ES2367749T3

ES2367749T3 - Proteínas de unión triméricas para citocinas triméricas.

Info

Publication number: ES2367749T3
Application number: ES03769251T
Authority: ES
Inventors: Thor Las Holtet; Mikkel Holmen Andersen; Helle Krogh Ottow
Original assignee: Anaphore Inc
Current assignee: Anaphore Inc
Priority date: 2002-10-29
Filing date: 2003-10-29
Publication date: 2011-11-08
Anticipated expiration: 2023-10-29
Also published as: DK1558640T3; JP2006520318A; ATE505484T1; CN1720263A; DE60336746D1; JP4690044B2

Abstract

Un polipéptido trimérico que comprende tres monómeros, comprendiendo cada uno de dichos monómeros un miembro de unión específico que puede unirse a una citocina trimérica, y comprendiendo cada uno de dichos monómeros un dominio de trimerización derivado de tetranectina.

Description

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la disposición de proteínas de unión triméricas que se unen a citocinas triméricas. En particular se proporciona agentes de unión triméricos que se unen de tal manera que tras la unión, todos los sitios de unión a receptor de la citocina trimérica se bloquean sustancialmente, y por tanto la actividad biológica potencial de la citocina trimérica se suprime. En un aspecto, la invención se refiere a agentes de unión triméricos que pueden unirse a citocinas de la superfamilia de ligandos del factor de necrosis tumoral, que incluye factor de necrosis tumoral (TNF).

Antecedentes de la invención y técnica anterior

Las citocinas son pequeños polipéptidos segregados de eucariotas superiores que son responsables de la transducción de señales intercelulares y que afectan al crecimiento, división y funciones de otras células. Son polipéptidos potentes, pleiotrópicos que, por ejemplo por medio de receptores correspondientes, actúan como factores reguladores intercelulares locales o sistémicos, y por tanto desempeñan papeles cruciales en muchos procesos biológicos, tales como inmunidad, inflamación y hematopoyesis (formación y desarrollo de células sanguíneas en la médula ósea). Las citocinas se producen mediante diversos tipos celulares que incluyen fibroblastos, células endoteliales, macrófagos/monocitos y linfocitos. Hasta el momento se han identificado un gran número de citocinas, incluyendo interferones, factores de necrosis tumoral, interleucinas y linfocinas. Se diferencian de las hormonas clásicas porque se producen por varios tejidos o tipos de células distintas de las glándulas especializadas.

La modulación de las interacciones citocina-receptor puede ser un mecanismo útil para la intervención terapéutica en diversas enfermedades y patologías. Las proteínas de unión solubles, que pueden interaccionar con citocinas, pueden secuestrar potencialmente la citocina alejándola del receptor, reduciendo o previniendo de ese modo la activación de esa ruta de receptor particular.

Ciertas citocinas se producen como complejos de múltiples subunidades que contienen múltiples copias de la misma subunidad. El factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) y proteínas dentro de la superfamilia de ligandos del factor de necrosis tumoral (TNFLSF), tal como el factor de necrosis tumoral (TNF; miembro 2 de TNFLSF) y linfotoxina alfa (LT-alfa; miembro 1 de TNFLSF), se producen como homotrímeros formados por tres subunidades idénticas. Se sabe que muchas de estas citocinas triméricas están implicadas en la transducción de señales y actúan como factores reguladores, y que están implicadas en muchos tipos diferentes de enfermedades e indicaciones médicas.

Se sabe que las citocinas triméricas de la superfamilia de ligandos del TNF controlan y organizan las respuestas inmunitarias e inflamatorias a varios niveles. Se sabe también que los miembros de la superfamilia de ligandos del TNF están asociados con varias afecciones patológicas, tales como afecciones inflamatorias agudas o crónicas. Actualmente, la superfamilia de ligandos del TNF tiene al menos 17 ligandos reconocidos, que incluyen LTA (linfotoxina alfa; miembro 1 de TNFLSF), TNF (factor de necrosis tumoral; miembro 2 de TNFLSF), LTB (linfotoxina beta; miembro 3 de TNFLSF), OX-40L (miembro 4 de TNFLS); CD40L (miembro 5 de TNFLS); FasL (miembro 6 de TNFLS); CD27L (miembro 7 de TNFLS); CD30L (miembro 8 de TNFLS); 4-1 BB-L (miembro 9 de TNFLS); TRAIL (miembro 10 de TNFLS); RANKL (miembro 11 de TNFLS); TWEAK (miembro 12 de TNFLS); APRIL (miembro 13 de TNFLS); BAFF (miembro 13B de TNFLS); LIGHT (miembro 14 de TNFLS); VEGI (miembro 15 de TNFLS); y GITRL (miembro 18 de TNFLS).

Existen pruebas de que la unidad de señalización de las citocinas triméricas de la superfamilia de ligandos del TNF y sus correspondientes receptores, se encuentra en la forma de tres receptores y tres ligandos ensamblados como complejo hexamérico en el que un único trímero de citocina se une a tres moléculas de receptor (Bodmer et al. 2002, TRENDS in Biochemical Sciences 27(1), pág. 19-26). Antes de formar parte de este complejo hexamérico, los receptores existen en forma monomérica. Este mecanismo general se ilustra en la figura 1.

El TNF (miembro 2 de TNFLSF) es uno de los mediadores principales de la respuesta inmunitaria e inflamatoria, y se sabe, por ejemplo, que tiene un papel importante en la patogénesis de la artritis reumatoide, que es una enfermedad inflamatoria autoinmunitaria común que afecta aproximadamente al 0,5-1% de la población humana. Adicionalmente, también se sabe que el TNF está implicado en la patogénesis de una amplia gama de estados patológicos, que incluyen choque endotóxico, malaria cerebral y reacción injerto frente a huésped. El TNF se produce por varios tipos de células, principalmente por macrófagos activados. La forma soluble de TNF está constituida por tres subunidades de proteína de 17 kD idénticas, mientras que la forma unida a membrana está constituida por tres subunidades de 26 kD idénticas. El TNF se conoce también previamente como “TNF-alfa” y “caquectina”.

Wüest et al (Oncogene vol. 21, n.º 27 pág. 4257-4265) se refieren a proteínas de fusión triméricas que comprenden TNF y un dominio de trimerización. Peng et al (J.Virology vol. 73, n.º 6 pág. 5098-5109) dan a conocer las proteínas de fusión TNFR-CD8.

Se encontró recientemente que TWEAK (miembro 2 de TNFLSF) es un inductor directo y fuerte de la angiogénesis (formación y crecimiento de vasos sanguíneos) tal como se observó que las concentraciones picomolares de TWEAK promueven la proliferación de células endoteliales normales y que TWEAK induce angiogénesis en un modelo de córnea de rata in vivo (Lynch et al., 1999, The Journal of Biological Chemistry, 274(13) pág. 8455-8459). En particular, la angiogénesis es esencial para el crecimiento y persistencia de tumores sólidos y sus metástasis, y se sabe también que está implicada en otras afecciones patológicas tales como retinopatía diabética, psoriasis, dermatitis por contacto y restenosis.

El documento US5716805 se refiere a un procedimiento para preparar proteínas oligoméricas solubles.

En el documento US20020037852A1 se describió la citocina trimérica BAFF (miembro 13B de TNFLS) que se expresaba por células T y células dendríticas para el fin de la coestimulación de células B y por consiguiente puede desempeñar un papel importante en el control de la función de las células B. Se sugiere en el mismo que BAFF y su receptor pueden tener aplicaciones anticancerígenas e inmunorreguladoras así como usos para el tratamiento de trastornos inmunosupresivos tales como VIH.

Drickamer, Kurt (Current Opinion in Structural Biology, vol. 9, n.º 5) da a conocer las formas triméricas de CTLD en relación con tetranectina.

APRIL (miembro 13 de TNFLS) es una citocina trimérica que se une al receptor TNFRSF13B y al TNFRSF17. Se ha demostrado recientemente que la adición de APRIL recombinante a diversas células tumorales estimula su proliferación y por tanto APRIL puede estar implicada en la regulación del crecimiento de células tumorales (Hahne M., et al, 1998; J. Exp. Med. 188: 1185-1190). Se ha sugerido también que APRIL puede estar implicada en procesos inmunológicos mediados por monocitos/macrófagos.

Además, se ha descrito también que las citocinas dentro de la superfamilia de TNF están implicadas en enfermedades hereditarias tales como el síndrome de hiper IgM, síndrome linfoproliferativo autoinmunitario tipo I, síndrome de fiebre periódica asociada a TNF-R1, displasia ectodérmica hipohidrótica y osteólisis familiar expansiva.

Se han realizado varios intentos con el fin de encontrar y desarrollar antagonistas y agentes de unión adecuados para citocinas triméricas que pueden unirse a citocinas triméricas específicas y pueden evitar por tanto que las citocinas triméricas se unan a por ejemplo receptores unidos a la membrana celular y por tanto pueden suprimir la activación de esa ruta de receptor particular.

Un ejemplo es antagonistas frente a la citocina trimérica TNF (miembro 2 de TNFLSF). Actualmente, dos tipos de antagonistas de TNF están comercialmente disponibles, concretamente Infliximab (Remicade) y Eternarcept (Enbrel) que han recibido ambos la autorización de comercialización en los Estados Unidos y Europa para el tratamiento de artritis reumatoide. Los dos productos han demostrado también que son eficaces para el tratamiento de psoriasis y enfermedad de Chrohn. Infliximab es un anticuerpo quimérico con regiones variables murinas y regiones constantes de IgG1 y ? humanas, que neutraliza la actividad biológica de TNF mediante la unión a las formas solubles y transmembranas de TNF e inhibe la unión de TNF con sus receptores. La estructura de Infliximab es similar a la de los anticuerpos que se producen de manera natural. Eternacept es una proteína de fusión constituida por el dominio extracelular del receptor p75 TNF y los dominios de bisagra y Fc de IgG1 humana.

Otro ejemplo de un antagonista para una citocina trimérica se proporciona en el documento WO 00/42073 en el que se da a conocer un anticuerpo monoclonal frente a la citocina trimérica TWEAK (miembro 12 de TNFLS). Se menciona que el anticuerpo puede bloquear el desarrollo de la enfermedad de injerto frente a huésped.

Sin embargo, un problema técnico común que se encuentra con los agentes de unión y productos inhibidores conocidos actualmente para las citocinas triméricas, es que tras la formación de un complejo 1:1 de la citocina trimérica y el agente de unión o producto inhibidor, no se bloquean de manera eficaz los tres sitios de unión a receptor de las citocinas triméricas, ya que al menos uno o dos de los tres sitios de unión a receptor se dejan abiertos. El(los) sitio(s) de unión a receptor de citocina abierto(s) puede(n) asociarse con un correspondiente receptor de citocina de superficie celular y por tanto, debido a la alta concentración local de los receptores en la superficie celular, inician el reclutamiento adicional de receptores de citocina y median la señalización de receptores.

El problema se ilustra claramente mediante el agente de unión a TNF Eternacept, que es una molécula bivalente que forma un complejo 1:1 con el trímero de TNF. Cuando Eternacept se une a TNF, sólo dos de tres posibles sitios de unión a receptor se ocupan por la molécula Eternacept, y el tercer sitio de unión a receptor de deja abierto. Esto implica que el sitio de unión a receptor de TNF abierto puede asociarse con un receptor de TNF de superficie celular y de ese modo, debido a la alta concentración local de los receptores en la superficie celular, inicia el reclutamiento adicional de receptores TNF y mediante esto la transducción de señales. Este problema se ilustra en la figura 2.

El mismo problema se observa con el agente de unión a TNF Infliximab. Cada molécula de Infliximab puede unirse sólo a un sitio de unión a receptor (subunidad) de una molécula de TNF dada, dejando por tanto dos sitios de unión a receptor abiertos. Estos sitios de unión a receptor abiertos pueden asociarse posteriormente con correspondientes receptores libres, dando como resultado el reclutamiento adicional de receptores de TNF y la señalización de receptores.

Se ha encontrado ahora mediante los presentes inventores, que los problemas técnicos anteriores pueden superarse mediante la disposición de una proteína de fusión (protómero) que se construye como una fusión de una unidad de unión (agente de unión) para citocinas triméricas a un dominio de trimerización. La proteína de fusión de la presente invención, puede formar, como proteína trimérica, un complejo 1:1 con una citocina trimérica y preferentemente al mismo tiempo pueden unirse eficazmente los tres sitios de unión a receptor de las citocinas triméricas, mediante lo cual ningún sitio de unión a receptor se deja abierto, y por tanto puede inhibir el acoplamiento de la citocina a la superficie celular. Por tanto, se proporciona ahora una proteína de fusión que tiene la ventaja de poder inhibir y neutralizar de manera más eficaz la actividad biológica de citocinas triméricas en comparación con antagonistas de citocina trimérica conocidos actualmente. Una ventaja adicional de la proteína de fusión según la invención es que cuando se aplica como fármaco, se requiere menos cantidad de la proteína de fusión con el fin de obtener un efecto terapéutico, en comparación con los agentes de unión conocidos actualmente para citocinas triméricas.

Sumario de la invención

Por consiguiente, la invención se refiere en un primer aspecto a un polipéptido trimérico que comprende tres monómeros, comprendiendo cada uno de dichos monómeros un miembro de unión específico que puede unirse a una citocina trimérica, y comprendiendo cada uno de dichos monómeros un dominio de trimerización derivado de tetranectina.

En un aspecto adicional se proporciona una composición farmacéutica que comprende el polipéptido trimérico según la invención.

Todavía en un aspecto adicional, la invención se refiere a un polipéptido trimérico según la invención para su uso como fármaco.

Finalmente, se proporciona un procedimiento para la preparación del polipéptido trimérico según la invención, y un procedimiento de ensayo para detectar una citocina polipeptídica trimérica en una muestra.

Descripción detallada de la invención

En un aspecto, la presente invención proporciona agentes de unión triméricos que pueden unirse a citocinas triméricas, preferentemente de tal manera que tras la unión, todos los sitios de unión a receptor de la citocina trimérica se bloquean sustancialmente y/o se neutralizan, y por tanto la actividad biológica potencial de la citocina trimérica se suprime o se neutraliza. Por consiguiente, se proporciona un polipéptido trimérico que comprende tres monómeros, en el que cada uno de los monómeros comprende un miembro de unión específico que puede unirse a una citocina trimérica, y en el que cada uno de los monómeros comprende un dominio de trimerización, derivado de tetranectina.

En el presente contexto, la expresión “citocina trimérica” se refiere a proteínas pequeñas y fragmentos de las mismas, que se producen y segregan por una célula, y que provocan una respuesta específica en una célula que tiene un receptor para esa citocina, por ejemplo afectando al crecimiento, división y/o función de la célula. El término “trimérica” se usa en el presente documento para describir que las citocinas según la invención se producen como complejos de múltiples subunidades que contienen tres subunidades, preferentemente tres subunidades idénticas (homotrímero).

Ciertos ejemplos típicos de tales citocinas triméricas incluyen factor inhibidor de migración de macrófagos (MIF) y citocinas dentro de la superfamilia de ligandos del factor de necrosis tumoral (TNFLSF). Actualmente, según se mencionó anteriormente, la superfamilia de ligandos del TNF tiene al menos 17 ligandos reconocidos que comparten todos un dominio C terminal trimérico conservado conocido como “dominio de homología de TNF” (THD), que es el responsable de la unión a receptor. La identidad de secuencia de este dominio trimérico es aproximadamente un 2030% entre los miembros de la familia de TNF. El THD es una secuencia larga de 150 aminoácidos que contiene una estructura conservada de residuos aromáticos e hidrófobos que se ilustra en la figura 2 en Bodmer et al. 2002, TRENDS in Biochemical Sciences 27(1), pág. 19-26. Por consiguiente, en el presente contexto un “miembro de la superfamilia de ligandos del factor de necrosis tumoral” pretende significar una proteína trimérica que comprende el dominio de homología de TNF, THD. Las citocinas triméricas actualmente conocidas dentro de la superfamilia de ligandos del TNF se enumeran a continuación en la tabla 1, junto con sinónimos y sus correspondientes ID de Genbank (GenBank, National Center for Biotecnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank). La nomenclatura para la superfamilia de ligandos del TNF tal como se usa en el presente documento sigue la nomenclatura de la superfamilia del TNF (TNFSF) oficial que puede encontrarse en http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/genefamily/tnftop.html.

TABLA 1: Superfamilia de ligandos del TNF

Símbolo de ligando: ID de Genbank Sinónimos

LTA: X01393 TNFSF1, TNFB, LT

TNF: X02910 TNFSF2, TNF-alfa, DIF

LTB: L11016 TNFSF3, TNFC, p33

TNFSF4: D90224 OX-40L, gp34, TXGP1

TNFSF5: X67878 CD40LG, IMD3, HIGM1, CD40L, hCD40L, TRAP, CD154, gp39

TNFSF6: U11821 FasL, APT1LG1

TNFSF7: L08096 CD70, CD27L, CD27LG

TNFSF8: L09753 CD30LG

TNFSF9: U03398 4-1BB-L

TNFRSF10: U37518 TRAIL, Apo-2L, TL2

TNFSF11: AF013171 TRANCE, RANKL, OPGL, ODF

TNFSF12: AF030099 TWEAK, DR3LG, AP03L

TNFSF13: NM_003808 APRIL

TNFSF13B: AF136293 BAFF, THANK, BLYS, TALL-1, TALL1, TNFSF20

TNFSF14: AF036581 LIGHT, LTg, HVEM-L

TNFRSF Fn14: - Proteína 14 de respuesta inmediata-temprana inducible por el factor de crecimiento de fibroblastos, 14 inducible por FGF, receptor Tweak, TweakR

TNFSF15: AF039390 TL1, VEGI

TNFSF18: AF125303 AITRL TL6 nGITRL

Por consiguiente, en una realización útil de la invención el polipéptido trimérico según la invención puede unirse a una citocina trimérica que es un miembro de la superfamilia de ligandos del factor de necrosis tumoral seleccionado 5 de LTA; TNF ;LTB; TNFSF4; TNFSF5; TNFSF6; TNFSF7; TNFSF8; TNFSF9; TNFSF10; TNFSF11; TNFSF12; TNFSF13; TNFSF13B; TNFSF14; TNFRSF Fn14; TNFSF15; y TNFSF18.

La expresión “miembro de unión específico”, según se usa en el presente documento, se refiere a un miembro de un par de moléculas que tienen especificidad de unión entre sí. Los miembros de un par de unión específica pueden derivarse de manera natural o pueden producirse de manera completa o parcialmente sintética. Un miembro del par 10 de moléculas tiene un área en su superficie, o una cavidad, que se une específicamente a y es por tanto complementaria a una organización polar y espacial particular del otro miembro del par de moléculas. De ese modo, los miembros del par tienen la propiedad de unirse específicamente entre sí. Ciertos ejemplos de tipos de pares de unión específica son antígeno-anticuerpo, biotina-avidina, hormona-receptor de hormona, ligando-receptor de ligando, enzima-sustrato. Otros ejemplos de pares de unión específica incluyen, hidratos de carbono y lectinas, 15 secuencias de nucleótidos complementarias (que incluyen secuencias de ácidos nucleicos de sonda y captura usadas en ensayos de hibridación de ADN para detectar una secuencia de ácido nucleico diana), secuencias peptídicas complementarias que incluyen las formadas mediante procedimientos recombinantes, moléculas efectoras y receptoras, cofactores enzimáticos y enzimas, inhibidores enzimáticos y enzimas y similares. Además, los pares de unión específica pueden incluir miembros que son análogos o fragmentos del miembro de unión

20 específico original.

En realizaciones útiles, los miembros de unión específica que pueden unirse a una citocina trimérica, dotan al polipéptido trimérico según la invención de una afinidad de unión (Kd) por la citocina trimérica que preferentemente es 1 x 10-8 M o menos determinada mediante resonancia de plasmón de superficie. En otras realizaciones útiles, el valor de Kd es menor de 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 1 x 10-12 M, 1 x 10-13 M, 1 x 10-14 M, o incluso menor de 1 x 10-15 M. En otras realizaciones útiles, la constante K-off para el polipéptido trimérico según la invención es menor de 1 x 10-3 S-1, tal como menor de 1 x 10-4 S-1, incluyendo menor de 1 x 10-5 S11, e incluso menor de 1 x 10-6 S-1 determinada mediante resonancia de plasmón de superficie. El término “K-off”, según se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de disociación para la disociación de un miembro de unión específico

5 del complejo de miembro de unión específico/citocina trimérica. La expresión “resonancia de plasmón de superficie”, según se usa en el presente documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteína dentro de una matriz biosensora, por ejemplo usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia). Para descripciones adicionales, véase el ejemplo 10.

10 Según se mencionó anteriormente, se prefiere que el agente de unión a citocina trimérica bloquee, inhiba o neutralice, según la invención, al menos parcial o completamente, una actividad biológica de una citocina trimérica. Según se usa en el presente documento, la expresión “neutraliza” o “neutralización” significa la inhibición de o la reducción de una actividad biológica de una citocina trimérica según se mide in vivo o in vitro.

En realizaciones útiles, el miembro de unión específico es un polipéptido derivado de un miembro de la superfamilia

15 de receptores del factor de necrosis tumoral. Actualmente, se conocen al menos 29 receptores dentro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral y se enumeran a continuación en la tabla 2 junto con sus sinónimos y sus correspondientes ID de Genbank (GenBank, National Center for Biotecnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank). La nomenclatura para los miembros de la superfamilia de receptores del TNF según se usa en el presente documento sigue la nomenclatura de la superfamilia del TNF (TNFSF) oficial que puede

20 encontrarse en http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/genefamily/tnftop.html.

TABLA 2: Superfamilia de receptores del TNF 5

Símbolo de receptor: ID de Genbank Sinónimos

TNFRSF1A: M75866 p55-R, CD120a, TNF-R-I p55, TNF-R, TNFR1, TNFAR, TNF-R55, p55TNFR, TNFR60

TNFRSF1B: M32315 CD120b, p75, TNF-R, TNF-R-II, TNFR80, TNFR2,TNF-R75, TNFBR, p75TNFR

LTBR: L04270 TNFRSF3, TNFR2-RP, CD18, TNFR-RP, TNFCR, TNF-R-III

TNFRSF4: X75962 OX40, ACT35, TXGP1L

TNFRSF5: X60592 p50, Bp50, CD40

TNFRSF6: M67454 FAS, CD95, APO-1, APT1

TNFRSF6B: AF104419 DcR3, M68, TR6, HGNC:15888, NHL, DKFZP434CO13, KIAA1088, bK3184A7.3, C20orf41

TNFRSF7: M63928 Tp55, S152, CD27

TNFRSF8: M83554 Ki-1, D1S166E, CD30

TNFRSF9: L12964 4-1BB, CD137, ILA

TNFRSF10A: U90875 DRA, Apo2, TRAILR-1

TNFRSF10B: AF012628 DR5, KILLER, TRICK2A, TRAIL-R2, TRICKB

TNFRSF10C: AF012536 DcR1, TRAILR3, LIT, TRID

TNFRSF10D: AF029761 DcR2, TRUNDD, TRAILR4

TNFRSF11A: AF018253 RANK

TNFRSF11B: U94332 OPG, OCIF, TR1

TNFRSF12: U72763 DR3, TRAMP, WSL-1, LARD, WSL-LR, DDR3, TR3, APO-3

TNFRSF12L: - DR3L

TNFRSF13B: AF023614 TACI

10

15

20

25

30

35

40 (cont.)

Símbolo de receptor: ID de Genbank Sinónimos

TNFRSF13C: AF373846 BAFFR

TNFRSF14: U70321 HVEM, ATAR, TR2, LIGHTR, HVEA

NGFR: M14764 TNFRSF16, p75NTR

TNFRSF17: Z29574 BCMA, TNFRSF13

TNFRSF18: AF125304 AITR, GITR

TNFRSF19: AB040434 TAJ-alfa, TROY, TAJ, TRADE

TNFRSF19L: AF319553 FLJ14993, RELT

TNFRSF21: AF068868 DR6

TNFRSF22: - SOBa, Tnfrh2, 2810028K06Rik

TNFRSF23: - mSO6, Tnfrh1

De ese modo, en realizaciones útiles el miembro de unión específico derivado de un receptor dentro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral se selecciona de los receptores TNFRSF1A, TNFRSF1B, LTBR, TNFRSF4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFRSF6B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF10C, TNFRSF10D, TNFRSF11A, TNFRSF11B, TNFRSF12, TNFRSF12L, TNFRSF13B, TNFRSF13C, TNFRSF14, NGFR, TNFRSF17, TNFRSF18, TNFRSF19, TNFRSF19L, TNFRSF21, TNFRSF22 y TNFRSF23. Sin embargo, también se contempla que otros receptores útiles pueden identificarse dentro de esta familia de proteínas, y por tanto otros miembros de unión específica funcionales.

En una realización útil, el miembro de unión específico se deriva de los receptores de TNF TNFRSF1A (receptor TNFrI, p55) y/o TNFRSF1 B (receptor TNFrII, p75 TNF). Especialmente, se ha demostrado que el receptor TNFRSF1 B y las subunidades del mismo son eficaces para unirse de manera específica a y neutralizar TNF. Como ejemplo, la proteína de unión a TNF Eternacept es una proteína de fusión constituida por el dominio extracelular del receptor TNFRSF1 B, es decir una subunidad del receptor TNFRSF1B. Por consiguiente, en realizaciones específicas, el polipéptido trimérico según la invención incluye un miembro de unión específico que es una subunidad o fragmento del receptor TNFRSF1 B (TNFrII), tal como los fragmentos del receptor TNFRSF1 B dados a conocer en el documento US 5.712.155. De ese modo, en realizaciones útiles, el miembro de unión específico es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de TNFRSF1B 1-235 (SEC ID N.º:76), TNFRSF1B 1-185 (SEC ID N.º:77), TNFRSF1B 1-163 (SEC ID N.º:78) y TNFRSF1B 1-142 (SEC ID N.º:79).

En otras realizaciones útiles, según se da a conocer en los siguientes ejemplos, el miembro de unión específico puede ser uno o más fragmentos del receptor TNFRSF1 B (TNFrII) y combinaciones de tales fragmentos, tales como un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ADN seleccionada de TNFRSF1B D1D2 (SEC ID N.º:13), TNFRSF1B D1D2, 1/6 (SEC ID N.º:15), TNFRSF1B D1D2 1/4 (SEC ID N.º:17), TNFrII D1D2, 1/3 (SEC ID N.º:19), TNFRSF1B D1D2, 1/2 (SEC ID N.º:21), TNFRSF1B D1 D4 (SEC ID N.º:23), TNFRSF1B D2 (SEC ID N.º:25), TNFRSF1B D2, 1/6 (SEC ID N.º:26), TNFRSF1B D2, 1/4 (SEC ID N.º:27), TNFRSF1B D2, 1/3 (SEC ID N.º:28), TNFRSF1B D2, 1/2 (SEC ID N.º:29) y TNFRSF1B D2D4 (SEC ID N.º:30).

Según la invención, el miembro de unión específico que puede unirse a una citocina trimérica puede ser también un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En el presente contexto, el término “anticuerpo” se usa para describir una inmunoglobulina ya sea natural o producida de manera parcial o completamente sintética. Ya que los anticuerpos pueden modificarse de diversos modos, el término “anticuerpo” debe interpretarse como que cubre cualquier miembro de unión específico o sustancia que tiene un dominio de unión con la especificidad por citocina trimérica requerida. De ese modo, este término cubre fragmentos de anticuerpos, derivados, equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpos, incluyendo cualquier polipéptido que comprende un dominio de unión a inmunoglobulina, ya sea natural o completa o parcialmente sintética. Por tanto se incluyen moléculas quiméricas que comprenden un dominio de unión a inmunoglobulina, o equivalente, fusionado a otro polipéptido. El término también cubre cualquier polipéptido o proteína que tiene un dominio de unión que es, o es homólogo a, un dominio de unión a anticuerpo, por ejemplo simuladores de anticuerpo. Estos pueden derivarse de fuentes naturales, o pueden producirse de manera parcial o completamente sintética. Ejemplos de anticuerpos son los isotipos de inmunoglobulina y sus subclases isotípicas; fragmentos que comprenden un dominio de unión a antígeno tal como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; y diacuerpos.

El documento US 6.451.983 B2 describe anticuerpos para el factor de necrosis tumoral humano que, entre otras cosas, pueden neutralizar la actividad biológica de TNF. En particular, el documento US 6.451.983 B2 proporciona anticuerpos y fragmentos de los mismos que pueden unirse a TNF humano maduro (SEC ID N.º:80) dentro de ciertas regiones topográficas específicas. Por consiguiente, en realizaciones útiles de la presente invención, el miembro de unión específico es un anticuerpo o fragmento del mismo que puede unirse a TNF humano maduro (SEC ID N.º:80) en al menos una región seleccionada de las regiones que están constituidas por residuos de aminoácidos 1-18, 1-20, 1-26, 1-30, 12-22, 22-31, 22-40, 36-45, 49-97, 49-98 , 56-79, 58-65, 69-97, 70-87, 76-90, 96-105, 105-128, 108-128, 110-127, 115-125, 117-128, 132-157, 135-155, 136-153, 138-149, 141-153 y 146-157.

El documento US 6.451.983 B2 proporciona además anticuerpos monoclonales específicos que pueden ser útiles en la presente invención. Por consiguiente, el miembro de unión específico que puede unirse a TNF humano puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo seleccionado de MAb 1 (ECACC 89080301), MAb 21 (ECACC 90012432), MAb 25 (ECACC 89121401), MAb 32 (ECACC 89080302), MAb 37 (ECACC 89080303), MAb 42 (ECACC 89080304), MAb 47 (ECACC 89121402), MAb 53 (ECACC 90012433) y MAb 54 (ECACC 89083103), en los que ECACC se refiere a la Colección Europea de Cultivos de Células Animales.

Ejemplos adicionales de anticuerpos útiles incluyen el anticuerpo D2E7 humanizado según se da a conocer en el documento US 6.090.382 y el fragmento de anticuerpo humanizado CDP 870 según se da a conocer en el documento WO/00194585.

En realizaciones específicas, los miembros de unión específica de la presente invención pueden comprender análogos de anticuerpo o anticuerpos artificiales tales como por ejemplo una proteína que tiene la estructura de armazón proteínico de dominios similar a lectina de tipo C (CTLD) según se da a conocer en el documento WO/0248189. Tal como será evidente a partir de los siguientes ejemplos, análogos de anticuerpos de CTLD basados en tetranectina humanos útiles que pueden unirse a TNF pueden seleccionarse de TN3-2-B (SEC ID N.º:103), TN3-2-C (SEC ID N.º:104) y TN3-2-D (SEC ID N.º:105).

Un aspecto importante de la presente invención es que los monómeros del polipéptido trimérico, además del miembro de unión específico, comprende además un dominio de trimerización. En el presente contexto, la expresión “dominio de trimerización” es un péptido, una proteína o parte de una proteína que puede interaccionar con otros dominios de trimerización similares o idénticos. La interacción es del tipo que produce polipéptidos o proteínas triméricas. Una interacción de este tipo puede originarse mediante enlaces covalentes entre los componentes de los dominios de trimerización así como mediante fuerzas por puentes de hidrógeno, fuerzas hidrófobas, fuerzas de van der Waals y puentes salinos.

El dominio de trimerización se deriva de tetranectina, y puede comprender de manera más específica el elemento estructural de trimerización de tetranectina (denominado a continuación en el presente documento TTSE) que se describe en detalle en el documento WO 98/56906. La secuencia de aminoácidos de TTSE se muestra en SEC ID N.º:81. El efecto de trimerización de TTSE está provocado por una estructura de hélice enrollada que interacciona con la estructura de hélice enrollada de los otros dos TTSE para formar un trímero de triple hélice enrollada alfa helicoidal que es excepcionalmente estable incluso a temperaturas relativamente altas. El término TTSE pretende también abarcar variantes de un TTSE de un miembro que se produce de manera natural de la familia proteínas de tetranectina, variantes que se han modificado en la secuencia de aminoácidos sin afectar de manera adversa, hasta cualquier grado sustancial, a la capacidad del TTSE para formar trímeros de hélice enrollada alfa helicoidales. De ese modo, el polipéptido trimérico según la invención puede comprender un TTSE como dominio de trimerización, que comprende una secuencia que tiene al menos un 68% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de SEC ID N.º SEC ID N.º:81, tal como al menos un 75%, incluyendo al menos un 87%, tal como al menos un 92%. Según esto, el residuo de cisteína n.º 50 del TTSE (SEC ID N.º:81) puede estar mutado ventajosamente en serina, treonina, metionina o en cualquier otro residuo de aminoácido con el fin de evitar la formación de un puente disulfuro entre cadenas no deseado, que puede conducir a multimerización no deseada.

En otra realización, el dominio de trimerización de TTSE (SEC ID N.º:81) puede modificarse mediante (i) la incorporación de la secuencia de polihistidina y/o un sitio de escisión para el factor de coagulación sanguíneo Xa, (ii) sustitución de Cys 50 con Ser, e (iii) incluyendo una secuencia KGS C terminal.

Varios ejemplos de diferentes polipéptidos triméricos según la invención se proporcionan en los siguientes ejemplos, en los que se ha aplicado el dominio de trimerización de TTSE anterior. Estos incluyen entre otros las unidades de unión a TNF basadas en CTLD, TN-2-B (SEC ID N.º:106), TN-2-C (SEC ID N.º:108) y TN-2-D (SEC ID N.º:107), y el fragmento de TNFRII humano trimerizado AD1 D4-GSS-I10 (SEC ID N.º:109).

Según la invención, el miembro de unión específico puede unirse o bien al residuo de aminoácido N terminal o bien al C terminal del dominio de trimerización. Sin embargo, se prevé también que en ciertas realizaciones puede ser ventajoso enlazar un miembro de unión específico tanto al extremo N terminal como al extremo C terminal del dominio de trimerización del monómero, y por tanto proporcionar un polipéptido trimérico que comprende seis miembros de unión específica que puede unirse a una citocina trimérica.

Se apreciará que un ligador molecular flexible puede interponerse opcionalmente entre, y unirse covalentemente a, el miembro de unión específico y el dominio de trimerización. En ciertas realizaciones, el ligador es una secuencia polipeptídica de aproximadamente 1-20 residuos de aminoácidos. El ligador puede ser inferior a 10 aminoácidos, lo más preferentemente, 5, 4, 3, 2 ó 1. Puede ser en ciertos casos que 9, 8, 7 ó 6 aminoácidos sean adecuados. En realizaciones útiles el ligador es esencialmente no inmunogénico, no es propenso a la escisión proteolítica y no comprende residuos de aminoácidos que se saben que interaccionan con otros residuos (por ejemplo residuos de cisteína).

El polipéptido trimérico de la presente invención puede expresarse en cualquier sistema de expresión de proteínas convencional adecuado cultivando un huésped transformado con un vector que codifica el polipéptido trimérico en condiciones tales que se expresa el polipéptido trimérico. Preferentemente, el sistema de expresión es un sistema a partir del cual la proteína deseada puede aislarse fácilmente y replegarse in vitro. Como cuestión general, se prefieren sistemas de expresión procariotas ya que pueden obtenerse altos rendimientos de proteínas y están disponibles estrategias eficaces de purificación y replegamiento. De ese modo, se encuentra bien dentro las capacidades y criterio del experto, sin experimentación excesiva, elegir un sistema de expresión apropiado o favorito. De manera similar, una vez que se elige la secuencia de aminoácidos primaria para el polipéptido trimérico de la presente invención, un experto en la técnica puede diseñar fácilmente constructos de ADN recombinantes apropiados que codificaran las proteínas deseadas, teniendo en consideración factores tales como que el codón influye en el huésped elegido, la necesidad de secreción de secuencias de señal en el huésped, la introducción de sitios de escisión de proteinasa dentro de la secuencia señal y similares. Estos constructos de ADN recombinantes pueden insertarse en marco en cualquiera de varios vectores de expresión apropiados para el huésped elegido. La elección de un vector de expresión apropiado o favorito es de nuevo una cuestión que se encuentra bien dentro de la capacidad y criterio del experto en la técnica. Preferentemente, el vector de expresión incluirá un promotor fuerte para dirigir la expresión de los constructos recombinantes. Finalmente, el polipéptido trimérico puede aislarse usando procedimientos convencionales adecuados bien conocidos en la técnica, y puede someterse opcionalmente a procesamiento adicional tal como por ejemplo liofilización.

El polipéptido trimérico según la invención puede usarse para la preparación de una composición farmacéutica mediante cualquier procedimiento adecuado bien conocido en la técnica. La composición puede comprender por lo tanto, junto con el polipéptido trimérico, uno o más vehículos aceptables, y opcionalmente otros componentes terapéuticos. Los vehículos deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros componentes y no nocivos para el receptor del mismo. En general, los procedimientos para la preparación de composiciones farmacéuticas incluyen la etapa de asociar el principio activo y un vehículo.

La aplicación terapéutica de la presente invención comprende el tratamiento de una enfermedad o un trastorno en un animal, mediante administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido trimérico según la invención a un animal que necesita del mismo. Según se mencionó anteriormente, se sabe que las citocinas triméricas, y en particular citocinas triméricas de la superfamilia de ligandos del TNF, son polipéptidos pleiotrópicos que actúan como moléculas de transducción de señales intercelulares, entre otras cosas, controlando y coordinando las respuestas inmunitarias e inflamatorias. De ese modo, se apreciará que el polipéptido trimérico de la presente invención puede aplicarse para el tratamiento de una amplia gama de trastornos y enfermedades mediados por citocinas triméricas, incluyendo enfermedades inflamatorias, trastornos autoinmunitarios, trastornos inmunitarios, infecciones, tumores malignos y enfermedades neurodegenerativas. En una realización útil, la enfermedad es una patología mediada por factor de necrosis tumoral, tal como artritis reumatoide, psoriasis y enfermedad de Crohn.

El polipéptido trimérico de la presente invención puede administrarse directamente al animal mediante cualquier técnica adecuada, incluyendo por vía parenteral, y puede administrarse local o sistémicamente. La ruta específica de administración depende, por ejemplo, del historial médico del animal. Los ejemplos de la administración parenteral incluyen administración subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial e intraperitoneal.

Los animales que pueden tratarse potencialmente mediante la proteína de fusión trimérica incluyen en el presente documento mamíferos tales como un ser humano.

Finalmente, la presente invención proporciona un procedimiento de ensayo para detectar una citocina polipeptídica trimérica en una muestra que comprende (i) poner en contacto la muestra con un polipéptido trimérico según la invención, y (ii) detectar la unión del polipéptido trimérico con la citocina trimérica.

La invención se describirá ahora a modo de ilustración en los siguientes ejemplos no limitativos y figuras.

Descripción de las figuras

La figura 1 muestra la unión de una citocina trimérica dentro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral a un correspondiente receptor monomérico unido a la célula, que inicia el reclutamiento adicional de dos receptores de citocina más dando como resultado la formación de una unidad de señalización de citocina-receptor hexamérica.

La figura 2 muestra la unión de un agente de unión bivalente a una citocina trimérica dentro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNFSF), que forma un complejo 1:1 con la citocina trimérica. Cuando el agente de unión bivalente se une a la citocina de TNFSF trimérica, sólo dos de tres posibles sitios de unión a receptor están ocupados por la molécula de agente de unión bivalente y el tercer sitio de unión a receptor se deja abierto. Esto implica que el sitio de unión a receptor de citocina trimérica abierto puede asociarse con un receptor de citocina trimérica de superficie celular y de ese modo, debido a la alta concentración local de los receptores en la superficie celular, inicia el reclutamiento adicional de receptores triméricos y de ese modo la transducción de señal.

La figura 3 muestra un agente de unión para citocinas triméricas que puede formar un complejo 1:1 con una citocina trimérica y al mismo tiempo puede unirse de manera eficaz a los tres sitios de unión a receptor de la citocina trimérica, mediante lo cual ningún sitio de unión a receptor se deja abierto. El acoplamiento de la citocina a la superficie celular se bloquea y por tanto no se producirá ninguna transducción de señales.

La figura 4 muestra la inhibición de la citotoxicidad mediada por TNF alfa en un ensayo con la línea de células de fibroblastos murinas L929, a dos concentraciones diferentes fijadas de TNF alfa (1,0 ng/ml y 0,1 ng/ml) para el fragmento de receptor trimerizado D1D4GSSl10 Trip en diluciones de 10 veces.

Ejemplos

EJEMPLO 1

Diseño y construcción de plásmidos de expresión de E. coli trip y fagemidos para la producción de agentes de unión a citocina trimérica

Fagemidos

El fagemido, psktripB, se construyó mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Not I sktripB amplificado a partir del plásmido de expresión pTtripb con los cebadores oligonucleotídicos C-sfikpn-TRI (SEC ID N.º:1) y N-sfikpn-TRI (SEC ID N.º:2) en un vector precortado con Sfi I y Not I, pCANTAB 5E suministrado por Amersham Pharmacia Biotech (n.º de código 27-9401-01) usando procedimientos convencionales. La secuencia de nucleótidos de los insertos sktripB se proporciona como SEC ID N.º:3.

El fagemido, pskl10tripB, se construyó mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Not I skl10tripB amplificado a partir del plásmido de expresión pTtripb con los cebadores oligonucleotídicos C-sfikpn-TRI (SEC ID N.º:1) y N-sfikpn-l10TRI (SEC ID N.º:4) en un vector precortado con Sfi I y Not I, pCANTAB 5E suministrado por Amersham Pharmacia Biotech (n.º de código 27-9401-01) usando procedimientos convencionales. La secuencia de nucleótido de los insertos skl10tripB se proporciona como SEC ID N.º: 5.

Plásmidos de expresión

El plásmido de expresión pT7H6-bktripB se construyó mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamHI y Hind I bktripB, amplificado a partir del plásmido de expresión pTtripb con los cebadores oligonucleotídicos C-bamkpn-TRI (SEC ID N.º:6) y N-bamkpn-TRI (SEC ID N.º: 7), en el plásmido de expresión restringido con BamH I y Hind I, pT7H6, usando procedimientos convencionales. La secuencia de nucleótidos de bktripB se proporciona como SEC ID N.º:8.

El plásmido de expresión pT7H6-bkl10tripB se construyó mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Hind I bkl10tripB, amplificado a partir del plásmido de expresión pTtripb con los cebadores oligonucleotídicos C-bamkpn-TRI (SEC ID N.º: 6) y N-bamkpn-l10TRI (SEC ID N.º:9), en el plásmido de expresión restringido con BamH I y Hind I, pT7H6, usando procedimientos convencionales. La secuencia de nucleótidos de bkltripB se proporciona como SEC ID N.º:10.

Ejemplo 2

Diseño y construcción de un agente de unión a TNF trimérico usando fragmentos de TNFRII

Se usaron fragmentos y subunidades del receptor de TNF TNFRSF1B (TNFRII) para la construcción de agentes de unión a TNF triméricos basándose en el dominio de trimerización TripB derivado de tetranectina. El diseño y la clonación se esquematiza a continuación:

Clonación de fragmentos TNFRSF1B en vectores de fagemido

El vector de fagemido pD1 D2tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D1D2 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D1-rev (SEC ID N.º: 11) y D2kpn-fo (SEC ID N.º: 12)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, psktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D1D2, se proporciona como SEC ID N.º:13.

El vector de fagemido pD1 D2,1/6tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D1D1/6 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D1-rev (SEC ID N.º: 11) D1/6kpn-fo (SEC ID N.º: 14)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, psktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D1D2,1/6, se proporciona como SEC ID N.º:15.

El vector de fagemido pD1 D2,1/4tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D1D1/4 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D1-rev (SEC ID N.º: 11) y D1/4kpn-fo (SEC ID N.º: 16)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, psktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D1D2,1/4, se proporciona como SEC ID N.º:17.

El vector de fagemido pD1 D2,1/3tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D1D1/3 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D1-rev (SEC ID N.º: 11) y D1/3kpn-fo (SEC ID N.º: 18)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, psktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D1D2,1/3, se proporciona como SEC ID N.º:19.

El vector de fagemido pD1 D2, 1/2tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D1D1/2 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D1-rev (SEC ID N.º: 11) y D1/2kpn-fo (SEC ID N.º: 20)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, psktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D1D2,1/2, se proporciona como SEC ID N.º:21.

El vector de fagemido pD1 D4tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D1D4 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D1-rev (SEC ID N.º: 11) y D4kpn-fo (SEC ID N.º: 22)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, psktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D1D4, se proporciona como SEC ID N.º:23.

El vector de fagemido pD1 D2l10tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D1D2 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D1-rev (SEC ID N.º: 11) y D2kpn-fo (SEC ID N.º: 12)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, pskl10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D1D2, se proporciona como SEC ID N.º:13.

El vector de fagemido pD1D2, 1/6l10tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D1D1/6 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D1-rev (SEC ID N.º: 11) y D1/6kpn-fo (SEC ID N.º: 14)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, pskl10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D1D2, 1/6, se proporciona como SEC ID N.º:15.

El vector de fagemido pD1 D2,1/4l10tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D1D1/4 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D1-rev (SEC ID N.º: 11) y D1/4kpn-fo (SEC ID N.º: 16)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, pskl10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D1D2,1/4, se proporciona como SEC ID N.º:17.

El vector de fagemido pD1D2,1/3l10tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D1D1/3 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D1-rev: (SEC ID N.º: 11) y D1/3kpn-fo (SEC ID N.º: 18)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, pskl10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D1D2,1/4, se proporciona como SEC ID N.º:19.

El vector de fagemido pD1 D2,1/2/10tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D1D1/2 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D1-rev (SEC ID N.º: 11) y D1/2kpn-fo (SEC ID N.º: 20)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, pskl10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D1D2,1/2, se proporciona como SEC ID N.º:21.

El vector de fagemido pD1 D4I10tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D1D4 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D1-rev (SEC ID N.º: 11) y D4kpn-fo (SEC ID N.º: 22)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, psk110tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D1D4, se proporciona como SEC ID N.º:23.

El vector de fagemido pD2tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D2 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D2-rev (SEC ID N.º: 24) y D2kpn-fo (SEC ID N.º: 12)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, psktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D2, se proporciona como SEC ID N.º:25.

El vector de fagemido pD2,1/6tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D1/6 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D2-rev (SEC ID N.º: 24) y D1/6kpn-fo (SEC ID N.º: 14)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, psktripB, usando procedimientos convencionales, Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D2,1/6, se proporciona como SEC ID N.º:26.

El vector de fagemido pD2,1/4tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D1/4 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D2-rev (SEC ID N.º: 24) y D1/4kpn-fo (SEC ID N.º: 16)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, psktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D2,1/4, se proporciona como SEC ID N.º:27.

El vector de fagemido pD2,1/3tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D1/3 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D2-rev (SEC ID N.º: 24) y D1/3kpn-fo (SEC ID N.º: 18)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, psktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D2,1/3, se proporciona como SEC ID N.º:28.

El vector de fagemido pD21/2tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D1/2 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D2-rev (SEC ID N.º: 24) y DI/2kpn-fo (SEC ID N.º: 20)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, psktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D2,1/2, se proporciona como SEC ID N.º:29.

El vector de fagemido pD2D4tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D2D4 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D2-rev (SEC ID N.º: 24) y D4kpn-fo (SEC ID N.º: 22)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, psktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D2D4, se proporciona como SEC ID N.º:30.

El vector de fagemido pD2110tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D2 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D2-rev (SEC ID N.º: 24) y D2kpn-fo (SEC ID N.º: 12)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, pskl10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D2, se proporciona como SEC ID N.º:25.

El vector de fagemido pD2,1/6I10tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D1/6 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D2-rev (SEC ID N.º: 24) y D1/6kpn-fo (SEC ID N.º: 14)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, pskI10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D2,1/6, se proporciona como SEC ID N.º:26.

El vector de fagemido pD2,1/4I10tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D1/4 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D2-rev (SEC ID N.º: 24) y D1/4kpn-fo (SEC ID N.º: 16)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, pskl10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D2,1/4, se proporciona como SEC ID N.º:27.

El vector de fagemido pD2,1/3110tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D1/3 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D2-rev (SEC ID N.º: 24) y D1/3kpn-fo (SEC ID N.º: 18)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, pskl10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D2,1/3, se proporciona como SEC ID N.º:28.

El vector de fagemido pD2,1/2I10tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D1/2 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D2-rev (SEC ID N.º: 24) y D1/2kpn-fo (SEC ID N.º: 20)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, pskl10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D2.1/2, se proporciona como SEC ID N.º:29.

El vector de fagemido pD2D4I10tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I D2D4 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos D2-rev (SEC ID N.º: 24) y D4kpn-fo (SEC ID N.º: 22)) en el vector cortado con Sfi I y Kpn I, pskl10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de D2D4, se proporciona como SEC ID N.º:30.

Clonación de fragmentos de receptor TNFRSF1B (TNFRII) en vectores de expresión

El vector de expresión pT7H6FXD1 D2tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I FXD1 D2 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamD1-rev (SEC ID N.º: 31) y D2kpn-fo (SEC ID N.º: 12)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, PT7H6-bktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD1 D2, se proporciona como SEC ID N.º:32.

El vector de expresión pT7H6FXD1D2,1/6tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I FXD1 D1/6 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamD1-rev (SEC ID N.º: 31) y D1/6kpn-fo (SEC ID N.º: 14)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, PT7H6-bktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD1D2,1/6, se proporciona como SEC ID N.º:33.

El vector de expresión pT7H6FXD1 D2,1/4tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I FXD1 D1/4 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamD1-rev (SEC ID N.º: 31) y D1/4kpn-fo (SEC ID N.º: 16)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, PT7H6bktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD1 D2,1/4, se proporciona como SEC ID N.º:34.

El vector de expresión pT7H6FXD1 D2,1/3tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I FXD1 D1/3 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamD1-rev (SEC ID N.º: 31) y D1/3kpn-fo (SEC ID N.º: 18)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, pT7H6bktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD1 D2,1/3, se proporciona como SEC ID N.º:35.

El vector de expresión pT7H6FXD1 D2,1/2tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I FXD1 D1/2 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamD1-rev (SEC ID N.º: 31) y D1/2kpn-fo (SEC ID N.º: 20)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, pT7H6bktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD1 D2,1/2, se proporciona como SEC ID N.º:36.

El vector de expresión pT7H6FXD1 D4tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I FXD1 D4 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamD1-rev (SEC ID N.º: 31) y D4kpnfo (SEC ID N.º: 22)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, pT7H6-bkI10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD1 D4, se proporciona como SEC ID N.º:37.

El vector de expresión pT7H6FXD2tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I FXD2 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamD2-rev (SEC ID N.º: 38) y D2kpn-fo (SEC ID N.º: 12)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, PT7H6-bktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD2, se proporciona como SEC ID N.º:39.

El vector de expresión pT7H6FXD2,1/6tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I FXD1/6 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamD2-rev (SEC ID N.º: 38) bamD2-rev (SEC ID N.º: 38) y D1/6kpn-fo (SEC ID N.º: 14)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, PT7H6-bktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD2,1/6, se proporciona como SEC ID N.º:40.

El vector de expresión pT7H6FXD2,1/4tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I FXD1D1/4 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamD2-rev (SEC ID N.º: 38) y D1/4kpn-fo (SEC ID N.º: 16)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, PT7H6-bktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD2,1/4, se proporciona como SEC ID N.º:41.

El vector de expresión pT7H6FXD2,1/3tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I FXD1D1/3 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamD2-rev (SEC ID N.º: 38) y D1/3kpn-fo (SEC ID N.º: 18)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, pT7H6-bktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD2,1/3, se proporciona como SEC ID N.º:42.

El vector de expresión pT7H6FXD2,1/2tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I FXD1/2 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamD2-rev (SEC ID N.º: 38) y D1/2kpn-fo (SEC ID N.º: 20)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, pT7H6-bktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD2,1/2, se proporciona como SEC ID N.º:43.

El vector de expresión pT7H6FXD2D4tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I FXD2D4 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamD2-rev (SEC ID N.º: 38) y D4kpn-fo (SEC ID N.º: 22)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, pT7H6-bktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD2D4, se proporciona como SEC ID N.º:44.

El vector de expresión pT7H6FXD1D2I10tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I FXD1 D2 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamD1-rev (SEC ID N.º: 31) y D2kpn-fo (SEC ID N.º: 12)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, PT7H6-bkI10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD1 D2, se proporciona como SEC ID N.º:32.

El vector de expresión pT7H6FXD1 D2,1/6I10tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I FXD1 D1/6 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamD1-rev (SEC ID N.º: 31) y D1/6kpn-fo (SEC ID N.º: 14)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, PT7H6bkl10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD1D2,1/6, se proporciona como SEC ID N.º:33.

El vector de expresión pT7H6FXD1 D2.1/4I10tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I FXD1 D1/4 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamD1-rev (SEC ID N.º: 31) y D1/4kpn-fo (SEC ID N.º: 16)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, PT7H6bkl10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD1 D2,1/4, se proporciona como SEC ID N.º:34.

El vector de expresión pT7H6FXD1 D2,1/13I10tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I FXD1 D1/3 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamD1-rev (SEC ID N.º: 31) y D1/3kpn-fo (SEC ID N.º: 18)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, pT7H6-bkl10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD1 D2,1/3, se proporciona como SEC ID N.º:35.

El vector de expresión pT7H6FXD1 D2,1/2I10tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I FXD1 D1/2 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamD1-rev (SEC ID N.º: 31) y D1/2kpn-fo (SEC ID N.º: 20)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, pT7H6bkl10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD1D2,1/2, se proporciona como SEC ID N.º:36.

El vector de expresión pT7H6FXD1 D4I10tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I FXD1 D4 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamD1-rev (SEC ID N.º: 31) y D4kpn-fo (SEC ID N.º: 22)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, pT7H6-bkl10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD1 D4, se proporciona como SEC ID N.º:37.

El vector de expresión pT7H6FXD2I1 OtripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I FXD2 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamD2-rev (SEC ID N.º: 38) y D2kpn-fo (SEC ID N.º: 12)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, PT7H6-bkI10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD2, se proporciona como SEC ID N.º:39.

El vector de expresión pT7H6FXD2,1/6I10tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I FXD1/6 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamD2-rev (SEC ID N.º: 38) y D1/6kpn-fo (SEC ID N.º: 14)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, PT7H6-bkl10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD2,1/6, se proporciona como SEC ID N.º:40.

El vector de expresión pT7H6FXD2,1/4I10tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I FXD1 D1/4 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamD2-rev (SEC ID N.º: 38) y D1/4kpn-fo (SEC ID N.º: 16)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, PT7H6-bkI10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD2,1/4, se proporciona como SEC ID N.º:41.

El vector de expresión pT7H6FXD2,1/3I10tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I FXD1 D1/3 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1 (con los cebadores oligonucleotídicos bamD2-rev (SEC ID N.º: 38) y D1/3kpn-fo (SEC ID N.º: 18)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, pT7H6-bkI10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD2,1/3, se proporciona como SEC ID N.º:42.

El vector de expresión pT7H6FXD2,1/2I10tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I FXD1/2 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamD2-rev (SEC ID N.º: 38) y D1/2kpn-fo (SEC ID N.º: 20)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, pT7H6-bkI10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD2,1/2, se proporciona como SEC ID N.º:43.

El vector de expresión pT7H6FXD2D4I10tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Sfi I y Kpn I FXD2D4 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamD2-rev (SEC ID N.º: 38) y D4kpn-fo (SEC ID N.º: 22)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, pT7H6-bkl10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXD2D4, se proporciona como SEC ID N.º:44.

El vector de expresión pT7AD1 D4-l162-tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I AD1 D4-I162 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos pBamHl-A5 (SEC ID N.º:82) y pKpnl-I162 (SEC ID N.º:83) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, pT7-bktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante AD1 D4-I162-tripB, se proporciona como SEC ID N.º:84.

El vector de expresión pT7AD1 D4-GSS-tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I AD1 D4-GSS amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos pBamHI-A5 (SEC ID N.º:82) y pKpnl-GSS (SEC ID N.º:85) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, pT7-bktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante AD1 D4-GSS-tripB, se proporciona como SEC ID N.º:86.

El vector de expresión pT7AD1 D4-D235-tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I AD1 D4-D235 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos pBamHl-A5 (SEC ID N.º:82) y pKpnl-D235 (SEC ID N.º:87) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, pT7-bktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante AD1 D4-D235-tripB, se proporciona como SEC ID N.º:88.

El vector de expresión pT7AD1D4-I162-I10-tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I AD1 D4-I162 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos pBamHl-A5 (SEC ID N.º:82) y pKpnl-I162 (SEC ID N.º:83) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, PT7-bkl10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante AD1D4-I162-I10tripB, se proporciona como SEC ID N.º:89.

El vector de expresión pT7AD1D4-GSS-I10-tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I AD1 D4-GSS amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos pBamHl-A5 (SEC ID N.º:83) y pKpnl-GSS (SEC ID N.º:85) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, PT7-bkl10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante AD1D4-GSS-110tripB se proporciona como SEC ID N.º:90.

El vector de expresión pT7AD1 D4-D235-I10-tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I AD1 D4-D235 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos pBamHl-A5 (SEC ID N.º:83) y pKpnl-D235 (SEC ID N.º:87) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, PT7-bkI10tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante AD1D4-D235-I10tripB, se proporciona como SEC ID N.º:91.

El vector de expresión pT7AD1D4-GSS-V17-tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Kpn I y Hind III V17-TripB amplificado a partir de ADNc (con los cebadores oligonucleotídicos pKpnl-V17 (SEC ID N.º:92) y pBAD6H (SEC ID N.º:93) en un vector cortado con Kpn I y Hind III, pT7AD1 D4-GSS-tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante AD1 D4-GSS-V17-tripB, se proporciona como SEC ID N.º:94.

El vector de expresión pT7AD1D4-D235-V17-tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Kpn I y Hind III V17-TripB amplificado a partir de ADNc (con los cebadores oligonucleotídicos pKpnl-V17 (SEC ID N.º:92) y pBAD6H (SEC ID N.º:93) en un vector cortado con Kpn I y Hind III, pT7AD1D4-D235-tripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante AD1 D4-D235-V17-tripB, se proporciona como SEC ID N.º:95.

Ejemplo 3

Producción, replegamiento y purificación del fragmento de TNFRII trimerizado AD1D4-GSS-I10-TripB

La construcción del plásmido de expresión dependiente de la ARN polimerasa T7, pT7D1 D4GSSI10 (que expresa el derivado de TNFRII AD1 D4-GSS-I10-TripB) se describe anteriormente en el ejemplo 2.

Se produjo el fragmento de TNFRII humano trimerizado AD1 D4-GSS-I10 (SEC ID N.º:109) haciendo crecer y expresando el plásmido pT7AD1 D4-GSS-110 en células BL21 de E. coli en una escala media (6 x 1 litro) según se describe por Studier y Moffat, J. Mol. Biol., 189: 113-130, 1986. Brevemente, se infectaron a DO600 0,8 cultivos de crecimiento exponencial a 37ºC con bacteriófago λ-CE6 a una multiplicidad de aproximadamente 5. Se hicieron crecer cultivos a 37ºC durante otras tres horas antes de que se recogieran las células mediante centrifugación. Se lisaron las células mediante choque osmótico y sonicación y se extrajo la proteína celular total en fenol (ajustado a pH 8 con base Trisma). Se hizo precipitar la proteína desde la fase de fenol mediante la adición de 2,5 volúmenes de etanol y centrifugación. Se disolvió el sedimento de proteína en un tampón que contenía cloruro de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM pH 8 y ditioeritriol 50 mM. Tras la filtración en gel en Sephadex G-25 (Amersham Biosciences) en urea 8 M, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y 2-mercaptoetanol 5 mM se aplicó la preparación de proteínas bruta a columnas de NTA-agarosa (Qiagen, Alemania) activada con Ni2+ para la purificación (Hochuli et al., 1988) de las proteínas de fusión y, mientras estaban inmovilizadas en la columna, para someterlas al procedimiento de plegamiento cíclico según se describió anteriormente en el documento WO 94/18227.

Se desgasificaron todos los tampones preparados para la cromatografía de líquidos a vacío antes de la adición del agente reductor y/o su uso.

Tras la aplicación de los extractos de proteína brutos en la columna de Ni2+NTA-agarosa, se purificó la proteína de fusión, AD1D4-GSS-I10, de la mayoría de proteínas de coli y fago λ mediante lavado con un volumen de columna del tampón de carga seguido de cloruro de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM y 2-mercaptoetanol 5 mM hasta que la densidad óptica (DO) a 280 nm del eluido de la columna era estable.

Se replegaron las proteínas de fusión en la columna de Ni2+NTA-agarosa usando un perfil de control de gradiente según se describe en la tabla 1 y NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8 y glutatión reducido/oxidado 2 mM/0,2 mM como tampón A y urea 8 M, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8 y glutatión reducido 3 mM como tampón B.

Tras completar el procedimiento de plegamiento cíclico se eluyó la proteína de fusión AD1 D4-GSS-I10 de las columnas de Ni2+NTA-agarosa con un tampón que contenía urea 8 M, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM y EDTA 10 mM pH 8.

Se purificaron las proteínas de fusión AD1 D4-GSS-I10 monoméricas de dímeros y multímeros de orden superior

mediante cromatografía de intercambio iónico en S-y Q-Sepharose (Amersham Biosciences): se filtró en gel la

proteína de fusión, eluida mediante el tampón de elución (aproximadamente un 80 % del material de proteínas de

fusión), en un tampón que contenía urea 8 M, Tris-HCl 10 mM pH 8,0 y NaCl 25 mM en Sephadex G-25 y se aplicó

5 en la columna de intercambio iónico S-Sepharose. La proteína no unida en las fracciones “que atraviesan” se

cargaron directamente en la columna Q-Sepharose. Se eluyeron proteínas de fusión AD1 D4-GSS-I10 monoméricas

desde la columna Q-Sepharose con un gradiente lineal desde urea 8 M, NaCl 25 mM, Tris-HCl 10 mM pH 8 hasta

urea 8 M, NaCl 300 mM, Tris-HCl 10 mM pH 8 con respecto a volúmenes de 10 columnas. La proteína de fusión

AD1D4-GSS-I10 monomérica eluyó al comienzo del gradiente, mientras que dímeros y multímeros de orden superior 10 eluyeron más tarde. Se renaturalizaron fracciones que contenían la proteína de fusión monomérica y se trimerizaron

mediante filtración en gel en un tampón que contenía HEPES 10 mM pH 7,4 y NaCl 125 mM.

TABLA 3: Perfil de control de gradiente de tampón (cont.) (cont.)

Etapa: Tiempo (min,) Flujo (ml/min,) Bomba A (%) Bomba B (%)

1: 0,0 2,00 100,0 0,0

2: 45,0 2,00 100,0 0,0

3: 46,0 2,00 0,0 100,0

4: 52,0 2,00 0,0 100,0

5: 60,0 2,00 100,0 0,0

6: 105,0 2,00 100,0 0,0

7: 106,0 2,00 4,0 96,0

8: 113,0 2,00 4,0 96,0

9: 120,0 2,00 100,0 0,0

10: 165,0 2,00 100,0 0,0

11: 166,0 2,00 6,0 94,0

12: 172,0 2,00 6,0 94,0

13: 180,0 2,00 100,0 0,0

14: 225,0 2,00 100,0 0,0

15: 226,0 2,00 8,0 92,0

16: 232,0 2,00 8,0 92,0

17: 240,0 2,00 100,0 0,0

18: 285,0 2,00 100,0 0,0

19: 286,0 2,00 10,0 90,0

20: 292,0 2,00 10,0 90,0

21: 300,0 2,00 100,0 0,0

22: 345,0 2,00 100,0 0,0

23: 346,0 2,00 12,0 88,0

24: 352,0 2,00 12,0 88,0

25: 360,0 2,00 100,0 0,0

26: 405,0 2,00 100,0 0,0

27: 406,0 2,00 14,0 86,0

Etapa: Tiempo (min,) Flujo (ml/min,) Bomba A (%) Bomba B (%)

28: 412,0 2,00 14,0 86,0

29: 420,0 2,00 100,0 0,0

30: 465,0 2,00 100,0 0,0

31: 466,0 2,00 16,0 84,0

32: 472,0 2,00 16,0 84,0

33: 480,0 2,00 100,0 0,0

34: 525,0 2,00 100,0 0,0

35: 526,0 2,00 18,0 82,0

36: 532,0 2,00 18,0 82,0

37: 540,0 2,00 100,0 0,0

38: 585,0 2,00 100,0 0,0

39: 586,0 2,00 20,0 80,0

40: 592,0 2,00 20,0 80,0

41: 600,0 2,00 100,0 0,0

42: 645,0 2,00 100,0 0,0

43: 646,0 2,00 22,0 78,0

44: 652,0 2,00 22,0 78,0

45: 660,0 2,00 100,0 0,0

46: 705,0 2,00 100,0 0,0

47: 706,0 2,00 24,0 76,0

48: 713,0 2,00 24,0 76,0

49: 720,0 2,00 100,0 0,0

50: 765,0 2,00 100,0 0,0

51: 766,0 2,00 25,0 75,0

52: 772,0 2,00 25,0 75,0

53: 780,0 2,00 100,0 0,0

54: 825,0 2,00 100,0 0,0

55: 826,0 2,00 25,0 75,0

56: 832,0 2,00 25,0 75,0

57: 840,0 2,00 100,0 0,0

58: 885,0 2,00 100,0 0,0

59: 886,0 2,00 25,0 75,0

60: 892,0 2,00 25,0 75,0

Etapa: Tiempo (min,) Flujo (ml/min,) Bomba A (%) Bomba B (%)

61: 900,0 2,00 100,0 0,0

62: 945,0 2,00 100,0 0,0

63: 946,0 2,00 25,0 75,0

64: 952,0 2,00 25,0 75,0

65: 960,0 2,00 100,0 0,0

66: 1005,0 2,00 100,0 0,0

67: 1006,0 2,00 30,0 70,0

68: 1012,0 2,00 30,0 70,0

69: 1020,0 2,00 100,0 0,0

70: 1065,0 2,00 100,0 0,0

71: 1066,0 2,00 30,0 70,0

72: 1072,0 2,00 30,0 70,0

73: 1080,0 2,00 100,0 0,0

74: 1125,0 2,00 100,0 0,0

75: 1126,0 2,00 35,0 65,0

76: 1132,0 2,00 35,0 65,0

77: 1140,0 2,00 100,0 0,0

78: 1185,0 2,00 100,0 0,0

79: 1186,0 2,00 40,0 60,0

80: 1192,0 2,00 40,0 60,0

81: 1200,0 2,00 100,0 0,0

82: 1245,0 2,00 100,0 0,0

83: 1246,0 2,00 50,0 50,0

84: 1252,0 2,00 50,0 50,0

85: 1260,0 2,00 100,0 0,0

86: 1305,0 2,00 100,0 0,0

87: 1306,0 2,00 60,0 40,0

88: 1312,0 2,00 60,0 40,0

89: 1319,0 2,00 100,0 0,0

90: 1364,0 2,00 100,0 0,0

91: 1365,0 2,00 60,0 40,0

92: 1371,0 2,00 60,0 40,0

93: 1378,0 2,00 100,0 0,0

94: 1423,0 2,00 100,0 0,0

Ejemplo 4

Actividad biológica del fragmento de TNFRII trimerizado AD1D4-GSS-I10

Se midió la actividad biológica del fragmento de TNFRII trimerizado AD1D4-GSS-I10 (producido según se describió en el ejemplo 3) en un ensayo de células L929 para determinar la inhibición de la citotoxicidad mediada por TNF alfa.

La línea de células de fibroblastos murinos L929 (ECACC n.º: 85011425) se usó para medir la citotoxicidad mediada por TNF alfa. Se mantuvieron las células en medio líquido RPMI 1640 (Biowhittaker, R.U.) complementado con FBS al 10% y antibióticos (penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 µg/ml). Se colocaron en placas las células en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos (NUNC, Roskilde, Dinamarca) a 3 x 105 células/ml y 75 µl/pocillo de medio RPMI 1640 completo y se cultivaron durante la noche a 37ºC en CO2 al 5%. Se incubó TNF alfa humano recombinante (rhTNFa, RD Systems, R.U.) (1 ng/ml y 0,1 ng/ml) con diversas concentraciones (diluciones de 10 veces) del fragmento de receptor trimerizado (AD1D4-GSS-l10) en medio RPMI 1640 completo complementado con 2 µg/ml de actinomicina D (Sigma) durante 1 h a 37ºC en CO2 al 5%. A continuación, se añadieron 75 µl/pocillo de las mezclas TNF-alfa/fragmento de receptor trimerizado al cultivo celular para la incubación durante la noche a 37ºC en CO2 al 5%. Se sometió a prueba por triplicado cada concentración de la mezcla TNF-alfa/fragmento de receptor. Se determinó la proliferación celular usando MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-di-fenil-tetrazolio) como parte del kit de ensayo de la proliferación celular no radiactivo CellTiter 96 (Promega). Para la preparación de reactivos suficientes para una placa de 96 pocillos que contiene células cultivadas en un volumen de 150 µl, se añadieron 3,0 ml de disolución de MTS a 150 µl de PMS. Se añadieron 30 µl/pocillo de la disolución de MTS/PMS combinada y se incubaron las placas durante 1-4 h a 37ºC en CO2 al 5% antes de registrar la absorbancia a 492 nm usando un lector de placas ELISA. Se incluyeron también en cada ensayo controles de TNF alfa con las células, células solas y control de tampón.

El resultado del experimento se resume en la figura 4. El efecto citotóxico de TNF alfa se inhibió significativamente en presencia de la concentración máxima de AD1 D4-GSS-110 demostrando de ese modo la actividad biológica del compuesto.

Ejemplo 5

Diseño, construcción y producción de un agente de unión a TNF trimérico usando fragmentos de anticuerpo D2E7.

Se selecciona como agente de unión fragmentos de región variable de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) del anticuerpo humanizado D2E7 en la construcción de un polipéptido trimérico que puede unirse a TNF. El agente de unión trimérico puede construirse amplificando los dominios VH y VL de D2E7, basándose en la secuencia dada a conocer en el documento US 6.090.382.

Diseño y construcción de scFv de D2E7 trimérico con un ligador de Gly, Thr entre scFv N terminal y dominio de trimerización C terminal

El vector de expresión pT7H6FXD2E7tripB se construye en dos etapas. La primera etapa es la construcción de pT7H6FX (D2E7VH)tripB. Este vector se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Bgl II y Kpn I FX (D7E2VH) amplificado a partir de ADN que contiene la secuencia de D2E7 (con los cebadores oligonucleotídicos FXVH (SEC ID N.º: 45) y VHBamKpn (SEC ID N.º: 46)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, pT7H6bktripB. La segunda etapa es la construcción de pT7H6FXD2E7tripB mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I G4SVL amplificado a partir de ADN que contiene la secuencia de D2E7 (con los cebadores oligonucleotídicos G4SVL (SEC ID N.º: 47) y VLkpn (SEC ID N.º: 48)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, pT7H6FX(D2E7VH)tripB. La secuencia de nucleótidos de FXD2E7, se proporciona como SEC ID N.º:49.

Diseño y construcción de scFv de D2E7 trimérico con un ligador de Gly, Gly, Gly, Gly, Ser, Gly, Thr entre scFv N terminal y dominio de trimerización C terminal

El vector de expresión pT7H6FXD2E7G4StripB se construye en dos etapas. La primera etapa es la construcción de pT7H6FX(D2E7VH)tripB mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Bgl II y Kpn I FX(D7E2VH) amplificado a partir de ADN que contiene la secuencia de D2E7 (con los cebadores oligonucleotídicos FXVH (SEC ID N.º: 45) y VHBamKpn (SEC ID N.º: 46)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, pT7H6bktripB. La segunda etapa es la construcción de pT7H6FXD2E7tripB mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I G4SVL amplificado a partir de ADN que contiene la secuencia de D2E7 (con los cebadores oligonucleotídicos G4SVL (SEC ID N.º: 47) y VLG4Skpn (SEC ID N.º: 50)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, pT7H6FX(D2E7VH)tripB. La secuencia de nucleótidos resultante de FXD2E7G4S, se proporciona como SEC ID N.º:51.

Diseño y construcción de scFv de D2E7 trimérico con ligador de Gly, Ser entre el dominio de trimerización N terminal y el scFv C terminal

El vector de expresión pT76HFXTripAGSD2E7 se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Bcl I y Hind III, amplificado a partir de pT7H6FXD2E7G4StripB (con los cebadores oligonucleotídicos bclVH (SEC ID N.º:52) y VLhind (SEC ID: 53)) en un vector cortado con BamH I y Hind III, pT76HFXtripa (Lorentsen, RH. et al, Biochem J.;347:83-87, 2000) usando procedimientos convencionales. La secuencia de nucleótidos resultante de GSD2E7, se proporciona como SEC ID N.º:54.

Diseño y construcción de scFv de D2E7 trimérico con ligador de Gly, Ser, Gly, Gly, Gly, Gly, Ser entre el dominio de trimerización N terminal y el scFv C terminal

El vector de expresión pT76HFXTripAG4SD2E7 se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Bcl I y Hind III, amplificado a partir de pT7H6FXD2E7G4StripB (con los cebadores oligonucleotídicos bclG4SVH (SEC ID N.º:55) y VLhind (SEC ID: 53)) en un vector cortado con BamH I y Hind III, pT76HFXtripa (Lorentsen, RH. et al, Biochem J.;347: 83-87, 2000) usando procedimientos convencionales. La secuencia de nucleótidos resultante de G4SD2E7, se proporciona como SEC ID N.º:56.

Para preparar las proteínas de fusión anteriores H6FXD2E7tripB, H6FXD2E7G4StripB, H6FXTripAD2D7TripA y H6FxTripAG4SD2E7, se hacen crecer los plásmidos pT7H6FXD2E7tripB, pT7H6FXD2E7G4StripB, pT7H6FXTripAD2D7TripA y pT7H6FxTripAG4SD2E7 a escala pequeña (1 litro; 2x medio TY, MgSO4 5 mM y 100 4 g de ampicilina) en células BL21 de E. coli, según se describe por Studier et al. (1990). Se infectan a DE600 0,8 cultivos de crecimiento exponencial a 37ºC con bacteriófago lambda CE6 a una multiplicidad de aproximadamente 5. Se hacen crecer los cultivos a 37ºC durante otras tres horas y las células se recogen mediante centrifugación. Se resuspenden las células en 50 ml de NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8 y EDTA 1 mM pH 8. Se añadió fenol (50 ml ajustado a pH 8) a cada una y las mezclas se someten a sonicación para extraer la proteína total. Tras la clarificación mediante centrifugación (25 minutos a 10,000 g) se hacen precipitar las fracciones de proteína bruta desde las fases de fenol mediante la adición de 2,5 volúmenes de etanol y centrifugación. Se disuelven los sedimentos de proteínas en un tampón (15-25 ml) que contiene cloruro de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM pH 8 y ditioeritriol 0,1 M. Tras la filtración en gel en Sephadex G-25 (Pharmacia, Suecia) en urea 8 M, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM pH 8 y 2-mercaptoetanol 10 mM, se aplican las preparaciones de proteína bruta a columnas de NTA-agarosa activada con Ni (volumen de columna de 75 ml) para la purificación (Hochuli et al., 1988). Entonces se hace fluir el tampón de lavado (HCl de guanidina 6 M, Tris-HCl 50 mM pH 8 y 2-mercaptoetanol 10 mM) a través de las columnas hasta que se obtienen niveles iniciales estables.

Entonces se eluyen las proteínas de fusión prácticamente puras aplicando un gradiente de pH a cada columna (1000 ml de gradiente in urea 8 M y 2-mercaptoetanol 10 mM obtenido mediante mezclado lineal (por volumen) de disoluciones que contienen dihidrogenofosfato de sodio 50 mM (tampón de pH 5) y hidrogenofosfato de disodio 50 mM (tampón de pH 8).

En la preparación para el replegamiento in vitro mediante el procedimiento de Thøgersen et al. (documento WO 94/18227) se mezclan 20 mg de cada proteína de fusión purificada en suspensiones en “tampón B” de replegamiento (descrito a continuación) con alícuotas de suspensiones de matriz de NTA-agarosa activada con Ni2+ suficientes para generar columnas de aproximadamente 75 ml de volumen de lecho empaquetado. Cada proteína de fusión se somete entonces al procedimiento de replegamiento iterativo según se describe para el plasminógeno kringle 4 en el documento WO 94/18227, excepto que el replegamiento de las proteínas de fusión que contienen scFv se lleva a cabo a 10ºC usando un tampón que contiene NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, glutatión 2 mM y glutatión oxidado 0,2 mM como “tampón A” y un tampón que contiene urea 8 M, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM pH 8 y glutatión 2 mM como “tampón B”.

Tras completar el procedimiento de replegamiento se lava cada columna con 300 ml de tampón que contiene NaCl 0,5 M y Tris-HCl 50 mM pH 8 para separar por lavado el glutatión. La fracción replegada de cada proteína se eluye entonces desde la NTA-agarosa en EDTA 20 mM, NaCl 0,5 M y Tris-HCl 50 mM pH 8 hasta el tampón de elución. Tras la adición de urea sólida para alcanzar una concentración final de aproximadamente 8 M para cada muestra de proteínas y la dilución o diálisis para reducir las concentraciones de NaCl hasta por debajo de 5 mM, se realiza entonces la purificación final de cada producto de proteína de fusión plegada correctamente mediante cromatografía de intercambio iónico (S-Sepharose, Pharmacia, columna de 1,6 (diámetro interno) por 90 centímetros en un tampón que contiene urea 8 M, Tris-HCl 5 mM (de una disolución de reserva 1 M a pH 8) y acetato de sodio 25 mM (de una disolución de reserva 1 M a pH 5), eluida a 2 ml/min.). Tras diálisis frente a tampones acuosos (por ejemplo solución salina tamponada con fosfato) cada proteína de fusión pura y plegada correctamente se recupera en rendimientos de 2-6 mg por litro de cultivo que se ha hecho crecer.

Ejemplo 6

Diseño y construcción de un agente de unión a APRIL trimérico usando fragmentos de receptor TNFRSF13B

El receptor de APRIL, TNFRSF13B, se usa para la construcción de agentes de unión triméricos frente a la citocina trimérica APRIL, y basándose en el dominio de trimerización TripB derivado de tetranectina. El diseño y la clonación de tales agentes de unión con diferentes ligadores se esquematiza a continuación:

Clonación de TNFRSF13B6 El vector de expresión pT7H6FXTNFRS13B6tripB se construye en dos etapas. La primera etapa es construir pT7H6FX?TNFSF13B mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Bgl II y Kpn I FX?TNFRSF13B amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bgliiFX?TNFRSF13B (SEC ID N.º: 57) y ?TNFRSF13Bkpn: (SEC ID N.º: 58)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, pT7H6-bktripB, usando procedimientos convencionales. La segunda etapa es construir el vector de expresión final pT7H6FXTNFRSF13B6tripB mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Kpn I, ?TNFRSF13B6 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos kpn?TNFSF13B (SEC ID N.º: 59) y ?TNFSF13B6kpn (SEC ID N.º: 60)) en un vector cortado con Kpn I, pT7H6FX?TNFSF13B, usando procedimientos convencionales. La secuencia de nucleótidos resultante de FXTNFRSF13B6, se proporciona como SEC ID N.º:61.

Clonación de TNFRSF13B10

El vector de expresión pT7H6FXTNFRS13B10tripB se construye en dos etapas. La primera etapa es construir pT7H6FX?TNFRSF13B mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Bgl II y Kpn I FX?TNFRSF13B amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bgliiFX?TNFRSF138 (SEC ID N.º: 57) y ?TNFRSF13Bkpn (SEC ID N.º: 58)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, PT7H6-bktripB, usando procedimientos convencionales. La segunda etapa es construir el vector de expresión final pT7H6FXTNFRSF13B10tripB mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Kpn I, ?TNFSF13B10 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos kpn?TNFSF13B (SEC ID N.º: 59) y ?TNFSF13B10kpn (SEC ID N.º: 62)) en un vector cortado con Kpn I, pT7H6FX?TNFRSF13B, usando procedimientos convencionales. La secuencia de nucleótidos resultante de FXTNFRSF13B10, se proporciona como SEC ID N.º: 63.

Clonación de TNFRSF13B20

El vector de expresión pT7H6FXTNFRS13B20tripB se construye en dos etapas. La primera etapa es construir pT7H6FX?TNFRSF13B mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Bgl II y Kpn I FX?TNFSF13B amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bgliiFX?TNFRSF13B (SEC ID N.º: 57) y ?TNFRSF13Bkpn (SEC ID N.º: 58)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, PT7H6-bktripB usando procedimientos convencionales. La segunda etapa es construir el vector de expresión final pT7H6FXTNFRSF13B20tripB mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Kpn I, ?TNFSF13B20 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos kpn?TNFRSF13B (SEC ID N.º: 59) y ?TNFRSF13B20kpn (SEC ID N.º: 64)) en un vector cortado con Kpn I, pT7H6FX?TNFRSF13B, usando procedimientos convencionales. La secuencia de nucleótidos resultante de FXTNFRSF13B20, se proporciona como SEC ID N.º:65.

Clonación de TNFRSF13B30

El vector de expresión pT7H6FXTNFRS13B30tripB se construye en dos etapas. La primera etapa es construir pT7H6FX?TNFRSF13B mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Bgl II y Kpn I, FX?TNFRSF13B amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bgliiFX?TNFRSF13B (SEC ID N.º: 57) y ?TNFRSF13Bkpn (SEC ID N.º: 58)) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, PT7H6-bktripB, usando procedimientos convencionales. La segunda etapa es construir el vector de expresión final pT7H6FXTNFRSF13B30tripB mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Kpn I, TNFRSF13B30 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos kpn?TNFRSF13B (SEC ID N.º: 59) y ?TNFRSF13B30kpn (SEC ID N.º: 66)) en un vector cortado con Kpn I, pT7H6FX?TNFRSF13B, usando procedimientos convencionales. La secuencia de nucleótidos resultante de FXTNFRSF13B30, se proporciona como SEC ID N.º:67.

Clonación de TNFRSF13B61

El vector de expresión pT7H6FXTNFRS13B61tripB se construye en dos etapas. La primera etapa es construir pT7H6FX?TNFRSF13B mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Bgl II y Kpn I, FX?TNFRSF13B amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bgliiFX?TNFRSF13B (SEC ID N.º: 57) y ?TNFRSF13Bkpn (SEC ID N.º: 58)) en un vector cortado con BamHI y Kpn I, PT7H6-bktripB, usando procedimientos convencionales. La segunda etapa es construir el vector de expresión final pT7H6FXTNFRSF13B61tripB mediante ligación del fragmento de ADN restringido con Kpn I, TNFRSF13B61 amplificado a partir de ADNc, aislado de una mezcla de médula ósea humana y leucocito humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7181-1 y 7182-1) (con los cebadores oligonucleotídicos kpn?TNFRSF13B (SEC ID N.º: 59) y ?TNFRSF13B61kpn (SEC ID N.º: 68)) en un vector cortado con Kpn I, pT7H6FX?TNFRSF13B, usando procedimientos convencionales. La secuencia de nucleótidos resultante de FXTNFRSF13B61, se proporciona como SEC ID N.º:69.

Ejemplo 7

Diseño y construcción de un agente de unión a TWEAK trimérico usando fragmentos de receptor TNFRSF Fn14

El receptor de TWEAK, TNFRSF Fn14, se usa para la construcción de un agente de unión trimérico frente a la citocina trimérica TWEAK, y basándose en el dominio de trimerización TripB derivado de tetranectina. El diseño y la clonación del agente de unión se esquematiza a continuación:

El vector de expresión pT7H6FXFn14tripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I FXFn14 amplificado a partir de ADNc, aislado de corazón humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7121-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bamFn-rev (SEC ID N.º: 70) y FNkpn-fo (SEC ID N.º:71) en un vector cortado con BamH I y Kpn I, PT7H6-bktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXFn14, se proporciona como SEC ID N.º:72.

Ejemplo 8

Diseño y construcción de un agente de unión a BAFF trimérico usando fragmentos de receptor TNFRSF13C

El receptor de BAFF, TNFRSF13B, se usa para la construcción de un agente de unión trimérico frente a la correspondiente citocina trimérica BAFF, y basándose en el dominio de trimerización TripB derivado de tetranectina. El diseño y la clonación del agente de unión se esquematiza a continuación:

Clonación del fragmento TNFRSF13C trimérico

El vector de expresión pT7H6FXTNFSF13CtripB se construye mediante ligación del fragmento de ADN restringido con BamH I y Kpn I, FXTNFRSF13C amplificado a partir de ADNc, aislado de ganglio linfático humano (Clontech Laboratories, Inc n.º de cat. 7164-1) (con los cebadores oligonucleotídicos bam13C-rev (SEC ID N.º: 73) y 13Ckpn-fo (SEC ID N.º:74) en un vector cortado con BamHI y Kpn I, PT7H6-bktripB, usando procedimientos convencionales. Un esquema de la secuencia de nucleótidos resultante de FXTNFRSF13C, se proporciona como SEC ID N.º:75.

Ejemplo 9

Aislamiento y construcción de agentes de unión a CTLD trimerizados para TNF

La estructura de armazón proteínico de dominios similar a lectina de tipo C (CTLD) de tetranectina (SEC ID N.º:96), según se dio a conocer anteriormente en el documento WO/0248189, se usó para el aislamiento y la construcción de una unidad de unión trimérica para la citocina trimérica TNF (TNF alfa). El diseño y la clonación de las unidades de unión se esquematiza a continuación:

Construcción de bibliotecas y selección primaria

Se usó la presentación en fago para aislar agentes de unión a CTLD de TNF. Las bibliotecas de presentación en fago usadas se basaron en el formato de CTLD monovalente de tetranectina (SEC ID N.º:97). La biblioteca combinatoria PhtCTLD-Ib003 (documento WO/0248189, ejemplo 5) y una variante de esta biblioteca realizada esencialmente como PhtCTLD-Ib003, pero que incluye dos oligonucleótidos aleatorizados adicionales para el bucle

1: TN-lib3-tprev, aleatorizado en posiciones de residuos de aminoácidos 116-122 de tetranectina (SEC ID N.º:98) y TN-lib2-tprev (SEC ID N.º: 99) y 2 oligonucleótidos adicionales para el bucle 4: TN-lib3-tpfo, aleatorizado en la posición 146-149 (SEC ID N.º:100) y TN-lib2-tpfo (SEC ID N.º:101) en la reacción de ensamblaje. Se realizaron dos ciclos de selección usando aproximadamente 1 x 1012 fagos como entrada y 10 µg/ml de TNF biotinilado en el primer ciclo de barrido y 1 µg/ml en el segundo.

Se realizaron las selecciones tal como sigue: 20 µl de perlas paramagnéticas cubiertas con estreptavidina (Dynal) se lavaron dos veces en 1 ml de PBS (PBS, 0,2 g de KCI, 0,2 g de KH2PO4, 8 g de NaCl, 1,44 g de Na2HPO4, 2H2O, agua hasta 1 I, y ajustado a pH 7,4 con NaOH), y se bloquearon en leche en polvo desnatada al 3% durante una hora a temperatura ambiente. Se mezclaron 250 µl de fago prebloqueado en leche en polvo desnatada al 3%/PBS con 250 µl de TNF biotinilado soluble y se dejó incubar a 37ºC durante 30 minutos. Tras el lavado de las perlas de estreptavidina una vez en PBS, Tween 20 al 0,1 % y dos veces en PBS, se añadieron éstas a la reacción para capturar el fago unido a antígeno. Las perlas se lavaron de manera extensa con PBS, Tween 20 al 0,1 % y PBS, y se eluyeron los fagos unidos a antígeno de las perlas con 200 µl de ditiotreitol 50 mM durante 30 min. a temperatura ambiente. Se reinfectaron los fagos eluidos en células TG1 de E. coli de crecimiento exponencial, antes de la colocación en placa y la titulación en placas de agar 2xTY que contienen glucosa al 2% y ampicilina 0,1 mg/ml.

5

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La selección de clones individuales a partir de poblaciones seleccionadas mediante el análisis de unión a TNF alfa en ELISA se realizó esencialmente según se describe en el documento WO/0248189, excepto que el antígeno usado para cubrir en ELISA era TNF 5 µg/ml.

Se aisló un agente de unión a TNF alfa específico, denominado TN3-2, del segundo ciclo de selección (tabla 4).

Construcción de bibliotecas secundarias y selección dirigida por afinidad

Se investigó si la afinidad por TNF de TN3-2 podía mejorarse introduciendo una nueva variación de secuencia para TN3-2. Para la construcción de una biblioteca de mutantes de TN3-2, se usó el clon TN3-2 como molde y se sometió a nueva aleatorización en bucle 4 usando los oligonucleótidos TN-lib2-tpfo (SEC ID N.º:101) y TN-lib3-tpfo (SEC ID N.º: 100) (biblioteca TN3-2 loop4r). La construcción de bibliotecas se realizó esencialmente según se describe en el documento WO/0248189.

La biblioteca TN3-2loop4r se usó en 3 ciclos de selección dirigida por afinidad con concentraciones en disminución de TNF biotinilado (de 100 ng/ml a 0,1 ng/ml). Se realizó la selección según se describió anteriormente. Se realizó la selección de clones positivos según se describió anteriormente.

Resultados

La secuencia del clon parental TN3-2 era diferente de tetranectina en el bucle 1 (aminoácidos de tetranectina n.os 116-122) y en el bucle 4 (aminoácidos de tetranectina n.os 146-149). Tras tres ciclos de selección dirigida por afinidad en la biblioteca TN3-2loop4r, se identificaron clones positivos mediante análisis ELISA, y se mostró que 45 de 48 clones se unían a TNF alfa. Las secuencias del bucle 1 y bucle 4 de una selección de los clones de unión a TNF alfa identificados junto con sus correspondientes SEC ID N.os se muestran en la tabla 4 (TN3-2-B, TN3-2-C, TN3-2-D).

TABLA 4: secuencias de aminoácidos en el bucle 1 y bucle 4 del clon parental TN3-2 y tres clones madurados por afinidad aislados de la biblioteca TN3-2loop4r

Clon: SEC ID Secuencia de bucle 1 Secuencia de bucle 4 Otras mutaciones a

Tetranectina: SEC ID N.º:96 DMAAEGT GGKT

TN3-2: SEC ID N.º:102 KVRSRYF PRHT V124 a M

TN3-2-B: SEC ID N.º:103 KVRSRYF PTNN V124 a M, D165 a G

TN3-2-C: SEC ID N.º:104 KVRSRYF PTNR

TN3-2-D: SEC ID N.º:105 KVRSRYF PNNR V124 a I, D165 a G

aMutaciones fuera de la secuencia de bucle 4 en tetranectina

Ejemplo 10

Mediciones de afinidad de agentes de unión a CTLD trimerizados para TNF

Los insertos de ADN que codifican los agentes de unión a CTLD de TNF alfa monoméricos aislados según se describió en el ejemplo 7 se subclonaron en el vector de expresión pBAD de E. coli (Invitrogen Corp., EE.UU.). los agentes de unión a TNF alfa monoméricos recombinantes se expresaron en E. coli y se purificaron del periplasma según las instrucciones de los fabricantes. Se dializaron los monómeros purificados en Tris pH 10 mM 8,0, NaCl 150 mM, CaCl2 2 mM antes del análisis en BiaCore.

Con el fin de expresar el formato trimérico de los agentes de unión a TNF alfa, se escindieron insertos de ADN apropiados que codifican los agentes de unión a TNF alfa (del ejemplo 7) con las endonucleasas de restricción Bgl II y Mun I, y se subclonó el fragmento de ADN que contenía el bucle 1 y 4 en el ADN pT7H6FX-htlec de E. coli restringido con Bgl II y Mun I (según se esquematiza en el documento WO 02/48189, ejemplo 1 y figura 5).

Los agentes de unión a TNF alfa triméricos recombinantes se expresaron en E. coli y se realizó la purificación de los derivados de proteína de fusión no plegada esencialmente según se describe en el documento WO 94/18227, ejemplo 9.

Brevemente, se realizó el replegamiento de los agentes de unión a TNF alfa cargando las proteínas de fusión en columnas de ácido nitrilotriacético (NTA) cargadas con Ni2+ en urea 8 M, Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 500 mM, 2mercaptoetanol 5 mM. Tras cargarse, las columnas se sometieron a un procedimiento de replegamiento cíclico. Los tampones de replegamiento usados fueron: tampón A de renaturalización (Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 500 mM,

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CaCl2 2 mM, glutatión reducido 2 mM y glutatión oxidado 0,2 mM) y tampón B de desnaturalización (urea 8 M, Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 500 mM, CaCl2 2 mM, glutatión reducido 3 mM). Se eluyeron las proteínas de fusión replegadas de las columnas en Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 500 mM, EDTA 10 mM y se escindieron las proteínas de fusión con factor de coagulación de sangre bovina Xa (Protein Engineering Technology, Aarhus, Dinamarca) a

1:100 (p/p) a 4ºC durante la noche. Las proteínas escindidas se llevaron en urea 8 M, tampón de acetato de sodio 25 mM (pH 5), NaCl 50 mM, tampón Tris-HCl 1 mM mediante filtración en gel en Sephadex G25 y se cargaron en columnas de 10 ml de SP-Sepharose (Amersham Biosciences) y se eluyeron en gradiente desde NaCl 50 mM hasta 500 M con respecto a 20 volúmenes de columna. Se combinaron las fracciones que contenían proteína escindida y monomérica, según se evalúa mediante análisis SDS/PAGE no reductor y se intercambio el tampón por Tris 10 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, CaCl2 2 mM mediante filtración en gel en columnas PD10 (Amersham Biosciences).

Se realizó el análisis de unión de resonancia de plasmón superficial (SPR) en un instrumento BIAcore 3000 (BiaCore, Suecia). Se disolvió el anticuerpo de captura de TNF alfa (AHC3712, Biosource International) que va a inmovilizarse en acetato de Na 10 mM pH 5,0 y entonces se inmovilizó en un chip sensor CM5 BiaCore usando el kit Amine Coupling (BiaCore, Suecia).

Se realizó el análisis de unión a una velocidad de flujo de 5 µl/min. Antes de la carga de la muestra de proteínas, se equilibró el chip en Tris 10 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, CaCl2 2 mM, EDTA 50 µM y tensioactivo P20 al 0,005%. Se disolvió TNF alfa en Tris 10 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, CaCl2 a mM a 10 µg/ml y se inyectaron 10 µl. Se inyectaron alícuotas (20 µl) de agentes de unión a TNF alfa en el formato monomérico o trimérico usando la opción KINJECT. Se dejaron cinco min. de disociación antes de que se generara el chip con glicina 10 mM pH 2,5. Se sometió a prueba la unión de los agentes de unión a TNF alfa en seis concentraciones de proteínas diferentes, oscilando entre 1 nM y 200 nM. Se evaluaron los datos de unión usando el programa BIAevaluation versión 3.2 (BiaCore).

La tabla 5 muestra los valores cinéticos derivados de los datos de BiaCore. El efecto de avidez de la trimerización de los agentes de unión a TNF alfa TN3-2-B, TN3-2-C, TN3-2-D se observa a partir del aumento de veces de la afinidad que se mueve desde los agentes de unión monoméricos hasta los correspondientes agentes de unión triméricos (TN-2-B, TN-2-C y TN-2-D).

TABLA 5

Clon: SEC ID kon M -1 s -1 * koff s -3 KD 003 Aumento de veces

TN-2-B (trimérico): SEC ID N.º:106 3,02 x 106 7,36 x 10 -4 ~ 0,24 nM 304

TN3-2-B (monomérico): SEC ID N.º:103 1,4 x 107 0,923 73 nM n.d.

TN-2-D (trimérico): SEC ID N.º:107 5,06 x 105 2,07 x 10 -3 4,1 nM 12

TN3-2-D (monomérico): SEC ID N.º:105 3,64 x 105 0,0185 50 nM n.d.

TN-2-C (trimérico): SEC ID N.º:108 8,84 x 105 3,53 x 10 -3 4 nM 37

TN3-2-C (monomérico): SEC ID N.º:104 1,34 x 105 0,022 150 nM n.d.

Mediante la trimerización de los agentes de unión a TNF alfa se obtiene un aumento significativo de la afinidad (KD). Por ejemplo, TN3-2-B monomérico tiene un valor de koff muy bajo. Por el contario a esto, la versión trimérica del mismo agente de unión a CTLD (TN-2-B), tiene un valor de koff que está mejorado en más de 1000 veces. En general puede observarse que las constantes de disociación están mejoradas varias veces mediante la trimerización. Además, el clon parental poco afín TN3-2 del ejemplo 7 podía medirse sólo en BiaCore en su forma trimérica, ya que el monómero tenía una afinidad por debajo del límite de detección.

Referencias

Studier y Moffat (1986), Journal de Molecular Biology 189: 113-130. Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R. y Stüber, D. (1988), Bio/Technology 6:1321-1325. Lorentsen, RH. et al. (2000) Biochemical Journal 347:83-87. LISTADO DE SECUENCIAS

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<130> 3005

<160> 109

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 33 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1 ctgccatgcg gccgccttca gggagaccgt ctg 33

<210> 2 10 <211> 58

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 2

gtgaccaggc ccagccggcc atgtaagtag ctaaggtacc gagccaccaa cccagaag 58 15 <210> 3

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<212> ADN

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<212> ADN

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<210> 5

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<212>: ADN 30 <213> Homo sapiens

<400> 5

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<212>: ADN 5 <213> Homo sapiens

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<400> 6 ctgccataag cttacttcag ggagaccgtc tg 32

<210> 7

<211> 51 10 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 7 gtgaccagga tccatgtaag tagctaaggt accgagccac caacccagaa g 51

<210> 8 15 <211> 191

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400>: 8

<400>: 15

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20: <210> 9

<211> 55

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 9

25: gtgaccagga tccatgtaag tagctaaggt accattgtaa atgccaagaa agatg 55

<210> 10

<211> 162

<212> ADN

<213> Homo sapiens

30: <400> 10

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<210> 11

<211> 44

<212> ADN

5: <213> Homo sapiens

<400> 11

gtgaccaggc ccagccggcc atggccggga gcacatgccg gctc: 44

<210> 12

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10: <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 12

cgtgctgggt accggtgcag atgcggttct gttc: 34

<210> 13

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 13

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20: <210> 14

<211> 39

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 14

25: cgtgctgggt accgggccta gcggtgcaga tgcggttct 39

<210> 15

<211> 283

<212> ADN

<213> Homo sapiens

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<210> 16

<211> 31

5: <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 16

cgtgctgggt acccgcgcag taccagccgg g: 31

<210> 17

10: <211> 298

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 17

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15: <210> 18

<211> 29

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 18

20: cgtgctgggt accctcctgc ttgctcagc 29

<210> 19

<211> 316

<212> ADN

<213> Homo sapiens

25: <400> 19

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<210> 20

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<212> ADN

5: <213> Homo sapiens

<400> 20

cgtgctgggt acctgcagcc agccgagccc cctcctgctt gctc: 44

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<211> 331

10: <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 21

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<210> 22

15: <211> 31

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 22

cgtgctgggt accggacgtg gacgtgcaga c: 31

20: <210> 23

<211> 529

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 23

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<211> 44

<212> ADN

5: <213> Homo sapiens

<400> 24

gtgaccaggc ccagccggcc atggccgact cctgtgagga cagc: 44

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10: <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 25

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

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20 <210> 27

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

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<210> 28

<211> 199

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 28

imagen2

<210> 29 10 <211> 214

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 29

imagen2

15 <210> 30

<211> 412

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 30

imagen2

<210> 31

<211> 41

<212> ADN

5: <213> Homo sapiens

<400> 31

gccagggatc catcgagggt agggggagca catgccggct c: 41

<210> 32

<211> 278

10: <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 32

imagen4

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 33

imagen2

20 <210> 34 <211> 302

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 34

imagen5

<210> 35

<211> 320

<212> ADN

<213> Homo sapiens 10 <400> 35

imagen2

<210> 36

<211> 335

<212>: ADN 15 <213> Homo sapiens

<400> 36

<210> 37

<211> 533

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 37

<210> 40

<211> 168

<212>: ADN 20 <213> Homo sapiens

<400> 40

<210> 41

<211> 183

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 41

<210> 42

<211> 201

<212>: ADN 10 <213> Homo sapiens

imagen2

5: <210> 38

<211> 44

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 38

10: gccagggatc catcgagggt aggggcgact cctgtgagga cagc 44

<210> 39

<211> 159

<212> ADN

<213> Homo sapiens

15: <400> 39

imagen2

<400> 42

imagen2

<210> 43

<211> 216 15 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 43

imagen2

<210> 44 20 <211> 414

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 44

imagen2

<210> 45

<211> 41

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 45 gccagagatc tatcgagggt agggaggtgc agctggtgga g 41

<210> 46

<211> 59

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 46 ctggtcggta ccggatccgc cgccaccact cgagacggtg accagagtac cttggcccc 59

<210> 47

<211> 62

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 47

imagen2

<210> 48

<211> 33

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 48 ccgagcggta cctttgattt ccaccttggt ccc 33

<210> 49

<211> 754

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 49

imagen2

5: <210> 50

<211> 48

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 50

10: ccgagcggta ccagatccac cgcccccttt gatttccacc ttggtccc 48

<210> 51

<211> 769

<212> ADN

<213> Homo sapiens

15: <400> 51

imagen2

<210> 52

<211> 29 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 52 gccagtgatc agaggtgcag ctggtggag 29

<210> 53 10 <211> 33

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 53

cctcgaagct tatttgattt ccaccttggt ccc 33 15 <210> 54

<211> 743

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400>: 54

<400>: 60

imagen2

<210> 55

<211> 44

<212> ADN

5: <213> Homo sapiens

<400> 55

gccagtgatc aggaggtggc gggtctgagg tgcagctggt ggag: 44

<210> 56

<211> 758

10: <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 56

imagen2

<210> 57

<211> 38

<212> ADN

5: <213> Homo sapiens

<400> 57

gccagagatc tatcgagggt aggatgagtg gcctgggc: 38

<210> 58

<211> 18

10: <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 58

catgcaggta cccagcag 18

<210> 59

15: <211> 18

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 59

ctgctgggta cctgcatg 18

20: <210> 60

<211> 32

<212> ADN

<213> Homo sapiens

cggcacggta ccgctcctga gcttgttctc ac 32

<210> 61

<211> 354

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 61

imagen2

<210> 62

10: <211> 31

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 62

cggcacggta ccaaggttca ctgggctcct g: 31

15: <210> 63

<211> 366

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 63

imagen1

<210> 64

<211> 31

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 64

cggcacggta cctccactcc gctgtctcct g 31

<210> 65

<211> 396

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 65

imagen2

<210> 66 10 <211> 36

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 66

cggcacggta ccagggctca acagacttaa caaaag 36 15 <210> 67

<211> 426

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 67

imagen6

<210> 68

<211> 31

<212> ADN

<213> Homo sapiens

5 <400> 68 31 cggcacggta ccgctgtaga ccagggccac c

<210> 69

<211> 519

<212> ADN 10 <213> Homo sapiens

<400> 69

imagen2

<210> 70

<211> 41

15: <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 70

ggccagggat ccatcgaggg taggggggag caagcgccag g: 41

<210> 71

20: <211> 31

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 71

cggtgcggta ccgggccaaa gcagccggaa g: 31

25: <210> 72

<211> 186

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 72

imagen2

5

<210> 73

<211> 41

<212> ADN

<213> Homo sapiens

10: <400> 73

ggccagggat ccatcgaggg taggatgagg cgagggcccc g: 41

<210> 74

<211> 28

<212> ADN

15: <213> Homo sapiens

<400> 74

cggtgcggta ccgagcagcc cgggcagg: 28

<210> 75

<211> 258

20: <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 75

imagen2

<210> 76 25 <211> 235

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 76

imagen2

<210> 77

<211> 185 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 77

imagen2

<210> 78

<211> 163

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 78

imagen2

<210> 79

<211> 142

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 79

imagen2

<210> 80

<211> 157

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 80

imagen2

<210> 81

<211> 51

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 81

imagen2

<210> 82

<211> 39

<212> ADN

<213> Artificial

5: <220>

<223> cebador oligonucleotídico

<400> 82

gcgcacggat ccatggccca ggtggcattt acaccctac: 39

<210> 83

10: <211> 33

<212> ADN

<213>Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

15: <400> 83

caccacggta ccgatctggt ggggcctgca aat 33

<210> 84

<211> 738

<212> ADN

20: <213> Artificial

<220>

<223> AD1D4-I162-tripB

<400> 84

imagen2

<210> 85

<211> 51

<212> ADN

5: <213>Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

<400> 85

caccacggta ccggaggaac cggaggacgt ggacgtgcag actgcatcca t: 51

10: <210> 86

<211> 810

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

15: <223> AD1D4-GSS-tripB

<400> 86

imagen2

<210> 87

<211> 39

<212> ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

<400> 87

agatttggta ccgtcgccag tgctcccttc agctggggg 39 10 <210> 88

<211> 957

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 15 <223> AD1D4-D235-tripB

<400> 88

imagen2

<210> 89

<211> 711

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> AD1D4-I162-I10-TripB

<400> 89

imagen2

<210> 90

<211> 711

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> AD1D4-GSS-I10-tripB

<400> 90

imagen2

10 <210> 91

<211> 930

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> AD1D4-D235-I10-tripB

<400> 91

imagen5

<210> 92

<211> 31

<212> ADN

<213> Artificial

10: <220>

<223> pKpnI-V17

<400> 92

gacggtaccg ttgtgaacac aaagatgttt g: 31

<210> 93

15: <211> 35

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> pBAD6H

20: <400> 93

ggctcggaat tcaatgatga tgatgatgat ggtcg 35

<210> 94

<211> 762

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> AD1D4-GSS-V17-tripB

<400> 94

imagen2

10 <210> 95

<211> 909

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 15 <223> AD1D4-D235-V17-tripB

<400> 95

imagen2

<210> 96

<211> 181

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 96

imagen2

<210> 97

<211> 137

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 97

imagen2

<210> 98

<211> 102

<212> ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> TN-lib3-tprev

<220>

<221> misc_feature 10 <222> (22) .. (23)

<223> aleatorizado

<220>

<221> misc_feature

<222>: (25) .. (26) 15 <223> aleatorizado

<220>

<221> misc_feature

<222>: (28) .. (29) 20 <223> aleatorizado

<220>

<221> misc_feature

<222> (31) .. (32)

<223> aleatorizado 5 <220>

<221> misc_feature

<222> (34) .. (35)

<223> aleatorizado

<220> 10 <221> misc_feature

<222> (37) .. (38)

<223> aleatorizado

<220>

<221> misc_feature 15 <222> (40) .. (41)

<223> aleatorizado

<400> 98

imagen2

<210> 99 20 <211> 94

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> TN-lib2-tprev 25 <220>

<221> misc_feature

<222> (17) .. (17)

<223> aleatorizado

<220> 30 <221> misc_feature

<222> (18) .. (18)

<223> aleatorizado

<220>

<221> misc_feature

<222> (20) .. (21)

<223> aleatorizado

<220>

<221> misc_feature 5 <222> (23) .. (24)

<223> aleatorizado

<220>

<221> misc_feature

<222> (29) .. (29) 10 <223> aleatorizado

<220>

<221> misc_feature

<222> (30) .. (30)

<223> aleatorizado 15 <220>

<221> misc_feature

<222> (32) .. (33)

<223> aleatorizado

<400> 99

imagen1

<210> 100

<211> 108

<212> ADN

<213> Artificial 25 <220>

<223> TN-lib3-tpfo

<220>

<221> misc_feature

<222> (63) .. (64) 30 <223> aleatorizado

<220>

<221> misc_feature

<222> (66) .. (67)

<223> aleatorizado 35 <220>

<221> misc_feature

<222> (69) .. (70)

<223> aleatorizado

<220>

<221> misc_feature

<222> (72) .. (73)

<223> aleatorizado

<220>

<221> misc_feature

<222> (75) .. (76)

<223> aleatorizado

<220>

<221> misc_feature

<222> (78) .. (79)

<223> aleatorizado

<400> 100

imagen2

<210> 101

<211> 102

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> TN-lib2-tpfo

<220>

<221> misc_feature

<222> (63) .. (64)

<223> aleatorizado

<220>

<221> misc_feature

<222> (66) .. (67)

<223> aleatorizado

<220>

<221> misc_feature

<222> (69) .. (70)

<223> aleatorizado <220>

<221> misc_feature

<222> (72) .. (73)

<223> aleatorizado

<400> 101

imagen2

<210> 102

<211> 137

<212> PRT 10 <213> Artificial

<220>

<223> TN3-2

<400> 102

imagen2

15 <210> 103 <211> 137

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> TN3-2-B

<400> 103

imagen2

<210> 104

<211> 137 10 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> TN3-2-C

<400> 104

imagen2

<210> 105

<211> 137

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> TN3-2-D

<400> 105 <210> 106

imagen2

<211> 181

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> TN-2-B

<400> 106 <210> 107

imagen2

<211> 181

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> TN-2-D

<400> 107 <210> 108

imagen2

<211> 181

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> TN-2-C

<400> 108

imagen2

<210> 109

<211> 256

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> AD1D4-GSS-I10

<400> 109

imagen2

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un polipéptido trimérico que comprende tres monómeros, comprendiendo cada uno de dichos monómeros un miembro de unión específico que puede unirse a una citocina trimérica, y comprendiendo cada uno de dichos monómeros un dominio de trimerización derivado de tetranectina.
2.

Un polipéptido trimérico según la reivindicación 1, en el que el dominio de trimerización derivado de tetranectina comprende una secuencia que tiene al menos un 68% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de SEC ID N.º:81.
3.

Un polipéptido trimérico según la reivindicación 2, en el que la identidad de secuencia de aminoácidos es al menos un 75%, tal como al menos un 87%, incluyendo al menos un 92%.
4.

Un polipéptido trimérico según la reivindicación 1, en el que el dominio de trimerización derivado de tetranectina comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID N.º:81.
5.

Un polipéptido trimérico según la reivindicación 1, seleccionado del grupo constituido por TN-2-B (SEC ID N.º:106), TN-2-C (SEC ID N.º:108), TN-2-D (SEC ID N.º:107) y AD1D4-GSS-I10 (SEC ID N.º:109).
6.

Un polipéptido trimérico según la reivindicación 1, en el que la citocina trimérica es un miembro de la superfamilia de ligandos del factor de necrosis tumoral.
7.

Un polipéptido trimérico según la reivindicación 6, en el que el miembro de la superfamilia de ligandos del factor de necrosis tumoral se selecciona del grupo que consiste en LTA; TNF; LTB; TNFSF4; TNFSF5; TNFSF6; TNFSF7; TNFSF8; TNFSF9; TNFSF10; TNFSF11; TNFSF12; TNFSF13; TNFSF13B; TNFSF14; TNFSF15; y TNFSF18.
8.

Un polipéptido trimérico según la reivindicación 6, en el que el miembro de unión específico es un polipéptido derivado de un miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral.
9.

Un polipéptido trimérico según la reivindicación 6, en el que el miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral se selecciona del grupo que consiste en TNFRSF1A, TNFRSF1B, LTBR, TNFRSF4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFRSF6B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF10C, TNFRSF10D, TNFRSF11A, TNFRSF11B, TNFRSF12, TNFRSF12L, TNFRSF13B, TNFRSF13C, TNFRSF14, TNFRSF Fn14, NGFR, TNFRSF17, TNFRSF18, TNFRSF19, TNFRSF19L, TNFRSF21, TNFRSF22 y TNFRSF23.
10.

Un polipéptido trimérico según la reivindicación 1, en el que el miembro de unión específico se deriva de TNFRSF1A (receptor p55 TNF).
11.

Un polipéptido trimérico según la reivindicación 1, en el que el miembro de unión específico se deriva de TNFRSF1B (receptor p75 TNF).
12.

Un polipéptido trimérico según la reivindicación 11, en el que el miembro de unión específico es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en TNFRSF1B 1-235 (SEC ID N.º:76), TNFRSF1B 1-185 (SEC ID N.º:77), TNFRSF1B 1-163 (SEC ID N.º:78) y TNFRSF1B 1-142 (SEC ID N.º:79).
13.

Un polipéptido trimérico según la reivindicación 11, en el que el miembro de unión específico es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en TNFRSF1B D1D2 (SEC ID N.º:13), TNFRSF1B D1D2, 1/6 (SEC ID N.º:15), TNFRSF1B D1D2 1/4 (SEC ID N.º:17), TNFRSF1B D1D2, 1/3 (SEC ID N.º:19), TNFRSF1B D1D2, 1/2 (SEC ID N.º:21), TNFRSF1B D1D4 (SEC ID N.º:23), TNFRSF1B D2 (SEC ID N.º:25), TNFRSF1B D2, 1/6 (SEC ID N.º:26), TNFRSF1B D2, 1/4 (SEC ID N.º:27), TNFRSF1B D2, 1/3 (SEC ID N.º:28), TNFRSF1B D2, 1/2 (SEC ID N.º:29) y TNFRSF1B D2D4 (SEC ID N.º:30).
14.

Un polipéptido trimérico según la reivindicación 1, en el que el miembro de unión específico es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
15.

Un polipéptido trimérico según la reivindicación 14, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a TNF humano (SEC ID N.º:80) en al menos una región seleccionada de las regiones constituidas por residuos de aminoácidos 1-18, 1-20, 1-26, 1-30, 12-22, 22-31, 22-40, 36-45, 49-97, 49-98 , 56-79, 58-65, 69-97, 70-87, 76-90, 96-105, 105-128, 108-128, 110-127, 115-125, 117-128, 132-157, 135-155, 136-153, 138-149, 141-153 y 146-157.
16.

Un polipéptido trimérico según la reivindicación 15, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se selecciona de MAb 1 (ECACC 89080301), MAb 21 (ECACC 90012432), MAb 25 (ECACC 89121401), MAb 32 (ECACC 89080302), MAb 37 (ECACC 89080303), MAb 42 (ECACC 89080304), MAb 47 (ECACC 89121402), MAb 53 (ECACC 90012433) y MAb 54 (ECACC 89083103) o un fragmento del mismo.
17.

Un polipéptido trimérico según la reivindicación 14, en el que el anticuerpo es D2E7 o un fragmento del mismo.
18.

Un polipéptido trimérico según la reivindicación 14, en el que el anticuerpo es CDP 870 o un fragmento del

mismo.
19.

Un polipéptido trimérico según la reivindicación 1, en el que el miembro de unión específico es una proteína que tiene la estructura de armazón proteínico de dominios similar a lectina de tipo C (CTLD).
20.

Un polipéptido trimérico según la reivindicación 19, en el que el miembro de unión específico que tiene la estructura de armazón proteínico de dominios similar a lectina de tipo C se selecciona del grupo que consiste en TN3-2-B (SEC ID N.º:103), TN3-2-C (SEC ID N.º:104) y TN3-2-D (SEC ID N.º:105).
21.

Un polipéptido trimérico según la reivindicación 1, que comprende además un ligador entre el miembro de unión específico y el dominio de trimerización.
22.

Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido trimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1-21.
23.

Un procedimiento para la preparación de un polipéptido trimérico que comprende tres monómeros, comprendiendo cada uno de dichos monómeros un miembro de unión específico que puede unirse a una citocina polipeptídica trimérica, y comprendiendo cada uno de dichos monómeros un dominio de trimerización según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de (i) cultivar un huésped transformado con un vector que codifica dicho polipéptido trimérico en condiciones tales que se expresa dicho polipéptido trimérico; y (ii) aislar dicho polipéptido trimérico.
24.

Un procedimiento según la reivindicación 23, en el que dicho miembro de unión específico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en TNFRSF1B 1-235 (SEC ID N.º:76), TNFRSF1B 1-185 (SEC ID N.º:77), TNFRSF1B 1-163 (SEC ID N.º:78) y TNFRSF1B 1-142 (SEC ID N.º:79).
25.

Un procedimiento según la reivindicación 23, en el que el miembro de unión específico es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en TNFRSF1B D1D2 (SEC ID N.º:13), TNFRSF1B D1D2, 1/6 (SEC ID N.º:15), TNFRSF1B D1D2 1/4 (SEC ID N.º:17), TNFRSF1B D1D2, 1/3 (SEC ID N.º:19), TNFRSF1B D1D2, 1/2 (SEC ID N.º:21), TNFRSF1B D1D4 (SEC ID N.º:23), TNFRSF1B D2 (SEC ID N.º: 25), TNFRSF1B D2, 1/6 (SEC ID N.º:26), TNFRSF1B D2, 1/4 (SEC ID N.º:27), TNFRSF1B D2, 1/3 (SEC ID N.º: 28), TNFRSF1B D2, 1/2 (SEC ID N.º:29) y TNFRSF1B D2D4 (SEC ID N.º:30).
26.

Un polipéptido trimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1-21, para su uso como medicamento.
27.

Un polipéptido trimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1-21, para el tratamiento de una enfermedad mediada por citocina trimérica.
28.

Uso de un polipéptido trimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1-21, en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad mediada por citocina trimérica.
29.

Un procedimiento de ensayo para detectar una citocina trimérica en una muestra que comprende (i) poner en contacto dicha muestra con un polipéptido trimérico según la reivindicación 1, y (ii) detectar la unión del polipéptido trimérico a la citocina trimérica.