oil)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑;抗菌試劑,例如苯甲醇(benzyl alcohol)或苯甲酸甲脂(methyl paraben);抗氧化劑,例如抗壞血酸(ascorbic acid)或亞硫酸氫鈉(sodium bisulfite);螯合劑(chelating agent),例如乙烯二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid);緩衝溶液,例如醋酸、檸檬酸或磷酸;調整張力之試劑,例如氯化鈉或葡萄糖(dextrose)。藥學組成物之pH可以酸或鹼來調整,例如鹽酸或氫氧化鈉。
本發明之醫藥組成物,除包括本發明之細胞毒性藥物之共軛物為有效成分外,還可包含藥學上可接受的載體。藥學上可接受之載體包括溶劑、分散媒(dispersion medium)、套膜(coating)、抗菌與抗真菌試劑、與等滲透壓與吸收延遲(absorption delaying)試劑等。對於不同的給藥方式,可利用一般方法將藥學
組合物配置成劑型(dosage form)。劑量範圍與給藥方式可透過體內(in vivo)與試管內(in vitro)兩者的測試而決定適當的劑量及給藥方式。
(實施例1)單鏈抗體763scFvCS5、763scFvCS5m1、763scFvCS5m2、EG2dAb-m1與EG2dAb-m2的建構
根據美國專利USP 6,235,883之記載,使用引子組(primer set),編碼出763scFv之VL與VH的cDNAs,進行重疊延伸(overlapping)PCR擴增。並藉由甘胺酸連結子(Glycine linker)(GGGGS)3連結VL與VH鏈來建構763scFv之cDNA產物。763scFv多胜肽序列如序列辨識號:1,編碼出其的cDNA序列如序列辨識號:2。
所得的763scFv PCR產物片段,分別選殖於源自pSecTag2/Hygro(Invitrogen)之表現載體中的Asc I及Not I,並框內(in-frame)融合至不同的類膠原蛋白胜肽區CS5(序列辨識號:3)、CS5m1(序列辨識號:4)、CS5m2(序列辨識號:5)之N-端,並框內(in-frame)融合甘胺酸-連結子(GlyGlySerGlyGlyThrGlyGlySer)與親合性多胜肽鏈,其中包含thrombin切位(LeuValProArgGlySer)、Strep-tag® II序列(TrpSerHisProGlnPheGluLys)、c-Myc tag(GluGlnLysLeuIleSerGluGluAspLeu)、以及C端組胺酸標籤(histidine tag)(HisHisHisHisHisHis),分別成為763scFv-CS5(序列辨識號:6)、763scFv-CS5m1(序列辨識號:7)、763scFv-CS5m2(序列辨識號:9)。
763scFv-CS5的多胜肽序列(序列辨識號:6)中的第
248~292位胺基酸為CS5類膠原蛋白胜肽區,第293~301位的胺基酸為甘胺酸連結子,第302~348位的胺基酸為親合性多胜肽鏈。
763scFv-CS5m1的多胜肽序列(序列辨識號:7)中的第248~286位胺基酸為CS5m1類膠原蛋白胜肽區,第287~295位的胺基酸為甘胺酸連結子(Glycine linker),第296~342位的胺基酸為親合性多胜肽鏈,編碼出其的cDNA序列如序列辨識號:8。
763scFv-CS5m2的多胜肽序列(序列辨識號:9)中的第248~283位胺基酸為CS5m2類膠原蛋白胜肽區,第284~292位的胺基酸為甘胺酸連結子(Glycine linker),第293~339位的胺基酸為親合性多胜肽鏈,編碼出其的cDNA序列如序列辨識號:10。
另一方面,根據國際專利公開案WO 2008/141449,建構EG2單域抗體(single-domain antibody;adAb)。使用重疊PCR(overlapping PCR),編碼出EG2之cDNA,進行PCR擴增產生EG2dAb之cDNA。EG2dAb多胜肽序列如序列辨識號:11,編碼出其的cDNA序列如序列辨識號:12。
將所得的EG2dAb PCR產物片段,分別選殖於源自pSecTag2/Hygro(Invitrogen)之表現載體中的Asc I及Not I,並框內(in-frame)融合至不同的類膠原蛋白胜肽區m1(序列辨識號:13)、m2(序列辨識號:14)之N-端,並框內(in-frame)融合甘胺酸連結子(GlyGlySerGlyGlyThrGlyGlySer)與親合性多胜肽鏈,其中包含thrombin切位(LeuValProArgGlySer)、Strep-tag® II序列(TrpSerHisProGlnPheGluLys)、c-Myc tag(GluGlnLysLeuIleSerGluGluAspLeu)、以及C端組胺酸標籤(HisHisHisHisHisHis),分別成為EG2dAb-m1(序列辨識號:15)、
EG2dAb-m2(序列辨識號:16)。
EG2dAb-m1的多胜肽序列(序列辨識號:15)中的第132~143位胺基酸為m1類膠原蛋白胜肽區,第144~152位的胺基酸為甘胺酸連結子,第153~199位的胺基酸為親合性多胜肽鏈。
EG2dAb-m2的多胜肽序列(序列辨識號:16)中的第132~137位胺基酸為m2類膠原蛋白胜肽區,第138~146位的胺基酸為甘胺酸連結子,第147~193位的胺基酸為親合性多胜肽鏈。
(實施例2)763scFvCS5、763scFvCS5m1、763scFvCS5m2的生產與純化
將建構之763scFvCS5、763scFvCS5m1、763scFvCS5m2的表現質體,使用Effectene(Qiagen),並根據其操作指示,轉染至小鼠骨髓瘤(myeloma)NS0細胞(European Collection of Animal Cell Cultures,Wiltshire,UK)。以Hygromycin B(400μg/ml)篩選4週後,將穩定的選殖株(clone)培養於含2%胎牛血清之無血清化學定義培養基(chemically-defined medium)HyQCDM4NS0(Hyclone)的搖瓶,起始的接種密度為5×105cells/ml。於37℃維持130rpm培養5天。重組抗體之純化分為兩階段,第一階段先將His Mag Sepharose excel管柱(1-ml柱床體積,GE Healthcare)以pH 7.4磷酸緩衝食鹽水(PBS)(0.01M磷酸緩衝液、0.0027M KCl、0.14M NaCl)流速60ml/h平衡後,將經過濾後的培養基通過此管柱以純化上述之抗EGFR膠原蛋白支架抗體(anti-EGFR collabody)。之後以相同緩衝液清洗後,以pH 7.4的磷酸緩衝食鹽水含有250mM之咪唑(imidazole)緩衝液洗提重組抗體。為進一步獲得更精純之重組抗體,第二階段純化將第一階段沖提出之重組抗體通過已先使用100
mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM EDTA,pH8.0之沖洗緩衝液平衡後之Strept-Tactin樹脂管柱。結合後之管柱以含100mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM EDTA、2.5mM desthiobiotin,pH8.0之沖提緩衝液將重組抗體沖提下來。之後將重組抗體以透析袋透析至磷酸緩衝食鹽水(PBS)(0.01M磷酸緩衝液、0.0027M KCl、0.14M NaCl)緩衝液中。重組抗體進行SDS-PAGE分析,使用4~12% NuPAGE雙-三聚乙醯胺膠,以MES作為移動的緩衝液(Invitrogen,San Diego,CA)。蛋白質以InstantBlue(Expedeon,Cambridgeshire,UK)染色,使用Bench Mark(Invitrogen,San Diego,CA)作為分子體積標準。純化結果如圖1所示,763scFvCS5為三倍體之膠原蛋白支架抗體,分子量約為120kDa(圖1,lane 2),在經過還原劑DTT還原後成為單倍體,其分子量約40kDa(圖1,lane 4)。
(實施例3)EG2dAb-m1、EG2dAb-m2的生產與純化
將建構之EG2dAb-m1和EG2dAb-m2的表現質體,使用Amaxa® Nucleofector® Technology並根據其操作指示,轉染至中國倉鼠卵巢CHO-S細胞(FreeStyleTM CHO-S Cells,InvitrogenTM)。以Hygromycin B(400μg/ml)篩選後,將穩定的選殖株(clone)培養於無血清化學定義培養基(CD OptiCHOTM Medium,Life,12681-011)的搖瓶並收集培養上清液。重組抗體之純化分為兩階段,第一階段先將His Mag Sepharose excel管柱(1-ml柱床體積,GE Healthcare)以pH 7.4磷酸緩衝食鹽水(PBS)(0.01M磷酸緩衝液、0.0027M KCl、0.14M NaCl)流速60ml/h平衡後,將經過濾後的培養基通過此管柱以純化上述之EG2dAb。之後以相同緩衝液清洗後,以pH 7.4的磷酸緩衝食鹽水含有250mM之imidazole緩
衝液洗提重組抗體。為進一步獲得更精純之重組抗體,第二階段純化將第一階段沖提出之重組抗體通過已先使用100mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM EDTA,pH8.0之沖洗緩衝液平衡後之Strept-Tactin樹脂管柱,結合後之管柱以含100mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM EDTA、2.5mM脫硫生物素(desthiobiotin),pH8.0之沖提緩衝液將重組抗體沖提下來。之後將重組抗體以透析袋透析至磷酸緩衝食鹽水(PBS)(0.01M磷酸緩衝液、0.0027M KCl、0.14M NaCl)緩衝液中。重組抗體進行SDS-PAGE分析,使用4~12% NuPAGE雙-三聚乙醯胺膠,以MES作為移動的緩衝液(Invitrogen,San Diego,CA)。蛋白質以InstantBlue(Expedeon,Cambridgeshire,UK)染色,使用Bench Mark(Invitrogen,San Diego,CA)作為分子體積標準。
此單域抗體的類膠原蛋白胜肽區是以形成單倍體所設計,主要目的是與類膠原蛋白胜肽區CS5所形成的三倍體做比較。由圖2所示,EG2dAb-m1及EG2dAb-m2在非還原條件下的電泳結果,分子量約為26kDa,其中EG2dAb-m2的類膠原蛋白胜肽區較EG2dAb-m1的類膠原蛋白胜肽區少了6個胺基酸,所以分子量略低一點。
(實施例4)763scFvCS5、763scFvCS5m1、763scFvCS5m2、EG2dAb-m1與EG2dAb-m2類膠原蛋白胜肽區間中,lysine位點轉譯後修飾分析
分別將100μg的763scFvCS5、763scFvCS5m1、763scFvCS5m2、EG2dAb-m1與EG2dAb-m2蛋白質以TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine)還原雙硫鍵(disulfide bond),再
以烴化試劑(alkylating agent)碘乙醯胺(iodoacetamide)將半胱胺酸(cysteine)修飾成較穩定的結構,而不致使雙硫鍵恢復。再加入酪胺酸(trypsin)或Lys-C類的蛋白酵素,將蛋白質切成較小的胜肽片段。之後將酵素作用後的胜肽片段利用LC-MS/MS進行分析:選用C18管柱(Acclaim PepMap RSLC,75μm x 150mm,2μm,100Å)做為液相層析的分離管柱,並結合Q Exactive mass spectrometer(Thermo Scientific)及Ultimate 3000 RSLC system(Dionex)進行分析,最後利用Mascot version 2.4.1進行資料庫的比對。
下表1為LC-MS/MS分析763scFvCS5、763scFvCS5m1、763scFvCS5m2、EG2dAb-m1與EG2dAb-m2在離胺酸(lysine)位點轉譯後羥基化與醣分子修飾結果。在763scFv-CS5的序列(序列辨識號:6)中,第268及274位胺基酸的離胺酸(lysine)位點有後修飾作用,但第265位胺基酸的離胺酸(lysine)位點並未偵測到任何的修飾作用。
在763scFv-CS5-m1的序列(序列辨識號:7)中,只有第268位胺基酸的離胺酸(lysine)位點有後修飾作用。在763scFv-CS5-m2的序列(序列辨識號:9)中,第265位的離胺酸(lysine)位點並沒有後修飾作用。至於EG2dAb-m1的序列(序列辨識號:15),第137位的離胺酸(lysine)位點並沒有後修飾作用。在EG2dAb-m2的序列(序列辨識號:16)中,第134位的離胺酸(lysine)位點有後修飾作用。
綜合以上的結果發現,只要類膠原蛋白胜肽區中有GEKGDP的胺基酸序列,不論是單倍體或三倍體,其離胺酸(lysine)
位點均有後修飾作用。但如果胺基酸序列為GPKGDP,則不論是單倍體或三倍體,其離胺酸(lysine)位點均不會有後修飾。
(實施例5)763scFvCS5鍵結auristatin類小分子藥物:
763scFv-CS5(1~10mg)以1mM的高碘酸鈉(sodium periodate,Sigma)於冰上進行氧化反應1小時,之後加入甘油(glycerol,3% v/v),置於冰上15分鐘以停止其反應。之後以NAP-5(GE Healthcare Life Sciences)管柱去除多餘之高碘酸鈉
(sodium periodate),接著加入10倍莫耳濃度之小分子藥物,包括MMAE(Monomethyl auristatin E)、MMAF(Monomethyl auristatin F)或Doxorubicin於4℃下反應16小時後,加入NaCNBH4於室溫靜置4小時以穩定763scFv-CS5與藥物的鍵結。最後以透析袋透析置換緩衝液至磷酸緩衝食鹽水(PBS)(0.01M磷酸緩衝液、0.0027M KCl、0.14M NaCl)緩衝液中。以SDS-PAGE與分光比色計(spectrophotometer)分析膠原蛋白支架抗體與小分子藥物結合的結果。
SDS-PAGE分析結果如圖1所示,763scFvCS5在與小分子藥物相結合後成為763scFvCS5-MMAE,在三倍體時因為已與MMAE相結合,其分子量可見到略高於未結合之原始抗體763scFvCS5(120kDa)(圖1,lane 3)。以還原劑DTT還原後成為單倍體,其分子量也可見到略高於原始抗體763scFvCS5之單倍體(40kDa)(圖1,lane 4)。
圖4為763scFvCS5-MMAE和763scFvCS5在波長220nm~320nm的UV光譜掃描疊合圖。以波長280nm做為基準點相互疊合後之結果,小分子藥物MMAE在波長250nm有最大吸收峰。由圖2顯示可知,當763scFvCS5與小分子藥物MMAE結合後,在波長250nm有明顯之吸收峰,可見得763scFvCS5已與MMAE相互結合成為763scFvCS5-MMAE。
(實施例6)763scFv-CS5鍵結其他小分子藥物
取高碘酸鈉(sodium meta-periodate,Sigma,NaIO4,7790-28-5)加到763scFv-CS5三倍體融合蛋白中均勻混合後置於室溫作用1小時使氧化形成醛基。加入己二酸二醯肼(adipic acid
dihydrazine,AADH,Sigma,A0638)均勻混合後避光靜置1小時,使抗體上的醛基與AADH的胺基形成鍵結。離心後利用NAP-5(GE,17-0853-02)管柱移除多餘的NaIO4及AADH。再加入5倍莫耳濃度的小分子藥物Cytochalasin D(Sigma,C8273)、Apicidin(Enzo,BML-GR340-0005)、D-64131(Senta Cruz Biotechnology)於4℃冰箱避光作用16-20小時。最後加入NaCNBH4於室溫靜置4小時以穩定763scFv-CS5與藥物的鍵結。
結果如圖5所示,763scFv-CS5鍵結藥物後在非還原的狀態,為分子量120kD的三倍體(trimer)(圖5,lane 1、3、5),大於220kD者應該是鍵結過程中分子間形成的多倍體(multimer)。當樣本以50mM的DTT在90℃處理10分鐘將鍵間雙硫鍵還原後,主要條帶(major band)為分子量40kD的單體形態(monomer)(圖5,lane2、4、6)。
(實施例7)EG2dAb-m2鍵結螢光分子
EG2dAb-m2以10mM的高碘酸鈉(Sigma)進行氧化反應1小時,之後加入甘油(10% v/v),置於室溫60分鐘以停止其反應。之後以Amicon Ultra(Millipore)管柱離心去除多餘之高碘酸鈉,接著加入5倍莫耳濃度之化學分子Hydrazide Alexa 594(Life,A10438,Alexa Fluor hydrazides),於室溫下反應16小時。最後以透析袋透析置換緩衝液至磷酸緩衝食鹽水(PBS)(0.01M磷酸緩衝液、0.0027M KCl、0.14M NaCl)緩衝液中。
使用4~12% NuPAGE雙-三聚乙醯胺膠,以MES作為移動的緩衝液(Invitrogen,San Diego,CA)。EG2dAb-m2與化學分子Hydrazide Alexa 594相結合後可由冷光螢光擷取系統LAS-4000
(GE healthcare life sciences)偵測螢光,蛋白質則以Instant Blue(Expedeon,Cambridgeshire,UK)染色,使用Bench Mark(Invitrogen,San Diego,CA)作為分子體積標準。
結果如圖6所示,EG2dAb-m2利用化學分子高碘酸鈉氧化醣基形成醛基(Aldehyde)後鍵結Hydrazide Alexa 594分子,在非還原的狀態下,確實可看到紅色螢光,其分子位置可與Instant Blue染色結果相比對,此結果可間接驗證實施例4之質譜分析,類膠原蛋白胜肽區中GEKGDP的胺基酸序列,其離胺酸(lysine)位點確實有後修飾作用並與肼(或聯氨,hydrazide)反應形成穩定的共軛(conjugation)。
(實施例8)763scFvCS5與763scFvCS5-MMAE的內噬化作用測試
為測試抗EGFR膠原蛋白支架抗體(anti-EGFR collabody)與抗EGFR膠原蛋白支架抗體藥物共軛物(anti-EGFR collabody-drug conjugate)的內噬化作用(internalization),將腫瘤細胞以冰冷含2% FBS之磷酸緩衝食鹽水(PBS)沖洗3次後,加入飽和之抗EGFR膠原蛋白支架抗體(anti-EGFR collabody)(763scFvCS5)或抗EGFR膠原蛋白支架抗體藥物共軛物(anti-EGFR collabody-drug conjugate)(763scFvCS5-MMAE),於冰上作用1小時後以冰冷含2% FBS之磷酸緩衝食鹽水(PBS)沖洗3次以去除未結合之抗體。將抗體置於37℃水浴槽中並於不同時間點(0分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘)取出迅速置於冰上,以冰冷含2% FBS與0.01% NaN3之磷酸緩衝食鹽水(PBS)沖洗細胞3次後,加入Myc-Tag(9B11)小鼠mAb(Alexa Fluor 488 Conjugate)(1:50)於冰
上作用1小時後,以BD FACSCalibur分析。
結果如圖7所示,圖中(●)代表763scFvCS5、(○)代表763scFvCS5-MMAE,顯示細胞置於37℃水浴槽的時間越長,其細胞表面之抗體所表達出之螢光量越少,代表結合於腫瘤細胞表面受體(EGFR)之抗體已經由內噬化作用進入細胞。在60分鐘後細胞表面之內噬化比例相較於控制組(0分鐘)只剩40%的螢光量,而抗EGFR膠原蛋白支架抗體(anti-EGFR collabody)在與小分子藥物相結合後,仍然維持相同的內噬化能力,並沒有因為藥物的結合而減少內噬化能力。
(實施例9)763scFv-CS5血清中的穩定度分析
將763scFv-CS5以20μg/mL的濃度加到人類血清中,混合均勻後放到37℃、二氧化碳培養箱中模擬生理條件。
分別在0,1,3,7,24,48,72,96,120,144,168小時的時間點取樣並凍存於-80℃冰箱,待所有取樣點完成後再用酵素連結免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析之。
將微滴定盤在4℃以EGFRvIII-hFc(epidermal growth factor receptor variant III fused with human Fc region),2μg/ml塗覆過夜。以StartingBlockTM blocking buffer(Thermo Scientific)填滿未塗覆到之空白處,加入20倍稀釋的763scFv-CS5樣品,在37℃下作用1小時。清洗後,與辨識CS5的抗體在37℃下作用1小時。清洗後,再與辣根過氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的山羊抗人類IgG Lκ片段(Millipore,AP502P,Goat Anti-Human Ig κ chain Antibody,HRP conjugate)在37℃作用1小時,清洗後使用3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine)為基質,偵
測已結合的763scFv-CS5。以微滴定盤讀取器讀取在450nm的吸光值。此處活性分析計算方法是以0小時當做百分之百(初始活性),其它時間點佔初始活性的百分比做為穩定度的定義。結果如圖8所示,兩次的測試中,763scFv-CS5在24小時還有90%左右的初始活性,甚至168小時也維持在80-90%,因此763scFv-CS5在血清中是相當穩定的。
(實施例10)763scFv-CS5鍵結不同藥物對細胞生長抑制分析
細胞毒殺試驗依照PrestoBlue Cell Viability Reagent(Life Technologies)的分析方法進行。亦即,將不同之腫瘤細胞包括人類結腸癌腫瘤細胞(HCT116)、人類表皮腫瘤細胞(A431)或人類腦腫瘤細胞(F98),培養在96孔盤中(每孔1×104顆細胞),加入系列稀釋之測試物包括763scFvCS5、763scFvCS5-MMAE、763scFvCS5-MMAF、763scFvCS5-Doxorubcin、MMAE、MMAF或Doxorubcin。於37℃之二氧化碳培養箱中培養48小時後,將PrestoBlue reagent以10%的濃度加於細胞培養液中,染劑還原之螢光以螢光盤式計數儀(激發光波長:540nm,發散光波長:590nm)計數。控制組則以相同之培養液培養細胞,但不加入任何測試物。IC50以相較於控制組在細胞存活率達50%之測試物濃度為定義之。
結果如圖9(a)~9(e)所示,圖中黑色實心圓線表示763scFvCS5-MMAE、763scFvCS5-MMAF或763scFvCS5-Doxorubcin,白色空心圓線表示小分子藥物MMAE、
MMAF或Doxorubcin,黑色實心三角形線表示763scFvCS5。由圖9(a)~9(d)顯示,763scFvCS5對腫瘤細胞沒有毒性,而763scFvCS5-MMAE、763scFvCS5-MMAF對腫瘤細胞具有很高的抑制效果,可達皮莫耳(picol-molar)的範圍。另一方面,由圖9(e)顯示,763scFvCS5-Doxorubcin對腫瘤細胞的生長抑制效果較差(IC50=19.01nM),推測應該是Doxorubcin藥物本身的藥物效價(potency)較低的緣故。
(實施例11)763scFv-CS5鍵結不同藥物對細胞生長抑制能力分析
為了證實763scFv-CS5鍵結非同源性分子的功能活性,進行763scFv-CS5鍵結不同藥物對腫瘤細胞的生長抑制能力分析。在過度表現EGFR的腫瘤細胞(HCT116、MDA-MB-231)加入系列稀釋之測試物包括763scFvCS5、763scFvCS5-Apicidin、763scFvCS5-Cytochalasin D、763scFvCS5-D-64131、Apicidin、Cytochalasin D、D-64131),並於37℃之二氧化碳培養箱中培養48小時後,利用螢光偵測染劑PrestoBlueTM(Life Technologies,A-13261,PrestoBlue® Cell Viability Reagent)以10%的濃度加於細胞培養液中,染劑還原之螢光以螢光盤式計數儀(激發光波長:540nm,發散光波長:590nm)計數。控制組則以相同之培養液培養細胞,但不加入任何測試物。IC50以相較於控制組在細胞存活率達50%之測試物濃度為定義之。
結果如圖10(a)~10(f)所示。圖10(a)、圖10(d)顯示,763scFvCS5對腫瘤細胞沒有毒性,而763scFvCS5-Apicidin在HCT116及MDA-MB231細胞的IC50分別為6.52nM及11.7nM。圖
10(b)、圖10(e)顯示,763scFvCS5-Cytochalasin D在HCT116及MDA-MB231細胞的IC50分別為24.73nM及11.5nM。圖10(c)、圖10(f)顯示,763scFvCS5-D-64131在HCT116的IC50為80.07nM,但在MDA-MB231細胞並未看到毒性。
(實施例12)763scFvCS5-MMAE在小鼠體內異體移植腫瘤細胞HCT116之療效測試
關於763scFvCS5-MMAE在小鼠體內異體移植腫瘤細胞的試驗,取8至10周齡SCID(Severe Combined Immunodeficiency)雌鼠購自樂斯科生物科技公司(南港,台灣)。小鼠維持在12小時日夜循環的氣候控制環境。將HCT116於第0天(SD0)經由皮下異體移植到免疫不全的SCID小鼠背部,移植後每天量測腫瘤尺寸,當小鼠的腫瘤尺寸生長至約為100mm3時進行分組給藥。在分組後(第0天),每組(n=6)小鼠每日分別給予尾巴靜脈注射100μl磷酸緩衝食鹽水、763scFvCS5-MMAE劑量為0.5mg/kg/day,連續10天後停藥7天再連續給藥10天的處理組(圖11,▲)或連續給藥15天的處理組(圖11,↑)。比較磷酸緩衝食鹽水處理組及763scFvCS5-MMAE不同給藥頻率處理組抑制腫瘤效果。期間以游標尺進行腫瘤尺寸的量測,量測頻率為每週2次。
結果顯示,不論尾巴靜脈注射763scFvCS5-MMAE劑量為0.5mg/kg/day,連續10天後停藥7天再連續給藥10天的處理組或連續給藥15天的處理組皆有顯著抑制腫瘤生長,且以連續給藥15天的處理組抑制效果較佳(P<0.01)。
(實施例13)763scFvCS5-MMAE在小鼠體內異體移植腫瘤細胞A431之療效測試
將腫瘤細胞A431於第0天(SD0)經由皮下異體移植到免疫不全的SCID小鼠背部,移植後每天量測腫瘤尺寸,當小鼠的腫瘤尺寸生長至約為75mm3時進行分組給藥。在分組後(第0天),每組小鼠每日分別給予尾巴靜脈注射100μl磷酸緩衝食鹽水、763IgG-MMAE處理組或763scFvCS5-MMAE處理組以尾巴靜脈注射每劑量0.5mg/kg/day,連續10天(圖12,▲)。期間以游標尺進行腫瘤尺寸的量測,量測頻率為每週2次。結果如圖12所示,相較於磷酸緩衝生理食鹽水處理組或763IgG-MMAE處理組,763scFvCS5-MMAE處理組的小鼠顯著抑制腫瘤生長(P<0.01)。
根據本發明之細胞毒性藥物之共軛物,可提供對標的細胞的多特異性,並且改善習知細胞對抗體-藥物複合體(ADC)內噬化不佳的問題,以提高藥物在標靶細胞中的有效量。並且,由於細胞毒性藥物共軛鍵結於類膠原蛋白胜肽支架區,本發明之細胞毒性藥物之共軛物可完全避開與標靶標的細胞的標靶結合區域,進而提高該共軛物的應用性。
<110> 工業技術研究院
<120> 細胞毒性藥物之共軛物、包含其之醫藥組成物及其用途
<130> 0965-A24720-TW
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (20)
- 一種細胞毒性藥物之共軛物,包括重組蛋白複合物及共軛連接於該重組蛋白複合物之細胞毒性藥物,其中,該重組蛋白複合物係由:(1)一結合區,其係專一性結合至一配體,其中該結合區包括抗體區、細胞激素區或細胞激素受器區,其中該抗體區包括一個或多個免疫球蛋白的互補決定區(CDR)、Fab片段、單鏈抗體(scFv)、單域抗體(sdAb)、或其片段;及(2)一膠原蛋白支架區,其係由擇自於下列(a)或(b)所述之序列所構成的多胜肽胺基酸序列:(a)(GPP)或(GPO)重複序列及至少一個GEKGDP胺基酸序列;(b)至少一個GEKGDP胺基酸序列;其中該膠原蛋白支架區的GEKGDP胺基酸序列中的離胺酸(K)經過羥基化和醣基化而與該細胞毒性藥物形成共軛連接,其中該細胞毒性藥物包括MMAE(monomethyl auristain E)、MMAF(monomethyl auristin F)、艾黴素(Doxorubicin)、阿比西定(Apicidin)、細胞鬆弛素D(cytochalasin D)、D-64131((5-Methoxy-1H-indol-2-yl)phenylmethanone),太平洋紫杉醇(taxol)、細胞鬆弛素B(cytochalasin B)、短桿菌素 D(gramicidin D)、溴化乙錠(ethidium bromide)、吐根鹼(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、滅必治(etoposide)、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、維克思丁(vincristine)、敏伯斯登(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicin)、阿霉素多柔比星(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、(dihydroxy anthracin dione)、米托(mitoxantrone)、普卡黴素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycin D)、去氫睪丸素(1-dehydrotestosterone)、糖皮質素(glucocorticoids)、普魯卡因(procaine)、得特卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、恩特來(propranolol)、嘌呤黴素核苷酸(puromycin)、美登素(maytansinoids)、美登醇(maytansinol)、滅殺除癌(methotrexate)、胇嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鳥嘌呤核苷(6-thioguanine)、賽達命(cytarabine)、(5-fluorouracil decarbazine)、氮芥氣(mechlorethamine)、thioepa chlorambucil、CC-1065、美法崙(melphalan)、卡莫司汀(carmustine,BSNU)、洛莫司汀(lomustine,CCNU)、(cyclothosphamide)、補束剋(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈脲佐菌素(streptozotocin)、絲裂黴素C(mitomycin C)、順鉑帝爾(cis-dichlorodiamine platinum(II)(DDP)cisplatin))、四環黴素(anthracyclines)、可美淨(dactinomycin;actinomycin)、撲類惡(bleomycin)、普卡黴素 (mithramycin)、氨茴黴素(anthramycin,AMC))、維克思丁(vincristine)、敏伯斯登(vinblastine)、雞母珠毒蛋白(abrin)、蓖麻蛋白A(ricin A)、綠膿桿菌外毒素(pseudomonas exotoxin)或白喉毒素(diphtheria toxin)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor)、α-干擾素(α-interferon)、β-干擾素(β-interferon)、神經生長因子(nerve growth factor)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor)、組織胞漿素原激活素(tissue plasminogen activator)、淋巴激素(lymphokines)、細胞白介素-1(interleukin-1;IL-1)、細胞白介素-2(interleukin-2;IL-2),細胞白介素-6(interleukin-6;IL-6)、顆粒球-巨噬細胞之聚落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor;GM-CSF)、或顆粒球聚落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor;G-CSF)。
- 如申請專利範圍第1項所述之細胞毒性藥物之共軛物,其中該膠原蛋白支架區的胺基酸序列為(GPP)5-GEKGEKGDPGPKGDP-(GPP)5、(GPP)5-GEKGEKGDP-(GPP)5、或GEKGDP。
- 如申請專利範圍第1項所述之細胞毒性藥物之共軛物,其中該經過羥基化和醣基化的離胺酸(K)藉由醛基與該細胞毒性藥物形成共軛連接。
- 如申請專利範圍第1項所述之細胞毒性藥物之共軛物,其中 該醣基化包括葡萄糖基化、半乳糖基化、或兩者之組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之細胞毒性藥物之共軛物,其中該配體包括人類上皮生長因子受體(EGFR)、人類CD3、HER2/neu、或人類腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。
- 如申請專利範圍第1項所述之細胞毒性藥物之共軛物,其中該(GPP)或(GPO)重複序列為至少10個重複序列。
- 如申請專利範圍第1項所述之細胞毒性藥物之共軛物,其中該重組蛋白複合物為序列辨識號:16所示之胺基酸序列。
- 一種細胞毒性藥物之共軛物,包括重組蛋白複合物及共軛連接於該重組蛋白複合物之細胞毒性藥物,其中,該重組蛋白複合物係由三條相同的多胜肽所組成之三聚體複合蛋白質,其中每一條多胜肽包含:(1)一結合區,其係專一性結合至一配體,其中該結合區包括抗體區、細胞激素區或細胞激素受器區,其中該抗體區包括一個或多個免疫球蛋白的互補決定區(CDR)、Fab片段、單鏈抗體(scFv)、單域抗體(sdAb)、或其片段;及(2)一膠原蛋白支架區,其係由擇自於下列(a)或(b)所述之序列所構成的多胜肽胺基酸序列:(a)(GPP)或(GPO)重複序列及至少一個GEKGDP胺基酸序列;(b)至少一個GEKGDP胺基酸序列;其中該膠原蛋白支架區的GEKGDP胺基酸序列中的離胺 酸(K)經過羥基化和醣基化而與該細胞毒性藥物形成共軛連接,其中該細胞毒性藥物包括MMAE(monomethyl auristain E)、MMAF(monomethyl auristin F)、艾黴素(Doxorubicin)、阿比西定(Apicidin)、細胞鬆弛素D(cytochalasin D)、D-64131((5-Methoxy-1H-indol-2-yl)phenylmethanone),太平洋紫杉醇(taxol)、細胞鬆弛素B(cytochalasin B)、短桿菌素D(gramicidin D)、溴化乙錠(ethidium bromide)、吐根鹼(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、滅必治(etoposide)、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、維克思丁(vincristine)、敏伯斯登(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicin)、阿霉素多柔比星(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、(dihydroxy anthracin dione)、米托(mitoxantrone)、普卡黴素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycin D)、去氫睪丸素(1-dehydrotestosterone)、糖皮質素(glucocorticoids)、普魯卡因(procaine)、得特卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、恩特來(propranolol)、嘌呤黴素核苷酸(puromycin)、美登素(maytansinoids)、美登醇(maytansinol)、滅殺除癌(methotrexate)、胇嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鳥嘌呤核苷(6-thioguanine)、賽達命(cytarabine)、(5-fluorouracil decarbazine)、氮芥氣 (mechlorethamine)、thioepa chlorambucil、CC-1065、美法崙(melphalan)、卡莫司汀(carmustine,BSNU)、洛莫司汀(lomustine,CCNU)、(cyclothosphamide)、補束剋(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈脲佐菌素(streptozotocin)、絲裂黴素C(mitomycin C)、順鉑帝爾(cis-dichlorodiamine platinum(II)(DDP)cisplatin))、四環黴素(anthracyclines)、可美淨(dactinomycin;actinomycin)、撲類惡(bleomycin)、普卡黴素(mithramycin)、氨茴黴素(anthramycin,AMC))、維克思丁(vincristine)、敏伯斯登(vinblastine)、雞母珠毒蛋白(abrin)、蓖麻蛋白A(ricin A)、綠膿桿菌外毒素(pseudomonas exotoxin)或白喉毒素(diphtheria toxin)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor)、α-干擾素(α-interferon)、β-干擾素(β-interferon)、神經生長因子(nerve growth factor)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor)、組織胞漿素原激活素(tissue plasminogen activator)、淋巴激素(lymphokines)、細胞白介素-1(interleukin-1;IL-1)、細胞白介素-2(interleukin-2;IL-2),細胞白介素-6(interleukin-6;IL-6)、顆粒球-巨噬細胞之聚落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor;GM-CSF)、或顆粒球聚落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor;G-CSF)。
- 如申請專利範圍第8項所述之細胞毒性藥物之共軛物,其中該膠原蛋白支架區的胺基酸序列為(GPP)5-GEKGEKGDPGPKGDP-(GPP)5、(GPP)5-GEKGEKGDP-(GPP)5、或GEKGDP。
- 如申請專利範圍第8項所述之細胞毒性藥物之共軛物,其中該經過羥基化和醣基化的離胺酸(K)藉由醛基與該細胞毒性藥物形成共軛連接。
- 如申請專利範圍第8項所述之細胞毒性藥物之共軛物,其中該醣基化包括葡萄糖基化、半乳糖基化、或兩者之組合。
- 如申請專利範圍第8項所述之細胞毒性藥物之共軛物,其中該配體包括人類上皮生長因子受體(EGFR)、人類CD3、HER2/neu、或人類腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。
- 如申請專利範圍第8項所述之細胞毒性藥物之共軛物,其中該(GPP)或(GPO)重複序列為至少10個重複序列。
- 如申請專利範圍第8項所述之細胞毒性藥物之共軛物,其中該三聚體複合蛋白質以具有平衡結合常數KA至少為107M-1之親合力,專一性結合至該配體。
- 如申請專利範圍第8項所述之細胞毒性藥物之共軛物,其中該重組蛋白複合物為序列辨識號:6、7或9所示之胺基酸序列。
- 一種醫藥組成物,包含如申請專利範圍第1至15項任一項 所述之細胞毒性藥物之共軛物作為活性成分。
- 如申請專利範圍第16項所述之醫藥組成物,其係用於治療癌症、自體免疫、代謝疾病或心血管疾病。
- 如申請專利範圍第16項所述之醫藥組成物,其係用於減緩老年化。
- 一種如申請專利範圍第1至15項任一項所述之細胞毒性藥物之共軛物之用途,其係用於在製備治療癌症、自體免疫、代謝疾病或心血管疾病之治療之藥物。
- 一種如申請專利範圍第1至15項任一項所述之細胞毒性藥物之共軛物之用途,其係用於在製備減緩老年化之藥物。
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