ES2439896T3

ES2439896T3 - Polipéptidos recombinantes de los miembros de la familia de ligandos de TNF y su utilización

Info

Publication number: ES2439896T3
Application number: ES05716360.2T
Authority: ES
Inventors: Klaus Pfizenmaier; Peter Scheurich; Ingo Grunwald; Anja Krippner-Heidenreich
Original assignee: Universitaet Stuttgart
Current assignee: Universitaet Stuttgart
Priority date: 2004-03-26
Filing date: 2005-03-24
Publication date: 2014-01-27
Anticipated expiration: 2025-03-24
Also published as: CA2563754A1; JP2007530021A; PT1727833E; US20070286843A1; EP1727833B1; EP1727833A1; CA2563754C; DE102004014983A1; WO2005103077A1; DK1727833T3; PL1727833T3; US8927205B2; AU2005235669A1; AU2005235669B2

Abstract

Procedimiento para la depleción y/o eliminación extracorporal de receptores del factor de necrosis tumoral(TNFR) de la sangre o fracciones sanguíneas, que comprende las etapas siguientes: a) eventualmente, separar la sangre en una o varias fracciones con componentes sólidos y/o líquidos; b) unir la sangre o las fracciones sanguíneas a una partícula o superficie acoplada con un polipéptido,comprendiendo el polipéptido por lo menos tres componentes A y por lo menos dos componentes B, siendocada componente A un monómero de TNF o un fragmento y/o una variante del mismo, que presenta unapropiedad de unión y trimerización, y siendo cada componente B un ligante peptídico, y c) separar el TNFR unido.

Description

Polipéptidos recombinantes de los miembros de la familia de ligandos de TNF y su utilización.

La presente invención se refiere a procedimientos para la manipulación, depleción y/o eliminación extracorporal de componentes contenidos en los líquidos corporales, por ejemplo por medio de aféresis.

En el caso de los miembros de la familia de ligandos de TNF se trata de citocinas proinflamatorias. Las citocinas en general y los miembros de la familia de ligandos de TNF en particular desempeñan un papel importante en la estimulación y coordinación del sistema inmunitario innato así como de la respuesta inmunitaria humoral (mediada por anticuerpos), en la inducción de apoptosis, en la creación de huesos, en la formación de los soportes estructurales para el crecimiento de pelo, el crecimiento de los dientes y el desarrollo de las glándulas sudoríparas, el soporte estructural de ganglios linfáticos y muchos más (Aggarwal, B.B. (2003), Nat. Rev. Immunol. 3, 745-756). Por el contrario, una regulación deficiente de los miembros de la familia de ligandos de TNF puede conducir a numerosos estados patológicos. A éstos pertenecen, por ejemplo, el choque septicémico, enfermedades autoinmunitarias, tales como artritis reumatoide, o enfermedades neurodegenerativas. El factor de necrosis tumoral (TNF) es el miembro que da nombre y probablemente el más importante de esta gran familia de citocinas.

Los miembros de la familia de ligandos de TNF despliegan su acción en su forma biológicamente activa como homotrímeros (Banner, D.W. et al, (1993) Cell 73, 431-445). Las estructuras triméricas y también las agregaciones de orden superior (por ejemplo oligómeros o multímeros de trímeros) de proteínas pueden encontrarse en gran número en la naturaleza. Ejemplos son la proteína de matriz del cartílago (CMP), una proteína del tejido conjuntivo (Beck et al (1996), J Mol Biol 256, 909-923), proteínas de la familia del colágeno, tal como la familia Clq, a la que pertenecen Clq, colágeno α1 (X), α2 (VII), la proteína específica de la hibernación, ACRP30, la proteína de la estructura interna del oído, celebrina y multimerina (Kishore y Reid, (1999), Immunopharmacol. 42, 15-21), y proteínas de la familia de la colectina, tal como la proteína surfactante pulmonar A (SP-A) y la proteína de unión a manosa (MBP) (Epstein et al. (1996), Current Opinion in Immunology, vol. 8 n.º 1, 29-35).

La disposición conjunta de proteínas para dar un trímero tiene lugar en las superficies de estas proteínas que se trimerizan en disolución debido a interacciones, tales como interacciones hidrófobas, uniones por puente de hidrógeno, uniones covalentes (por ejemplo puentes disulfuro) y/o fuerzas de Coulomb, pero también debido a motivos estructurales, es decir secuencias de aminoácidos características, que provocan una formación de superestructuras secundarias intermoleculares. En el caso de los miembros de la familia de ligandos de TNF, los tres monómeros se mantienen juntos en la estructura homotrimérica de manera no covalente a través de uniones hidrófobas. En su forma activada activan a su vez los miembros de la familia de receptores de TNF opuestos a ellos, que como tales no presentan actividad enzimática. Por ejemplo, el TNF, como miembro de la familia de ligandos de TNF, se une a los dos receptores de membrana TNFR1 y TNFR2 y facilita la trimerización o la activación de receptores que se encuentran ya en forma de trímeros, pero inactivos desde el punto de vista de las señales. Mediante la formación de complejos de los receptores se inicia una cascada de señales con la que, entre otros, va acompañada una asociación de proteínas adaptadoras citoplasmáticas (Wajant, H. et al (2003), Cell Death, Differ, 10, 45-65). La estructura trimérica de TNFR1 y TNFR2 se presenta de tal manera que los receptores se unen en cada caso en el intersticio entre dos de los tres monómeros de TNF del homotrímero de TNF (Banner et al (1993) citado anteriormente). De esto resulta evidente que tanto el TNF como los otros miembros de la familia de ligandos de TNF sólo son biológicamente activos en su estructura como homotrímero.

Debido a su función, los miembros der familia de ligandos de TNF o sus receptores de membrana pueden utilizarse de múltiples maneras para el tratamiento de numerosas enfermedades, tales como enfermedades infecciosas e inflamatorias, enfermedades metabólicas, enfermedades que se deben a una regulación deficiente de la apoptosis, enfermedades neurodegenerativas y muchas otras enfermedades. Un papel especialmente importante lo desarrolla su utilización en el tratamiento de enfermedades cancerosas, dado que en el caso de los miembros de la familia de ligandos de TNF se trata en general de sustancia de acción antitumoral. En este contexto pueden mencionarse en particular el propio TNF (Eggermont, A.M. y ten Hagen, T.L. (2003), Curr. Oncol. Rep. 5, 79-80), TRAIL (TNF related apoptoses inducing ligand, ligando que produce apoptosis relacionadas con TNF), también denominado Apo 2L (Weley et al. (1995), Immunity 6: 673-682; Petti et al (1996) J Biol Chem 271: 12687-12689) y FasL. Sin embargo, estudios in vivo mostraron fuertes efectos secundarios sistémicos en el caso del TNF y agonistas del receptor Fas y estudios in vitro indican también efectos tóxicos similares en determinadas preparaciones de TRAIL (Jo et al. (2000) Nat Med 6: 564-567, Ichikawa et al (2001) Nat Med 7: 954-960; Ogasawara et al. (1993) Nature 364: 806-809). Por ejemplo, anticuerpos agonistas mostraron contra Fas, el receptor de FasL, un efecto extremadamente hepatotóxico (Ogasawara et al. (1993) citado anteriormente). Por tanto, en el caso de ligandos/agonistas que activan Fas se ha descartado por el momento una aplicación clínica por motivos de seguridad. No obstante, debido a la gran importancia de TNF, TRAIL, FasL y otros miembros de la familia de ligandos de TNF en este campo y los efectos secundarios asociados con su aplicación en forma de una administración sistémica clínica, se han seguido varios enfoques para minimizar estos efectos secundarios (Eggermont, A.M. y ten Hagen, T.L. (2003), Curr. Oncol. Rep. 5, 79-80).

Así, por ejemplo el documento WO 02/22680 describe proteínas de fusión, que posibilitan un efecto dirigido y

específico de tejido o de célula de las citocinas mediante la fusión de la citocina con un anticuerpo de unión a antígeno. De esta manera se consigue que las citocinas no desplieguen ninguna acción sobre tejidos o células que no entran en contacto con estas proteínas de fusión y que se reduzcan los efectos secundarios sobre estos tejidos o células.

En el documento DE 102 47 755 se da a conocer un sistema independiente de anticuerpos, que posibilita igualmente una acción dirigida y específica de tejido o de célula de las citocinas. En este caso se trata de proteínas de fusión, en las que la activación de un tramo de proteína contenido en las mismas con función biológica tiene lugar a través de su unión a un dominio de unión de moléculas de la superficie celular, que representa un tramo de proteína adicional de la proteína de fusión. Además de una reducción de los efectos secundarios en los tejidos no diana, este sistema puede utilizarse ventajosamente también para moléculas de la superficie celular en las células diana para las que no hay anticuerpos o hay anticuerpos con una especificidad demasiado reducida.

Sin embargo, además de los efectos secundarios mencionados también es extremadamente problemático el hecho de que los homotrímeros activos de los miembros de la familia de ligandos de TNF se disocian en diluciones, es decir también en el caso de concentraciones fisiológicamente útiles. Si bien esta disociación es básicamente reversible, sin embargo la proteína pierde rápidamente su bioactividad, dado que se desnaturaliza. Se supone que esta desnaturalización tiene lugar a lo largo de la etapa de los monómeros inestables (Smith,R.A. y Baglioni, C. (1987), J. Biol. Chem. 262, 6951-6954; Narhi, LO. y Arakawa, T. (1987), Biochem. Biophys. Res. Commun 147, 740746).

Debido a observaciones correspondientes en el caso de TRAIL, que presenta una labilidad especial, se intentó superar la estabilidad de la proteína agregando una cremallera de leucina como módulo de trimerización (Cha, S.S. et al., (1999), Immunity. 11, 253-261). En el estado natural, TRAIL se estabiliza mediante un ión zinc, que se encuentra en el centro del ligando trimérico, y que se coordina mediante restos cisteína (Hymowitz, S.G. et al. (2000), Biochemistry 39, 633-640). Sin embargo, en este caso puede ser desventajoso que mediante la agregación de la cremallera de leucina no sólo se consiga un aumento de estabilidad, sino que también se vean perjudicadas otras propiedades, por ejemplo propiedades estructurales, tales como modificaciones estructurales, la tasa de actividad o propiedades fisiológicas.

En el documento WO 01/37873 se presenta un procedimiento para el tratamiento de enfermedades que se caracterizan por la producción de moléculas de receptores de citocinas solubles, por ejemplo receptores del factor de necrosis tumoral solubles (sTNFR). Las enfermedades comprenden muchos tipos de cáncer y determinadas enfermedades adicionales tales como infecciones por VIH. A este respecto, en una forma de realización preferida se hace pasar la sangre del paciente a través de una columna, en la que están inmovilizados anticuerpos que se unen a moléculas de sTNFR y las eliminan, y a continuación se lleva entonces la sangre de vuelta al paciente. El proceso puede realizarse solo o en combinación con otras formas de terapia.

En el documento WO 01/43770 se presenta un procedimiento para reforzar la respuesta inmunitaria en un mamífero, que facilita la erradicación de un estado patológico crónico. El procedimiento comprende la eliminación de inhibidores del sistema inmunitario de la circulación del mamífero y permite de este modo una respuesta inmunitaria más intensa sobre el patógeno. La eliminación de los inhibidores del sistema inmunitario se consigue poniendo en contacto un componente de la sangre libre de células, o una fracción de la misma, con una o varias parejas de unión, que pueden unirse a los inhibidores y eliminarlos de este modo de los líquidos biológicos. En la realización del procedimiento es especialmente útil una matriz absorbente, que se compone de una sustancia inerte biocompatible, que está unida covalentemente con una pareja de unión, por ejemplo un anticuerpo, que puede unirse específicamente a los inhibidores deseados.

En la publicación internacional WO 99/61085 se da a conocer un procedimiento para el tratamiento del cáncer utilizando ultraaféresis, que se mejoró para eliminar compuestos de menos de 120000 Dalton de peso molecular. A esto le sigue la administración de líquido de sustitución, para estimular el sistema inmunitario del paciente para atacar los tumores sólidos. En una forma de realización preferida se lleva a cabo una ultraaféresis en el paciente utilizando un ultrafiltro de tubos de capilaridad con un tamaño de poro de 0,02 - 0,05 mm y con una exclusión de peso molecular de 120000 Dalton. El líquido de recambio preferido es plasma tratado con ultraaféresis.

Existe por tanto la necesidad de aumentar la estabilidad de las citocinas activas, en particular los miembros de la familia de ligandos de TNF, sin que sus propiedades naturales se vean influidas desventajosamente por una modificación de su estructura, y sin que muestren fuertes efectos secundarios citotóxicos u otros en caso de aplicaciones terapéuticas.

La presente invención se basa en el conocimiento de que los miembros de citocina solubles que se producen de manera natural de la familia de ligandos de TNF sólo despliegan toda su bioactividad como homotrímeros, pero por otro lado tienden a desnaturalizarse en sus monómeros a través de disociación.

Por tanto, debe impedirse esta disociación de los homotrímeros en monómeros. Esto se consiguió uniendo covalentemente entre sí por lo menos tres monómeros de un miembro de la familia de ligandos de TNF, en particular

TNF, a través de sus extremos C y N-terminales por medio de ligantes peptídicos cortos para dar una molécula “de cadena sencilla” (a continuación “sc”), en particular para dar un scTNF. Por tanto, la molécula completa (por lo menos tres monómeros de un miembro de la familia de ligandos de TNF con los dos ligantes peptídicos) se compone de una única hebra de proteína, de modo que ya no puede tener lugar una disociación en los monómeros. Se estableció que las moléculas de este tipo presentan una pérdida muy reducida de su actividad en comparación con sus miembros de tipo natural solubles correspondientes de la familia de ligandos de TNF. Al contrario, se demostró no sólo que los polipéptidos presentan las mismas actividades (cualitativas) que su miembro de tipo natural soluble correspondiente de la familia de ligandos de TNF, sino también que debido a su estabilidad considerablemente mayor también presentan todavía bioactividad en un momento en el que el miembro de tipo natural soluble de la familia de ligandos de TNF ya ha perdido su actividad, es decir está disociado o desnaturalizado (para ello se remite a las diferentes pruebas de estabilidad descritas a continuación, que se describen en los ejemplos así como en las figuras).

Por un “miembro de tipo natural soluble de la familia de ligandos de TNF” debe entenderse un tramo extracelular soluble de un miembro de membrana de la familia de ligandos de TNF. A continuación se utilizan como sinónimos para el término “tipo natural soluble” las expresiones “tipo natural”, “wt”, “soluble” y “s” (para “soluble”). En particular puede tratarse de un TNF de tipo natural soluble (como miembro de la familia de ligandos de TNF), para el que de manera correspondiente a continuación se utilizan los términos sinónimos “TNF de tipo natural”, “wtTNF”, TNF soluble y “sTNF”.

Un componente A en el sentido de la invención es un monómero de TNF o un fragmento funcional o una variante funcional del mismo. Por un “monómero” debe entenderse la unidad proteica o polipeptídica más pequeña que pueda separarse de una proteína oligomérica sin separación de las uniones covalentes.

Un polipéptido o un componente A o un fragmento o una variante del mismo son funcionales en el sentido de la invención, siempre que presente su función o bioactividad, en particular su propiedad de unión a una pareja de interacción, por ejemplo un receptor de membrana, y también su propiedad de trimerización. Si bien en los fragmentos funcionales y las variantes funcionales de la invención estas funciones biológicas pueden estar modificadas, por ejemplo con respecto a su especificidad o selectividad, sin embargo la función biológica básica se mantiene.

En el estado de la técnica se conocen numerosos procedimientos para la medición de la bioactividad de una proteína, un polipéptido o una molécula, por ejemplo ensayos de proteína, que utilizan sustratos marcados, análisis de sustratos mediante procedimientos cromatográficos, tales como HPLC o cromatografía en capa fina, procedimientos espectrofotométricos, etc. (véase, por ejemplo Maniatis et al (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY).

Por un fragmento en el sentido de la invención debe entenderse tanto un fragmento de un monómero de un miembro de la familia de ligandos de TNF como un fragmento de un polipéptido o proteína de la presente invención. Puede tratarse en este sentido de secuencias de aminoácidos, acortadas en el extremo N-terminal, en el extremo Cterminal o dentro de la secuencia, del monómero, polipéptido o proteína. En particular en el caso de acortamientos del polipéptido o proteína dentro de la secuencia puede tratarse de acortamientos de la secuencia de uno o varios de los tres monómeros, que a su vez pueden aparecer en el extremo N-terminal, en el extremo C-terminal o dentro de la secuencia.

En una forma de realización especialmente preferida de la invención, el fragmento representa un monómero cuyo dominio extracelular corresponde a todo el dominio extracelular del miembro de tipo natural soluble de la familia de ligandos de TNF o un tramo del mismo. En particular, el fragmento representa un monómero cuyo dominio extracelular corresponde o bien al TNF de tipo natural soluble (aminoácidos 77-233) o bien a todo el dominio extracelular (aminoácidos 53-233).

La producción de tales fragmentos se conoce ampliamente en el estado de la técnica y puede realizarse por un experto en la materia aplicando procedimientos convencionales (véase por ejemplo Maniatis et al (2001), Molecular cloning: Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press). En general, la producción de fragmentos de los monómeros, polipéptidos o proteínas puede realizarse modificando la secuencia de ADN que codifica para el monómero, polipéptido o proteína nativo, seguido de una transformación de esta secuencia de ADN en un huésped adecuado y la expresión de esta secuencia de ADN modificada, con la condición de que la modificación del ADN no destruya las actividades funcionales del monómero, polipéptido o proteína.

La identificación de un fragmento puede o bien tener lugar a través de la comprobación de su funcionalidad mediante la medición de su bioactividad, tal como se describió anteriormente, o bien también mediante una secuenciación del fragmento y una comparación posterior de la secuencia obtenida con la secuencia nativa. La secuenciación puede tener lugar mediante procedimientos convencionales, que son numerosos y se conocen ampliamente en el estado de la técnica.

Como variantes de monómeros, polipéptidos o proteínas biológicamente activos o fragmentos de los mismos o de un

componente A se denominan en particular aquellos monómeros, polipéptidos o proteínas o fragmentos de los mismos que presentan diferencias de secuencia con las secuencias nativas correspondientes. En el caso de estas diferencias de secuencia puede tratarse de una o varias inserciones, deleciones y/o sustituciones de aminoácidos, habiendo una homología de secuencia de por lo menos el 60%, preferentemente el 70%, más preferentemente el 80%, igualmente más preferentemente el 85%, aún más preferentemente el 90% y lo más preferentemente el 97%.

Para determinar la identidad porcentual de dos secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos, pueden alinearse las secuencias, para compararlas a continuación entre sí. Para ello pueden introducirse por ejemplo huecos en la secuencia de la primera secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico y compararse los aminoácidos o nucleótidos en la posición correspondiente de la segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico. Cuando una posición en la primera secuencia de aminoácidos está ocupada con el mismo aminoácido o el mismo nucleótido que en una posición en la segunda secuencia, entonces ambas secuencias son idénticas en esta posición. La identidad porcentual entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas dividido entre las secuencias.

La determinación de la identidad porcentual de dos secuencias puede realizarse mediante un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido, pero no limitativo, de un algoritmo matemático, al que puede recurrirse para la comparación de dos secuencias, es el algoritmo de Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877. Un algoritmo de este tipo está integrado en el programa NBLAST, con el que pueden identificarse secuencias que presentan una identidad deseada con las secuencias de la presente invención. Para obtener una alineación de huecos (también “gapped alignment”), tal como se describió anteriormente, puede utilizarse el programa “Gapped BLAST”, tal como se describe en Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402.

Las variantes biológicamente activas, es decir funcionales, de monómeros, polipéptidos o proteínas o fragmentos de los mismos en el sentido der invención, pueden presentar preferentemente propiedades de unión a receptores selectivas, pudiendo estar optimizada la variante por ejemplo con respecto a su bioactividad específica u otras propiedades, en particular su estabilidad.

Dentro del término variantes están incluidas en particular aquellas secuencias de aminoácidos que presentan una sustitución conservativa con respecto a las secuencias fisiológicas. Se denominan sustituciones conservativas aquellas sustituciones en las que se intercambian aminoácidos entre sí que proceden de una misma clase. En particular hay aminoácidos con cadenas laterales alifáticas, cadenas laterales con carga positiva o negativa, grupos aromáticos en las cadenas laterales o aminoácidos, cuyas cadenas laterales pueden formar puentes de hidrógeno, por ejemplo cadenas laterales que presentan una función hidroxilo. Esto significa que, por ejemplo, un aminoácido con una cadena lateral polar se sustituye por otro aminoácido con una cadena lateral igualmente polar o por ejemplo un aminoácido caracterizado por una cadena lateral hidrófoba se sustituye por otro aminoácido con una cadena lateral igualmente hidrófoba (por ejemplo serina (treonina) por treonina (serina) o leucina (isoleucina) por isoleucina (leucina)). Las inserciones y sustituciones son posibles en particular en aquellas posiciones de secuencia que no provocan una modificación de la estructura tridimensional o afectan a una región de unión. Una modificación de una estructura tridimensional mediante inserción (inserciones) o deleción (deleciones) puede comprobarse fácilmente, por ejemplo, con ayuda de espectros CD (espectros de dicroísmo circular) (Urry, 1985, Absorption, circular Dichroism and ORD of Polypeptides, en: Modem Physical Methods in Biochemistry, Neuberger et al (Ed.), Elsevier, Ámsterdam).

Procedimientos adecuados para la producción de variantes, por ejemplo de monómeros, polipéptidos o proteínas o fragmentos de los mismos con secuencias de aminoácidos, que presentan sustituciones con respecto a la(s) secuencia(s) nativa(s), se dan a conocer por ejemplo en los documentos US 4.737.462, US 4.588.585, US 4.959.314, US 5.116.943, US 4.879.111 y US 5.017.691. La producción de variantes en general se describe en particular también por Maniatis et al, (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). A este respecto pueden suprimirse, añadirse o intercambiarse codones. Las variantes pueden ser en particular también aquellas proteínas o polipéptidos que están estabilizados para evitar la degradación fisiológica, por ejemplo mediante estabilización de la estructura principal proteica mediante sustitución de la unión de tipo amida, por ejemplo también mediante la utilización de β-aminoácidos.

Igualmente pueden producirse variantes introduciendo modificaciones en los ácidos nucleicos que codifican para las variantes, tales como por ejemplo inserciones, deleciones y/o sustituciones de uno o varios nucleótidos. En el estado de la técnica se conocen numerosos procedimientos para tales modificaciones de secuencias de ácido nucleico. Una de las técnicas más utilizadas es la mutagénesis de sitio específico dirigida a oligonucleótidos (véase Comack B., Current Protocols in Molecular Biology, 8.01- 8.5.9, Ausubel F. et al, Ed. 1991). En esta técnica se sintetiza un oligonucleótido, cuya secuencia presenta una determinada mutación. Este oligonucleótido se hibrida entonces con un molde que contiene la secuencia de ácido nucleico de tipo natural. Preferentemente, en esta técnica se utiliza un molde de una sola hebra. Tras la hibridación del oligonucleótido y el molde se utiliza una ADN polimerasa dependiente de ADN, para sintetizar la segunda hebra del oligonucleótido, que es complementaria a la hebra de ADN del molde. Como resultado se obtiene una molécula heterodúplex, que contiene un apareamiento erróneo que se genera por la mutación mencionada anteriormente en el oligonucleótido. La secuencia de oligonucleótidos se introduce en un plásmido adecuado, éste se introduce en una célula huésped y en esta célula huésped se replica el ADN del oligonucleótido. Con esta técnica se obtienen secuencias de ácido nucleico con modificaciones

(mutaciones) dirigidas que pueden utilizarse para la producción de variantes según de la invención.

Los componentes A comprendidos en el polipéptido pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, un polipéptido puede contener 4, 5, 6 o más componentes A, que forman un tetrámero, pentámero, hexámero, etc. Igualmente, de manera especialmente preferible un polipéptido contiene un múltiplo entero de un trímero, tal como se ha descrito anteriormente, de los componentes A, por ejemplo dos, tres, cuatro o más trímeros dispuestos uno detrás de otro. Los componentes A contenidos en los polipéptidos pueden estar separados entre sí mediante ligantes (véase más adelante). Si a este respecto, tal como se describió anteriormente, están dispuestos dos, tres, cuatro o más trímeros de los componentes A uno detrás de otro, entonces los ligantes que unen entre sí los diferentes trímeros pueden ser eventualmente más largos que los ligantes que unen entre sí los componentes A en un único trímero.

Los componentes A pueden proceder del mismo o de diferentes organismos. A este respecto puede tratarse de vertebrados, en particular de mamíferos, por ejemplo ratón, rata, cerdo y sobre todo ser humano.

Según la invención, en el caso de los componentes A del polipéptido se trata en cada caso de un monómero o un fragmento funcional o una variante funcional de TNF (factor de necrosis tumoral; GenBank n.º de registro NM_000594).

En una forma de realización especialmente preferida, en el caso del componente A del polipéptido tal como se definió anteriormente se trata de un monómero de TNF que es resistente frente a la enzima de procesamiento TACE. TACE es un miembro de la familia de proteasas ADAM y representa la enzima de procesamiento específica de TNF fisiológica del TNF que se encuentra de manera natural en la membrana celular. El TNF se escinde habitualmente de la membrana celular y se libera al entorno. A un componente A según la invención, resistente frente a TACE, le falta preferentemente el sitio de escisión Ala-Val (por ejemplo AS 76-77 en scTNF según la nomenclatura SWISSPROT para TNF humano, n.º PO1375). El sitio de escisión puede eliminarse a este respecto según la invención mediante la deleción de uno o ambos aminoácidos relevantes Ala o Val. Alternativa o adicionalmente, según la invención la secuencia de reconocimiento para TACE (por ejemplo AS 77-88 en scTNF según la nomenclatura SWISSPROT para TNF humano, n.º PO1375) puede delecionarse total o parcialmente. Esto tiene lugar preferentemente mediante la deleción de dos, tres, cuatro o más aminoácidos, por ejemplo de todos los aminoácidos de la secuencia de reconocimiento de TACE. Para scTNF la secuencia resistente frente a TACE se encuentra por ejemplo en la región de los aminoácidos 89-233 (AS 89-233) del scTNF según la nomenclatura SWISSPROT para TNF humano, n.º PO1375. Una deleción de este tipo en el componente A impide una posible escisión del componente A, por ejemplo scTNF, mediante TACE cerca de los sitios de enlace de los componentes A en la región de los ligantes (componente B, véase más adelante), y aumenta por consiguiente la estabilidad in vivo de los polipéptidos. Eventualmente el acortamiento de la secuencia generado por la deleción puede compensarse mediante un alargamiento correspondiente de los ligantes. La deleción de la secuencia del componente A descrita a modo de ejemplo para scTNF puede aplicarse en cada uno de los componentes A mencionados anteriormente. Si la secuencia TACE no se elimina o sólo se elimina parcialmente, entonces se presta preferentemente atención a que en caso de utilizar componentes B o C adicionales (véase más adelante) en el polipéptido según la invención no se restablezca la secuencia de reconocimiento de TACE y el sitio de escisión de TACE.

En una forma realización especialmente preferida adicional, los componentes A del polipéptido de la invención tal como se definieron anteriormente están modificados de tal manera que los polipéptidos según la invención puedan acoplarse covalentemente a superficies. Este acoplamiento tiene lugar preferentemente a superficies planas o a partículas esféricas, tal como por ejemplo en partículas magnéticas (perlas magnéticas) o a nanopartículas/micropartículas, preferentemente como reactivo terapéutico, mimético para la célula, con propiedades similares al TNF unido a la membrana. Para el acoplamiento se introduce un grupo de acoplamiento, preferentemente el grupo SH de un resto cisteína, en la región N-terminal de por lo menos un componente A de un polipéptido. (Grupos de acoplamiento preferidos según la invención adicionales se describen más adelante). Esto puede tener lugar de manera especialmente preferible mediante la introducción de un resto cisteína en forma de una adición y/o sustitución en la posición deseada. El grupo de acoplamiento puede encontrarse en cualquier posición de la región N-terminal del componente A, preferentemente cerca del extremo N-terminal. De manera especialmente preferible el grupo de acoplamiento se encuentra en una región de los primeros 1-15, y aún más preferentemente en una región de los primeros 1-10 aminoácidos N-terminales. Por ejemplo, la modificación puede introducirse en un scTNF expresado en procariotas tras una metionina inicial (posición 2) de la secuencia de aminoácidos o en un scTNF expresado en eucariotas directamente tras la secuencia líder escindida, que representan por tanto los aminoácidos N-terminales del componente A. Alternativamente, en el caso de una etiqueta utilizada según la invención, por ejemplo una etiqueta de His, una etiqueta Flag (véase por ejemplo la figura 18) puede introducirse según la invención un grupo de acoplamiento, dando como resultado por ejemplo una etiqueta de CysHis con una cisteína en la posición de aminoácido 9. Una alternativa adicional incluye la introducción de un grupo de acoplamiento en uno o ambos componentes B (ligantes) del polipéptido.

Preferentemente, en un polipéptido sólo el componente A situado en el extremo N-terminal o la etiqueta situada más en el extremo N-terminal se dota de/modifica con un grupo de acoplamiento tal como se describió anteriormente. En una forma de realización adicional, en caso de un polipéptido, que contiene 3 componentes A, se modifican por ejemplo 2 o 3 de los componentes A con en cada caso un grupo de control, de modo que toda la molécula (el

polipéptido según la invención) puede acoplarse a través de dos o 3 uniones covalentes a una matriz adecuada para ello. El acoplamiento del polipéptido a través de uno o varios grupos de acoplamiento de todos los componentes A de un polipéptido preferentemente no perjudica a la función de los componentes A individuales del TNF, sino que posibilita más bien una mejora de la inmovilización del scTNF en superficies y/o partículas. Tal como se expuso anteriormente, cada uno de los polipéptidos según la invención contiene preferentemente las subunidades necesarias para la función biológica (componentes A) en una disposición funcionalmente relevante. Mediante el acoplamiento de un polipéptido a una superficie/una partícula, según la invención es posible producir superficies o partículas con, por ejemplo, homo o heterotrímeros u homo o heteromultímeros de TNF acoplados. Sobre estas superficies/partículas, los homo o heterotrímeros u homo o heteromultímeros de TNF acoplados están inmovilizados de manera estable y bioactiva. Mediante el principio de la cadena sencilla, el estado trimérico funcionalmente relevante de los componentes A se estabiliza mediante los componentes B, con lo que se garantiza que, tras un acoplamiento covalente a una superficie/las partículas, se excluya una disociación de los componentes A individuales y con ello se impida la pérdida de la bioactividad.

Una propiedad preferida de tales polipéptidos acoplados a superficies o partículas es su actividad biomimética, que corresponde a la de los ligandos de membrana naturales de la familia de TNF. Por ejemplo, un scTNF inmovilizado consigue una elevada afinidad por TNFR2 y con ello una elevada capacidad de señalización.

Los polipéptidos que contienen componentes A modificados con un grupo de acoplamiento, tal como se describieron anteriormente, y se acoplan/están acoplados a una superficie y/o partícula, pueden utilizarse según la invención para la detección así como para la manipulación, depleción y/o eliminación de parejas de unión de TNF así como de uniones asociadas con ellos. A este respecto son de interés prioritario los procedimientos para la manipulación, depleción y/o eliminación extracorporal de componentes contenidos en líquidos corporales, por ejemplo por medio de aféresis.

Las realizaciones siguientes con respecto a los objetos de la invención se refieren al miembro de la familia de ligados de TNF, TNF.

Los polipéptidos de la presente invención comprenden, además de los componentes A descritos, por lo menos dos componentes B, presentando el componente B la propiedad de un ligante peptídico. Como ligante peptídico en el sentido de la invención es concebible cualquier secuencia peptídica que pueda expresarse en un sistema biológico. Los ligantes peptídicos se representan en el caso de los constructos polipeptídicos por ejemplo como una unión flexible, pero que preferentemente no influye negativamente en las propiedades de trimerización intrínsecas del TNF. Preferentemente se seleccionan ligantes con propiedades tales, en particular flexibilidad y longitud, que puedan estabilizar los homotrímeros formados espontáneamente del respectivo ligando (derivado).

En una forma de realización preferida de la invención, en el caso del componente B se trata por tanto de ligantes peptídicos compuestos de 2 a 30, preferentemente entre 4 y 16 y de manera especialmente preferible entre 4 y 12 aminoácidos, que contienen preferentemente estructuras de glicina-serina repetitivas, muy preferentemente módulos Gly-Gly-Gly-Ser (módulos GGGS) en una disposición repetitiva.

Preferentemente en el caso de los ligantes peptídicos de la invención se trata por tanto de ligantes peptídicos ricos en glicina (G), es decir que la secuencia de aminoácidos de un ligante peptídico presenta un elevado porcentaje de glicina, preferentemente de desde el 60 hasta el 80%, de manera especialmente preferible del 75%.

En formas de realización especialmente preferidas de la invención, el ligante peptídico (componente B) comprende la secuencia de aminoácidos GGGSGGGSGGGS, también denominada (GGGS), o Lcorta, o la secuencia de aminoácidos GGGSGGGSGGGSGGS, también denominada (GGGS)4 o Llarga. Los ligantes peptídicos se denominan según la invención entre otros L1 y L2, de modo que también resultan denominaciones tales como L1corta, L2corta, L1larga y/o L2larga. Es posible la utilización de dos ligantes diferentes para la estabilización de una molécula trimérica.

Preferentemente los ligantes peptídicos según la invención, es decir los componentes B, enlazan en cada caso dos de dichos por lo menos tres componentes A entre sí. Este enlace tiene lugar covalentemente a través del extremo Cterminal de un componente A y el extremo N-terminal de un componente A adicional. El polipéptido representa una molécula monocatenaria (también denominada molécula de cadena sencilla o sc). Esto significa que todos los componentes A y componentes B que comprende el polipéptido se encuentran en una única hebra de polipéptido o de proteína.

En una forma de realización preferida de la invención, los componentes A y los componentes B forman una estructura proteica trimérica. Preferentemente en este caso se trata de una estructura proteica homotrimérica, aunque la invención también comprende estructuras proteicas heterotriméricas.

La formación de esta estructura proteica trimérica se provoca preferentemente por el componente B y/o se potencia por el mismo. Dado que el componente B que conduce a la trimerización o el componente B que potencia una trimerización del polipéptido no debería forman esencialmente ningún agregado superior, el componente B normalmente no debería presentar ningún resto cisteína, que puede formar un puente disulfuro intermolecular.

Preferentemente el componente B en un polipéptido por tanto no presentará ningún resto cisteína o sólo aquellos restos cisteína que un puente disulfuro intramolecular, es decir en el propio polipéptido, para evitar que en condiciones oxidantes pueda aparecer un enlace covalente con dicho por lo menos un resto cisteína de una proteína de fusión de otro trímero.

Las secuencias de polipéptidos nativos o fragmentos de estos polipéptidos nativos, que se utilizan como ligantes peptídicos según la invención, pueden encontrarse también en forma de variantes funcionales biológicamente activas de los mismos en el sentido de esta invención y según la definición anterior.

En el caso de los componentes B según la invención puede tratarse de secuencias peptídicas idénticas o diferentes que se producen de manera natural. Pueden proceder del mismo o de diferentes organismos. En el caso de los organismos puede tratarse de vertebrados, en particular de mamíferos, por ejemplo de ratón, rata, cerdo y sobre todo de ser humano.

El polipéptido puede presentar además de los componentes A y B tramos de secuencia adicionales. Se prefieren en este contexto las denominadas secuencias de etiqueta, por ejemplo por lo menos una etiqueta Flag, es decir la sucesión de aminoácidos DYKDDDDK, y/o por ejemplo por lo menos una etiqueta de His (que contiene varias histidinas consecutivas, por ejemplo por lo menos 5) y/o secuencias de etiqueta o antigénicas adicionales. Un tramo de secuencia adicional especialmente preferido es una secuencia peptídica líder. Preferentemente esta secuencia peptídica líder representa una señal para la secreción del polipéptido o proteína en células eucariotas. Esta secuencia peptídica líder está dispuesta preferentemente de manera N-terminal.

En una forma de realización adicional de la invención, un polipéptido comprende un componente C adicional, estando éste caracterizado por una interacción específica con una molécula de la superficie celular complementaria (“antígeno”). El principio de acción de los constructos polipeptídicos es acertado en particular para todos aquellos miembros de la familia de ligandos de TNF que son eficaces para determinados receptores exclusivamente o en un grado especialmente bueno como molécula de membrana. A éstos pertenecen, además de TRAIL (TNFSF10), FasL (TNFSF6) y TNF (TNFSF2), por ejemplo también los inmunomoduladores CD40L (TNFSF5) y CD30L (TNFSF8). El componente C presenta por tanto una función de “selección como diana”. Por consiguiente el componente C es un fragmento de anticuerpo, preferentemente un fragmento de anticuerpo monocatenario, un denominado scfv, o un derivado de anticuerpo que reconoce una molécula diana específica en una superficie celular. En una forma de realización adicional, el componente C es una proteína o péptido no perteneciente a los anticuerpos, pero que de manera análoga a una interacción anticuerpo-antígeno o una interacción receptor-ligando reconoce igualmente de manera selectiva una molécula diana específica sobre una superficie celular. En una forma de realización especialmente preferida, la presente invención comprende un polipéptido tal como se describió anteriormente como componente A, por lo menos un scTNF, así como como componente C un fragmento de anticuerpo tal como se describió anteriormente, por ejemplo scFv. De este modo se generan polipéptidos más pequeños con en cada caso un “dominio de selección como diana”. Tales polipéptidos más pequeños son ventajosamente menos propensos a, por ejemplo, una agregación.

Preferentemente en el caso del componente C se trata de un fragmento de anticuerpo que se une a antígeno o un derivado de anticuerpo que se una a antígeno de un mamífero, en particular de origen murino o humano, o se trata de un fragmento de anticuerpo humanizado o un derivado de anticuerpo humanizado, por ejemplo de origen mamífero. En el caso de la derivatización y/o humanización, el componente C se compone normalmente de un derivado murino de Fv de cadena sencilla producido según el estado de la técnica, un componente C humanizado mediante injerto de CDR o se trata de un componente C de origen completamente humano que se transforma de manera correspondiente en un derivado de scFv.

En una forma de realización preferida adicional, en el caso del componente C se trata de un ligando proteico o peptídico, que como monómero forma una unión específica a un receptor de membrana.

En una forma de realización preferida adicional, en el caso del componente C se trata de una proteína o péptido con especificidad para moléculas de la superficie celular, que es en particular un receptor de citocinas, un receptor de factor de crecimiento, una integrina o molécula de adhesión celular. De manera especialmente preferible se trata de un receptor de citocinas, que se selecciona del grupo de la familia de genes de TNFR.

El componente C de un polipéptido presenta preferentemente especificidad para un antígeno expresado de manera selectiva o dominante en el tejido tumoral. Un antígeno tumoral de este tipo puede expresarse en general en las propias células malignas o también en la parte no maligna del tumor, las células estromales o el endotelio tumoral. Los antígenos de este tipo de partes de tejido no malignas de un tumor sólido (carcinoma) son por un lado genéticamente invariables, por otro lado aparecen en las más diversas entidades tumorales y por tanto son marcadores tumorales universales. Ejemplos de tales ligandos para la asociación tumoral, contra los que puede estar dirigido un componente C del polipéptido, son el VEGFR o el complejo VEGFR/VEGF así como la integrina av β3 y la isoforma de vibronectina β Fn como estructuras diana ampliamente selectivas del endotelio tumoral y la proteína de activación de fibroblastos (como marcador selectivo del estroma tumoral). Todos los ejemplos mencionados anteriormente pueden detectarse eficazmente con scFv específico, por lo que los scFv de este tipo

(“Fv de cadena sencilla”) son especialmente adecuados como componente C de un polipéptido. También se tiene en cuenta galectina a este respecto como marcador tumoral, contra el que está dirigido el componente C.

Por consiguiente, se prefieren especialmente fragmentos de anticuerpo en diferentes formatos de anticuerpo, por ejemplo scFv, en particular scFv40, como componente C.

En otra forma de realización de la presente invención, el polipéptido reconoce a través de su componente C como molécula diana específica un receptor de membrana celular de un miembro de la familia de ligandos de TNF, preferentemente diferente del miembro de la familia de ligandos de TNF del componente A. Ejemplos, que no representan una enumeración concluyente, de tales ligandos posibles son TNFSF1 (LTalfa), TNFSF2 (TNF), TNFSF3 (LTbeta), TNFSF4 (OX40L), TNFSF5 (CD40L), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27L), TNFSF8 (CD30L), TNFSF9 (4-1BBL), TNFSF10 (TRAIL), TNFSF11 (RANKL), TNFSF12 (TWEAKL), TNFSF13 (APRIL), TNFSF143B (BLYS), TNFSF14 (LIGHT), TNFSF15 (VEGI), TNFSF16 (CD30L) y TNFSF18 (AITRL), así como EDA, los cuales o sus fragmentos funcionales o variantes funcionales de la secuencia nativa o de los fragmentos también pueden servir como componente A en un constructo polipeptídico. En particular se dan a conocer conjuntamente a este respecto todas las proteínas de tipo II de membrana (extremo C-terminal extracelular), sus fragmentos funcionales o variantes funcionales, que requieren una organización trimérica de sus subunidades como condición para la bioactividad. Se describe en Maniatis et al. (2001) supra.

Los procedimientos para la producción de un polipéptido que va a utilizarse según la invención comprenden normalmente las siguientes etapas (a) cultivar una célula huésped en condiciones adecuadas, (b) expresar un constructo de ácido nucleico correspondiente en condiciones adecuadas, y (c) aislar el polipéptido de las células huésped y/o del sobrenadante del cultivo.

Cultivar una célula huésped significa posibilitar que la célula huésped crezca en un medio de cultivo adecuado, a un pH adecuado y temperaturas adecuadas. Tales condiciones de crecimiento dependen de las células huésped utilizadas en cada caso y el experto en la materia las conoce ampliamente. Indicaciones para el cultivo de células se encuentran también en Maniatis et al. (2001), citado anteriormente.

La expresión del polipéptido puede tener lugar a este respecto normalmente según el estado de la técnica en sistemas de expresión adecuados, preferentemente como producto secretado de transfectantes estables, por ejemplo células CHO u otras células animales, tales como Cos7 o SF9 (células de insecto), o sistemas celulares eucariotas adicionales, por ejemplo Pichia pastoris. Preferentemente, los polipéptidos expresados presentan respectivas secuencias líder adecuadas para la secreción en el sistema celular. Por tanto, los vectores utilizados para la expresión contendrán también tramos codificantes, que codifican para una secuencia líder funcional, por ejemplo tal como se describe en Brocks et al (Immunotechnology 3: 173-184, 1997) para células de insecto y mamíferos o utilizando por ejemplo vectores pPIC-Zalfa (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) para la expresión y secreción en la levadura Pichia pastoris.

El aislamiento del polipéptido a partir de la célula huésped puede tener lugar mediante procedimientos convencionales, tales como procedimientos cromatográficos, procedimientos de precipitación, etc., que son adecuados para la purificación de polipéptidos y proteínas (véase también Maniatis et al (2001), citado anteriormente).

Son objeto de la presente invención procedimientos para la manipulación, depleción y/o eliminación extracorporal (ex vivo) de componentes contenidos en los líquidos corporales, como por ejemplo parejas de unión de un componente A tal como se definió anteriormente o células que se unen a los mismos o asociadas con los mismos. Tales procedimientos extracorporales comprenden preferentemente procedimientos tales como por ejemplo aféresis, en particular las formas básicas de la aféresis, die plasmaféresis y la citaféresis.

La plasmaféresis incluye según la invención la manipulación, depleción y/o eliminación extracorporal de determinados componentes solubles o suspendidos en la parte de plasma de la sangre, así como la recirculación de la sangre así tratada al paciente. Para ello se extrae sangre periférica a un paciente preferentemente por medio de una máquina de aféresis, se añaden a la sangre medios que inhiben la coagulación y se separa la sangre en sus componentes principales, partes sólidas (glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas sanguíneas) y líquidas (plasma). Tras la separación en estos componentes principales, los componentes de la sangre solubles o suspendidos contenidos en la fracción de plasma así obtenida pueden manipularse, agotarse y/o eliminarse en una etapa de procedimiento adicional, por ejemplo utilizando polipéptidos descritos según la invención. A continuación, el plasma sanguíneo así tratado puede combinarse con los componentes sanguíneos sólidos separados anteriormente y reinyectarse al paciente. La pérdida de volumen condicionada por la plasmaféresis puede sustituirse en el procedimiento según la invención además por solución salina isotónica. La plasmaféresis se realiza según la invención preferentemente utilizando procedimientos tales como intercambio terapéutico de plasma (TPE), inmunoabsorción (IA), precipitación (HELP), filtración por membrana diferencial y otros medios. A modo de ejemplo se mencionan en este caso columnas de filtración de plasma (véase por ejemplo el documento US 4.619.639, Asahi Medical Company, incorporado en la presente memoria mediante referencia). Igualmente pueden utilizarse sistemas

de filtración por membrana (MDF) utilizando diferentes partículas y superficies, por ejemplo filtros tales como filtros de sangre RheoFilter®AR2000 y PlasmaFlo®OP-05(W)L (fabricados por Asahi Medical Company, Ltd. de Japón). Alternativamente, en los procedimientos de plasmaféresis según la invención pueden utilizarse todas las superficies y partículas adecuadas.

En el caso de la citaféresis, según la invención, a diferencia de la plasmaféresis descrita anteriormente, se manipulan, agotan y/o eliminar de manera extracorporal los componentes celulares que circulan en la sangre y/o unidos a la médula ósea (glóbulos rojos, glóbulos blancos, células madre o trombocitos) o subpoblaciones específicas de estas células, para conseguir un efecto clínico. También en este caso se extrae preferentemente sangre periférica a un paciente por medio de una máquina de aféresis. Después se le añaden a la sangre opcionalmente medios que inhiben la coagulación y se separa la sangre en sus componentes principales. A continuación, en la fracción de la sangre que contiene los componentes celulares, pueden manipularse, agotarse y/o eliminarse estos componentes celulares en una etapa de procedimiento adicional, preferentemente también utilizando polipéptidos descritos según la invención. La fracción así obtenida puede reinyectarse finalmente de nuevo al paciente. Preferentemente, en el caso de la citaféresis según la invención, la separación de la sangre en diferentes fracciones así como eventualmente la separación de determinados componentes celulares de la sangre se produce por medio de procedimientos tales como centrifugación, filtración por membrana diferencial u otros medios. Pueden utilizarse además sistemas de filtración por membrana (MDF) utilizando diferentes partículas y superficies, por ejemplo filtros tales como filtros de sangre RheoFilter®AR2000 y PlasmaFlo®OP-05(W)L (fabricados por Asahi Medical Company, Ltd. de Japón).

En una tercera alternativa según la invención, los procedimientos de plasmaféresis y citaféresis descritos anteriormente pueden combinarse entre sí, por ejemplo para manipular, agotar y/o eliminar tanto componentes solubles o suspendidos en la parte de plasma de la sangre como componentes celulares que circulan en la sangre y/o unidos a la médula ósea (glóbulos rojos, glóbulos blancos, células madre o trombocitos) o subpoblaciones específicas de estas células, para conseguir un efecto clínico. Una combinación de este tipo de plasmaféresis y citaféresis se produce utilizando los polipéptidos descritos.

La presente invención se refiere a un procedimiento (de aféresis) según la reivindicación 1.

En una forma de realización especial del procedimiento de aféresis según la invención, antes de la separación de la sangre que eventualmente tiene lugar, puede realizarse opcionalmente una extracción de sangre en un paciente. Además opcionalmente la sangre tratada con el procedimiento según la invención o la fracción sanguínea así tratada puede reinyectarse de nuevo al paciente. Para ello es necesario combinar de nuevo eventualmente las fracciones sanguíneas separadas anteriormente y eventualmente tratadas de diferente manera con otros componentes sólidos y/o líquidos no tratados de la sangre. Las pérdidas de volumen generadas mediante el procedimiento según la invención pueden compensarse mediante la adición de líquidos adecuados, por ejemplo mediante la adición de una solución salina isotónica.

La etapa incluida en el procedimiento de aféresis según la invención para la unión de los componentes solubles, suspendidos o celulares de la sangre a una superficie o partícula acoplada con un polipéptido según la invención puede realizarse según sea necesario una vez o varias veces, para conseguir una selectividad deseada.

En el procedimiento de aféresis según la invención se utilizan aquellas superficies y/o partículas que se acoplaron covalentemente con un polipéptido según la invención, tal como se definió anteriormente. Para ello preferentemente el polipéptido se acopla covalentemente, a través del(de los) grupo(s) de acoplamiento A contenido(s) en el polipéptido, a la superficie y/o las partículas.

Un acoplamiento de los polipéptidos utilizados según la invención a través de los componentes A individuales tiene lugar preferentemente tal como se describe en el documento DE 101 44 252 A1. El acoplamiento de los polipéptidos utilizados según la invención tiene lugar preferentemente a este respecto a una superficie o partículas (vehículos) a través de una unión entre primeros grupos funcionales presentes en la superficie de los vehículos y en el polipéptido a través de los grupos de acoplamiento contenidos en componentes A. Estos grupos de acoplamiento son preferentemente complementarios a los grupos funcionales del vehículo y pueden formar con éstos una unión afín, preferentemente covalente. Preferentemente el grupo funcional del componente A está situado dentro del componente A de tal manera que está dispuesto fuera de los dominios del polipéptido responsables de la bioactividad a una distancia adecuada. De esta manera es posible, según la invención, inmovilizar TNF, de manera dirigida y manteniendo sus actividades biológicas, en el vehículo. Tras la inmovilización, el polipéptido está fijado preferentemente sobre la superficie del vehículo de tal manera que la estructura tridimensional del(de los) dominio(s) necesarios para la bioactividad no está modificada con respecto al polipéptido no inmovilizado, y de tal manera que el(los) dominio(s) en caso de contacto con parejas de reacción celulares está(n) accesibles libremente para las mismas. En una forma de realización preferida de la invención, el grupo funcional de la superficie del vehículo se selecciona del grupo compuesto por grupo amino, grupo carboxilo, grupo epoxi, grupo maleinimido, grupo alquilcetona, grupo aldehído, grupo hidrazina, grupo hidrazida, grupo tiol y grupo tioéster.

Según la invención los grupos de acoplamiento de los componentes A del polipéptido que deben inmovilizarse se

seleccionan de un grupo que contiene las mismas especies que para el grupo funcional de la superficie del vehículo. Una superficie/partícula (= vehículo) que puede utilizarse en el procedimiento de aféresis según la invención presenta por tanto en su superficie un grupo funcional que está enlazado covalentemente con un grupo de acoplamiento del polipéptido que debe inmovilizarse, siendo el grupo de acoplamiento del polipéptido un grupo distinto a la proteína funcional del vehículo. Los dos grupos funcionales y grupos de acoplamiento que se unen entre sí deben ser a este respecto complementarios entre sí, es decir deben poder formar una unión covalente entre sí. Si según la invención se utiliza como grupo funcional del vehículo por ejemplo un grupo amino, entonces el grupo de acoplamiento del componente A del polipéptido según la invención es un grupo carboxilo. Si, a la inversa, según la invención se utiliza un grupo carboxilo como grupo funcional del vehículo, entonces según la invención el grupo de acoplamiento del componente A del polipéptido es un grupo amino. Si según la invención se selecciona como grupo funcional del vehículo un grupo tiol, entonces según la invención el grupo de acoplamiento complementario del componente A del polipéptido es un grupo maleinimido. Si, a la inversa, se selecciona un grupo maleinimido como grupo funcional del vehículo, entonces según la invención el grupo de acoplamiento complementario del componente A del polipéptido es un grupo tiol. Si según la invención se utilizar como grupo funcional del vehículo un grupo alquilcetona, en particular un grupo metilcetona o aldehído, entonces el grupo de acoplamiento complementario funcional del componente A del polipéptido es un grupo hidracina o hidrazida. Si, a la inversa, según la invención se utiliza un grupo hidracina o hidrazida como grupo funcional del vehículo, entonces según la invención el grupo de acoplamiento complementario funcional del componente A del polipéptido es un grupo alquilcetona, en particular metilcetona o aldehído. Según la invención, de manera especialmente preferible en el caso del grupo funcional en la superficie del vehículo se trata de un grupo maleinimido y en el caso del grupo de acoplamiento del componente A del polipéptido, de un grupo tiol.

La inmovilización tiene lugar a este respecto preferentemente de manera dirigida. En relación con la presente invención, el término “inmovilizado de manera dirigida” o “inmovilización dirigida” significa que un scTNF está inmovilizado en un vehículo en posiciones definidas dentro del scTNF de tal manera que la estructura tridimensional del(de los) dominio(s) necesario(s) para la bioactividad no está modificada con respecto al estado no inmovilizado y de tal manera que este(estos) dominio(s) de TNF, por ejemplo cavidades de unión para parejas de reacción celulares, en caso de contacto con parejas de reacción celulares está(n) accesible(s) libremente para las mismas. “Inmovilizado de manera dirigida” significa también que el acoplamiento del polipéptido sobre la superficie del vehículo tiene lugar de tal manera que la proteína inmovilizada, en caso de una utilización posterior en un entorno celular o similar a una célula, no puede degradarse o sólo muy lentamente mediante enzimas degradadores de proteínas. Es decir, la molécula de TNF inmovilizada está orientada sobre la superficie del vehículo de tal manera que ofrece el menor número posible de puntos de ataque para proteasas. Adicionalmente, el polipéptido puede hacerse resistente frente a proteasas antes del acoplamiento mediante procedimientos de biología molecular, tal como se describió por ejemplo anteriormente para miembros de TNF en el caso de la proteasa TACE.

El polipéptido conserva por medio de su(s) componente(s) A acoplado(s) su función biológica y la capacidad para crear una interacción con otros compuestos/sustancias. Si un polipéptido contiene por ejemplo tres componentes A (trímero), entonces normalmente todos, dos o preferentemente sólo uno de los tres componentes A se unen covalentemente a la superficie/a la partícula.

Las superficies y/o partículas adecuadas para el acoplamiento pueden comprender todas las superficies y/o partículas adecuadas, a las que pueden acoplarse los polipéptidos. Se prefieren en particular placas de cultivo o las denominadas microperlas, por ejemplo Dynabeads (Dynal Biotech GMBH), nanoperlas, nanopartículas o fases sólidas tales como por ejemplo lana de nailon, Sepharose, Sephadex, etc. Según la invención está previsto además que en el caso de los sistemas de vehículo utilizados según la invención se trate de nanopartículas compactas ohuecas con tamaños de entre 25 y 1000 nm. Éstas están compuestas por materiales particulados o bien orgánicos o bien inorgánicos. El tipo del material puede variarse según la invención conforme a la aplicación posterior, estando compuesto del vehículo de las nanopartículas preferentemente por materiales biológicamente compatibles y/o biodegradables. En relación con la presente invención, por “nanopartículas” se entienden además matrices de unión, que comprenden un vehículo con una superficie en la que están dispuestos grupos funcionales químicamente reactivos, que forman con grupos funcionales complementarios de moléculas que van a unirse, en particular polipéptidos, uniones afines, es decir uniones covalentes y/o no covalentes y de esta manera pueden fijar los polipéptidos a sus superficies de manera estable. Los vehículos de las nanopartículas están compuestos por materiales inorgánicos u orgánicos químicamente inertes y presentan un tamaño de menos de 1 μm, preferentemente de desde 25 hasta 500 nm.

Una forma de realización especial del procedimiento de aféresis según la invención incluye una superficie biofuncionalizada (plana o como partículas) con el polipéptido scTNF, que se inmovilizó de la manera descrita anteriormente covalentemente y de manera dirigida sobre la superficie. Una superficie biofuncionalizada de este tipo, que incluye por ejemplo varias moléculas de scTNF inmovilizadas o variantes de las mismas, posibilita una afinidad elevada por las respectivas parejas de unión complementarias, por ejemplo TNFR1 y TNFR2. Los receptores TNFR1 y en particular TNFR2 se encuentran en concentraciones muy elevadas como moléculas procesadas, solubles, en la sangre de pacientes con tumor y en el caso de otras enfermedades. La eliminación de TNFR de la sangre de pacientes con tumor conduce, como puede comprobarse, a regresiones tumorales documentadas clínicamente, lo que se atribuye a la reconstitución de la defensa propia del cuerpo (véase por ejemplo Lentz M R, (1999)

Therapeutics Apheresis, vol. 3, n.º 1). Un procedimiento de aféresis con scTNF posibilita que preferentemente ambos receptores de TNF puedan eliminarse al mismo tiempo y de manera eficaz de las muestras. Una ventaja adicional de este procedimiento es el hecho, descrito anteriormente, de que no es posible una disociación de componentes A individuales del polipéptido, es decir no se espera ni una pérdida de actividad de la superficie funcionalizada ni una contaminación de la sangre tratada con sustancias disociadas.

El procedimiento de aféresis según la invención puede realizarse como procedimiento continuo o como procedimiento discontinuo. Como procedimiento continuo, el procedimiento según la invención se realiza de manera preferible directamente a continuación de la extracción de sangre o el fraccionamiento de la sangre extraída y antes de la recirculación de la sangre al paciente sin un almacenamiento intermedio de la sangre o de las fracciones sanguíneas obtenidas. Por el contrario, en un procedimiento discontinuo la sangre extraída o las fracciones de la sangre extraída pueden almacenarse tras cada etapa durante un determinado periodo de tiempo.

La temperatura en procedimientos de aféresis según la invención se encuentra preferentemente a 0-40ºC. En el caso de un procedimiento continuo, la temperatura se encuentra preferentemente a de 25 a 40ºC, de manera especialmente preferible en un intervalo de entre 36 y 38ºC. En el caso de un procedimiento discontinuo, la temperatura puede encontrarse entre 0-40ºC.

El procedimiento de aféresis según la invención tal como se describió anteriormente se utiliza preferentemente para el diagnóstico, la terapia y/o la profilaxis en enfermedades asociadas con TNF, en particular en enfermedades tumorales, en particular tumores sólidos o linfáticos, en particular tumores sólidos y linfáticos. El restablecimiento de la homeostasis del sistema inmunitario con sus componentes humorales y celulares se considera clave para la eficacia de los procedimientos de aféresis. Por tanto, en una aplicación adicional, el sistema de aféresis según la invención también puede utilizarse para el restablecimiento de la homeostasis inmunitaria en el caso de enfermedades no malignas. A éstas pertenecen las enfermedades inflamatorias, enfermedades artríticas y reumáticas o enfermedades del sistema inmunitario, así como para el tratamiento de enfermedades infecciosas, enfermedades metabólicas, estados inflamatorios, enfermedades hiperproliferativas, enfermedades autoinmunitarias, en particular enfermedades reumatoides/artríticas, necrólisis epidérmica tóxica (TEN), esclerosis múltiple, tiroiditis de Hashimoto, GvHD, hepatitis viral (VHB, VHC), hepatitis inducida por alcohol, reacciones de rechazo en trasplante de hígado, enfermedades que se basan en reacciones hiperapoptóticas, enfermedades degenerativas, en particular enfermedades neurodegenerativas.

En el caso de las enfermedades tumorales están comprendidas en particular carcinomas de colon, melanomas, carcinomas renales, linfomas, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoide aguda (ALL), leucemia mieloide crónica (CML), leucemia linfocítica crónica (CLL), tumores gastrointestinales, carcinomas pulmonares, gliomas, tumores de la tiroides, carcinomas de mama, tumores de próstata, hepatomas, diversos tumores inducidos por virus tales como por ejemplo carcinomas inducidos por el virus del papiloma (por ejemplo carcinoma de cuello uterino), adenocarcinomas, tumores inducidos por virus del herpes (por ejemplo linfoma de Burkitt, linfoma de células B inducido por VEB), tumores inducidos por hepatitis B (carcinomas hepatocelulares), linfomas inducidos por VLTH-1 y VLTH-2, neurinoma acústico, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón, cáncer de garganta, carcinoma anal, glioblastoma, linfomas, carcinoma de recto, astrocitoma, tumores cerebrales, cáncer de estómago, retinoblastoma, basalioma, metástasis cerebrales, meduloblastomas, cáncer de vagina, cáncer de páncreas, cáncer de testículos, melanoma, carcinoma de tiroides, cáncer de vejiga, síndrome de Hodgkin, meningeomas, enfermedad de Schneeberg, carcinoma de bronquios, tumor de la hipófisis, micosis fungoide, cáncer de esófago, cáncer de mama, carcinoides, neurinoma, espinalioma, linfoma de Burkitt, cáncer de laringe, cáncer renal, timoma, carcinoma endometrial, cáncer de huesos, linfomas no Hodgkin, cáncer de uretra, síndrome de CUP, tumores de cabeza y cuello, oligodendroglioma, cáncer de vulva, cáncer de intestino, carcinoma de colon, carcinoma de esófago, participación en verrugas, tumores del intestino delgado, craneofaringeomas, carcinoma ovárico, tumores de partes blandas, cáncer de las trompas de falopio, cáncer de hígado, carcinoma de páncreas, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de endometrio, metástasis de hígado, cáncer de pene, cáncer de lengua, cáncer de la vesícula biliar, leucemia, plasmocitoma, cáncer de útero, tumor de párpado, cáncer de próstata, etc.

Las enfermedades artríticas comprenden en particular monoartritis, oligoartritis, poliartritis, artritis aguda (sobre todo artritis reactiva, inducida por cristales, séptica y sarcoidosis aguda), artritis subaguda, artritis crónica (sobre todo artritis reumatoide, artritis en el caso de espondiloartritis seronegativa), artritis infecciosa, artritis para-o posinfecciosa, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, artritis en el caso de enfermedades del tejido conjuntivo inflamatorias y vasculitis, artritis alérgica, artritis en relación con enfermedades metabólicas y alteraciones dependientes de la alimentación, artritis en el caso de trastornos endocrinos, artritis en el caso de enfermedades granulomatosas, artritis en el caso de enfermedades del sistema hematopoyéticos, artritis en el caso de hemorragias en las articulaciones como consecuencia de alteraciones de la coagulación sanguínea, artritis neoplásica, artritis paraneoplásica, artritis (pos)traumática, artritis en el caso de enfermedades del cartílago articular, artritis en el caso de neuropatías, artritis en el caso de dermatosis pustulosa que forma abscesos, necrotizante o asociada a neutrofilia tisular, artritis en el caso de otras enfermedades primarias extraarticulares, así como artritis alérgica, artritis inducida por clamidia, artritis disentérica, artritis gonorreica, artritis mutilante, artritis psoriásica, artritis seca, artritis sifilítica, artritis tuberculosa, artritis úrica, etc.

En resumen puede establecerse que en la presente memoria se da a conocer un polipéptido que presenta estabilidad aumentada, porque la molécula entera se compone de una hebra de proteína o de polipéptido (scTNF), de modo que los monómeros (componentes A) ya no pueden disociarse. scTNF, cuya bioactividad en la técnica no muestra diferencia cualitativa con el sTNF soluble normal (también TNF de tipo natural o wtTNF), es sin embargo mucho más estable y muestra por tanto mayor bioactividad, es decir es activo a concentraciones más bajas. Igual que TNF soluble normal (wtTNF), scTNF consigue provocar la apoptosis en células sensibles, activar el factor de transcripción NF-κB, activar el receptor TNFR1, pero no el TNFR2, así como, en presencia de determinados anticuerpos (por ejemplo 80M2) también activar el receptor TNFR2. En caso de una utilización de los polipéptidos con un grupo de acoplamiento para la producción de superficies biofuncionalizadas y utilización de los mismos por ejemplo para aféresis, no se observa pérdida del polipéptido o una reducción de ligandos perjudiciales en el sistema. Además, scTNF representa un material de partida ideal para la producción de moléculas bifuncionales nuevas. Por un lado, scTNF, o fragmentos funcionales del mismo, puede unirse covalentemente a superficies celulares. Esto presenta la ventaja de que en este caso sólo debe establecerse un único enlace covalente para la unión estable de la molécula. En el caso de un miembro de tipo natural soluble normal de la familia de ligandos de TNF, por ejemplo sTNF soluble, deben enlazarse covalentemente los tres monómeros del homotrímero individual a la superficie, para obtener una construcción estable, porque de el contrario los monómeros unidos no covalentemente se disocian. En esta forma de realización es especialmente ventajosa una aplicación en la aféresis con scTNF como principio activo biofuncional para la eliminación de receptores de TNF de los líquidos corporales.

Igualmente es posible mediante la presente invención, debido al enlace covalente de los monómeros (componentes A) del polipéptido, insertar mutaciones de manera dirigida en sólo uno o también dos o más de dichos por lo menos tres monómeros (componentes A) de manera estable. Así, por ejemplo se conocen mutaciones puntuales, que fuerzan una selectividad por receptor, es decir por ejemplo en el caso de TNF se logra una unión sólo a uno de los dos receptores de TNF (TNFR1 y TNFR2). Según la invención por primera vez es posible producir un mutante de por ejemplo TNF, que por ejemplo consigue unir de manera controlada una molécula de TNFR1 y dos moléculas de TNFR2 al mismo tiempo, es decir se originan complejos de receptor heteroméricos. A este respecto por primera vez es posible producir miembros heteroméricos, estables y de cadena sencilla, de la familia de ligandos de TNF, que unen y activan de manera dirigida sólo uno de varios receptores posibles.

La presente invención se explicará en detalle mediante las figuras a continuación:

La figuras 1 a 3 muestran resultados de diferentes pruebas de citotoxicidad biológicas, en las que se estudian y comparan las características, en particular la especificidad, de distintas variantes de scTNF con las de TNF de tipo natural soluble clásico, es decir el dominio extracelular soluble del TNF humano (NCBI gi:25952111, 17,09 kDa como monómero de la forma soluble, abreviado con TNFhum o sTNF, AA 79-181).

Para estos ensayos se utilizaron tanto fibroblastos de ratón transferidos como células Kym1 humanas. Se representan resultados a modo de ejemplo de los análisis, en los que se someten a prueba variantes de scTNF, que presentan ligantes peptídicos de longitudes diferentes entre los módulos de TNF individuales (es decir monómeros de TNF). Los ligantes peptídicos consisten en cada caso en la repetición de secuencia de aminoácidos GGGS triple

: o cuádruple (o también GlyGlyGly-Ser) (denominada como “TNF3x de cadena sencilla” o “TNF4x de cadena sencilla”

: o como “scTNF3x” o “scTNF4x”).

La figura 1 muestra el resultado de una prueba de citotoxicidad típica de TNF. Como células diana se utilizaron fibroblastos de ratón (MF) de ratones deficientes dobles para TNFR1/TNFR2, que expresan la quimera de receptor TNFR1 (TNFR1-Fas) estable (células TNFR1-Fas de MF). Tales células expresan una molécula híbrida, que extracelularmente consiste en la parte correspondiente del TNFR1, y por consiguiente se une a TNF, e intracelularmente presenta el dominio intracelular de acción apoptótica fuerte del receptor Fas. Estas células TNFR1-Fas de MF pueden activarse mediante estímulos específicos para TNFR1, sin embargo transmiten una señal de muerte específica de Fas. El recuento de células supervivientes se cuantificó tras 24 horas mediante tinción con un colorante mediante su absorción. Como control negativo se utilizó un lisado de bacterias control, que se trató de un lisado de bacterias que no expresa scTNF, que se procesó de manera idéntica a las proteínas de scTNF recombinantes. En los resultados se establece que tanto el TNF soluble humano convencional (TNFhum) como las variantes de scTNF recombinantes conducen a la muerte celular. Puede reconocerse un efecto citotóxico comparable, dependiente de la dosis, de TNFhum o scTNF (véanse las tres curvas inferiores de la gráfica), siendo la actividad específica de scTNF por lo menos equivalente, sino incluso mayor, que la de TNF de tipo natural. Tal como se esperaba, el control negativo no mostró efecto tóxico.

En un enfoque de ensayo adicional se sometió a prueba el efecto de anticuerpos específicos de TNF neutralizados sobre la citotoxicidad de TNF de tipo natural (TNFhum) o scTNF. Se utilizaron diluciones recién preparadas de TNF humano soluble (TNFhum) o de las variantes de scTNF descritas anteriormente con ligantes peptídicos de glicinaserina triples (3x) o cuádruples (3x) (scTNF3x: GGGS-GGGS-GGGS / scTNF4x: GGGS-GGGS-GGGS-GGGS). Se utilizaron series de concentraciones con diluciones 1:3 en presencia y ausencia de anticuerpos específicos para TNF neutralizados (αTNF-AK) [1μg/ml). Como control negativo se utilizó el lisado de bacterias control descrito anteriormente. Como resultado se reconoce que el efecto citotóxico de TNF de tipo natural humano soluble o scTNF puede anularse mediante anticuerpos específicos para TNF neutralizados (véanse las tres curvas superiores de la

gráfica) y concretamente en un intervalo de concentración amplio (0,03-10 ng/ml). No se establecieron diferencias entre la reacción de scTNF con ligantes peptídicos triples y scTNF con ligantes peptídicos cuádruples.

La figura 2 muestra el resultado de una prueba de citotoxicidad en la que se estudia el efecto de sTNF y variantes de scTNF sobre células que expresan quimeras de receptor TNFR2 (TNFR2-Fas). En este enfoque de ensayo se utilizan fibroblastos de ratón, que expresan quimeras de receptor estables, que consisten en TNFR2 y Fas (TNFR2-Fas, en las que la parte extracelular de TNFR2 procede de la parte intracelular de receptor Fas), (células TNFR2-Fas de MF). Las células TNFR2-Fas de MF (al igual que de TNFR2 de tipo natural) únicamente pueden activarse mediante un estímulo de TNFR2 adecuado, por ejemplo mediante TNF de membrana, pero no mediante TNF soluble. Resultado: Tal como se esperaba, ni el TNF humano soluble (TNF humano) ni las variantes de scTNF muestran efecto tóxico con ligantes peptídicos triples y cuádruples (scTNF3x, scTNF4x) sobre las células TNFR2-Fas de MF. En otras palabras, sTNF y las variantes de scTNF no pueden activar, de la misma manera, células que expresan quimeras de TNFR2 (TNFR2-Fas), es decir no provocan en estas células la muerte celular. Igualmente, tal como se esperaba, el lisado de bacterias control utilizado como control negativo (tal como se describió anteriormente) no mostró efecto tóxico.

La figura 3 muestra el resultado de una prueba de citotoxicidad en la que se estudió el efecto de TNF de tipo natural humano soluble y una variante de scTNF en combinación con un anticuerpo específico para TNFR2 especial, 80M2, sobre células que expresan quimeras de TNFR2 (FNFR2-Fas). El enfoque de ensayo corresponde al de la figura 2 con la diferencia de que se añadió el TNF de tipo natural soluble o el scTNF con ligantes peptídicos triples (scTNF3x) junto con el anticuerpo 80M2. A este respecto se conoce que el anticuerpo 80M2 confiere al TNF soluble normal la capacidad de señalización especial de TNF unido a membrana. El resultado muestra que tanto TNF de tipo natural soluble como scTNF en combinación con el anticuerpo 80M2 logran un fuerte efecto citotóxico sobre las quimeras de receptores TNFR2-Fas. Un motivo para esto es que TNF soluble en combinación con determinados anticuerpos específicos para TNFR2, tal como por ejemplo 80M2, puede desarrollar la actividad de TNF unido a membrana. Las células TNFR-2-Fas de MF se destruyen tras la incubación con TNF soluble o el scTNF en presencia de un anticuerpo estabilizador del complejo ligando-receptor de este tipo (80M2-AK). Es decir, en presencia de este anticuerpo, TNF soluble así como scTNF provocan en la misma medida un efecto tóxico en las células TNFR2/FAS de MF, igual al que sólo puede lograrse mediante TNF de membrana. Tal como se esperaba, el lisado de bacterias control utilizado como control negativo (tal como se describió anteriormente en la figura 1) no mostró efecto tóxico.

Las figuras 4 a 10 muestran resultados de diferentes pruebas de estabilidad, que corroboran que las variantes de scTNF según la invención, debido a su estructura, disponen de una estabilidad notablemente mejor que TNF de tipo natural soluble.

Se incubaron sTNF o las variantes de scTNF en medio de cultivo que contiene suero en concentraciones de desde 3,0 hasta 0,01 ng/ml a 37ºC y CO2 al 5% durante diferentes tiempos. A continuación se sometió a prueba la funcionalidad de sTNF o variantes de scTNF (scTNF3x, scTNF4x) en pruebas de citotoxicidad, basadas en células TNFR1-Fas de MF y células Kym1. Para estas pruebas de citotoxicidad se utilizaron diluciones 1:3, partiendo de una muestra de TNF 3,0 ng/ml. Como control negativo se utilizó el lisado de bacterias control utilizado en las pruebas de citotoxicidad descritas anteriormente (lisado de bacterias que no expresan scTNF, que se procesó de manera idéntica a las proteínas de scTNF recombinantes).

La figura 4 muestra la bioactividad de las moléculas utilizadas antes de las pruebas de estabilidad sobre células TNFR1-Fas de MF de fibroblastos de ratón. Se prepararon nuevas diluciones de TNF de tipo natural humano soluble (TNFhuman) y scTNF y se diluyeron con las células. Tanto el TNF control soluble como las variantes de scTNF condujeron tras la incubación con las MF a su muerte celular. Tal como se esperaba, el lisado de bacterias control no mostró efecto tóxico. Los valores de DE50 (mitad de la concentración activa máxima) se situaron a aproximadamente 0,2 ng/ml para el TNF de tipo natural humano soluble y a 0,1 ng/ml para las dos variantes de scTNF diferentes utilizadas. Tal como se esperaba, el lisado de bacterias control utilizado como control negativo no mostró efecto tóxico.

La figura 5 muestra el resultado de una prueba de estabilidad con células TNFR1-Fas de MF de fibroblastos de ratón. Las diluciones de TNF de tipo natural y scTNF mostradas en la figura 5 se incubaron en este caso durante 8 días en un incubador de células antes de llevar a cabo la prueba, para poder valorar la estabilidad de las muestras. Pudo medirse una clara disminución de la bioactividad del TNF de tipo natural soluble (TNFhuman) tras 8 días a 37ºC, mientras que la actividad de las dos variantes de scTNF (scTNF3x, scTNF4x; véase la explicación anteriormente) se mantuvo invariable. Para el TNF de tipo natural se obtuvo un valor de DE50 de aproximadamente 2 ng/ml (recién utilizado 0,2 ng/ml, véase la figura 4). Las variantes de scTNF se mantuvieron con valores de DE50 de aproximadamente 0,1 ng/ml igual de activas que las muestras recién preparadas (véase la figura 4). Tal como se esperaba, el lisado de bacterias control utilizado como control negativo no mostró efecto tóxico.

La figura 6 muestra el resultado de una prueba de estabilidad con células TNFR1-Fas de MF de fibroblastos de ratón. Se incubaron las disoluciones de TNF de tipo natural y scTNF tal como se explica en la figura 5 en este caso durante 14 días en un incubador de células. Pudo medirse una clara disminución adicional de la bioactividad del TNF

de tipo natural tras 14 días a 37ºC, mientras que la actividad de las variantes de scTNF se mantuvo aproximadamente igual. Para sTNF se obtuvo un valor de DE50 de aproximadamente 2,8 ng/ml (recién utilizado 0,2 ng/ml, véase la figura 4), las variantes de scTNF se mantuvieron con 0,13 ng/ml casi igual de activas que las muestras recién preparadas (0,1 ng/ml, véase la figura 4). Tal como se esperaba, el lisado de bacterias control utilizado como control negativo no mostró efecto tóxico.

La figura 7 muestra el resultado de una prueba de estabilidad con la línea de células humanas Kym1. Las células Kym1 expresan receptores de TNF de tipo natural humanos normales y reaccionan igualmente de manera citotóxica sobre TNF. El ensayo se llevó a cabo de manera análoga a las pruebas de estabilidad con fibroblastos de ratón según las figuras 4 a 6: Se incubaron TNF de tipo natural soluble o variantes de scTNF (scTNF3x, scTNF4x) en un medio que contenía suero a concentraciones de desde 3,0 hasta 0,01 ng/ml a 37ºC y CO2 al 5% durante diferentes tiempos. A continuación se sometió a prueba la funcionalidad del sTNF soluble o de las variantes de scTNF en pruebas de citotoxicidad sobre células Kym1. Partiendo de una muestra de TNF 3,0 ng/ml se utilizaron diluciones 1:3 para la prueba. Como control negativo se utilizó el lisado de bacterias control descrito anteriormente. Se prepararon nuevas diluciones de TNF de tipo natural y scTNF y se utilizaron. El resultado muestra que tanto TNF de tipo natural como las variantes de scTNF presentan fuerte actividad citotóxica. Los valores de DE50 se sitúan a aproximadamente 0,1 ng/ml para el TNF de tipo natural y a aproximadamente 0,06 ng/ml para las variantes de scTNF. Tal como se esperaba, el lisado de bacterias control utilizado como control negativo no mostró efecto tóxico.

La figura 8 muestra el resultado de una prueba de estabilidad con la línea de células humanas Kym1. Las disoluciones de TNF de tipo natural y scTNF se incubaron en este caso durante 16 días en un incubador de células. A continuación se llevó a cabo la prueba de citotoxicidad de células Kym1. Pudo medirse una clara disminución de la actividad de sTNF tras 16 días a 37ºC, mientras que por el contrario la toxicidad, es decir la bioactividad, de las variantes de scTNF se mantuvo aproximadamente igual. Para TNF de tipo natural se obtuvo un valor de DE50 de aproximadamente 1,2 ng/ml. Las variantes de scTNF se mantuvieron con 0,06 ng/ml igual de activas que las muestras recién preparadas. Tal como se esperaba, el lisado de bacterias control utilizado como control negativo no mostró efecto tóxico.

La figura 9 muestra el resultado de una prueba de estabilidad con la línea de células humanas Kym1. Se incubaron las disoluciones de sTNF y scTNF en este caso durante 22 días en un incubador de células. Pudo medirse una clara disminución adicional de la actividad de sTNF tras 22 días a 37ºC. Las variantes de scTNF eran igual de estables antes y después. Tal como se esperaba, el lisado de bacterias control utilizado como control negativo no mostró efecto tóxico.

La siguiente tabla 1 muestra los datos de los resultados de las pruebas de estabilidad según las figuras 7 y 9 en comparación:

Tabla 1: Comparación de los valores de ED50 de las figuras 7+9

DE50 recién valorado: DE50 tras 22 días Pérdida de actividad

(figura 7): (figura 9)

sTNF: 0,1 ng/ml 1,50 ng/ml >90%

scTNF: 0,06 ng/ml 0,07 ng/ml Apenas comprobable

La figura 10 muestra el resultado de una prueba de estabilidad con la línea de células humanas Kym1. Se valoraron diluciones de 3 ng/ml tras 16 días a 37ºC. Al contrario que en las figuras 4 a 9 anteriores, en este ensayo se confeccionó una curva de valoración partiendo de una dilución de TNF 3 ng/ml que se almacenó 16 días, mientras que en el caso de las curvas de valoración mostradas anteriormente se produjeron las diluciones en cada caso y después se almacenaron durante el tiempo determinado. Queda por determinar que una comparación de los datos de la figura 8 (ensayo análogo con tiempo de incubación de 16) y la figura 10 no da diferencias importantes. Tal como se esperaba, el lisado de bacterias control utilizado como control negativo no mostró efecto tóxico.

La figura 11 muestra el resultado de una prueba de estabilidad en suero humano. Para someter a prueba la estabilidad de TNF de tipo natural y scTNF en suero humano, en un primer enfoque de ensayo se diluyó el TNF de tipo natural soluble y la variante de scTNF4x en suero al 100% y se valoró inmediatamente. Como resultado, para TNF de tipo natural se midió un valor de DE50 de 0,004 ng/ml y para la variante de scTNF, un valor de DE50 de 0,007ng/ml.

La figura 12 muestra el resultado de una prueba de estabilidad en suero humano. Para someter a prueba la estabilidad de TNF de tipo natural y scTNF en suero humano, en un enfoque de ensayo adicional se almacenaron TNF de tipo natural y la variante de scTNF4x en suero no inactivado por calor recién preparado al 100% durante 8 días a 37ºC y a continuación se valoró en células Kym1. Como resultado, para TNF de tipo natural se midió un valor de DE50 de 0,40 ng/ml y para la variante de scTNF, un valor de DE50 de 0,03 ng/ml. Las consecuencias del almacenamiento de 8 días en suero al 100% se representan tal como sigue: en comparación con scTNF valorado inmediatamente, el scTNF almacenado 8 días mostró una pérdida de actividad alrededor del factor de aproximadamente 4,3, mientras que para el scTNF soluble mostró una pérdida de actividad drástica alrededor del

factor 100 durante el almacenamiento en suero al 100%. Por consiguiente, el scTNF según la invención mostró, en comparación con sTNF, una bioactividad notablemente más alta tras la incubación de 8 días en suero y por consiguiente se confirma como muy estable en suero humano a temperaturas fisiológicas.

En la siguiente tabla 2 se ponen a disposición los datos de los resultados de las figuras 11 y 12 una vez más como aclaración.

Tabla 2: Comparación de los valores de ED50 de las figuras 11+12

DE50 recién valorado: DE50 tras 8 días Pérdida de actividad

(figura 11): (figura 12)

TNF soluble: 0,004 ng/ml 0,40 ng/ml 100 veces

TNF de cadena sencilla: 0,007 ng/ml 0,03 ng/ml 4,3 veces

La figura 13 muestra el resultado de un análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones reductoras y desnaturalizantes. Se representa un gel de plata de TNF de tipo natural purificado y las variantes de scTNF purificadas, scTNF3x y scTNF4x. En cada caso se incuban las muestras con β-mercaptoetanol (concentración final del 5%) a 95ºC durante 5 min. Sobre el gel de plata se cargaron aproximadamente 500 ng de sTNF y scTNF4x y aproximadamente 150 ng de scTNF3x por carril. El resultado del gel de plata de las variantes de scTNF separadas en un SDS-PAGE al 15% muestra que las dos variantes de scTNF también en condiciones reductoras presentan un peso molecular de aproximadamente 50 kDa, que se corresponde con su estructura. También puede establecerse que las diferentes cantidades de las proteínas scTNF3x y scTNF4x cargadas no tuvieron ninguna influencia sobre el resultado. Esto prueba la estabilidad de las proteínas o polipéptidos según la invención en condiciones reductoras y desnaturalizantes. Por el contrario, el resultado para sTNF muestra que la proteína se divide en sus monómeros de aproximadamente 17 kDa.

La figura 14 muestra el resultado de una prueba de estabilidad en condiciones reductoras y desnaturalizantes. En este enfoque de ensayo se realizó una inmunotransferencia de tipo Western de las muestras separadas en un SDS-PAGE al 15% de TNF de tipo natural y de las variantes de scTNF, scTNF3x y scTNF4x. Se realizaron dos enfoques paralelos, en los que las muestras en un enfoque en se incubaron cada caso con β-mercaptoetanol (concentración final al 5%) a 95ºC durante 5 min., mientras que en el otro enfoque no se llevó a cabo incubación en βmercaptoetanol. La detección tras la ejecución de la electroforesis se llevó a cabo con un anticuerpo anti-TNF. Como resultado puede reconocerse que el anticuerpo detecta de manera específica la proteína de las dos variantes de scTNF en bandas claras a aproximadamente 50 kDa. Para TNF de tipo natural se detecta de manera específica la proteína a aproximadamente 17 kDa. De nuevo, esto prueba la estabilidad de las variantes scTNF3x y scTNF4x según la invención en condiciones reductoras y desnaturalizantes y tal como se esperaba coincide igualmente con los resultados de la figura 13.

La figura 15 muestra el resultado de un ensayo de degradación de IkappaB. IkappaB (I-κB) es un inhibidor del factor de transcripción del factor nuclear kappa B (NF-κB), que se suministra de manera conocida mediante TNF para la degradación, mediante lo cual se activa NF-κB. Para comprobar la degradación de I-κB se produjeron lisados de células 0, 30 y 60 minutos tras la estimulación con en cada caso TNF de tipo natural, scTNF3x y scTNF4x 10 ng/ml y a continuación se analizaron en inmunotransferencia de tipo Western con anticuerpos específicos para I-κB. El resultado muestra que se indujo la degradación transitoria de I-κB tanto por TNF de tipo natural como por las dos variantes de scTNF, correspondiendo el comportamiento de reacción de las variantes de scTNF con el de TNF de tipo natural. Tal como se esperaba, el lisado de bacterias control utilizado como control negativo (tal como se describió anteriormente un lisado de bacterias que no expresa scTNF, que se procesó de manera idéntica a las proteínas de scTNF recombinante) no mostró efecto sobre la degradación de I-κB.

La figura 16 muestra el resultado de un ensayo de JNK. JNK (cinasa N-terminal de c-jun) es una cinasa inducida por estrés, que se activa muy fuertemente mediante TNF de manera conocida. Tras la estimulación de células Kym-1 durante 0, 30 o 60 minutos con en cada caso TNF de tipo natural, scTNF3x y scTNF4x 10 ng/ml se produjeron lisados de células y se sometió a prueba la actividad de JNK a través de inmunoprecipitación de JNK con anticuerpos específicos para JNK y posterior ensayo de cinasa con GST c-Jun como sustrato. Tal como se esperaba, el lisado de bacterias control utilizado como control negativo (tal como se describió anteriormente) no mostró activación de cinasa JNK. El resultado muestra que se llevó a cabo una activación de JNK tanto mediante las dos variantes de scTNF como mediante el TNF de tipo natural, correspondiendo el comportamiento de reacción de las variantes de scTNF con el de TNF de tipo natural.

La figura 17 muestra el resultado de un ensayo de cambio de la movilidad electroforética (EMSA). Una comprobación adicional típica de la actividad de TNF representa la translocación del factor de transcripción NF-κB en el núcleo celular desarrollada tras la inducción llevada a cabo de la degradación de I-κB. Para ello se produjeron preparaciones de núcleos celulares de células control KYM-1 no estimuladas (cero minutos de estimulación) y de células estimuladas (30 y 60 minutos de estimulación), respectivamente. La estimulación de las células se llevó a cabo en cada caso con TNF de tipo natural, scTNF3x y scTNF4x. El factor de transcripción NF-κB translocado en los núcleos celulares se comprobó con ayuda de oligonucleótidos marcados radiactivamente, específicos para NF-κB. El resultado muestra que NF-κB se translocó en el núcleo celular. A este respecto, el comportamiento de reacción de las variantes de scTNF se corresponde con el de TNF de tipo natural.

5 La figura 18 muestra un esquema de constructo a modo de ejemplo de los polipéptidos según la invención, representado mediante TNF (como un miembro de la familia de ligandos de TNF). Las denominaciones presentan los siguientes significados:

los constructos AI/AII y BI/II presentan una utilización de codones optimizada para la expresión de las proteínas

10 en E. coli, y representan moléculas que están enlazadas con en cada caso ligantes triples o ligantes cuádruples de GlyGlyGlySer. Todas las moléculas portan en el extremo N-terminal una etiqueta de histidina para una purificación más fácil, las moléculas BI/BII portan adicionalmente una cadena de aminoácidos corta con un resto cisteína para un enlace covalente dirigido.

15 los constructos de C a H son adecuados para la expresión de las proteínas en células eucariotas, portan la correspondiente secuencia peptídica líder N-terminal.

sc = es la abreviatura para cadena sencilla,

20 cys = denomina un ligante peptídico N-terminal con cisteína interna para un acoplamiento covalente,

L1largo o L2 largo = denomina el ligante 1 o 2, en cada caso con la secuencia de aminoácidos (GGGS-GGGS-GGGS-GGGS) o (GGGS)4,

25 L1corto o L2 corto = denomina el ligante 1 o 2 en cada caso con la secuencia de aminoácidos (GGGS-GGGS-GGGS) o (GGGS)3,

secuencia peptídica líder = es la secuencia de aminoácidos para la secreción de la proteína a partir de células (huésped) eucariotas.

30 scFv40 = representa la secuencia del fragmento de anticuerpo 40 de cadena individual (scFv), que es específico para el antígeno FAP de estroma tumoral,

AMAIZe = es la abreviatura para “citocinas de inducción de la apoptosis mediada por anticuerpos” y

35 Etiqueta de His/Flag = representa la secuencia peptídica para la purificación por afinidad de las proteínas expresadas

La figura 19 muestra la secuencia de ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos correspondiente de scTNF-Lcorto 40 (constructo A-II)

Características del constructo A-II

• Secuencia peptídica de etiqueta de His para la purificación por afinidad de la proteína formada: aminoácidos

45 (abreviado a continuación en las figuras 19 a 26 con “AA”) AA 5-10, nucleótidos (abreviado a continuación en las figuras 19 a 26 con “NT”) NT 13-30

• Secuencia del módulo 1 de TNF humano (dominio extracelular, AA 79-181, de la molécula de TNF humano

natural, secuencia con utilización de codones de E. coli optimizada): AA 11-169, NT 31-507 50

•: Secuencia del ligante 1 (GGGS)3: AA 170- 181, NT 508- 543

•: Secuencia del módulo 2 de TNF humano (dominio extracelular, AA 79-181, de la molécula de TNF humano

natural, secuencia con utilización de codones de E. coli optimizada): AA 182-335, NT 544-1005 55

•: Secuencia del ligante 2 (GGGS)3: AA 336-347, NT 1006-1041

•: Secuencia del módulo 3 de TNF humano (dominio extracelular, AA 79-181, de la molécula de TNF humano

natural, secuencia con utilización de codones de E. coli optimizada): AA 348-501, NT 1042-1503 60

• Codón de parada: NT 1504-1506

La figura 20 muestra la secuencia de ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos correspondiente de cysscTNFLcorto (constructo B-II) 65

Características del constructo B-II

•: Aminoácido cisteína para el acoplamiento covalente: AA 9, NT 25-27

•: Secuencia peptídica de etiqueta de His para la purificación por afinidad de la proteína formada: AA 15-20, NT 43-60

•: Secuencia del módulo 1 de TNF humano (dominio extracelular de la molécula de TNF humano natural, secuencia con utilización de codones de E. coli optimizada): AA 21-181, NT 61-543

•: Secuencia del ligante 1 (GGGS)3: AA 182-193, NT 544-579

•: Secuencia del módulo 2 de TNF humano (dominio extracelular de la molécula de TNF humano natural, secuencia con utilización de codones de E. coli optimizada): AA 194-347, NT 580-1041

•: Secuencia del ligante 2 (GGGS)3: AA 348- 359, NT 1042-1077

•: Secuencia del módulo 3 de TNF humano (dominio extracelular de la molécula de TNF humano natural, secuencia con utilización de codones de E. coli optimizada): AA 360-513, NT 1078-1539

•: Codón de parada: NT 1540-1542

La figura 21 muestra la secuencia de ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos correspondiente de scFasL (constructo C) Características del constructo C

•: Secuencia peptídica líder para la secreción de la proteína en células eucariotas: AA 1-15, NT 1-45

•: Secuencia peptídica de etiqueta Flag para la purificación por afinidad de la proteína formada: AA 19-26, NT 55-78

•: Secuencia del módulo 1 de FasL humano (dominio extracelular AA 139-281 de la molécula de FasL humano natural): AA 30-173, NT, 90-519

•: Secuencia del ligante 1 de (GGGS)4: AA 174-189, NT 520-567

•: Secuencia del módulo 2 de FasL humano (dominio extracelular AA 139-281 de la molécula de FasL humano natural): AA 190-332, NT 568-996

•: Secuencia del ligante 2 de (GGGS)4: AA 333- 348, NT 997-1044

•: Secuencia del módulo 3 de FasL humano (dominio extracelular AA 139-281 de la molécula de FasL humano natural): AA 349-491, NT 1045-1473

•: Codón de parada: NT 1474-1476

La figura 22 muestra la secuencia de ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos correspondiente de scTRAIL (constructo D) Características del constructo D

•: Secuencia del módulo 1 de TRAIL humano (dominio extracelular AA 95-281 de la molécula de TRAIL humano natural): AA 30-216, NT 88-648

•: Secuencia del ligante 1 de (GGGS)4: AA 217-232, NT 649-696

•: Secuencia del módulo 2 de TRAIL humano (dominio extracelular AA 95-281 de la molécula de TRAIL humano natural): AA 233-419, NT 697-1257

•: Secuencia del ligante 2 de (GGGS)4: AA 420-435, NT 1258-1305

•: Secuencia del módulo 3 de TRAIL humano (dominio extracelular AA 95-281 de la molécula de TRAIL humano natural): AA 436-622, NT 1306-1866

•: Codón de parada: NT 1861-1863

La figura 23 muestra la secuencia de ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos correspondiente de scTNF (constructo E) Características del constructo E

•: Secuencia peptídica de etiqueta de Flag para la purificación por afinidad de la proteína formada: AA 19-26, NT 55-78

•: Secuencia del módulo 1 de TNF humano (dominio extracelular de la molécula de TNF humano natural): AA 30-184, NT 88-552

•: Secuencia del ligante 1 de (GGGS)4: AA 85-200, NT 553-600

•: Secuencia del módulo 2 de TNF humano (dominio extracelular de la molécula de TNF humano natural): AA 201-355, NT 601-1065

•: Secuencia del ligante 2 de (GGGS)4: AA 356-371, NT 1066-1113

•: Secuencia del módulo 3 de TNF humano (dominio extracelular de la molécula de TNF humano natural): AA 372-526, NT 1114-1581

•: Codón de parada: NT 1799-1581

La figura 24 muestra la secuencia de ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos correspondiente de scFasL-AMAIZe (constructo F) Características del constructo F

•: Secuencia peptídica líder para la secreción de la proteína en células eucariotas: AA 1-19, NT 1-57

•: Secuencia del fragmento de anticuerpo 40 monocatenario (scFv) específico para el antígeno FAP de estroma tumoral: AA 20-267, NT 58-801

•: Secuencia peptídica de etiqueta Flag para la purificación por afinidad de la proteína formada: AA 278-285, NT 832-855

•: Secuencia del módulo 1 de FasL humano (dominio extracelular, AA 139-281, de la molécula de FasL humano natural): AA 290-432, NT 868-1296

•: Secuencia del ligante 1 de (GGGS)4: AA 433-448, NT 1297-1344

•: Secuencia del módulo 2 de FasL humano (dominio extracelular, AA 139-281, de la molécula de FasL humano natural): AA 449-591, NT 1345-1773

•: Secuencia del ligante 2 de (GGGS)4: AA 592-607, NT 1774-1821

•: Secuencia del módulo 3 de FasL humano (dominio extracelular, AA 139-281, de la molécula de FasL humano natural): AA 608-750, NT 1822-2250

•: Codón de parada: NT 2251-2253

La figura 25 muestra la secuencia de ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos correspondiente de scTRAIL-AMAIZe (constructo G) Características del constructo G

• Secuencia peptídica líder para la secreción de la proteína en células eucariotas: AA 1-19, NT 1-57

•: Secuencia del módulo 1 de TRAIL humano (dominio extracelular, AA 95-281, de la molécula de TRAIL humano natural): AA 289-475, NT 865-1426

•: Secuencia del ligante 1 de (GGGS)4: AA 476-491, NT 1427-1476

•: Secuencia del módulo 2 de TRAIL humano (dominio extracelular, AA 95-281, de la molécula de TRAIL humano natural): AA 492-678, NT 1477-2034

•: Secuencia del ligante 2 de (GGGS)4: AA 679-694, NT 2035-208

•: Secuencia del módulo 3 de TRAIL humano (dominio extracelular, AA 95-281, de la molécula de TRAIL humano natural): AA 695-, NT 2083-2643

•: Codón de parada: NT 2644-2646

La figura 26 muestra la secuencia de ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos correspondiente de scTNF-AMAIZe (constructo H) Características del constructo H

•: Secuencia del módulo 1 de TNF humano (dominio extracelular, AA 79-181, de la molécula de TNF humano natural): AA 289-443, NT 865-1329

•: Secuencia del ligante 1 de (GGGS)4: AA 444- , NT 1330-1377

•: Secuencia del módulo 2 de TNF humano (dominio extracelular, AA 79-181, de la molécula de TNF humano natural): AA 460-614, NT 1378-1842

•: Secuencia del ligante 2 de (GGGS)4: AA 615-630, NT 1843-1890

•: Secuencia del módulo 3 de TNF humano (dominio extracelular, AA 79-181, de la molécula de TNF humano natural): AA 631-785, NT 1891-2353

•: Codón de parada: NT 2356-2358

La figura 27 muestra la farmacocinética de TNF de tipo natural humano y scTNF humano (véase el ejemplo 2). Los datos en la figura 27 muestran un claro aumento de la semivida in vivo de las variantes de scTNF. Por consiguiente, para scTNF frente a TNF, se espera una duración de la acción in vivo claramente elevada, que por consiguiente destaca el valor de scTNF, en particular de scTNF-L2, como posible producto terapéutico.

La figura 28 muestra CysHis-scTNF acoplado covalentemente a partículas (sílice). Este CysHis-scTNF acoplado covalentemente es bioactivo y presenta la actividad especial del TNF unido a membrana, es decir activa TNFR2. La figura 28 muestra que las células de fibroblastos de ratón, que están transfectadas con el constructo TNFR2-Fas y que se han tratado con diluciones en serie de los reactivos indicados, son completamente resistentes frente a wtTNF soluble. Tras el acoplamiento covalente de CysHis-scTNF reducido a micropartículas de sílice (perlas) según protocolos establecidos (DPA 2001, n.º DE10144252) éstas provocan una fuerte respuesta citotóxica (círculos), similar a un control positivo que se compone de CysHis-scTNF y un anticuerpo unido a TNFR2, Acm 80M2 (triángulos). Tal como se esperaba, el CysHis-scTNF no acoplado no muestra actividad sobre células positivas para TNFR2 (cuadrados).

La presente invención se ilustra a continuación mediante los ejemplos:

Ejemplos

Ejemplo 1: Producción de diferentes constructos polipeptídicos

5 Se realizaron todas las clonaciones según protocolos convencionales. A continuación se exponen las condiciones de las mismas.

PCR convencional:

10 Se amplificaron 60 ng de molde, 0,5 μl de cebador 100 μM, 1 μl de dNTPs 10 mM así como 5 μl de tampón 10x y 2 U de Taq-polimerasa en un volumen de reacción de 50 μl con el siguiente programa de PCR. Desnaturalización: 94ºC, 3 min.; 15 ciclos: desnaturalización 94ºC, 30 s, hibridación 55ºC, 30 s, alargamiento 72ºC, 90 s; alargamiento final: 72ºC, 7 min.

15 Digestión de productos de PCR:

Se purificó el producto de PCR sobre un gel de agarosa y se eluyó y a continuación se digirió con las respectivas enzimas de restricción (véanse los datos precisos) en una mezcla básica de reacción de 40 μl a una temperatura de escisión óptima (facilitada por el fabricante) durante 2 horas.

20 Digestión de vectores:

Se digirió 1 μg de vector con 5 U de la enzima de restricción correspondiente en un volumen de reacción de 20 μl durante 2 horas a una temperatura de escisión óptima (ésta depende de la enzima utilizada y la facilitará el 25 fabricante). Para la desfosforilación de los vectores se añadieron 10 U de fosfatasa alcalina durante 1 hora para la digestión de reacción.

Reacción de “relleno”:

30 Se mezcló la mezcla básica de una digestión de vector con dNTPs 33 μM y fragmento de Klenow de ADN 1 U/1 μg de la ADN polimerasa I y se incubó 15 min. a 25ºC. Se detuvo esta reacción con EDTA 10 mM durante 20 min. a 75ºC.

Ligación:

35 Se ligaron el vector y el inserto en una razón molar de 1:5 junto con 400 U de ligasa en un volumen de 10 μl durante la noche a 16ºC.

I. Producción de scTNFhumano (scTNF) con ligantes cuádruples o triples:

40 Se produjeron dos variantes de scTNF, que se diferencian por la longitud del ligante peptídico entre los módulos individuales. Se utilizaron cebadores con secuencia de ligante peptídico cuádruple o triple: ligantelargo con secuencia (GGGS)4 o ligantecorto con secuencia (GGGS)3. Por tanto, los constructos producidos contenían o bien sólo dos ligantes cuádruples (L1 o L2 con (GGGS)4 denominado “largo”) o sólo dos ligantes triples (L1 o L2 con (GGGS)3

45 denominado “corto”).

1. Con los cebadores V y I o II (para el ligantelargo) y el vector pQE-9 con un módulo de TNF (pQE9-HisTNF) como molde, se realizó una PCR convencional. El vector porta una secuencia de etiqueta de His para la purificación por afinidad posterior de la proteína producida.

2. A continuación, se digirió el producto de PCR I obtenido con 20 U de la respectiva enzima de restricción StuI y HindIII a 37ºC. Se realizó la misma digestión así como una reacción de desfosforilación con el vector pQE9-HisTNF y se insertó mediante una ligación el producto de PCR I en el vector pQE9-HisTNF. El resultado de esta etapa fue una etiqueta de His-módulo 1 de TNF con un ligante 1corto o largo o el siguiente constructo en el vector

55 pQE9:

EcoRI-etiqueta de His-módulo 1 de TNF-Ligante 1corto o largo-BamHI

3. A través de una PCR adicional con los cebadores III y I o II (para ligantelargo) y el vector pQE9-HisTNF como

60 molde, se produjo el producto de PCR II. A continuación, se cortó el producto de PCR II con en cada caso 20 U de la enzima de restricción EcoRI y HindIII y se insertó en el vector pQE9-HisTNF, que se había cortado y desfosforilado con las mismas enzimas. El resultado de esta clonación fue un vector pQE9, que se era tal como sigue:

Módulo 2 de TNF-Ligante 2corto o largo-BamHI

Este constructo no portaba ninguna secuencia para una etiqueta de His antes de la secuencia de TNF.

5 4. Se cortó del vector el producto de PCR II clonado de la etapa 3 en primer lugar con la enzima de restricción HindIII y a continuación parcialmente con BamHI (1 U/μg de ADN). Igualmente, se cortó, se desfosforiló secuencialmente el vector pQE9-etiqueta de His-módulo 1 de TNF-ligante 1corto o largo con las enzimas de restricción BamHI y HindIII, y se ligó el producto de PCR II en este vector. El resultado fue un vector pQE9 con el siguiente constructo:

etiqueta de His-módulo 1 de TNF-ligante 1corto o largo-módulo 2 de TNF-ligante 2corto o largo.

5. Con el vector pQE9-HisTNF como molde y los cebadores III y IV se realizó una PCR adicional en condiciones convencionales y se digirió secuencialmente el producto de PCR III obtenido con las enzimas de restricción

15 BamHI (40 U) y HindIII (40 U). Entonces se ligó este fragmento en un vector pBluescript SKII, que igualmente se cortó con las enzimas de restricción BamHI y HindIII. El resultado de esta clonación fue un vector pBluescript SKII, que contenía el módulo 3 de TNF sin ligante.

6. Se cortó el vector pQE9 con el constructo etiqueta de His-módulo 1 de TNF-ligante 1corto o largo-módulo 2 de

20 TNF-ligante 2corto o largo con la enzima de restricción EcoRI, a continuación se trató este vector con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli, para realizar una reacción de “relleno”. Tras esta etapa se realizó una digestión de restricción parcial con la enzima BamHI (1 U/μg de ADN).

7. De forma paralela a la etapa 6 se cortó el vector pBluescript SKII, que contiene el módulo 3 de TNF, con la

25 enzima de restricción XbaI, a continuación se trató este vector con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli, para realizar una reacción de “relleno”. Tras esta etapa se realizó una segunda digestión de restricción con la enzima BamHI en condiciones convencionales con desfosforilación adicional.

8. A continuación, se ligó el fragmento obtenido mediante la digestión de restricción de la etapa 6 en el vector

30 lineal generado en la etapa 7. Los constructos se encontraban en orden inverso tal como se indica a continuación:

HindIII-módulo 3 de TNF-ligante 2corto o largo-módulo 2 de TNF-ligante 1corto o largo-módulo 1 de TNF-etiqueta de His-EcoRI 35

9. Se cortó el constructo de TNF inverso de la etapa 8 con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII del vector pBluescript SKII y se ligó en el vector pQE9-HisTNF tratado con las mismas enzimas así como desfosforilado. Mediante esto se generó el siguiente constructo con el scTNF completo en la orientación correcta:

40 EcoRI-etiqueta de His-módulo 1 de TNF-ligante 1corto o largo-módulo 2 de TNF-ligante 2corto o largo-módulo 3 de TNF-HindIII

10. Para la producción de un scTNF con una cisteína N-terminal, se hibridaron los oligo cys-scTNF VI y VII (se calentaron en cada caso 20 μl de Oligo VI o VII 100 μM juntos durante 5 min. a 95ºC y se dejó enfriar lentamente

45 hasta temperatura ambiente) y así se formó el oligo1. Se digirió el constructo del punto 9 con las enzimas de restricción EcoRI y BbsI y se ligó el Oligo1, que dispone de los mismos puntos de corte, en el vector. Alternativamente se insertó la cisteína a través de mutagénesis de PCR. El resultado de esta clonación fue el siguiente constructo:

50 EcoRI-cisteína-etiqueta de His-módulo 1 de TNF-ligante 1corto o largo-módulo 2 de TNF-ligante 2corto o largomódulo 3 de TNF-HindIII

Se verificaron todos los constructos por medio de secuenciación.

55 La expresión tuvo lugar en la cepa XL-1 blue de E. coli. La purificación de las variantes de scTNF expresadas tuvo lugar con ayuda de métodos cromatográficos (cromatografía de intercambio aniónico y de afinidad por la etiqueta de His).

A continuación se indican las secuencias de los cebadores utilizados: 60 Secuencias de ligantes peptídicos a nivel de proteínas

Ligante GGGS triple (corto) = (GGGS)3: GGGS GGGS GGGS Ligante GGGS cuádruple (largo) = (GGGS)4: GGGS GGGS GGGS GGGS 65

Secuencias de ligantes peptídicos a nivel de nucleótidos

Ligante GGGS triple (corto) =5’GGT GGC GGT TCT GGT GGC CGT GGT TCT GGT GGC GGA TCC3’ Ligante GGGS cuádruple (largo) = 5’GGT GGC GGT TCT GGT GGC GGT TCT GGT GGC GGT TCT GGT GGC GGA TCC3’

Cebadores para las clonaciones

Cebador de scTNF I

Cebador de scTNF II

Cebador de scTNF III

Cebador de scTNF IV

25 Cebador de scTNF V

Oligo para la inserción de CysHis: Cebador de cys-scTNF VI

Cebador de cys-scTNF VII

II. Producción de scFasL en constructos de pcDNA3 y AMAIZe: Para la siguiente clonación se utilizaron las condiciones convencionales indicadas en el ejemplo 1.

A. Generación de señal HA en pcDNA3

1.: Digestión del vector pcDNA3 con KpnI y NotI.

2.: Producción del oligo-HA con la secuencia KpnI-señal HA-NotI a través de la hibridación del cebador HA-IF y HA-IIR para la secuencia peptídica líder:

3.: Ligación del oligo-HA (contiene el punto de corte de KpnI y NotI) en el vector pcDNA3.

B. Producción de scFasL en el vector pcDNA3(+)

1. PCR con cebador FasL#1F y FasL#2R sobre el vector de FasL-AMAIZE de molde. La producción de este tipo de constructos se describe en la solicitud de patente DE 10045591.3, que por la presente se incluye en su

5 totalidad en el contenido dado a conocer de la presente invención. El producto de esta PCR 1 era un constructo NotI-etiqueta Flag-módulo 1 de FasL-ligante 1-BamHI-XbaI.

2. A través de los puntos de corte de restricción de NotI y Xbal, se clonó este constructo en el vector de la

secuencia pcDNA3-HA digerido con las mismas enzimas, de modo que se produce el siguiente constructo: 10

Secuencia de HA-etiqueta Flag-módulo 1 de FasL-ligante 1-BamHI-XbaI

3. Con ayuda de una PCR adicional, en el vector FasL-AMAIZE de molde y los cebadores FasL#3 y FasL#1 se

generó el siguiente producto de PCR 2: 15

Extremo romo-módulo 2 de FasL- ligante 2-BamHI-XbaI

4. En la siguiente etapa se digirió el vector pcDNA3 del punto 2 con BamHI, se rellenó este punto de corte con la enzima de Klenow y a continuación se cortó con XbaI, de modo que se produjo un “extremo romo” y un “extremo

20 cohesivo”. A continuación, en este vector así modificado, se clonó el producto de PCR 2, mediante lo cual se formó el siguiente constructo:

Secuencia de HA-etiqueta Flag-módulo 1 de FasL-ligante 1-módulo 2 de Fasl-ligante 2-BamHI-XbaI

25 5. Para el tercer módulo se realizó una PCR adicional con el vector FasL-AMAIZE de molde y los cebadores FasL#4 y FasL#5. A continuación se digirió el producto de PCR formado con las enzimas de restricción BamHI y XbaI y se ligó en el vector cortado con las mismas enzimas del punto 4. El resultado de esta clonación fue el siguiente constructo en el vector pcDNA3:

30 Secuencia de HA-NotI-etiqueta Flag-módulo 1 de FasL-ligante 1-módulo 2 de FasL-ligante 2-módulo 3 de FasL-parada-XbaI.

Para la producción de los constructos de scFasL o scTNF-AMAIZe se digirieron los respectivos scFasL o scTNF con las enzimas de restricción NotI o EcoRI y XbaI y se insertaron los insertos como casete en los vectores AMAIZe 35 correspondientes (véase la solicitud de patente DE 10045591.3), cortándose estos vectores igualmente con las enzimas NotI o EcoRI y XbaI. Sobre esto se produjeron los siguientes constructos:

Péptido líder-scFv40-etiqueta Flag-módulo 1 de FasL-ligante 1-módulo 2 de FasL-ligante 2-módulo 3 de FasL

40 Péptido líder-scFv40-etiqueta Flag-módulo 1 de TNF-ligante 1-módulo 2 de TNF-ligante 2-módulo 3 de TNF

A continuación se indican las secuencias de los cebadores utilizados:

FasL#1R: 45

FasL#2F:

FasL#3F:

FasL#4F:

60 FasL#5R:

HA-IF

HA-IIR

III. Clonación de scTRAIL y producción de constructos de scTRAIL AMAIZe

10 Para las siguientes clonaciones se utilizaron las condiciones convencionales indicadas en el ejemplo 1.

1. PCR con cebadores TRAIL#1 y TRAIL#2 sobre pcDNA3-sc40-TRAIL de molde (véase la solicitud de patente DE 10045591.3). Se cortó el producto de PCR 1 con EcoRI y XbaI y se ligó en el vector pcDNA3-scFasL digerido

15 con las mismas enzimas de restricción. Esta digestión delecionó la secuencia FasL, manteniéndose la secuencia de HA y de la etiqueta Flag y ahora se produjo el siguiente constructo:

Secuencia de HA - etiqueta Flag-módulo 1 de TRAIL-ligante 1-BamHI-XbaI

20 2. Con ayuda del cebador TRAIL#1R y TRAIL#2F, se generó con el TRAIL-AMAIZe de molde (véase la solicitud de patente DE 10045591.3) el producto de PCR 2. Éste se cortó sólo con XbaI, produciéndose un extremo romo y un extremo cohesivo. Se digirió el constructo del punto 1 con BamHI y a continuación se trató con la enzima de Klenow, de modo que se rellenaron los extremos. A continuación de esto se realizó una digestión con XbaI y se clonó el producto de PCR 2 en este vector. El resultado fue el siguiente constructo:

Secuencia de HA-etiqueta Flag-módulo 1 de TRAIL-ligante 1-módulo 2 de TRAIL-ligante 2-BamHI-XbaI

3. Para la clonación del módulo 3 de TRAIL, se realizó una PCR con los cebadores TRAIL#4 y TRAIL#5 sobre el

TRAIL-AMAIZe de molde, a continuación se digirió el producto con BamHI y XbaI y se clonó en el constructo del 30 punto 2, digerido igualmente con BamHI y XbaI, mediante lo cual se produjo el siguiente constructo:

Secuencia de HA-etiqueta Flag-módulo 1 de TRAIL-ligante 1-módulo 2 de TRAIL-ligante 2-módulo 3 de TRAIL-parada-XbaI

35 Para la producción de los constructos scTRAIL-AMAIZe se digirieron los respectivos vectores scTRAIL con las enzimas de restricción NotI o EcoRI y XbaI y se insertaron los insertos como casete en los vectores AMAIZe correspondientes (véase la solicitud de patente DE 10045591.3), cortándose estos vectores igualmente con las enzimas NotI o EcoRI y XbaI. Sobre esto se produjeron los siguientes constructos:

40 HA-svFv40-etiqueta Flag-módulo 1 de TRAIL-ligante 1-módulo 2 de TRAIL-ligante 2-módulo 3 de TRAIL

A continuación se indican las secuencias de los cebadores utilizados:

Cebadores para la clonación de scTRAIL 45 TRAIL#1R:

50 TRAIL#2F:

TRAIL#3F:

TRAIL#4F: TRAIL#5R:

Ejemplo 2: Farmacocinética de TNF de tipo natural humano y scTNF humano.

10 A ratones Balb/c de 6 semanas de edad se les inyectaron por vía i.v. 12 μg de TNF o scTNF (en cada caso 3 ratones). Cada 45 min. se extrajo sangre, se recogió y se determinó la concentración de TNF en suero por medio de un kit de ELISA específico para TNF humano. Los datos en la figura 27 muestran un claro aumento de la semivida in vivo de las variantes de scTNF. Por tanto, para scTNF se espera que presente una duración del efecto biológico in vivo claramente elevada, destacando por consiguiente el valor de scTNF como potencial producto terapéutico.

Ejemplo 3: CysHis-scTNF acoplado covalentemente a partículas (sílice).

Se trataron fibroblastos de ratón, que están transfectados con el constructo TNFR2-Fas, con diluciones en serie de los reactivos indicados. Estas células son completamente resistentes frente a wtTNF soluble. Tras el acoplamiento

20 covalente de CysHis-scTNF reducido en micropartículas de sílice (perlas) según protocolos establecidos (DPA 2001, n.º DE10144252) éstas provocan una fuerte respuesta citotóxica (círculos), similar a un control positivo compuesto de CysHis-scTNF y un anticuerpo unido a TNFR2, Acm 80M2 (triángulos). Tal como se esperaba, el CysHis-scTNF no acoplado no muestra actividad sobre células positivas para TNFR2 (cuadrados). El CysHis-scTNF acoplado covalentemente es bioactivo y presenta la actividad especial de TNF unido a membrana, es decir activa TNFR2.

25 Ejemplo 4: Comparación de (rh)TNF humano recombinante convencional y scTNF en modelos de necrosis tumoral in vivo y actividad citotóxica de L929 in vitro

Ratones: C3H/HeJ (hembras), 17-19 g de Charles River

30 Células tumorales: Línea de células de fibrosarcoma inducido por metilcolantreno CFS-1 de C3H/HeN derivadas de ratón (Referencia: Hafner M., P. Orosz, A. Krüger, y D.N. Männel. 1996 TNF promotes metastasis by impairing natural killer cell activity. Internat. J. Cancer 66:388-392);

35 Experimento de necrosis tumoral: Los ratones recibieron 1,6 x 107 células CFS-1 en 50 μl de medio (RPMI, FCS al 10%) por vía intradérmica en el lomo; se dejaron crecer los tumores 12 días, hasta que alcanzaron un tamaño de aproximadamente 5-6 mm de diámetro, antes de la inyección intraperitoneal con TNF (10 μg por ratón) en 200 μl de PBS o PBS solo como control. Se midió a diario el tamaño tumoral y se estudió macroscópicamente. Se sacrificaron los ratones en el 6º día tras el tratamiento y se extirparon los tumores para histología. Se cortaron los tumores, se

40 fijaron durante la noche en formalina tamponada con PBS al 4% y se incrustaron en parafina. Se tiñeron cortes verticales ecuatoriales (4 μm) con hematoxilina y eosina y se estudiaron microscópicamente para determinar necrosis (tal como se describe por ejemplo en: Lucas R. et al, 2001, Int J Cancer, 91:543-549).

TNF: actividad específica de rhTNF 6,6 x 106 U/mg (48 h prueba de L929 sin Act D) scTNF

45 Experimento in vitro, actividad de LD50 en ensayo de citotoxicidad de L929 con Act.D para:

rhTNF= 391 pg/ml

scTNF= 39 pg/ml

50 (sometido a prueba con las mismas muestras de TNF que se utilizaron para los experimentos in vivo) scTNF muestra en este experimento in vitro un actividad aumentada 10 veces.

Experimento de necrosis tumoral in vivo 55 Diámetro tumoral Necrosis macroscópica* microscópica**Grupo n d0 d4 <5% >10%

PBS 6 5,2+1 7,4+0,5 1 2 0 rhTNF 7 5,2+0,9 6,6+1,7 3 6 1 scTNF 7 5,9+0,5 7,3+03 5 0 7

* = necrosis superficial claramente distinguible macroscópicamente ** = necrosis hemorrágica central en el estudio microscópico, <5% o >10% del tejido tumoral

Conclusión:

Tras 4 días de tratamiento con dosis individuales, no se estableció ninguna diferencia en el tamaño tumoral (véase 5 una visión general de TNF como producto terapéutico antitumoral por ejemplo en Eggermont et al, Lancet Oncol.

4.429 (2003)).

rhTNF indujo una pequeña necrosis hemorrágica (<5% del área tumoral) , macroscópicamente sólo puede verse en 3/7 de los animales.

10 scTNF indujo una mayor necrosis hemorrágica (> 10% del área tumoral) en todos los tumores (7/7), pueden observarse macroscópicamente 5/7 de éstos.

scTNF >> rhTNF con respecto a la citotoxicidad tumoral in vitro y la inducción de necrosis. 15

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la depleción y/o eliminación extracorporal de receptores del factor de necrosis tumoral (TNFR) de la sangre o fracciones sanguíneas, que comprende las etapas siguientes:

5 a) eventualmente, separar la sangre en una o varias fracciones con componentes sólidos y/o líquidos;

b) unir la sangre o las fracciones sanguíneas a una partícula o superficie acoplada con un polipéptido, comprendiendo el polipéptido por lo menos tres componentes A y por lo menos dos componentes B, siendo 10 cada componente A un monómero de TNF o un fragmento y/o una variante del mismo, que presenta una

propiedad de unión y trimerización, y siendo cada componente B un ligante peptídico, y

c) separar el TNFR unido.

15 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los componentes A son idénticos o diferentes.
3. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que los componentes A proceden del mismo organismo o de organismos diferentes.

20 4. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que los componentes B enlazan, respectivamente, dos de dichos por lo menos tres componentes A entre sí.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que por lo menos uno de los componentes B

presenta la secuencia de aminoácidos (GGGS)3 o (GGGS)4. 25
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que los componentes A y los componentes B forman una estructura proteica trimérica.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que los componentes A y los componentes B forman una 30 estructura proteica homotrimérica.
8. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que los componentes A y los componentes B forman una estructura proteica heterotrimérica.

35 9. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que los componentes B son idénticos o diferentes.
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que los componentes B proceden del mismo

organismo o de organismos diferentes. 40
11. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido presenta una secuencia de etiqueta, preferentemente N-terminal, en particular una secuencia de etiqueta de His o una secuencia de etiqueta Flag.

45 12. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido presenta una secuencia peptídica líder, preferentemente N-terminal.
13. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido contiene por lo menos un

componente C adicional, que es un fragmento de anticuerpo u otra proteína o péptido, que reconoce selectivamente 50 una molécula diana específica sobre una superficie celular.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el componente C es un fragmento de anticuerpo de un mamífero, en particular de origen murino o humano, o un fragmento de anticuerpo humanizado.

55 15. Procedimiento según la reivindicación 13 o 14, en el que el fragmento de anticuerpo puede estar presente en diferentes formatos de anticuerpo, por ejemplo como scFv, en particular scFv40.
16. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el componente C es una proteína o un péptido con

especificidad para una molécula de la superficie celular, en particular un receptor de citocinas, un receptor de factor 60 de crecimiento, una integrina o una molécula de adhesión celular.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que el receptor de citocinas se selecciona de entre el grupo de la familia de genes de TNFR.