PT1727833E - Polipeptídeos recombinantes dos membros da família de ligandos do tnf e respetiva utilização - Google Patents

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1 DESCRIÇÃO "POLIPEPTÍDEOS RECOMBINANTES DOS MEMBROS DA FAMÍLIA DE LIGANDOS DO TNF E RESPETIVA UTILIZAÇÃO" A presente invenção consiste num método para manipulação extracorporal, depleção e/ou remoção de substâncias contidas nos fluidos corporais, por exemplo, através de aférese.

Em relação aos membros da família de ligandos do TNF trata-se de citocinas pró-inflamatórias. As citocinas em geral e os membros da família de ligandos do TNF, em particular, desempenham um importante papel na simulação e coordenação do sistema imunitário congénito, bem como, na resposta imunitária humoral (anticorpos), na indução de apoptose, no crescimento dos ossos, na formação de sistemas para crescimento de cabelo, de dentes e no desenvolvimento de glândulas sudoríparas, no sistema dos gânglios linfáticos e muito mais (Aggarwal, B.B. (2003), Nat. Rev. Immunol. 3, 745- 756). Uma regulação errada dos membros da família de ligandos do TNF pode, contudo, dar origem a inúmeros estados patológicos. Entre estes contam-se, por exemplo, choque sético, doenças autoimunes, como artrite reumatoide ou doenças neurodegenerativas. O fator de necrose tumoral (TNF) é o membro mais importante desta grande família de citocinas e que dá origem ao seu nome. O seu efeito é desenvolvido pelos membros da família de ligandos do TNF na sua forma biológica ativa como homotrímeros (Banner, D.W. et aL, (1993) Cell 73, 431-445). As estruturas de trímeros e também os agregados de ordem superior (por exemplo, oligómeros ou multímeros de trímeros) de proteínas encontram-se em grande quantidade na natureza. Exemplos são a Proteína da Matriz da Cartilagem (CMP), uma proteína do tecido conjuntivo (Beck et aL (1996), J Mol Biol 256, 909-923), proteínas da família do 2 colagénio, como a família Clq, do Clq, Colagénio al (X), a2 (VII), a proteína da hibernação, ACRP30, a proteína da estrutura do ouvido interno, incluindo Cellebrin e

Multimerin (Kishore und Reid, (1999), Immunopharmacol.42, 15-21), e proteínas da família Collectin, como a Lung Surfactant Protein A (SP-A) e a Proteína de Ligação à

Manose (MBP) (Epstein et al. (1996), Current Opinion in

Immunology, Vol 8 Nr.l, 29-35). A congregação de proteínas para formar um trímero ocorre nas superfícies destas proteínas, trímeras em solução, devido a interações, como interações hidrofóbicas, pontes de hidrogénio, ligações covalentes (por exemplo, ligações de dissulfureto), e/ou forças de Coulomb, mas também devido a motivos estruturais, ou seja, sequências de aminoácidos características, que originam uma formação de estruturas super-secundárias intermoleculares. No caso dos membros da família de ligandos do TNF os três monómeros são mantidos juntos na estrutura homotrimérica não covalente através de ligações hidrofóbicas. Na sua forma ativa, ativam por sua vez os seus membros opostos da família de recetores do TNF, que como tal não possuem atividade enzimática. Por exemplo, o TNF, como membro da família de ligandos do TNF liga-se aos dois recetores de membrana TNFR1 e TNFR2 e facilita a trimerização ou ativação dos recetores já com trimerização mas com sinal inativo.

Através da ligação complexa dos recetores é iniciada uma cascata de sinais acompanhada de, entre outras, uma associação a proteínas adaptadoras citoplasmáticas (Wajant, H. et al (2003), Cell Death, Differ, 10, 45-65). A estrutura de trímero do TNFR1 e do TNFR2 apresenta-se de tal forma, que os recetores, ligam no espaço intermédio entre dois dos três monómeros do TNF do homotrímero do TNF (Banner et aL (1993) supra). Assim é claro que tanto o TNF como os outros membros da família de ligandos do TNF apenas é/são biologicamente ativos na sua estrutura como 3 homotrímeros .

Com base na sua função, os membros da família de ligandos do TNF e os respetivos recetores de membranas são diversamente utilizados para tratamento de diversas doenças como doenças infecciosas e inflamatórias, doenças metabólicas, doenças, que no caso de uma regulação errada provocam a apoptose, doenças neurodegenerativas e muitas outras doenças. Um papel especialmente importante é desempenhado pela sua aplicação no tratamento de doenças cancerígenas, uma vez que, no caso dos membros da família de ligandos do TNF se tratam geralmente de substâncias com efeito antitumoral. De referência especial, neste contexto, é o próprio TNF (Eg-germont, A.M. and ten Hagen, T.L. (2003), Curr. Oncol. Rep. 5, 79-80), TRAIL (TNF releated apoptoses inducing ligand), também denominado Apo 2L (Weley et al. (1995), Immunity 6: Investigações In vivo revelam contudo fortes efeitos secundários no caso do TNF e agonistas do recetor Fas e investigações in vitro indiciam também efeitos tóxicos semelhantes no caso de determinados preparados TRAIL (Jo et al. (2000) Nat Med 6: 564-567,

Ichikawa et aL (2001) Nat Med 7: 954-960; Ogasawara et al. (1993) Nature 364: 806-809). Por exemplo, os anticorpos agonistas contra o Fas, o recetor de FasL, mostraram um efeito hepatóxico extremo (Ogasawara et al. (1993) supra).

No caso dos ligandos/agonistas ativados pelo Fas foi até agora excluída uma aplicação clínica por motivos de segurança. Devido ao importante significado do TNF, do TRAIL, do FasL e de outros membros da família de ligandos do TNF nesta área e aos efeitos secundários associados à sua aplicação, sob a forma de uma administração sistémica clínica, fez-se diversas tentativas de minimizar estes efeitos secundários. (Eggermont, A.M. and ten Hagen, T.L. (2003), Curr. OncoL Rep. 5, 79-80).

Assim, a patente WO 02/22680 descreve, por exemplo, proteínas de fusão que possibilitam um efeito direcionado 4 tecidular e/ou celular específico das citocinas através da fusão da citocinas com um anticorpo ligante de antigénio. Desta forma consegue-se gue a citocina não desenvolva qualquer efeito sobre tecidos e células, que não entram em contacto com estas proteínas de fusão, e assim reduzir-se os efeitos secundários sobre estes tecidos ou células.

Na patente DE 102 47 755 é divulgado um sistema independente de anticorpos que possibilita igualmente um efeito tecidular e celular específico da citocina. Trata-se aqui de proteínas de fusão, nas quais a ativação de uma secção de proteína nelas contidas, com função biológica, através desta ligação, ocorre num domínio de ligação da molécula da superfície celular, que apresenta uma outra secção de proteína da proteína de fusão. Além de uma redução dos efeitos secundários sobre tecidos não-alvo, este sistema pode ser utilizado, de forma vantajosa, também para moléculas da superfície celular sobre as células alvo, para as quais não estão disponíveis quaisquer anticorpos ou apenas anticorpos com especificidade reduzida.

Além dos efeitos secundários referidos é contudo extremamente problemático o facto de os homotrímeros ativos dos membros da família de ligandos do TNF se dissociarem em diluições, e isso significa também em concentrações fisiologicamente úteis. Esta dissociação, apesar de essencialmente reversível, faz com que a proteína perca rapidamente a sua bioatividade, uma vez que fica desnaturada. Assume-se que esta desnaturação ocorre no nível dos monómeros instáveis (Smith,R.A. and Baglioni, C. (1987), J. Biol. Chem. 262, 6951-6954; Narhi, LO. and Arakawa, T. (1987), Biochem. Biophys. Res. Commun 147, 740-746) .

Com base nas respetivas observações no caso do TRAIL, que apresenta uma instabilidade especial, tentou obter-se uma estabilidade da proteína inserindo um ziper de leucina como módulo de trimerização (Cha, S.S. et al., (1999), 5

Immunity 11, 253-261). No estado natural, o TRAIL é estabilizado através de um ião de zinco, que fica no centro do ligando trimerizado e que é coordenado através de resíduos de cisteína (Hymowitz, S.G. et al. (2000), Biochemistry 39, 633-640). Uma desvantagem neste caso pode ser o facto de, através da inserção do ziper de leucina não só se obter uma estabilidade aumentada, como também se prejudicar outras propriedades, por exemplo, propriedades estruturais, como alterações estruturais, velocidade da atividade ou propriedades fisiológicas.

Na patente WO 01/37873 é apresentado um processo de tratamento de doenças que se caracteriza pela produção de moléculas de recetores de citocina solúveis, como por exemplo recetores solúveis do fator de necrose tumoral (sTNFR). As doenças abrangem muitos tipos de cancro e outras doenças como infeções por HIV. Assim, numa forma de realização preferencial, o sangue do doente é feito passar por uma coluna, na qual são imobilizados anticorpos, que se ligam às moléculas sTNFR e as removem e, em seguida o sangue é novamente administrado aos doentes. O processo pode ser utilizado isoladamente ou em combinação com outras formas de tratamento.

Na patente WO 01/43770 é apresentado um método para reforço da resposta imunológica num mamífero, que facilita a eliminação de um estado de doença crónico. O método abrange a remoção de inibidores do sistema imunitário do circuito do mamífero e origina assim uma forte resposta imunológica sobre o patogéneo. A remoção dos inibidores do sistema imunitário é obtida, na medida em que um componente do sangue isento de células, ou uma fração do mesmo é colocado em contacto com um ou mais parceiros de ligação, que estão em posição de se ligar aos inibidores e assim remove-los dos fluidos biológicos. Especialmente útil na conceção do método é uma matriz absorvente que é composta por uma substância biocompatível inerte que está ligada de 6 forma covalente a um parceiro de ligação, por exemplo um anticorpo, que está em posição de se ligar especificamente aos inibidores desejados.

Na publicação internacional WO 99/61085 é divulgado um processo para tratamento do cancro com utilização de ultra-aférese, que foi melhorado, para remover ligações com peso molecular inferior a 120 000 Dalton. A administração engloba a administração de fluido de substituição, para estimular o sistema imunitário do doente e atacar os tumores sólidos. Numa forma de realização preferencial a ultra-aférese é efetuada nos doentes utilizando um ultra filtro de tubinhos capilares com um tamanho de poros de 0,02 -0,05 mm e com uma exclusão de peso molecular de 120000 Dalton. 0 fluido de substituição preferencial é plasma tratado com ultra-aférese.

Existe assim uma necessidade de aumentar a estabilidade das citocinas ativas, especialmente membros da família de ligandos do TNF, sem influenciar negativamente as respetivas propriedades através de uma alteração da sua estrutura e sem implicar efeitos secundários citotóxicos graves, ou outros, em aplicações terapêuticas. A presente invenção tem por base o conhecimento de que os membros das citocinas solúveis de origem natural da família de ligandos do TNF desenvolvem a sua bioatividade total unicamente como homotrímeros mas, por outro lado, têm uma disposição para desnaturarem os seus monómeros através de dissociação. É assim necessário evitar esta dissociação dos homotrímeros em monómeros. Isto obtém-se, na medida em que pelo menos três monómeros de um membro da família de ligandos do TNF, especialmente TNF, são ligados uns aos outros de forma covalente através dos seus termos C e N através de linkers peptídicos curtos numa molécula "single chain" (doravante "sc"), especialmente a um scTNF. Assim, toda a molécula (pelo menos três monómeros de um membro da 7 família de ligandos do TNF com os dois linkers peptídicos) consiste de uma única cadeia proteica, de forma que já não pode ocorrer uma dissociação nos monómeros. Foi determinado, que as moléculas desse tipo, em comparação com os seus correspondentes membros de tipo selvagem solúveis da família de ligandos do TNF, apresentam uma perda muito reduzida da sua bioatividade. Pelo contrário, ficou não só comprovado que os polipeptídeos apresentam as mesmas atividades (qualitativas) que o seu membro da família de ligandos do TNF de tipo selvagem correspondente, como também, que, devido à sua estabilidade significativamente aumentada, apresentam ainda bioatividades, num determinado momento, no qual o membro da família de ligandos do TNF de tipo selvagem solúvel já perdeu a sua atividade, ou seja está dissociado ou desnaturado (consultar os diversos testes de estabilidade descritos em seguida, que estão descritos nos exemplos e nas figuras).

Por "membro de tipo selvagem solúvel da família de ligandos TNF" deve entender-se uma secção extracelular solúvel de um membro membranoso da família de ligandos do TNF. De seguida serão utilizados sinónimos para o conceito "tipo selvagem solúvel" a expressão "tipo selvagem", "wt" (wild type), "solúvel" e "s" (para "soluble"). Especialmente, pode tratar-se de um TNF de tipo selvagem solúvel (como um membro da família de ligandos do TNF) , para o qual serão utilizados em seguida os conceitos sinónimos "Wildtyp TNF", "wtTNF", TNF solúvel e "sTNF".

Um componente A no âmbito da invenção é um monómero do TNF ou um fragmento funcional ou uma variante do mesmo. Por um "monómero" deve entender-se a unidade mais pequena de proteína ou polipeptídeo, que se consegue separar de uma proteína oligomérica sem a separação das ligações covalentes.

Um polipeptídeo ou um componente A ou um fragmento ou uma variante do mesmo são funcionais no âmbito da invenção, desde que apresentem a sua atividade ou função biológica, especialmente a sua propriedade de ligação a um parceiro de interação, por exemplo, um recetor membranoso e também a sua propriedade de trimerização. No caso de fragmentos funcionais e das variantes funcionais da invenção, estas funções biológicas podem ser alteradas, por exemplo, no que respeita à sua capacidade ou seletividade, mantendo-se contudo a função biológica básica.

No estado da técnica são conhecidos diversos processos para medição da atividade biológica de uma proteína, polipeptideo ou molécula, por exemplo, ensaios de proteínas, que utilizam substratos marcados, análises de substratos por processos cromatográficos, como HPLC ou cromatografia de camada fina, processos espetrométricos etc. (ver por ex. Maniatis et aL (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY).

Por um segmento, no âmbito da invenção, entende-se tanto um fragmento de um manómero de um membro da família de ligandos do TNF como também um fragmento de um polipeptideo ou proteína da presente invenção. Pode tratar-se aqui de sequências de aminoácidos encurtadas N-terminal, C-terminal ou intersequenciais, do monómero, de polipeptideos ou de proteínas. Especialmente nos encurtamentos intrasequenciais do polipeptideo ou proteína podem tratar-se de encurtamentos da sequência de um ou mais dos três monómeros, que por sua vez podem ocorrer em N-terminal, C-terminal ou de forma intrassequencial.

Numa forma de realização especialmente preferencial da invenção, o fragmento de um monómero apresenta o respetivo domínio extracelular, que corresponde a todo o domínio extracelular do membro de tipo selvagem solúvel da família de ligandos do TNF ou a uma secção do mesmo. Especialmente, o fragmento de um monómero apresenta o respetivo domínio extracelular, que corresponde ou ao tipo selvagem solúvel 9 do TNF (aminoácidos 77-233) ou a todo o domínio extracelular (aminoácidos 53 - 233). 0 fabrico desses fragmentos é bem conhecido do estado da técnica e pode ser efetuado por um técnico mediante utilização de métodos padrão (ver, por ex. Maniatis et aL (2001), Molecular cloning: Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press). No geral, pode efetuar-se o fabrico de fragmentos de monómeros, polipeptídeos ou proteínas através da modificação da sequência de ADN, que codifica o monómero, polipeptídeo ou proteína, seguido de uma transformação desta sequência de ADN num anfitrião adequado e expressão desta sequência de ADN modificada, mediante o pressuposto que a modificação do ADN não prejudica as atividades funcionais dos monómeros, polipeptídeos e proteínas. A identificação de um fragmento pode ocorrer quer através da verificação da sua funcionalidade, por intermédio de medição da sua atividade biológica, tal como acima descrito, quer também recorrendo a uma sequenciação do fragmento e posterior comparação da sequência obtida com a sequência nativa. A sequenciação pode ser realizada recorrendo aos inúmeros e bem conhecidos métodos padrão do estado da técnica.

Como variantes de monómeros, polipeptídeos e proteínas biologicamente ativas ou fragmentos dos mesmos ou de um componente A, são referidos aqui especialmente os monómeros, polipeptídeos ou proteínas ou fragmentos que apresentam diferenças de sequência em relação às respetivas sequências nativas. Estes desvios sequenciais podem tratar-se de uma ou mais inserções, eliminações e/ou substituições de aminoácidos, em que uma homologia de sequência é de pelo menos 60%, preferencialmente 70%, um pouco mais preferencialmente 80%, mais preferencialmente 85%, ainda mais preferencialmente de 90% e totalmente preferencial de 97%. 10

Para determinar a identidade percentual de duas sequências de aminoácidos ou ácidos nucleicos, podem equiparar-se as sequências, e depois compara-las uma com a outra. Aqui, podem, por exemplo ser inseridos espaços na sequência, da primeira sequência de aminoácido ou ácido nucleico, e comparar os aminoácidos e os nucleótidos na posição correspondente da segunda sequência de aminoácido ou ácido nucleico. Quando uma posição na primeira sequência de aminoácido é ocupada com o mesmo aminoácido ou o mesmo nucleótido como é o caso de uma posição na segunda sequência, então ambas as sequências nesta posição são idênticas. A identidade percentual entre ambas as sequências é uma função do número de posições idênticas dividido pelas sequências. A determinação da identidade percentual de duas sequências pode ser efetuada com a ajuda de um algoritmo matemático. Um exemplo de um algoritmo matemático preferencial, mas não limitado, que pode ser utilizado para a comparação de duas sequências, é o algoritmo de Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877. Um algoritmo desse tipo está integrado no programa NBLAST, com o qual se podem identificar sequências que possuem uma identidade desejada em relação às sequências da presente invenção. Para se obter um alinhamento dos espaços (também "gapped alignment"), tal como acima descrito pode utilizar-se o programa "Gapped BLAST" tal como descrito em Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402.

Variantes de monómeros, polipeptídeos e proteínas ou fragmentos dos mesmos biologicamente ativos, ou seja, funcionais, no âmbito da invenção, poderiam preferencialmente, apresentar propriedades de ligação a recetores, sendo que a variante pode ser otimizada, por exemplo, no que respeita à sua bioatividade especifica ou outras propriedades, especialmente a sua estabilidade.

Pelo termo "variantes" entende-se especialmente as 11 sequências de aminoácidos que apresentam uma substituição conservativa em relação às sequências fisiológicas. Por substituições conservativas designam-se aquelas substituições, nas quais aminoácidos, com origem na mesma classe, são trocados uns pelos outros. Em especial, existem aminoácidos com cadeias laterais alifáticas, cadeias laterais de carga positiva ou negativa, grupos de aromatizantes nas cadeias laterais, ou aminoácidos, cujas cadeias laterais podem iniciar ligações de hidrogénio, por exemplo, cadeias laterais que possuem uma função de hidróxido. Isto significa que, por exemplo, um aminoácido com uma cadeia lateral polar é substituído por um outro aminoácido com igualmente uma cadeia lateral polar ou, por exemplo, por um aminoácido caracterizado por uma cadeia lateral hidrófoba substituído por um outro aminoácido com igualmente uma cadeia lateral hidrófoba (por ex. serina (treonina) por treonina (serina) ou leucina (isoleucina) por isoleucina (leucina)). As inserções e substituições são especialmente possíveis nas posições de sequências, que não implicam qualquer alteração da estrutura tridimensional ou área de ligação. Uma alteração de uma estrutura tridimensional através de inserções ou eliminações pode ser facilmente comprovada com a ajuda de espetros de CD (espectros de diocrismo circular) (Urry, 1985, Absorption, circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modem Physical Methods in Biochemistry, Neuberger et aL (Hrgb.), Elsevier, Amsterdam)

Processos de fabrico adequados de variantes, por exemplo, monómeros, polipeptídeos e proteínas ou fragmentos dos mesmos com sequências de aminoácidos, que apresentam substituições em relação à ou às sequências nativas, são divulgados por exemplo nos pedidos de patente US 4,737,462, US 4,588,585, US 4, 959, 314, US 5, 116, 943, US 4,879, 111 e US 5,017,691t. 0 fabrico de variantes em geral é especialmente descrito também por Maniatis et al, (2001), Molecular 12

Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Aqui podem também omitir-se, complementar-se ou substituir-se os codões. As variantes podem ser especialmente também as proteínas ou polipeptídeos que são estabilizados, para contrariar a degradação fisiológica, por exemplo, através da estabilização da coluna vertebral da proteína por substituição da ligação tipo amida, por exemplo, também através da substituição de β-aminoácidos.

As variantes podem ser igualmente fabricadas, na medida em que os ácidos nucleicos, que codificam as variantes, são sujeitos a alterações como, por exemplo, inserções, eliminações e/ou substituições de um ou mais nucleótidos. No estado da técnica são conhecidos inúmeros processos de alterações de sequências de ácidos nucleicos desse tipo. Uma das técnicas mais utilizadas é a mutagénese específica do local orientada para o oligonucleótido (ver Comack B., Current Protocols in Molecular Biology, 8.01-8.5.9, Ausubel F. et aL, Aufl. 1991). Nesta técnica é sintetizado um oligonucleótido, cuja sequência apresenta uma determinada mutação. Este oligonucleótido é então hibridizado com um modelo que contém a sequência de ácidos nucleicos de tipo selvagem. Preferencialmente utiliza-se, com esta técnica, um modelo de cadeia simples. Depois da hibridização do oligonucleótido e modelos, é iniciada uma polimerase de ADN dependente de ADN para sintetizar a segunda cadeia do oligonucleótido , que é complementar à cadeia de ADN do modelo. Como resultado obtém-se uma molécula heteroduplex, que contém uma conjugação errada, que ocorre no oligonucleótido devido à mutação acima referida. A sequência de oligonucleótido está inserida num plasmido adequado, este é inserido numa célula hospedeira e esta célula hospedeira é replicada no ADN do oligonucleótido. Com esta técnica obtêm-se sequências de ácidos nucleicos com alterações direcionadas (mutações), que podem ser utilizadas para o fabrico de variantes de 13 acordo com a invenção.

Os componentes A abrangidos pelo polipeptídeo podem ser idênticos ou diferentes. Por exemplo, um polipeptídeo 4, 5, 6 pode conter um ou mais componentes A que formam um tetrâmero, pentâmero, hexâmero, etc. De forma igualmente preferencial, um polipeptídeo contém uma multiplicidade de um trímero, tal como anteriormente descrito, dos componentes A, por exemplo, dois, três, quatro ou mais trímeros dispostos, uns a seguir aos outros. Os componentes A contidos nos polipeptídeos podem ser separados uns dos outros por linkers (ver em baixo) . Se, tal como acima descrito, estiverem dispostos dois, três, quatro ou mais trímeros dos componentes A atrás uns dos outros, os linkers, que ligam os diversos trímeros uns aos outros, podem ser igualmente mais compridos do que os linkers, que ligam os componentes A num trímero individual.

Os componentes A podem ser originários dos mesmos organismos ou de organismos diferentes. Pode tratar-se aqui de vertebrados, especialmente de mamíferos, por exemplo, rato, ratazana, porco e acima de tudo humanos.

De acordo com a invenção trata-se, no caso dos componentes A do polipeptídeo de um monómero ou de um fragmento funcional ou de uma variante funcional do TNF (Tumor Nekrose Faktor; Genbank Zugriffsnt. NM_ 000594).

Numa forma de realização especialmente preferencial trata-se, no caso dos componentes A definidos como acima, do polipeptídeo, de um monómero TNF que é resistente contra a enzima de processamento TACE. O TACE é um membro da família de protéases ADAM e define a enzima de processamento fisiológica específica de TNF do TNF que se encontra naturalmente na membrana celular. O TNF é normalmente separado da membrana celular e libertado no ambiente. Um componente A, de acordo com a invenção, resistente contra TACE, falta, preferencialmente o local de clivagem Ala-Val (por exemplo, AS 76-77 no caso de scTNF de 14 acordo com a nomenclatura SWISSPROT para o TNF humano, No. P01375). 0 local de clivagem pode assim, de acordo com a invenção, ser removido por eliminação de um ou ambos os aminoácidos Ala ou Vai relevantes. Em alternativa ou adicionalmente, de acordo com a invenção, a sequência para reconhecimento do TACE (por exemplo AS 77-88 no caso de scTNF de acordo com a nomenclatura SWISSPROT para TNF em humanos, No. P01375) pode ser eliminada total ou parcialmente. Isto ocorre preferencialmente através da eliminação de dois, três, quatro ou mais aminoácidos, por exemplo, todos os aminoácidos da sequência de reconhecimento TACE. Para scTNF, por exemplo, a sequência resistente TACE fica na zona dos aminoácidos 89-233 (AS 89-233) do scTNF de acordo com a nomenclatura SWISSPROT para TNF humano, n.° P01375. Uma eliminação desse tipo, no componente A, impede uma potencial clivagem do componente A, por exemplo, scTNF, por TACE junto dos pontos de associação dos componentes A na zona do linker (componente B, ver em baixo) , e aumenta assim a estabilidade in vivo dos polipeptideos. Caso necessário, através do encurtamento da sequência decorrente da eliminação, pode compensar-se o linker através de um prolongamento correspondente. A eliminação descrita, a titulo de exemplo, da sequência do componente A, pode ser utilizada para cada um dos componentes A acima referidos. Caso a sequência TACE não seja removida ou apenas o seja parcialmente, deve preferencialmente ter-se em atenção, que na utilização de componentes B ou C (ver em baixo) adicionais, no polipeptideo, de acordo com a invenção, a sequência de reconhecimento TACE e o local de clivagem TACE não são novamente gerados.

Numa outra forma de realização especialmente preferencial, os componentes A, tal como acima definidos, do polipeptideo da invenção são modificados de forma a que os polipeptideos de acordo com a invenção podem ser 15 acoplados de forma covalente nas superfícies. Este acoplamento ocorre preferencialmente em superfícies planares ou em partículas esféricas como, por exemplo, em partículas magnéticas (Magnebeads), ou em nanopartículas/micropartículas, preferencialmente como reagente terapêutico mimético celular com propriedades semelhantes ao TNF ligado à membrana. Para acoplamento introduz-se um grupo de acoplamento, preferencialmente o grupo SH de um resíduo de cisteína, na zona N-terminal, pelo menos de um componente A de um polipeptídeo. (Outros grupos de acoplamento preferenciais de acordo com a invenção estão descritos em baixo). Isto pode ocorrer de forma especialmente preferencial através da inserção de um resíduo de cisteína sob a forma de uma adição e/ou substituição na posição desejada. 0 grupo de acoplamento pode encontrar-se em qualquer posição da zona N-terminal do componente A, preferencialmente perto de N-terminal. De forma especialmente preferencial encontra-se o grupo de acoplamento numa zona dos primeiros 1- 15, e ainda mais preferencialmente numa zona dos primeiros 1- 10 aminoácidos N-terminal. Por exemplo, a modificação num scTNF expresso procarioticamente após uma metionina inicial (posição 2) da sequência de aminoácido ou no caso de um scTNF expresso eucarioticamente, pode ser inserida diretamente após a sequência principal de clivagem, que assim apresentam os aminoácidos N-terminal do componente A. Em alternativa, no caso do Tag utilizado de acordo com a invenção, por exemplo, um HisTag, um Flag-Tag (ver por ex. Figura 18) pode inserir-se, de acordo com a invenção, um grupo de acoplamento, por ex., resultando num CysHis- Tag com uma cisteína na posição de aminoácido 9. Uma outra alternativa inclui a inserção de um grupo de acoplamento em um, ou em ambos, os componentes B (linkers) do polipeptídeo.

Preferencialmente, num polipeptídeo é apenas previsto/modifiçado o componente A colocado no N-terminal 16 ou outro Tag colocado no N-terminal com um grupo de acoplamento tal como acima descrito. Numa outra forma de realização, no caso de um polipeptídeo, que contenha 3 componentes A, por exemplo 2 ou 3 componentes A modificados cada um com um grupo de acoplamento, de forma a que a molécula completa (o polipeptídeo de acordo com a invenção) possa ser acoplada, através de duas ou 3 ligações covalentes a uma matriz adequada ao efeito. 0 acoplamento do polipeptídeo através de um ou mais grupos de acoplamento de todos os componentes A de um polipeptídeo não prejudica preferencialmente a função dos componentes A individuais do TNF, mas sim possibilita anda mais um melhoramento da imobilização do scTNF, em superfícies e/ou partículas. Tal como anteriormente descrito, cada polipeptídeo de acordo com a invenção contém preferencialmente para a função biológica as subunidades necessárias (componentes A) numa disposição funcional relevante. Através do acoplamento de um polipeptídeo numa superfície/partícula é, de acordo com a invenção, possível gerar superfícies ou partículas com, por exemplo, homotrímeros ou heterotrímeros ou heteromultímeros do TNF acoplados. Nestas superfícies/partículas os homotrímeros ou heterotrímeros ou heteromultímeros do TNF acoplados estão estáveis e bioativamente imobilizados. Através do princípio single-chain, o estado trimérico relevante funcional dos componentes A é estabilizado pelos componentes B, através do que, se garante que, após o acoplamento covalente numa superfície/à partícula, se exclui a hipótese de uma dissociação dos componentes A individuais e logo uma perda de atividade biológica.

Uma propriedade preferencial desses polipeptídeos acoplados nas superfícies ou partículas é a sua atividade biomimética, que corresponde aos ligandos membranosos naturais da família TNF. Por exemplo, um scTNF imobilizado obtém uma elevada afinidade para o TNFR2 e logo uma elevada 17 capacidade de sinalização.

Os polipept ideos, tal como acima descritos, com um grupo de acoplamento modificado, contêm componentes A e são acoplados numa superfície e/ou partícula, podem, de acordo com a invenção, serem utilizados para deteção bem como para manipulação, depleção e/ou remoção de parceiros de ligação do TNF e logo ligações associadas. De especial interesse têm aqui processos para manipulação extracorporal, depleção e/ou remoção de substâncias contidas nos fluidos corporais, por exemplo, através de aférese.

As execuções seguintes dos objetos da invenção referem-se ao TNF do membro da família de ligandos do TNF.

Os polipeptideos da presente invenção abrangem além dos componentes A descritos, pelo menos dois componentes B, em que o componente B apresenta a propriedade de um linker peptídico. Como linker peptídico, no âmbito da invenção pode ser considerada qualquer sequência de peptídeo expressa num sistema biológico. Os linkers peptídicos, nas construções de polipeptídeos apresentam, por exemplo, uma ligação flexível, que preferencialmente não influencia negativamente as propriedades de trimerização do TNF. Preferencialmente são selecionados linkers com essas propriedades, especialmente flexibilidade e comprimento, que possibilitam a estabilização dos homotrímeros formados de forma espontânea dos ligandos (derivados) relevantes.

Numa forma de realização preferencial da invenção, no caso do componente B, trata-se ainda de linkers peptídicos que consistem em 2 a 30, preferencialmente entre 4 e 16 e mais preferencialmente entre 4 e 12 aminoácidos, que contêm preferencialmente estruturas de glicina e serina repetitivas, mais preferencialmente módulos gli-gli-gli-ser (módulos GGGS) em disposição repetitiva.

Preferencialmente, no caso dos linkers peptídicos da invenção, tratam-se também de linkers peptídicos ricos em glicina (G) , ou seja, em que a sequência de aminoácido de 18 um linker peptídico apresenta uma elevada proporção de glicina, preferencialmente de 60 a 80%, especialmente preferencial de 75%.

Uma forma de realização especialmente preferencial da invenção engloba os linkers peptidicos (componente B) da sequência de aminoácido GGGSGGGSGGGS, também denominada (GGGS), ou Lshort, ou a sequência de aminoácido GGGS-GGGSGGGSGGS, também denominada (GGGS)4 ou Liong. Os linkers peptidicos, de acordo com a invenção, são designados como, entre outros, LI e L2, pelo que se obtêm também designações como Blshortf L2 Short f l* 1 íong c/ou L2jong· E possível uma utilização de dois linkers diferentes para estabilização de uma molécula trimera.

Preferencialmente, os linkers peptidicos, de acordo com a invenção, ou seja os componentes B, associam dois dos, pelo menos, três, componentes A uns aos outros. Esta associação ocorre de forma covalente através do C-terminal de um componente A e do N-terminal de um outro componente A. O polipeptideo apresenta uma molécula de cadeia simples (também denominada molécula single chain ou sc). Isto significa, que todos os componentes A e componentes B, que abrangem o polipeptideo, assentam numa única cadeia proteica ou de polipeptideo.

Numa forma de realização preferencial da invenção os componentes A e os componentes B formam uma estrutura proteica de trimero. Preferencialmente trata-se aqui de uma estrutura proteica homotrimérica, sendo, todavia, também abrangidas pela invenção estruturas proteicas heterotriméricas. A formação desta estrutura proteica trimera é preferencialmente ativada e/ou reforçada pelo componente B. Uma vez que o componente B que gera uma trimerização ou o componente B que reforça uma trimerização do polipeptideo essencialmente não deverá formar quaisquer agregados, o componente B não deve apresentar tipicamente qualquer 19 resíduo de cisteína, que pode formar ligações de dissulfureto intermoleculares. Preferencialmente, o componente B, conterá num polipeptídeo nenhum resíduo de cisteína ou apenas os resíduos de cisteína, que possuem uma ligação de dissulfureto intermolecular, ou seja no próprio polipeptídeo, para evitar que, em condições de oxidação, ocorra uma associação covalente com, pelo menos um resíduo de cisteína de uma proteína de fusão, a um outro trímero.

As sequências de polipeptídeos nativos ou fragmentos nativos destes polipeptídeos nativos, que são utilizados como linkers peptídicos, de acordo com a invenção, podem também ser utilizadas, no âmbito desta invenção e da definição acima, sob a forma de variantes funcionais biologicamente ativas.

No caso dos componentes B, de acordo com a invenção, podem tratar-se de sequências de peptídeos idênticas ou diferentes de origem natural. Podem ser originárias dos mesmos organismos ou de organismos diferentes. Os organismos podem tratar-se de vertebrados, especialmente mamíferos, por exemplo, rato, ratazana, porco e acima de tudo humanos. 0 polipeptídeo pode, além dos componentes A apresentar ainda secções sequenciais adicionais. Preferencialmente, neste contexto, as denominadas sequências Tag, por exemplo, pelo menos uma flag-tag, ou seja a série de aminoácidos DYKDDDDK, e/ou por exemplo, pelo menos o Tag His (que contém várias histidinas consecutivas, por exemplo, pelo menos 5) e/ou outras sequências de Tag ou anigénicas. Uma secção sequencial adicional especialmente preferencial é uma sequência de peptídeo condutor. Preferencialmente, esta sequência de peptídeo condutor apresenta um sinal para secreção do polipeptídeo ou proteína em células eucarióticas. Esta sequência de peptídeos condutores tem preferencialmente uma disposição N-terminal.

Numa outra forma de realização da invenção, um 20 polipeptídeo abrange um outro componente C, que é caracterizado por uma interação específica com uma molécula da superfície celular complementar ("Antigénio")· O princípio de ação da construção de polipeptídeos é especialmente adequado para todos os membros da família de ligandos do TNF, que são ativos para determinados recetores exclusivamente ou em especial medida como molécula de membrana. Aqui pertencem além de TRAIL (TNFSF10), FasL (INFSF6) e TNF (INFSF2) também os imunomoduladores CD40L (INFSF5) e CD30L (INFSF8) . O componente C tem assim uma função "targeting". De forma correspondente, o componente C é um fragmento de anticorpo, preferencialmente um fragmento de anticorpo de cadeia simples denominado scfv, ou um derivado de anticorpo que identifica uma molécula alvo específica sobre uma superfície celular. Numa outra forma de realização o componente C é uma proteína ou peptídeo que não pertence aos anticorpos mas que contudo analogamente identifica uma interação anticorpo-antigénio ou uma interação recetor-ligando igualmente numa molécula-alvo específica sobre uma superfície celular. Numa forma de realização especialmente preferencial, a presente invenção abrange, um polipeptídeo, tal como acima descrito, sob a forma de componente A, pelo menos um scTNF, bem como sob a forma de componente C, um fragmento de anticorpo, tal como acima descrito, por exemplo, scFv. Assim se obtêm polipeptídeos mais pequenos com um "domínio tatgeting". Esses pequenos polipeptídeos são vantajosamente menos sujeitos a, por exemplo, agregação.

Preferencialmente trata-se, no caso do componente C de um fragmento de anticorpo ligante de antigénio ou de um derivado de anticorpo ligante de antigénio, especialmente de origem murina ou humana, ou trata-se de um fragmento de anticorpo humanizado ou de um derivado de anticorpo humanizado, por ex. de origem mamífera. No caso da derivatização e/ou humanização, o componente C consiste 21 tipicamente numa derivado de Fv "single chain" gerado, de acordo com o estado da técnica, através do componente C humanizado CDR grafting ou trata-se de um componente C de origem completamente humana que foi correspondentemente transformado num derivado scFv.

Numa outra forma de realização preferencial, no caso do componente C trata-se de um ligando de proteínas ou peptídeos, que, como monómero, inicia uma ligação específica a um recetor de membrana.

Numa forma de realização preferencial, no caso do componente C trata-se aqui de uma proteína ou peptídeo com especificidade para moléculas da superfície celular, que é especialmente um recetor de citocinas, que foi selecionado a partir do grupo da família de genes TNFR 0 Componente C de um polipeptídeo apresenta preferencialmente especificidade para um antigénio que se expressa de forma seletiva e dominante em tecido tumoral. Um antigénio tumoral desse tipo pode em geral expressar-se nas células malignas ou, também, na parte não maligna do tumor, nas células do estroma ou no endotélio do tumor. A parte tecidular dos antigénios não malignos desse tipo, de um tumor sólido (carcinoma), são por um lado invariáveis geneticamente, por outro lado estão presentes em diversas entidades tumorais e logo marcadores tumorais universais. Exemplos de ligandos desse tipo para associação tumoral, contra os quais se pode direcionar um componente C do polipeptídeo, são o complexo VEGFR e/ou o complexo VEGFR/VEGF bem como a integrina av β3 e a vibronectinisoforma β Fn como estruturas alvo extensamente seletivas do endotélio do tumor e a Proteína de Ativação dos Fibroblastos (como marcador seletivo do estroma tumoral). Todos os exemplos referidos podem ser determinados de forma eficaz com scFv específico, em que o scFv desse tipo ("single chain Fv") serve especialmente como componente C de um polipeptídeo. Também a galectina é 22 aqui utilizada como marcador tumoral, contra a qual o componente C está orientado

Assim, são especialmente preferidos, fragmentos de anticorpos, em diversos formatos de anticorpos, por exemplo, scfv, especilamente scFv40 como componente C.

Numa outra forma de realização da presente invenção, o polipeptideo reconhece, através do seu componente C, como molécula alvo especifica, um recetor membranoso de um membro da família de ligandos do TNF, preferencialmente diferente do membro da familia de ligandos do TNF do componente A. Exemplos, que não constituem uma enumeração final, desses possíveis ligandos são TNFSF1 (LTalpha), TNFSF2 (TNF), TNFSF3 (LTbefa), TNFSF4 (OX40L), TNFSF5 (CD40L), TNFSF 6 (FasL), TNFSF7 (CD27L), TNFSF8 (CD30L), TNFSF9 (4-1BBL), TNFSF10 (TRAIL), TNFSF11 (RANKL), TNFSF12 (TWEAKL), TNFSF13 (APRIL), TNFSF143B (BLYS), TNFSF14 (LIGHT), TNFSF15 (VEGI), TNFSF16 (CD30L), e TNFSF18 (AITRL), bem como EDA, cujos fragmentos funcionais ou variantes funcionais da sequência nativa ou dos fragmentos podem igualmente servir como componente A numa construção de polipeptideo. Especialmente são reveladas, a este respeito, todas as proteínas de tipo II membranosas (C-terminal extracelular), cujos fragmentos funcionais ou variantes funcionais, requerem uma organização trímera das suas subunidades como pressuposto para a atividade biológica. Método de fabrico de um polipeptideo a utilizar de acordo com a invenção que engloba tipicamente os seguintes passos (a) Cultura de uma célula hospedeira em condições adequadas, (b) Expressão de uma construção de ácido nucleico correspondente em condições adequadas, e (c) Isolamento de um polipeptideo da célula hospedeira e/ou do sobrenadante da cultura. A cultura de uma célula hospedeira significa que a célula hospedeira possibilita um crescimento num meio de 23 cultura adequado com um pH adequado e temperaturas adequadas. Essas condições de crescimento dependem das células hospedeiras utilizadas e são bem conhecidas de um perito da especialidade. Informações sobre a cultura das células encontram-se também em Maniatis et al. (2001), supra. A expressão do polipeptídeo pode aqui ocorrer tipicamente, de acordo com o estado da técnica, em sistemas de expressão adequados, preferencialmente sob a forma de transfectantes estáveis de produto secretado, por exemplo, células CHO ou outras células animais, como Cos7 ou SF9 (células de insetos), ou outros sistemas de células eucarióticas, por exemplo Pichia pastoris. Preferencialmente os polipeptideos expressos apresentam sequências lideres adequadas para secreção no sistema celular. Assim, os vetores utilizados para a expressão contêm também secções codificadas, que codificam para uma sequência líder funcional, por exemplo, como em Brocks et aL (Immuaotechnology 3: 173- 184, 1997) para células de mamíferos e insetos ou mediante utilização de, por exemplo, vetores pPIC- Zalpha (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) para expressão e secreção na levedura Pichia pastoris. O isolamento do polipeptídeo da célula hospedeira pode ocorrer através de métodos padrão, como métodos de cromatografia, métodos de precipitação etc. que são adequados para a purificação de polipeptideos e proteínas, (s.a. Maniatis et aL (2001), supra. Objeto da presente invenção são métodos para manipulação extracorporal (ex vivo), depleção e/ou remoção de componentes contidos nos fluidos corporais, como, por exemplo, parceiros de ligação como um componente A acima definido ou as células a eles ligadas ou associadas. Estes métodos extracorporais abrangem preferencialmente métodos, como por exemplo, aférese, especialmente as formas básicas da aférese, a plasmaferese e a citaferese. 24 A plasmaferése contém, de acordo com a invenção, a manipulação extracorporal, a depleção e /ou a remoção de determinados componentes em solução ou em suspensão no plasma do sangue, bem como a re-administração do sangue assim tratado ao doente. Para este efeito, é retirado a um doente, preferencialmente com uma máquina de ferése, sangue periférico, ao sangue são adicionados opcionalmente anticoagulantes e o sangue é separado nos seus componentes principais sólidos (glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e plaquetas) e componentes líquidos (plasma). Após a separação nestes componentes principais, os componentes do sangue, em solução ou em suspensão, na fração de plasma assim obtida, podem ser manipulados, depletados e/ou removidos numa outra fase do processo, por exemplo com a utilização dos polipeptídeos de acordo com a invenção. Em seguida, pode adicionar-se o plasma do sangue assim tratado, juntamente com os componentes sólidos do sangue separados e ser reinjetado ao doente. A perda de volume associada à plasmaferese pode, no método de acordo com a invenção ser ainda substituída por uma solução salina isotónica. A plasmaferese é efetuada, de acordo com a invenção, preferencialmente utilizando métodos como substituição plasmática terapêutica (TPE) , imunoabsorção (IA), precipitação (HELP), filtração de membrana diferencial e outros métodos. Referem-se aqui, a título de exemplo, colunas de filtração de plasma (ver por ex. US 4, 619, 639, Asahi Medicai Company, aqui incluídas como referência). Igualmente podem ser utilizados sistemas de filtração de membrana (MDF) utilizando diferentes partículas e superfícies, por exemplo filtros como, os filtros de sangue PlasmaFlo® OP-05 (W) L e RheoFilter® AR2000 (fabricados pela Asahi Medicai Company, Ltd. of Japan). Em alternativa, podem, nos métodos de plasmaferese de acordo com a invenção, serem utilizadas todas as superfícies e partículas adequadas. 25

No caso da citaférese, de acordo com a invenção, ao contrário da plasmaferese anteriormente descrita, os componentes celulares em circulação no sangue e/ou associados ao sal (glóbulos vermelhos, glóbulos brancos, células estaminais ou trombócitos) ou subpopulações especificas destas células são manipulados, depletados e/ou removidos para se obter o efeito clinico. Também aqui retira-se a um doente sangue periférico através de uma máquina de aférese. São depois adicionados, opcionalmente, ao sangue anticoagulantes e o sangue é separado nos seus componentes principais. Em seguida, na fração do sangue contida nos constituintes de células, estes constituintes de células podem ser manipulados, depletados e/ou removidos, numa outra fase do processo, preferencialmente com a utilização dos polipeptideos descritos de acordo com a invenção. A fração assim tratada pode ser em seguida novamente reinjetada ao doente. Preferencialmente ocorre na citaferese, de acordo com a invenção, a separação do sangue em diversas frações bem como, caso necessário a separação de determinados constituintes de células do sangue através de métodos como centrifugação, filtração de membranas diferencial ou outros métodos. Podem ainda ser utilizados sistemas de filtração de membrana (MDF) utilizando diferentes partículas e superfícies, por exemplo filtros como, os filtros de sangue PlasmaFlo® OP (W) L e RheoFilter® AR2000 (fabricados pela Asahi Medicai Company, Ltd. of Japan).

Numa terceira alternativa de acordo com a invenção, os métodos acima descritos da plasmaferese e da citaferese podem ser combinados uns com os outros, por exemplo, para poderem manipular, depletar e/ou remover tanto componentes em solução como em suspensão na parte do plasma do sangue como também componentes em circulação no sangue e/ou ligados aos ossos (glóbulos vermelhos, glóbulos brancos, células estaminais ou trombócitos) ou subpopulações 26 específicas destas células, para se obter o seu efeito clínico. Uma combinação desse tipo de plasmaferese e citaferese é obtida com a utilização do polipeptídeo descrito. A presente invenção refere-se ao método de (aférese) de acordo com a reivindicação 1.

Numa forma de realização especial do processo de aférese, de acordo com a invenção, antes da separação do sangue que ocorre, consoante necessário, pode ser feita, opcionalmente uma recolha de sangue num doente. Além disso, sangue tratado com o método, de acordo com a invenção, ou a fração de sangue assim tratada, pode ser opcionalmente reinjetado ao doente. Para esse feito é igualmente necessário voltar a unir as frações do sangue anteriormente separadas e em determinadas circunstâncias, tratadas de forma diferente, com os outros componentes sólidos e/ou líquidos não tratados do sangue. As perdas de volume que ocorrem através do método de acordo com a invenção podem ser compensadas através da adição de fluidos adequados, por exemplo através da adição de uma solução salina isotónica. 0 passo contido nos métodos de aférese de acordo com a invenção para ligação dos componentes celulares do sangue em solução ou suspensão numa superfície ou partícula acoplada a um polipeptídeo, de acordo com a invenção, pode, consoante necessário, ser efetuado uma ou várias vezes para se obter a seletividade desejada

Num método de aférese de acordo com a invenção são utilizadas essas superfícies e/ou partículas, que são acopladas de forma covalente com um polipeptídeo definido como acima, de acordo com a invenção. Para esse efeito, o polipeptídeo é preferencialmente acoplado de forma covalente, através do(s) grupo (s) de acoplamento A, contido(s) no polipeptídeo, sobre a superfícies e/ou partícula.

Um acoplamento do polipeptídeo, utilizado de acordo 27 com a invenção, através dos componentes A individuais faz-se preferencialmente conforme descrito na patente DE 101 44 252 Al. O acoplamento dos polipeptideos utilizados de acordo com a invenção ocorre assim preferencialmente na superfície ou partículas (suporte) através de uma ligação entre os primeiros grupos monofuncionais disponíveis sobre a superfície de suporte e no polipeptídeo através dos grupos de acoplamento contidos nos componentes A. Estes grupos de acoplamento são preferencialmente complementares aos grupos funcionais do suporte e podem, juntamente com este, iniciar ligações afinas, preferencialmente covalentes. Preferencialmente, o grupo funcional do componente A está posicionado de tal forma que está disposto numa distância adequada, fora dos domínios responsáveis pela atividade biológica do polipeptídeo. Desta forma, é possível, de acordo com a invenção, imobilizar sobre o suporte de forma orientada para TNF e cumprindo as suas atividades biológicas. Após a imobilização, o polipeptídeo é preferencialmente fixado sobre a superfície de suporte, de tal forma que a estrutura tridimensional para os domínios necessários à atividade biológica em relação ao polipeptídeo não imobilizado, não é alterada e que o(s) domínio (s) no caso de contacto com parceiros de reação celular, estão livremente acessíveis para estes. Numa forma de realização preferencial da invenção, é selecionado o grupo funcional da superfície de suporte a partir do grupo que é constituído pelo grupo de aminas, grupo de carboxilatos, grupo de epóxi, grupo imidomaleico, grupo de alquilcetonas, grupo de aldeídos, grupo de hidrazinas, grupo de hidrazidas, grupo de tiolois e grupo de tioésteres.

De acordo com a invenção, os grupos de acoplamento dos componentes A do polipeptídeo a imobilizar são selecionados a partir de um grupo, que contém a mesma espécie que o grupo funcional da superfície de suporte. Uma 28 superfície/partícuia da fase de aférese, de acordo com a invenção, apresenta igualmente na sua superfície um grupo funcional, que associa de forma covalente a um grupo de acoplamento do seu polipeptídeo a imobilizar, em que o grupo de acoplamento do polipeptídeo apresenta um outro grupo como proteína funcional do suporte. Os dois grupos de acoplamento que se ligam um ao outro e os grupos funcionais devem ser assim complementares uns aos outros, ou seja estarem em posição de iniciar uma ligação covalente uns com os outros. Se, de acordo com a invenção, se utilizar como grupo funcional do suporte, por exemplo, um grupo de aminas, o grupo de acoplamento do componente A do polipeptídeo, de acordo com a invenção, é um grupo de carboxilatos. Se, por outro lado, de acordo com a invenção, se utilizar, como grupo funcional do suporte, um grupo de carboxilatos, o grupo de acoplamento do componente A do polipeptídeo, de acordo com a invenção, é um grupo de aminas. Se, de acordo com a invenção, se utilizar como grupo funcional do suporte um grupo de tiol, o grupo de acoplamento complementar do componente A do polipeptídeo, de acordo com a invenção, é um grupo de maleico imido. Se, ao contrário, se utilizar como grupo funcional do suporte um grupo de maleico imido, o grupo de acoplamento complementar do componente A do polipeptídeo é, de acordo com a invenção, um grupo de tiol. Se, de acordo com a invenção, se utilizar como grupo funcional do suporte, o grupo de alquilcetonas, especialmente o grupo de metilcetonas ou de aldeído, o grupo de acoplamento complementar funcional do componente A do polipeptídeo é um grupo de hidrazina ou um grupo de hidrazida. Se, de acordo com a invenção, por outro lado se utilizar um grupo de hidrazina ou hidrazida, como grupo funcional do suporte, o grupo de acoplamento complementar funcional do componente A do polipeptídeo é, de acordo com a invenção, um grupo de alquilcetona, especialmente metilcetona ou aldeído. 29

Especialmente preferencial, de acordo com a invenção, trata-se aqui, no caso do grupo funcional da superfície de suporte de um grupo de maleico imido e no caso do grupo de acoplamento do componente A do polipeptídeo de um grupo de tiol. A imobilização ocorre aqui de forma preferencialmente orientada. No contexto da presente invenção, o conceito "imobilizado de forma direcionada" ou "imobilização direcionada", significa que um scTNF, apresentado em posições definidas dentro do scTNF é imobilizado num suporte, em que a estrutura tridimensional dos domínios necessários para a atividade biológica não se altera em relação ao estado não-imobilizado e em que estes domínios TNF, são por exemplo locais de ligação para parceiros de reação celular e que, no caso de contacto com parceiros de reação celular estão acessíveis para os mesmos. "Imobilizado de forma direcionada" significa também que o acoplamento do polipeptídeo ocorre de tal forma sobre a superfície de suporte que a proteína imobilizada, no caso de uma utilização posterior, num ambiente celular ou semelhante a celular através de enzimas que degradam a proteína apenas se pode degradar lentamente ou não se degradar de todo. Isto significa, que a molécula do TNF está orientada sobre a superfície de suporte de tal forma que oferece o mínimo de pontos de acesso para as protéases. Adicionalmente, o polipeptídeo, antes do acoplamento, pode ser tornado resistente através de métodos biológicos moleculares, como por exemplo, acima descritos para os membros do TNF no caso da protéase TACE. 0 polipeptídeo possui, através do(s) seu(s) componente(s) A acoplados, a sua função biológica e a capacidade de iniciar uma interação com outras ligações/substâncias. Se um polipeptídeo, contiver, por exemplo, três componentes A (trímeros) , então, tipicamente, cada dois ou, preferencialmente apenas um dos três 30 componentes A é ligado de forma covalente à superfície/particuia.

Para acoplamento das superfícies e/ou partículas adequadas podem ser abrangidas todas as superfícies e/ou partículas adequadas nas quais os polipeptídeos se podem acoplar. Preferencialmente são especialmente tabuleiros de cultura ou as denominadas Mikrobeads, por exemplo Dynabeads (Dynal Biotech GMBH), nano-beads, nano partículas, ou fases solidas como, por exemplo, lã de nylon, Sepharose, Sephadex, etc. De acordo com a invenção, está ainda previsto que, no caso de sistemas de suporte usados, de acordo com a invenção, se tratem de nano partículas compactas ou ocas com tamanhos entre 25 e 1000 nm. Estas consistem, quer em materiais de partículas orgânicos quer anorgânicos. O tipo do material pode variar de acordo com a invenção consoante a posterior utilização, em que os suportes das nano partículas são preferencialmente constituídos por materiais compatíveis e/ou biodegradáveis. No contexto da presente invenção, entende-se ainda por "nano partículas", as matrizes de ligação, que abrangem um suporte com uma superfície, na qual estão dispostos grupos funcionais quimicamente reativos, que iniciam com grupos funcionais complementares de moléculas a ligar, especialmente polipeptídeos, ligações afinas, ou seja ligações covalentes e /ou não covalentes, e que desta forma conseguem fixar de forma estável os polipeptídeos nas suas superfícies. Os suportes das nano partículas consistem em materiais anorgânicos ou orgânicos quimicamente inertes e possuem um tamanho inferior a 1 mm, preferencialmente de 25 a 500 nm.

Uma forma de realização preferencial do método de aférese, de acordo com a invenção, contém uma superfície bifuncionalizada (planar ou de partículas) com o polipeptídeo scTNF, a qual foi imobilizada na forma anteriormente descrita, de forma covalente e orientada 31 sobre a superfície. Uma superfície biofuncionalizada desse tipo, contendo por exemplo várias moléculas scTNF imobilizadas, ou partículas das mesmas, possibilita uma elevada afinidade para o respetivo parceiro de ligação complementar, por exemplo, TNFRl e TNFR2. Os recetores TNFR1 e especialmente TNFR2 encontram-se em concentrações fortemente elevadas como moléculas processadas, solúveis no sangue de doentes tumorais e outras doenças. A remoção de TNFR do sangue de doentes tumorais gera uma regressão tumoral clinicamente documentada, o que leva a uma reconstituição das defesas do corpo (ver, por exemplo, Lentz M R, (1999) Therapeutics Apheresis, Vol. 1). Um método de aférese com scTNF possibilita que, preferencialmente, ambos os recetores TNF, possam ser removidos simultaneamente e de forma eficiente de amostras. Uma outra vantagem deste método é o facto acima descrito de que uma associação dos componentes individuais A do polipeptideo não é possível, ou seja não se espera nem uma perda de atividade das superfícies funcionalizadas nem uma contaminação do sangue tratado com as substâncias dissociadas. 0 procedimento de aférese de acordo com a invenção pode ser levada a cabo como um método contínuo ou como um método descontínuo. Como método contínuo, o método de acordo com a invenção é executado, preferencialmente de forma direta, após a recolha de sangue e/ou fracionamento do sangue recolhido e antes do retorno do sangue aos pacientes sem armazenamento intermédio do sangue ou de frações de sangue resultantes. Num processo descontínuo executado num processo descontínuo, por outro lado, o sangue recolhido e/ou as frações de sangue recolhido serão armazenados após cada etapa de um determinado período. A temperatura no método de aférese de acordo com a invenção é, de preferência de 0-40°C. Num método contínuo, a temperatura é de preferência de 25 a 40 C, mais 32 preferivelmente num intervalo de 36-38°C. Num processo descontinuo, a temperatura pode situar-se entre 0-40°C. 0 presente procedimento de aférese de acordo com a invenção é preferencialmente para o diagnóstico, terapia e/ou profilaxia em doenças associadas com o TNF, especialmente em tumores, em particular tumores sólidos ou linfóides, particularmente tumores sólidos e linfóides. A restauração da homeostasia do sistema imunitário com os seus componentes humorais e celulares é vista como a chave para a eficácia da aférese. Numa outra utilização, o sistema de aférese de acordo com a invenção, também pode ser usado para restaurar a homeostase imunológica em doenças benignas. Estas incluem doenças inflamatórias, doenças artríticas e reumáticas, ou doenças do sistema imunitário, bem como para o tratamento de doenças infecciosas, doenças metabólicas, circunstâncias inflamatórias, doenças hiperproliferativas, doenças autoimunes, doenças especialmente doenças reumatóides/artríticas, necrólise epidérmica tóxica (TEN), esclerose múltipla, tiroidite de Hashimoto, GVHD , hepatite virai (HBV, HCV), hepatite induzida pelo álcool, reações de rejeição a transplante de fígado, doenças com base em reações hiperapoptódicas, doenças degenerativas, em especial doenças neurodegenerativas.

Em doenças cancerígenas, incluem-se particularmente, o cancro do cólon, melanoma, carcinoma renal, linfomas de leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfóide aguda (LLA), leucemia mieloide crónica (LMC), leucemia linfocítica crónica (LLC), tumores gastrointestinais, carcinomas pulmonares, gliomas, tumores da tiroide, carcinomas da mama, tumores da próstata, hepatomas, vários tumores induzidos por vírus, tais como os carcinomas do Papilomavírus (por exemplo, carcinoma do colo do útero), adenocarcinomas, tumores induzidos por vírus do herpes (tal como linfoma de Burkitt, linfoma de células B induzido por 33 VEB), tumores induzidos por hepatite B (carcinoma de hepatocélulas), linfomas induzidos por HTLV-1 e HTLV-2, neuroma acústico, cancro cervical, cancro do pulmão, cancro da garganta, carcinoma anal, glioblastoma, linfoma, cancro retal, astrocitoma, cancro do cérebro, cancro gástrico, retinoblastoma, carcinoma basocelular, metástases do cérebro, blastoma da medula, cancro vaginal, cancro pancreático, cancro testicular, melanoma, cancro da tiroide, cancro da bexiga, doença de Hodgkin, meningioma, doença de Schneeberger, cancro do pulmão, tumor da hipófise, micose fungóide, cancro do esófago, cancro da mama, tumor carcinóide, neuroma, escamosas, linfoma de Burkitt, cancro da laringe, cancro do rim, timoma, câncer de Corpus, cancro ósseo, linfoma de Não-Hodgin, cancro uretral, sindrome de CUP, tumores na cabeça e na garganta, oligodendroglioma, cancro da vulva, cancro do estômago, cancro do cólon, cancro do esófago, verrugas, tumores do intestino delgado, craniofaringeomas, carcinoma do ovário, tumores dos tecidos moles, cancro do ovário, cancro do fígado, cancro do pâncreas, carcinoma cervical, carcinoma endometrial, metástases hepáticas, cancro do pénis, cancro da língua, cancro da vesícula biliar, leucemia, mieloma, cancro uterino, tumores das pálpebras, cancro da próstata, etc.

As doenças artríticas incluem, em particular, monoartrite, oligoartrite, poliartrite, artrite aguda (artrite sética, induzida por cristais, reativa e arcoidose aguda), artrite subaguda, artrite crónica (especialmente artrite reumatóide, artrite em espondilartrite seronegativa), artrite infeciosa, artrite parainfeciosa ou posinfeciosa, artrite reumatóide, artrite crónica juvenil, artrite em doenças do tecido conjuntivo inflamatória e vasculite, artrite alérgica, artrite associada com doenças metabólicas e distúrbios alimentares, artrite em doenças endócrinas, artrite em doenças granulomaroses, artrite em 34 doenças do sistema hematopoiético, artrite em sangramento nas articulações devido a distúrbios de coagulação do sangue, artrite neoplásica, artrite paraneoplásica, artrite postraumática, artrite em doenças das articulações, artrite em neuropatias, artrite em dermatoses provenientes de neutrofilia pustulosa, necrótica dos tecidos, artrite em outras doenças subjacentes extraarticulares e artrite alérgica, artrite induzida por clamidia, artrite disentérica, artrite gonocócica, artrite mutilante, artrite psoriática, artrite seca, artrite sifilitica, artrite tuberculosa, artrite gotosa, etc.

Em resumo, deve ser realçado que aqui é divulgado um polipeptideo que tem uma maior estabilidade, em que a totalidade da molécula é constituída por uma proteina e/ou um grupo de polipeptideos (scTNF), de modo que os monómeros (componentes A) não se possam dissociar. 0 scTNF não mostra, sob a forma da sua bioatividade, quaisquer diferenças qualitativas em relação ao sTNF solúvel normal (também de tipo selvagem, incluindo TNF ou wtTNF), mas é muito mais estável e, por conseguinte, apresenta uma atividade biológica mais elevada e, por conseguinte, é eficaz em concentrações mais baixas. Tal como o TNF solúvel normal (wtTNF), o scTNF pode desencadear apoptose em células sensíveis, ativar o fator de transcrição NF-kB, ativar o recetor TNFRl, mas não o TNFR2, bem como ativar o recetor TNFR2 na presença de um anticorpo específico (por exemplo, 80m2). No caso de utilizar polipéptidos com um grupo de acoplamento para a preparação de superfícies biofuncionalizadas e usar os mesmos, por exemplo para a aférese, não é possível observar qualquer sangramento dos polipeptídeos ou um retorno dos ligandos nocivos para o sistema. Além disso, o scTNF é um material de partida ideal para a produção de novas moléculas bifuncionais. Em primeiro lugar, o scTNF e/ou os fragmentos funcionais ligam de forma covalente às superfícies celulares. Isto tem a 35 vantagem de poder apenas ser produzida uma única ligação covalente ser feita para uma ligação estável da molécula. Com um membro solúvel de tipo selvagem normal da família de ligandos do TNF, por exemplo, o sTNF solúvel, têm de ser ligados, de forma covalente, três monómeros do homotrimero individual à superfície, a fim de obter uma construção estável, caso contrário os monómeros ligados não-covalentes se dissociam. Nesta forma de realização, é particularmente vantajosa uma utilização na aférese com scTNF como ingrediente biofuncional para a remoção dos recetores do TNF dos fluidos corporais.

Também é possível pela presente invenção, devido à ligação covalente de monómeros (componentes A) do polipeptídeo, introduzir estavelmente mutações em apenas um ou dois ou mais de, pelo menos, três monómeros (componentes A) . Por exemplo, são as conhecidas mutações pontuais gue forçam uma seletividade dos recetores, isto é, por exemplo, no caso do TNF, ocorre uma ligação em apenas um dos dois recetores do TNF (TNFR1 e TNFR2). De acordo com a invenção, é possível produzir, por exemplo, um mutante do TNF que se pode ligar especificamente e simultaneamente, por exemplo, a uma molécula do TNFR1 e duas moléculas do TNFR2, isto é incorrer em complexos heteroméricos de recetores. Desta forma, agora é possível produzir membros heteroméricos, estáveis, de cadeia única da família de ligandos do TNF, que ligam especificamente a um dos vários recetores possíveis, e ativam. A presente invenção é ainda ilustrada pelas seguintes figuras:

As Figuras 1-3 mostram os resultados de vários testes de citotoxicidade biológica, nos quais foram investigadas as propriedades, especialmente a especificidade de diferentes variantes do scTNF com TNF classicamente solúvel de tipo selvagem, isto é o domínio extracelular solúvel do TNF humano (NCBI gi:25952111, 17,09 kDa como monómero da forma 36 solúvel, abreviado para TNFhum ou sTNF, AA 79-181).

Para estas experiências, foram usados tanto fibroblastos de ratos transfetados como células humanas Kyml. São mostrados, a titulo de exemplo, resultados da análise, sendo que foram testadas variantes do scTNF, que possuem linkers peptídicos de diferente comprimento entre os módulos individuais do TNF (ou seja, monómeros do TNF) . Os linkers peptídicos consistem na repetição de três vezes ou quatro vezes a sequência de aminoácidos GGGS (ou GlyGlyGly-Ser) (referido como "singlechainTNF3x" e/ou "singlechainTNF4x" ou "scTNF3x" e/ou "scTNF4x"), respetivamente. A Figura 1 mostra o resultado de um típico teste de citotoxicidade do TNF. Como células-alvo, foram usados fibroblastos de ratos (MF) a partir do TNFR1/TNFR2, que expressam estavelmente as quimeras de recetores do TNFR1 (INFR1-FAS) (células MF TNFR1-FAS). Essas células expressam uma molécula quimérica, que consiste extracelularmente na respetiva parte do TNFR1, e assim liga ao TNF, intracelularmente apresenta o domínio intracelular com forte atuação apoptósica do recetor de Fas. Estas células MF TNFRl-Fas podem ser ativadas por estímulos específicos do TNFR1, mas emitem contudo um sinal específico de morte mediada por Fas. 0 número de células sobreviventes foi quantificado após 24 horas por coloração com um corante pela sua absorção. Como controlo negativo, foi usado um ligado bacteriano de controlo, sendo que não se tratava de um ligado bacteriano expressando scTNF, que foi processado de forma idêntica à das proteínas do scTNF recombinantes. Consequentemente, deve-se notar que tanto o TNF solúvel humano convencional (TNFhum) e as variantes do scTNF recombinantes levaram à morte celular. Deverá ser reconhecido um efeito citotóxico semelhante e dependente da dose do TNFhum e/ou scTNF (ver as três curvas inferiores do gráfico), sendo que a atividade específica do scTNF é, pelo 37 menos, equivalente, se não for ainda maior do que o TNF de tipo selvagem. Como esperado, o controlo negativo não mostra nenhum efeito tóxico.

Numa outra abordagem experimental, foi testado o efeito de anticorpos neutralizantes específicos do TNF sobre a citotoxicidade do TNF (TNFhum)e/ou scTNF. Foram recém-preparadas diluições do TNF humano solúvel (TNFhum) e/ou das variantes do scTNF acima descritas com 3 vezes (3x) ou 4 vezes (3x) de linker peptídico de glicina-serina (scTNF3x: GGGS-GGGS-GGGS / scTNF4x: GGGS- GGGS- GGGS- GGGS) . Foram usadas séries de concentração com diluições 1:3 na presença e ausência de anticorpos neutralizantes específicos do TNF (aTNF-AK) [lmg/ml). Como controlo negativo, foi usado oO lisado bacteriano de controlo acima descrito. Como resultado, pode observar-se que o efeito citotóxico do TNF humano solúvel de tipo selvagem ou e/ou do scTNF pode ser invertido por anticorpos neutralizantes específicos do TNF (ver as três curvas superiores do gráfico.), e numa ampla gama de concentrações (0, 03-10 ng/mL). Não foram detetadas diferenças entre a reação do scTNF com 3 vezes e com 4 vezes de linkers peptídicos. A Figura 2 mostra o resultado de um teste de citotoxicidade, sendo que foi estudado o efeito das variantes do sTNF e do scTNF e em células que expressam quimeras do recetor TNFR2 (TNFR2-Fas). Nesta abordagem experimental foram usados fibroblastos de rato que expressam quimeras recetoras estáveis, que consistem células que expressam TNFR2 e Fas (TNFR2-Fas, sendo que a parte extracelular é do TNFR2, a parte intracelular é de recetores Fas) . As células MF TNFR2-Fas (bem como os TNFR2 de tipo selvagem) só podem ser ativadas por um estímulo do TNFR2 adequado, por exemplo, através do TNF ligado à membrana, mas não através do TNF solúvel. Resultado: Tal como esperado, tanto o TNF humano solúvel (TNFhuman) como as variantes do scTNF com 3 vezes e 4 vezes de linker 38 peptídico (scTNF3X, scTNF4x) não mostraram qualquer efeito tóxico sobre as células MF TNFR2-Fas. Por outras palavras, as variantes do sTNF e do scTNF de células não conseguem ativar células que expressam quimeras do TNFR2 (TNFR2-FAS), ou seja não evocam, nestas células, qualquer morte celular. 0 lisado bacteriano usado como controlo negativo (como descrito acima) também não mostrou, como era esperado, qualquer efeito tóxico. A Figura 3 mostra os resultados do teste de citotoxicidade, no qual foi investigado o efeito do TNF humano solúvel de tipo selvagem e de uma variante do scTNF em combinação com um anticorpo especifico especial do TNFR2, 80m2, em células que expressam quimeras do TNFR2 (FNFR2-Fas). A preparação experimental corresponde à da Figura 2 com a diferença de que o TNF de tipo selvagem solúvel e/ou o scTNF com 3 vezes de linker peptídico(scTNF3x) foi adicionado com o anticorpo 80M2. 0 anticorpo 80M2 é conhecido por conceder ao TNF solúvel a capacidade de sinal especial do TNF ligado à membrana. 0 resultado mostra que tanto o TNF de tipo selvagem solúvel como o scTNF em combinação com o anticorpo 80M2 conseguem um efeito citotóxico forte por meio de quimeras de recetores do TNFR2-Fas. A razão para isto é que o TNF solúvel, em combinação com determinados anticorpos específicos do TNFR2, como ο 80M2, pode desenvolver a atividade do TNF ligado à membrana. As células MF TNFR2-Fas morrem após incubação com o TNF solúvel e/ou o scTNF na presença de um desses anticorpos estabilizantes do complexo ligando-recetor (80M2-AK) . Isto é, na presença deste anticorpo, o TNF e o scTNF solúveis incorrem igualmente um efeito tóxico nas células MF TNFR2/FAS, podendo apenas ser realizado por TNF ligado à membrana. 0 lisado bacteriano usado como controlo negativo (como descrito acima na Figura 1) também não mostrou, como era esperado, qualquer efeito tóxico. 39

As Figuras 4-10 mostram os resultados de diferentes testes de estabilidade que demonstram que as variantes do scTNF de acordo com a invenção, em virtude da sua estrutura, disponibilizam uma estabilidade significativamente melhor do que o TNF de tipo selvagem solúvel.

Foi incubado sTNF e/ou variantes do scTNF num meio de cultura contendo soro em concentrações de 3,0 a 0,01 ng/mL a 37°C e 5% de C02 para diferentes tempos. Por fim, foi analisada a funcionalidade das variantes do sTNF e/ou do scTNF (scTNF3x, scTNF4x) em testes de citotoxicidade, com base em células MF TNFRl-Fas e células Kyml. Para este teste de citotoxicidade, foram usadas diluições 1:3 a partir de amostra de 3,0 ng/ml do TNF. Como controlo negativo, foi usado, nos testes de citotoxicidade descritos acima, um lisado bacteriano de controlo (lisado bacteriano que não expressa o scTNF, que foi processado de forma idêntica à das proteínas recombinantes do scTNF). A Figura 4 mostra a bioatividade das moléculas utilizadas antes dos testes de estabilidade em fibroblastos de rato MF das células TNFRl-Fas. Foi preparado TNF humano solúvel de tipo selvagem(TNFhuman) e diluições do scTNF, e diluídas nas células. Tanto o TNF de controlo solúvel bem como as variantes do scTNF resultaram, após a incubação com o MF, em morte celular. O lisado bacteriano de controlo não mostrou, como esperado, qualquer efeito tóxico. Os valores de ED50 (metade da concentração máxima eficaz) foram de aproximadamente 0,2 ng/ml para o TNF humano solúvel de tipo selvagem e de 0,1 ng/ml para as duas variantes diferentes do scTNF usadas. O lisado bacteriano de controlo usado como controlo negativo não apresentou, como esperado, qualquer efeito tóxico.

A Figura 5 mostra os resultados de um teste de estabilidade com fibroblastos de ratos de células MF TNFRl-Fas. As diluições do TNF de tipo selvagem e do scTNF 40 mostradas na Figura 5 foram incubadas durante 8 dias, nesta incubadora celular, antes de serem testadas, a fim de avaliar a estabilidade das amostras. Foi possivel registar uma diminuição significativa da bioatividade do TNF solúvel de tipo selvagem (TNFhuman) após 8 dias a 37 °C, enquanto que a atividade de ambas as variantes do scTNF (scTNF3x, scTNF 4x; ver a explicação acima) se manteve inalterada. Para o TNF de tipo selvagem, é mostrado um valor de ED50 de cerca de 2 ng/ml (0,2 ng/ml recém-preparados, ver a Figura 4) . As variantes do scTNF permaneceram com valores de ED50 de aproximadamente 0,1 ng/ml, e usados de forma tão ativa quanto as amostras recém-usadas (ver a Figura 4) . O lisado bacteriano de controlo usado como controlo negativo não apresentou, como esperado, qualquer efeito tóxico. A Figura 6 mostra os resultados de um teste de estabilidade com fibroblastos de ratos de células MF TNFR1-Fas. As soluções do TNF e do scTNF de tipo selvagem foram agora incubadas durante 14 dias na incubadora celular, tal como explicado na Figura 5. Foi possivel registar uma diminuição significativa da bioatividade do TNF de tipo selvagem após 14 dias a 37 °C, enquanto que a atividade de ambas as variantes do scTNF se manteve inalterada. Para o sTNF, foi registado um valor de ED50 de cerca de 2,8 ng/ml (0,2 ng/mL recém-usados, ver a Figura 4); as variantes do scTNF permaneceram com 0,13 ng/ml quase tão ativas como as amostras recém-usadas (0,1 ng/ml, ver a Figura 4). O lisado bacteriano de controlo usado como controlo negativo não apresentou, como esperado, qualquer efeito tóxico. A Figura 7 mostra os resultados de um teste de estabilidade com linhas celulares humanas Kyml. As células Kyml expressam recetores do TNF humanos normais de tipo selvagem e reagem citotoxicamente ao TNF. A experimentação foi análoga aos testes de estabilidade com fibroblastos de ratos de acordo com as Figuras 4 a 6: Foi incubado o TNF solúvel de tipo selvagem e/ou variantes do scTNF num meio 41 de cultura contendo soro em concentrações de 3,0 a 0,01 ng/mL a 37°C e 5% de C02 para diferentes tempos. A seguir foi verificada a funcionalidade das variantes solúveis do sTNF e/ou do scTNF em testes de citotoxicidade em células Kyml. A partir de 3,0 ng/mL como amostra do TNF, foram usadas diluições de 1:3 para o teste. Como controlo negativo, foi utilizado o lisado bacteriano de controlo acima descrito. Foram preparadas e utilizadas diluições do TNF de tipo selvagem e do scTNF. Os resultados mostram que tanto o TNF de tipo selvagem como as variantes do scTNF tinham uma forte atividade citotóxica. Os valores de ED50 são de cerca de 0,1 ng/ml para o TNF de tipo selvagem e de cerca de 0,0 6 ng/mL para as variantes do scTNF. O lisado bacteriano de controlo usado como controlo negativo não apresentou, como esperado, qualquer efeito tóxico. A Figura 8 mostra os resultados de um teste de estabilidade com linhas celulares humanas Kyml. O TNF de tipo selvagem e as soluções do scTNF foram incubados durante 16 dias nesta incubadora celular. Posteriormente, foi realizado um teste de citotoxicidade das células Kyml. Foi possível registar uma diminuição significativa do sTNF após 16 dias a 37°C, enquanto que a toxicidade, i.e. a bioatividade das variantes do scTNF se manteve inalterada. Para o TNF de tipo selvagem, foi registado um valor de ED50 de cerca de 1,2 ng/mL. As variantes do scTNF permaneceram tão ativas como as amostras recém-preparadas com 0,06 ng/ml. O lisado bacteriano de controlo usado como controlo negativo não apresentou, como esperado, qualquer efeito tóxico. A Figura 9 mostra os resultados de um teste de estabilidade com a linha celular humana Kyml. As soluções do sTNF e do scTNF foram incubados durante 22 dias nesta incubadora celular. Foi possível registar uma diminuição significativa da atividade do sTNF após 22 dias a 37°C. As variantes do scTNF mantiveram-se estáveis como 42 anteriormente. 0 lisado bacteriano de controlo usado como controlo negativo não apresentou, como esperado, qualquer efeito tóxico. A seguinte Tabela 1 mostra os dados de resultados dos testes de estabilidade de acordo com as Figuras 7 e 9, e numa base comparativa:

Tabela 1: Comparação entre os valores de ED50 nas Figuras 7 + 9 ED50 recém-titulado (Figura 7) ED50 após 22 dias (Figura 9) Perda de atividade STNF 0,1 ng/mL 1,50 ng/mL >90% SCTNF 0,06 ng/mL 0,07 ng/mL Dificilmente detetável A Figura 10 mostra os resultados de um teste de estabilidade com linhas celulares humanas Kyml. Foram tituladas diluições a partir de 3 ng/ml após 16 dias a 37 °C. Em contraste com as Figuras anteriores 4 a 9, foi preparada uma curva de titulação a partir de um preparado 3 ng/ml da diluição do TNF armazenada durante 16 dias, enquanto que, nas respetivas curvas de titulação mostradas anteriormente, e depois as respetivas diluições foram armazenadas durante o tempo especificado. Resta notar que a comparação dos dados da Figura 8 (experiência análoga com 16 dias de incubação) e da Figura 10 não apresenta qualquer diferença significativa. 0 lisado bacteriano de controlo usado como controlo negativo não apresentou, como esperado, qualquer efeito tóxico. A Figura 11 mostra o resultado de um típico teste no soro humano. Para testar a estabilidade do TNF de tipo selvagem e do scTNF em soro humano, foi diluído, num primeiro lote experimental, o TNF solúvel de tipo selvagem e a variante do scTNF4x foram diluídos em 100% de soro e recém-titulado. Como resultado, foi registado um valor de ED50 de 0, 004 ng/ml para o TNF de tipo selvagem, e para a variante do scTNF foi medido um valor de ED50 de 0,007 43 ng/ml. A Figura 12 mostra o resultado de um teste de estabilidade no soro humano. Para testar a estabilidade do TNF de tipo e do scTNF em soro humano, foram armazenados, em outra abordagem experimental, o TNF de tipo selvagem e as variante do scTNF4x em 100% de soro não inativado pelo calor durante 8 dias a 37°C, e subsequentemente titulados em células Kyml. Como resultado, foi registado um valor de ED50 de 0,40 ng/ml para o TNF de tipo selvagem, e para a variante do scTNF foi medido um valor de ED50 de 0,03 ng/ml. Os efeitos de um armazenamento de 8 dias em 100% de soro foram como se segue: em comparação com o scTNF recém-titulado, o scTNF armazenado durante oito dias mostrou uma perda de atividade por um factor de cerca de 4,3, enquanto que o sTNF solúvel apresentou uma forte perda de atividade por um factor de 100 durante o armazenamento em 100% de soro. 0 sTNF de acordo com a invenção mostrou, comparativamente com o sTNF, uma bioatividade significativamente maior após 8 dias de incubação em soro e, portanto, mostrou-se muito estável em soro humano a temperaturas fisiológicas.

Na Tabela 2 que se segue, os dados dos resultados das Figuras 11 e 12 são mostrados de novo por razões de clareza.

Tabela 2: Comparação entre os valores de ED50 nas Figuras 11 + 12 ED50 recém-titulado ED50 após 8 dias Perda de (Figura 11) (Figura 12) atividade TNF solúvel 0,004 ng/mL 0,40 ng/mL 100 vezes TNF de 0,007 ng/mL 0,03 ng/mL 4,3 vezes cadeia única A Figura 13 mostra o resultado de uma análise por electroforese em gel de poliacrilamida sob condições redutoras e desnaturantes. É mostrado um gel de prata purificado do TNF de tipo selvagem e do scTNF purificado 44 das variantes do scTNF3x e do scTNF4x. As amostras foram incubadas, em cada um dos casos, com β-mercaptoetanol (final de 5%) a 95°C durante 5 min. No gel de prata, foram aplicados aproximadamente 500 ng do sTNF e do scTNF4x e aproximadamente 150 ng do scTNF3x por pista. O resultado do gel de prata das variantes do scTNF separadas em 15% do SDS-PAGE mostra que tanto as variantes do scTNF, mesmo sob condições redutoras, apresenta um peso molecular de aproximadamente 50 kDa que corresponde à sua estrutura. Certo é que também as diferentes quantidades de proteínas aplicadas do scTNF3x e do scTNF4x não tiveram influências no resultado. Isto demonstra a estabilidade das proteínas e/ou polipeptídeos de acordo com a invenção sob condições redutoras e desnaturantes. O resultado para o sTNF mostra que a proteína se divide nos seus monómeros de cerca de 17 kDa. A Figura 14 mostra o resultado de um teste de estabilidade sob condições redutoras e desnaturantes. Nesta abordagem experimental, foi realizado um teste Western Blot das amostras separadas em um 15% de SDS-PAGE do TNF do tipo selvagem e das variantes do scTNF, scTNF3x e scTNF4x. Houve duas abordagens paralelas, nas quais, num lote, as amostras foram incubadas com β-mercaptoetanol (final de 5%) a 95°C durante 5 minutos, e, por outro lado, num outro lote, não ocorreu qualquer incubação com β-mercaptoetanol. A deteção após a execução da eletroforese foi realizada com anticorpos do antiTNF. Como resultado, pode observar-se que o enticorpo da proteína de ambas as variantes do scTNF em bandas significativas a cerca de 50 kDa. Para o TNF de tipo selvagem, foi detetada a proteína em aproximadamente 17 kDa. Isto, novamente, mostra a estabilidade do scTNF3x e das variantes do scTNF4x de acordo com a invenção sob condições redutoras e desnaturantes, e também coincide com os resultados esperados a partir da Figura 13. A Figura 15 mostra o resultado de um ensaio de 45 degradação do IkappaB. 0 IkappaB (I-kappa B) é um inibidor do fator de transcrição do fator nuclear do kappa B (NF-kB) , que é conhecido por levar à degradação devido ao TNF, sendo que o NF-KB é ativado. Para a deteção da degradação do I-kappa B foram preparados lisados de células 0, 30 e 60 minutos após a estimulação com 10 ng/ml do TNF, scTNF3x e scTNF4x de tipo selvagem, e subsequentemente analisados num teste Western blot com anticorpos específicos do I-kB. O resultado mostra que foi induzida uma degradação transiente do I-kB como do TNF de tipo selvagem, como também de ambas as variantes do scTNF, sendo que o comportamento da reação das variantes do scTNF correspondia ao TNF de tipo selvagem. O lisado bacteriano de controlo usado como controlo negativo(tal como descrito acima, um lisado bacteriano que não expressa scTNF, que foi processado de forma idêntica às proteínas do scTNF recombinantes) não mostrou, como esperado, qualquer efeito sobre a degradação do Ι-κβ. A Figura 16 mostra o resultado de um ensaio do JNK. JNK (cinase c-Jun N-terminal) é uma cinase induzida pelo stress, que é conhecida por ser fortemente ativada por TNF. Após estimulação das células Kym-1 durante 0, 30 e/ou 60 minutos com 10 ng/ml do TNF de tipo selvagem, scTNF3x e scTNF4x, foram preparados lisados celulares e foi verificada a a atividade da JNK, utilizando a imunoprecipitação da JNK com os anticorpos específicos da JNK, e um subsequente ensaio da cinase JNK com GST c-Jun como substrato. O lisado bacteriano de controlo usado como controlo negativo (como descrito acima) não mostrou, como esperado, qualquer ativação da cinase JNK. O resultado mostra que ocorreu uma ativação da JNK tanto por ambas as variantes do scTNF como do TNF de tipo selvagem, sendo que o comportamento da reação das variantes do scTNF correspondia ao do TNF de tipo selvagem. A Figura 17 mostra o resultado de um Electrophoretic 46

Mobility Shift Assays (EMSA). Outra evidência típica da atividade do TNF representa a translocação decorrida da degradação após a indução do I-kB do fator de transcrição NF-kB no núcleo celular. Para isso, foram produzidas preparações do núcleo celular de células de controlo KYM-1 não estimuladas (zero minutos de estimulação) e/ou de células estimuladas (30 e 60 minutos de estimulação). A estimulação das células foi realizada, em cada caso, com o TNF de tipo selvagem, scTNF3x e scTNF4x. O fator de transcrição translocado para o núcleo celular NF-kB foi demonstrado com o auxílio de oligonucleotídios marcados radioativamente e específicos de NF-kB. O resultado mostra que o NF-KB é translocado para o núcleo celular. Isto corresponde ao comportamento da reação das variantes do scTNF e do TNF de tipo selvagem. A Figura 18 mostra um esquema exemplificativo de polipeptídeos de acordo com a invenção, ilustrado com a ajuda do TNF (como um membro da família de ligandos do TNF). As designações têm os seguintes significados: as construções AI/AII e BI/II têm uma utilização de codões otimizada para a expressão de proteínas em E. coli, e representam as moléculas que são ligadas a cada linker GlyGlyGlySer triplo ou quádruplo. Todas as moléculas transportam o N-terminal de uma etiqueta de histidina para facilitar a limpeza, as moléculas BI/BII transportam também uma cadeia curta de aminoácidos com um resíduo de cisteína no sentido de uma ligação covalente dirigida, as construções C a H são úteis para a expressão das proteínas em células eucarióticas, e transportam o sequências peptídicas líderes correspondentes a N-terminal. sc = é a abreviatura de uma "single chain" (cadeia única), cys = indica um linker peptídico de N-terminal com uma cisteína interna para acoplamento covalente,

Lllong e/ou L2long = indica o linker 1 e/ou 2, cada um com a sequência de aminoácidos (GGGS-GGGS-GGGS-GGGS) e/ou 47 (GGGS) 4,

Llshort e/ou L2short = indica o linker 1 e/ou 2, cada um com a sequência de aminoácidos (GGGS-GGGS-GGGS-GGGS) e/ou (GGGS) 3,

Sequência peptídica líder = é a sequência de aminoácidos para a secreção da proteína a partir de células (hospedeiras) eucarióticas. scFv40 = representa a sequência de cadeia única (scFv) - do fragmento de anticorpo 40, que é específico para o antigénio do estroma tumoral FAP, AMAIZe = é a abreviatura de "Antibody-Mediated Apoptosis Inducing Zytokine" e

His/Flag-Tag = representa a sequência peptídica para a purificação por afinidade das proteínas expressas A Figura 19 mostra a sequência de ácido nucleico e a sequência de aminoácidos correspondente do scTNF-Lshort (construção A-II)

Características da construção A-II • sequência peptídica His-Tag para a purificação por afinidade da proteína formada: aminoácidos (doravante nas Figuras 19 a 26, abreviados como "AA") AA 5-10, nucleótidos (doravante nas Figuras 19 a 26, abreviados com "NT") NT 13-30 • sequência do módulol do TNF humano (domínio extracelular, AA 79-181, da molécula do TNF humano natural, sequência com o uso de codão otimizado de E. coli): AA 11-169, NT 31-507 • sequência do (GGGS)3- ligantel: AA 170- 181, NT 508- 543 • sequência do módulo2 do TNF humano (domínio extracelular, AA 79-181, da molécula do TNF humano natural, sequência com o uso de codão otimizado de E. coli) : AA 182-335, NT 544-1005 • sequência do (GGGS) 3- ligante2: AA 336- 347, NT 1006- 1041 • sequência do módulo3 do TNF humano (domínio extracelular, AA 79-181, da molécula do TNF humano natural, sequência com 48 o uso de codão otimizado de E. coli) : AA 348-501, NT 1042-1503 • codão de paragem: NT 1504-1506 A Figura 20 mostra a sequência de ácido nucleico e a sequência de aminoácidos correspondente do scTNF-Lshort (construção B-II)

Características da construção B-II • aminoácidos de cisteina para acoplamento covalente: AA 9, NT 25-27 • sequência peptídica His-Tag para a purificação por afinidade da proteína formada: AA 15-20, NT 43-60 • sequência do módulo do TNF humano (domínio extracelular da molécula do TNF humano natural, sequência com o uso de codão otimizado de E. coli): AA 21-181, NT 61-543 • sequência do (GGGS)3- ligantel: AA 182- 193, NT 544- 579 • sequência do módulo2 do TNF humano (domínio extracelular da molécula do TNF humano natural, sequência com o uso de codão otimizado de E. coli) : AA 194-347, NT 580-1041 • sequência do (GGGS)3- ligante2: AA 348- 359, NT 1042- 1077 • sequência do módulo3 do TNF humano (domínio extracelular da molécula do TNF humano natural, sequência com o uso de codão otimizado de E. coli) : AA 360-513, NT 1078-1539 • codão de paragem: NT 1540-1542 A Figura 21 mostra a sequência de ácido nucleico e a sequência de aminoácidos correspondente do scTNF (construção C)

Características da construção C • sequência peptídica líder para a secreção de proteínas em células eucarióticas: AA1-15, NT 1-45 • sequência peptídica Flag-Tag para a purificação por afinidade da proteína formada: AA 19-26, NT 55-78 • sequência do módulol do FasL humano (domínio extracelular, AA 139-281, da molécula do FasL humano natural): AA 30-173, NT, 90-519 49 • sequência do (GGGS)4- ligantel: AA 174- 189, NT 520- 567 • sequência do módulo2 do FasL humano (domínio extracelular, AA 139-281, da molécula do FasL humano natural): AA 190- 332, NT 568-996 • sequência do (GGGS)4- ligante2: AA 333- 348, NT 997- 1044 • sequência do módulo3 do FasL humano (domínio extracelular, AA 139-281, da molécula do FasL humano natural): AA 349-491, NT 1045-1473 • codão de paragem: NT 1474-1476

A Figura 22 mostra a sequência de ácido nucleico e a sequência de aminoácidos correspondente do scTRAIL (construção D)

Características da construção D • sequência peptídica líder para a secreção de proteínas em células eucarióticas: AA 1-15, NT 1-45 • sequência peptídica Flag-Tag para a purificação por afinidade da proteína formada: AA 19-26, NT 55-78 • sequência do módulol do TRAIL humano (domínio extracelular, AA 139-281, da molécula do TRAIL humano natural): AA 30-216, NT 88-648 • sequência do (GGGS)4- ligantel: AA 217- 232, NT 649- 696 • sequência do módulo2 do TRAIL humano (domínio extracelular, AA95-281, da molécula do TRAIL humano natural): AA 233-419, NT 697-1257 • sequência do (GGGS)4- ligante2: AA 420- 435, NT 1258- 1305 • sequência do módulo3 do TRAIL humano (domínio extracelular, AA95-281, da molécula do TRAIL humano natural) : AA 436-622, NT 1306-1866 • codão de paragem: NT 1861-1863 A Figura 23 mostra a sequência de ácido nucleico e a sequência de aminoácidos correspondente do scTNF (construção E)

Características da construção E • sequência peptídica líder para a secreção de proteínas em 50 células eucarióticas: AA 1-15, NT 1-45 • sequência peptídica Flag-Tag para a purificação por afinidade da proteína formada: AA 19-26, NT 55-78 • sequência do módulol do TNF humano (domínio extracelular, AA 139-281, da molécula do TRAIL humano natural): AA30-184, NT 88-552 • sequência do (GGGS)4- ligantel: AA 85- 200, NT 553- 600 • sequência do módulo2 do TNF humano (domínio extracelular da molécula do TNF humano natural): AA 201-355, NT 601-1065 • sequência do (GGGS)4- ligante2: AA 356- 371, NT 1066- 1113 • sequência do módulo3 do TNF humano (domínio extracelular da molécula do TNF humano natural) : AA 372-526, NT 1114-1581 • codão de paragem: NT 1799-1581 A Figura 24 mostra a sequência de ácido nucleico e a sequência de aminoácidos correspondente do scFasL-AMAIZe (construção F)

Características da construção F • sequência peptídica lider para a secreção de proteínas em células eucarióticas: AA 1-19, NT 1-57 • sequência de cadeia única (scFv) - do fragmento de anticorpo 40, específico para o antigénio do estroma tumoral FAP: AA 20-267, NT 58- 801 • sequência peptídica Flag-Tag para a purificação por afinidade da proteína formada: AA278-285, NT 832-855 • sequência do módulol do FasL humano (domínio extracelular, AA 139-281, da molécula do FasL humano natural): AA 290-432, NT 868-1296 • sequência do (GGGS)4- ligantel: AA 433- 448, NT 1297- 1344 • sequência do módulo2 do FasL humano (domínio extracelular, AA 139-281, da molécula do FasL humano natural): AA 449-591, NT 1345-1773 • sequência do (GGGS)4- ligante2: AA 592- 607, NT 1774- 51 1821 • sequência do módulo3 do FasL humano (domínio extracelular, AA 139-281, da molécula do FasL humano natural): AA 608-750, NT 1822-2250 • codão de paragem: NT 2251-2253 A Figura 25 mostra a sequência de ácido nucleico e a sequência de aminoácidos correspondente do scTRAIL-AMAIZe (construção G)

Características da construção G • sequência peptídica líder para a secreção de proteínas em células eucarióticas: AA 1-19, NT 1-57 • sequência de cadeia única (scPv) - do fragmento de anticorpo 40, específico para o antigénio do estroma tumoral FAP: AA 20-267, NT 58- 801 • sequência peptídica Flag-Tag para a purificação por afinidade da proteína formada: AA278-285, NT 832-855 • sequência do módulol do TRAIL humano (domínio extracelular, AA95-281, da molécula do TRAIL humano natural): AA 289-475, NT 865-1426 • sequência do (GGGS)4- ligantel: AA 476- 491, NT 1427- 1476 • sequência do módulo2 do TRAIL humano (domínio extracelular, AA95-281, da molécula do TRAIL humano natural) : AA 492-678, NT 1477-2034 • sequência do (GGGS)4- ligante2: AA 679- 694, NT 2035- 208 • sequência do módulo3 do TRAIL humano (domínio extracelular, AA95-281, da molécula do TRAIL humano natural): AA 695-169, NT 2083-2643 • codão de paragem: NT 2644-2646 A Figura 26 mostra a sequência de ácido nucleico e a sequência de aminoácidos correspondente do scTNF-AMAIZe (construção H)

Características da construção H • sequência peptídica líder para a secreção de proteínas em células eucarióticas: AA 1-19, NT 1-57 52 • sequência de cadeia única (scFv) - do fragmento de anticorpo 40, especifico para o antigénio do estroma tumoral FAP: AA 20-267, NT 58- 801 • sequência peptidica Flag-Tag para a purificação por afinidade da proteína formada: AA 278-285, NT 832-855 • sequência do módulol do TNF humano (domínio extracelular, AA 79-181, da molécula do TNF humano natural): AA 289-443, NT 865-1329 • sequência do (GGGS)4- ligantel: AA 444- 181, NT 1330- 1377 • sequência do módulo2 do TNF humano (domínio extracelular, AA 79-181, da molécula do TNF humano natural): AA 460-614, NT 1378-1842 • sequência do (GGGS)4- ligante2: AA 615- 630, NT 1843- 1890 • sequência do módulo3 do TNF humano (domínio extracelular, AA 79-181, da molécula do TNF humano natural): AA 631-785, NT 1891-2353 • codão de paragem: NT 2356-2358 A Figura 27 mostra a farmacocinética do TNF humano de tipo selvagem e o scTNF humano (comp. com o Exemplo 2). Os dados na Figura 27 mostram um aumento claro da semivida in vivo das variantes do scTNF. É esperado para o scTNF, em contraste com o TNF, um aumento significativo da duração da ação in vivo, o que reforça o valor do scTNF, especialmente o scTNF-L2, como agente terapêutico potencial. A Figura 28 mostra o CysHis-scTNF ligado de forma covalente a partículas (sílica). Este CysHis-scTNF, ligado de forma covalente, é bioativo e tem uma atividade especial do TNF ligado à membrana, isto é, ativa o TNFR2. A Figura 28 mostra que as células de fibroblastos de ratos, que são transfetados com a construção TNFR2-Fas, e tratados com diluições em série dos reagentes indicados, são completamente resistentes o wtTNF solúvel. Após o acoplamento covalente do CysHis-scTNF reduzido em 53 micropartícuias de sílica (beads) de acordo com protocolos estabelecidos (DPA 2001, N° DE10144252), estas provocam uma forte resposta citotóxica (círculo), semelhante a um controlo positivo consistindo em CysHis-scTNF e um anticorpo reticulado de TNFR2, mAk 80M2 (triângulo). O Cys-His scTNF não ligado não mostra, como esperado, qualquer atividade em células positivas do TNFR2 (quadrado). A presente invenção irá agora ser ilustrada pelos exemplos:

Exemplos

Exemplo 1: Preparação de várias construções polipeptídicas

Todos os procedimentos de clonagem foram realizados de acordo com protocolos padrão. A seguir descrevem-se as condições respetivas. PCR padrão; 60 ng de molde, 0,5 ml de 100 mM de iniciadores, 1 ml de nM dNTPs e 5 mL de 10x tampão e 2 U de Taq -polimerase foram amplificados num volume de reação de 50 ml com o seguinte programa de PCR. Desnaturação: 94°C durante 3 min; 15 ciclos: Desnaturação 94°C durante 30s, hibridação 55°C durante 30 s; alongamento 72 °C durante 90s; alongamento final: 72°C durante 7 min.

Digestão dos produtos de PCR: O produto de PCR foi purificado e eluído em gel de agarose e, subsequentemente, digerido com as respetivas enzimas de restrição (ver especificações) em 40 ml de uma aplicação de reação com uma temperatura de clivagem ótima (a especificar pelo fabricante) durante 2 horas.

Digestão de vetores: lmg de vetor foi digerido com 5U das enzimas de restrição correspondentes em 20 ml de volume de reação durante 2 horas com uma temperatura de diferença ótima (isto está dependente da enzima utilizada, e é especificado pelo fabricante). Para a desfosforilação de vetores, foram adicionados, à digestão de reação 10 U de fosfatase 54 alcalina durante 1 hora.

Reação "Fill in":

Foi aplicada uma abordagem de uma digestão por vetores com 33 mM dNTPs e lU/lmg DNA de fragmento de Klenow da polimerase de ADN I e incubada durante 15 min a 25°C. Esta reação foi parada com 10 mM de EDTA durante 20 min a 75°C. Ligação: O vetor e o inserto foram ligados numa razão molar de 1:5, em conjunto com 400 U de ligase num volume de 10 ml durante a noite a 16°C. I. Preparação de scTNFhuman (scTNF) , com linkers quádruplos ou triplos:

Foram produzidas duas variantes do scTNF, que diferem no comprimento do linker peptidico entre os módulos individuais. Foram usados iniciadores com 4 vezes e/ou 3 vezes da sequência de linker peptidico: sequência de linkeriong (GGGS)4 ou de linkershort com (GGGS)3. As construções assim produzidas continham apenas dois linkers a quatro vezes (LI ou L2 com (GGGS)4, designado de "long") ou apenas dois linkers a três vezes (LI ou L2 (GGGS)3, designado de "short"). 1. Com os iniciadores V e I e/ou II (para linkersiong) e o vetor pQE-9 para um módulo do TNF (pQE9-HisTNF) como modelo, foi realizado um PCR convencional. O vetor carrega uma sequência His-Tag uma posterior limpeza por afinidade da proteína produzida. 2. O produto de PCR I resultante foi subsequentemente digerido com 20 U de enzimas de restrição StuI e HindIII a 37°C. A mesma digestão e uma reação de desfosforilação foram realizadas utilizando o vetor pQE9-HisTNF e introduzida, por meio de uma ligação do produto de PCR I, no vetor pQE9-HisTNF. O resultado deste passo foi um módulo do TNF His-TNF com um linkerssh0rt e/ou iong e/ou a seguinte construção no vetor pQE9:

EcoRI- His Tag - TNF Módulol-linkerslShort e/ou íong - BamHI 55

3. Por meio de outro PCR com os iniciadores III e I e/ou II (para linkersiong) e o vetor pQE9-HisTNF como modelo, foi produzido o produto de PCR II. 0 produto de PCR II foi subsequentemente cortado com 20 U das enzimas de restrição

EcoRI e HindIII e introduzido no vetor pQE9-HisTNF, que foi cortado com as mesmas enzimas e desfosforilado; um resultado desta clonagem foi um vetor pQE9 que se parecia como se segue:

TNF Módulo2-Linker2sh0rt e/ou íong - BamHI

Esta construção não tem qualquer sequência para uma His-Tag antes da sequência do TNF. 4. O produto de PCR II clonado a partir do passo 3 foi cortado primeiro com a enzima de restrição Hind III e,de seguida, parcialmente com BamHI (1 U/mg de ADN) a partir do vetor. O vetor pQE9-His-Tag do linkerlshort e/ouiong do módulo do TNF também foi ligado sequencialmente cortado com as enzimas de restrição BamHI e HindIII, desfosforilado e o produto de PCR II foi ligado a este vetor. O resultado foi um vetor pQE9 com a seguinte construção:

His Tag- TNF Módulol- Linkerlshort e/ou long- TNF Módulo2-LÍnker2short e/ou long· 5. Com o vetor pQE9-HisTNF como modelo e os iniciadores III e IV, foi realizado um outro PCR sob condições padrão, e o produto de PCR III resultante foi digerido sequencialmente com as enzimas de restrição BamHI (40U) e Hind III (40 L) . Este fragmento foi, de seguida, ligado num vetor pBluescript SKII, que foi também cortado com as enzimas de restrição BamHI e HindIII. O resultado desta clonagem foi um vetor pBluescript SKII contendo o módulo do TNF 3 sem linker. 6. O vetor pQE9 com a construção His Tag - TNF Módulol -Linkerlshort e/ou íong TNF Modulo2 -Linker2short e/ou íong foi cortado com enzima de restrição EcoRI; de seguida este vetor foi tratado com o fragmento de Klenow da polimerase de DNA I de E. coli, para realizar um "fill in". Após esta 56 etapa, foi realizada uma digestão de restrição parcial com a enzima BamHI (1 U/mg DNA). 7. Paralelamente à etapa 6, assiste-se ao vetor pBluescrpt SKII contendo o módulo do TNF 3, cortado com a enzima de restrição Xbal, e, em seguida, este vetor foi tratado com o fragmento de Klenow da polimerase de ADN I de E. coli, para realizar um "fill in". Após esta etapa, foi realizada uma segunda digestão de restrição com a enzima BamHI sob condições padrão com desfosforilação adicional.

8. 0 fragmento obtido através da digestão de restrição a partir do passo 6 foi subseguentemente ligado ao vetor linear gerado na etapa. As construções ocorrem na ordem inversa, como se segue: HindIII- TNF Módulo3- Linker2short e/ou long- TNF Módulo2- Linkershort e/ou long- TNF Módulol- His Tag- EcoRI 9. A construção do TNF inversa da etapa 8 foi cortada com

as enzimas de restrição EcoRI e HindIII do vetor pBluescript SKII e ligada no vetor pQE9-HisTNF desfosforilado e tratado com as mesmas enzimas. Isso produziu a seguinte construção com o scTNF pleno na orientação correta:

EcoRI- His Tag- TNF Módulol- Linkerlshort e/ou long- TNF Módulo2- Linker2short e/ou long- TNF Módulo3- HindIII 10. Para a preparação de um scTNF com uma cisteina N- terminal, os oligos cys-scTNF VI e VII foram emparelhados (por cada 20 ml, 100 mM de oligo VI e/ou VII foram aquecidos em conjunto durante 5 minutos a 95°C e deixados a arrefecer lentamente até à temperatura ambiente), formando-se assim o Oligol. A construção da etapa 9 foi digerida com as enzimas de restrição EcoRI e Bbsl e o Oligol, que tem as mesmas interfaces, foi ligado ao vetor. Alternativamente, foi inserida a cisteina através de mutagénese de PCR. O resultado desta clonagem foi a seguinte construção:

EcoRI- Cystein- His Tag- TNF Módulol- Linkerlshort e/ou long TNF Módulo2- Linker2sh0rt e/ou. long- TNF Módulo3-HindIII 57

Todas as construções foram verificadas por sequenciamento. A expressão foi E. coli estirpe XL-1 blue. A purificação as variantes do scTNF expressas ocorreu utilizando métodos cromatográficos (cromatografia de troca iónica e por afinidade His-Tag).

De seguida, são apresentadas as sequências dos iniciadores utilizados:

Sequências de linkers peptídicos ao nível da proteína 3fach GGGS-Linker (short) = (GGGS)3: GGGS GGGS GGGS 4fach GGGS-Linker (Ι0Γ19) = (GGGS)^: GGGS GGGS GGGS GGGS

Sequências de linkers peptídicos ao nível do nucleótido

3fach GGGS-Linker (short): 5'GGT GGC GGT TCT GGT GGC GGT TCT GGT GGC GGATCC3'

4fach GGGS-Iinker (Long): 5 'GGT GGC GGT TCT GGT GGC GGT TCT GGT GGC GGT TCT GGT GGC GGA TCC3'

Iniciadores para a clonagem scTNF Iniciador I

5'- TCG ATT AAG CTT CCC GGG GGA TCC GCC ACC AGA ACC GCC ACC AGA ACC GCC ACC CAG AGC GAT GAT ACC GAA GTA AAC CTG ACC -3’

scTNF Iniciador II 5’- ATC GAT TAA GCT TCC CGG GGG ATC CGC CAC CAG AAC CGC CAC CAG AAC CGC CAC CAG AAC CGC CAC CCA GAG CGA TGA TAC CGA AGT AAA CCT GAC C -3'

scTNF Iniciador III 5'- CCC CGA ATT CGG ATC CTC TTC TCG TAC CCC GTC TGA CAA ACC G -3'

scTNF Iniciador IV

5’- GGG GGG GAA GCT TAT CGA TAG TTA GAT ATC ATC ACA GAG CGA TGA TAC CGA AG -3'

scTNF Iniciador V 5'- CCT GTA CCT GAT CTA CTC CCA GGT TCT GTT CAA AGG CCA GG -3'

Oligo para inserção de CysHis: cys-scTNF Iniciador VI 58

AAT TCA ΤΤΑ AAG AGG AGA AAT TAA CTA TGG GAG AGC TCA TCG AAG GTC GCT GCG CCG GTG GAT CTG GTC ATC ATC ATC ACC ATC ACG GCT CAG ACGG

cys-scTNF Iniciador VII

CGC TCC GTC TGA GCC GTG ATG GTG ATG ATG ATG ACC AGA TCC ACC GGC GCA GCG ACC TTC GAT GAG CTC TCC CAT AGT TAA TTT CTC CTC TTT AAT G II. Preparação do scFasL em construções pcDNA3 e AMAIZe:

Para a clonagem subsequente, foram utilizadas as condições padrão descritas no Exemplo 1 A. Geração do sinal HA em pcDNA3 1. Digestão do vetor do pcADN3 com Kpnl e Notl. 2. Produção do HA-01igo com a sequência Kpnl-HA-sinal-NotI por meio de anilização dos iniciadores HA-IF e HA-IIR para uma sequência peptidica lider: 3. Ligação dos HA-01igos (contendo interfaces Kpnl e Notl) no vetor pcDNA3 B. Preparação do vetor scFasL no pcDNA3 (+) 1. PCR com iniciador FasL#lF e FasL#2R no modelo do vetor FasL-AMAIZe. A preparação deste tipo de construções está descrita no pedido de patente DE 10045591.3, da qual a respetiva divulgação está presente nesta invenção. O produto deste PCR 1 foi uma construção Notl—Flag Tag—FasL Módulol-Linkerl-BamHI-Xbal. 2. Por meio da interface de restrição Notl e Xbal, esta construção foi clonada no vetor da sequência pcADN3-HA digerido com as mesmas enzimas, de modo a que a seguinte construção seja criada: HA Sequência - Flag Tag - FasL Módulol -Linkerl - BamHI -Xbal 3. Com a ajuda de um outro PCR no modelo do vetor FasL AMAIZe e nos iniciadores FasL#3 e FasL#l, foi gerado o seguinte produto de PCR 2 blunt end- FasL Módulo2 - Linker2 - BamHI - Xbal 4. No próximo passo, o vetor pcDNA3 fda etapa 2 foi digerido com BamHI, esta interface foi preenchida com 59 enzima Klenow, e, subsequentemente, cortada com Xbal, de modo a ocorrer uma "blund end" e um "sticky end". Neste vetor assim modificado, o produto de PCR 2 foi, depois, clonado, tendo se formado a seguinte construção: HA Sequência - Flag Tag - FasL Módulol - Linkerl-Fasl Módulo2- Linker2- BamHI - Xbal 5. Para o terceiro módulo, foi realizado um outro PCR com o modelo de vetor FasL-AMAIZE e os iniciadores FasL#4 e FasL#5. 0 produto de PCR resultante foi então digerido com as enzimas de restrição BamHI e Xbal, e ligado ao vetor, da etapa 4, cortado com as mesmas enzimas. 0 resultado desta clonagem foi a seguinte construção no vetor pcDNA3: HA Sequência - Notl - Flag Tag - FasL Módulol - Linkerl-FasL Módulo2- Linker2-FasL Módulo3 - stop -Xbal.

Para a preparação das construções do scFasL e/ou scTNF-AMAIZe, os respetivos scFasL e/ou scTNF foram digeridos com as enzimas de restrição Notl e/ou Xbal, e as inserções comoou EcoRI e as inserções foram inseridas como uma cassete nos vetores do AMAIZe correspondentes (ver o pedido de patente DE 10045591.3), sendo que estes vetores também foram cortados com as enzimas Notl e/ou E-EcoRI e Xbal. Desta forma, foram preparadas as seguintes construções:

Peptideo líder-scFv40-Flag Tag- FasL Módulol-Linkerl-FasL Módulo2-Linker2-FasL Módulo3

Peptideo líder-scFv40-Flag Tag- TNF Módulol-Linkerl-TNF Módulo2-Linker2-TNF Módulo3

De seguida, são apresentadas as sequências dos iniciadores utilizados:

FasL#lR: SAAmmiTFeTmm€CC&0303ATC£^

AeC^£MM:€CCCA€£GAG€trTAm^

FasL#2F: 5'GGGGTAGCGGCCGCGCTGTCGACGATTACAAAGAC3' FasL#3F: 60 5'AGAAAAAA-AGGAGCTGAGGAAAGTGG3'

FasL#4F: 5'GGGGCGGATCCGAAAAAAAGGAGCTGAGGAAAGTGG3'

FasL#5R: 5'GGGGCCTCTAGAATCGATGGTCAGAGCTTATATAAGCCGAAAAACGTCTG3'

HA-IF 5'CGCCAT GGCTATCATC TACCTCATCC TCCTGTTCAC CGCTGTGCGG GGAGC3'

HA-IIR 5'GGC CGC TGC CCC GCA CAG CGG TGA ACA GGA GGA TGA GGT AGA TGA TAG CCA TGG CGG TAC3' III. Clonagem do scTRAIL e preparação das construções do SCTRAIL AMAIZe

Para a clonagem subsequente, foram utilizadas as condições padrão descritas no Exemplo 1 1. PCR com os iniciadores TRAIL#1 e TRAIL#2 no modelo pcDNA3-SC4O-TRAIL (ver pedido de patente DE 10045591.3). O produto de PCR 1 foi cortado com EcoRI e Xbal e ligado ao vetor do pcDNAl-scFadL digeridas com as mesmas enzimas de restrição. Esta digestão eliminou a sequência do FasL, sendo que a sequência da HA e da Flag-Tag foi preservada e criada a seguinte construção: HA-Sequência — Flag Tag - TRAIL Módulol - Linkerl- BamHI — Xbal 2. Com o auxilio dos iniciadores TRAIL#1 e TRAIL#2F, foi gerado o produto de PCR 2 com o modelo de TRAIL AMAIZe (ver o pedido de patente DE 10045591.3). Este foi cortado com Xbal, sendo que ocorre uma "blund end" e uma "sticky end". A construção a partir do ponto 1 foi digerida com BamHI e subsequentemente tratado com a enzima de Klenow, de modo que as extremidades foram preenchidas. Subsequentemente, foi realizada uma digestão Xbal e o produto de PCR 2 foi clonado neste vetor. O resultado foi a seguinte construção: HA Sequência - Flag Tag - TRAIL Módulol - Linkerl - TRAIL Módulo2 - Linker2 - BamHI-Xbal 61 3. Para a clonagem do módulo TRAIL 3, foi realizado um PCR com os iniciadores TRAIL#4 e TRAIL#5 no modelo TRAIL AMAIZe; o produto foi subsequentemente digerido com BamHI e Xbal e a construção do ponto 2 foi digerida-clonada também com BamHI e Xbal, tendo surgido a seguinte construção: HA Sequência - Flag Tag - TRAIL Módulol - Linkerl - TRAIL Módulo2 - Linker2 - TRAIL Módulo3 Stop - Xbal

Para a preparação das construções scTRAIL-AMAIZe, os respetivos vetores do scTRAIL foram digeridos com as enzimas de restrição Notl e/o EcoRI, e o Xbal foi digerido e as inserções, como uma cassete, nos vetores AMAIZe correspondentes (ver o pedido de patente DE 10045591.3), sendo que estes vetores também foram cortados com as enzimas Notl e/ou EcoRI e o Xbal. Desta forma, foram preparadas as seguintes construções: HA-svFv40-Flag Tag-TRAIL Modull-Linkerl-TRAIL Modul2-Linker2- TRAIL Modul3 De seguida, são indicadas as sequências dos iniciaidores usados:

Iniciadores para a clonagem do scTRAIL TRAIL#1R: 5ATCGATTTCTAGACCCGGGGGATCCGCCACCAGAACCGCCACCAGAACCGCC ACCAGAACCGCCACCGCCAACTAAAAAGGCCCCGAAAAAACTGGCTT-CATGGTC3' TRAIL#2F: S'GGGGTAGAATTCGGAACCTCTGAGGAAACCATTTCTACAGTTCAAG3' TRAIL#3F: 5'AACCTCTGAGGAAACCATTTCTACAG3' TRAIL#4F: 5'GGGGCGGATCCACCTCTGAGGAAACCATTTCTACAG3' TRAIL#5R: 5 'GGGGCCTCTAGAATC GATGGTCAGCCAACTAAAAAGGCCCCGAAAAAACTGG C3'

Exemplo 2: Farmacocinética do TNF humano de tipo selvagem e do scTNF humano.

Ratos de 6 semanas de idade foram injetados com 12 mg de TNF ou de scTNF (3 ratos cada um) . Todos os 45 minutos, 62 o sangue foi recolhido, reunido e a concentração de TNF no soro foi determinada usando um kit ELISA especifico do TNF humano. Os dados na Figura 27 mostram um aumento claro da semivida in vivo das variantes do scTNF. Espera-se, portanto, para o scTNF gue este tenha uma duração biológica in vivo aumentada consideravelmente, ressaltando o valor do scTNF como potencial terapêutico.

Exemplo 3: Ligação covalente a partículas (sílica) de cysHis-scTNF acoplado.

Fibroblastos de ratos transfetados com a construção TNFR2-Fas foram tratados com uma série de diluições dos reagentes indicados. Estas células são completamente resistentes ao wtTNF solúvel. Após o acoplamento covalente do cysHis-scTNF reduzido em micropartícuias de sílica (beads) de acordo com os protocolos estabelecidos (DPA 2001, N° DE10144252), estas provocam uma forte resposta citotóxica (círculo), de forma semelhante a um controlo positivo consistindo em CysHis-scTNF e um anticorpo reticulado do TNFR2, mAk 80M2 (triângulo). O Cys-His scTNF não ligado não mostra, como esperado, qualquer atividade em células positivas do TNFR2 (quadrado). Este CysHis-scTNF, ligado de forma covalente é bioativo e tem uma atividade especial do TNF ligado à membrana, isto é, ativa o TNFR2. Exemplo 4: Comparação do TNF padrão humano recombinante (rh) e do scTNF em modelos in vivo de necrose tumoral e a atividade in vitro da citotoxicidade de L929 Ratos: C3H/HeJ (femininos), 17-19 g de Charles River Células tumorais: Linhas celulares de fibrosarcoma induzida por metilcolantreno do CFS-1 a partir do C3H/HEN derivado de ratos (referência: Hafner Μ., P. Orosz, A. Krúger, und D.N. Mãnnel. 1996. O TNF promove a metástase, ao alterar a atividade das células naturalmente mortais. Internat. J. Câncer 66:388-392);

Experimentação com necrose tumoral: Os ratos receberam 1,6 x 107 de células do CFS-1 em 50 ml de meio (RPMI, 10% 63 FCS) por via intradérmica na parte de trás; os tumores foram deixados crescer durante 12 dias, até se atingir um tamanho de cerca de 5 a 6 mm de diâmetro, antes de uma injeção intraperitoneal com TNF (10 mg por rato) em 200 ml de PBS ou PBS por si como controlo. A dimensão do tumor foi medido diariamente e examinado macroscopicamente. Os ratos foram mortos ao sexto dia após tratamento e os tumores foram removidos para histologia. Os tumores foram retirados durante a noite, fixados em formalina tamponada com PBS a 4%, e incluídos em parafina. As seções verticais equatoriais (4 mm) foram coradas com hematoxilina e eosina e analisadas microscopicamente para necrose (tal como descrito em: Lucas R. et aL, 2001, Int J Câncer, 91:543-549) . TNF: o rhTNF da atividade específica de 6,6 x 106U/mg (48h de teste L929 sem Act D) do scTNF [0151] Na experiência in vitro, a atividade DL50 no ensaio de citotoxicidade L929 com Act.D para: ihTNF = 391 pg/ml scTNF = 39 pg/ml (testado usando as mesmas amostras do TNF, que foram usadas nas experimentações in vivo). O scTNF mostra, nesta experimentação in vitro, um aumento de atividade de 10 vezes.

Experimentação in vivo de necrose tumoral

Grupo n Diâmetro da tumor necrose dO d4 macroscopicamente* microscopicamente* * <5% >10% PBS 6 5,2 + 1 7,4+0,5 1 2 0 rhTNF 7 5,2+0,9 6,6+1,7 3 6 1 scTNF 7 5,9+0,5 7,3+0,3 5 0 7 * = Necrose superficial macroscopicamente visível = ** no exame microscópico, necrose central hemorrágica, <5% ou > 10% de todo o tecido tumoral 64

Conclusão :

Após 4 dias de tratamento com doses simples, não foi observada qualquer diferença no tamanho do tumor (para uma visão geral do TNF como um agente anti-cancerigeno ver, por exemplo, Eggermont et al, Lancet Oncol. 4.429 (2003) ) .

Necroses pequenas hemorrágicas induzidas por rhTNF (<5% da área de tumor), macroscopicamente observadas apenas em 3/7 dos animais.

Necroses maiores hemorrágicas induzidas por scTNF (> 10% da área de tumor) em todos os tumores (7/7), 5/7 dos quais são macroscopicamente visíveis. scTNF >> rhTNF em relação à citotoxicidade tumoral in vitro e à indução de necrose. 65

REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente Europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente citados na descrição • WO 0222680 A [0006] • DE 10247755 [0007] • WO 0137873 A [0010] • WO 0143770 A [0011] • WO 9961085 A [0012] • US 5877 A [0026] • US 4737462 A [0029] • US 4588585 A [0029] • US 4959314 A [0029] • US 5116943 A [0029] • US 4879111 A [0029] • US 5017691 A [0029] • US 4619639 A [0061] • DE 10144252 AI [0068] • DE 10144252 [0123] [0147] • DE 10045591 [0139] [0140] [0142] [0143]

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Claims (17)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para a depleção e/ou remoção extracorporal de recetor do fator de necrose tumoral (TNFR) do sangue ou de frações de sangue incluindo as etapas: a) separação opcional de sangue em uma ou mais frações com componentes sólidos e/ou líquidos; b) ligação de sangue ou de frações de sangue a uma superfície ou partícula acoplada a um polipeptídeo, sendo que o polipeptídeo compreende, pelo menos, três componentes A e, pelo menos, dois componentes B, sendo que cada componente A é um monómero do TNF ou um fragmento e/ou uma variante do mesmo exibindo propriedades de ligação e trimerização, e cada componente B é linker peptídico, e c) separação do TNFR ligado.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os componentes A serem iguais ou diferentes.

3. Método de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por os componentes A terem a sua origem no mesmo organismo ou em organismos diferentes.

4. Método de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por cada um dos componentes B ligarem dois de, pelo menos, três componentes A.

5. Método de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por, pelo menos um dos componentes B compreender a sequência de aminoácidos (GGGS)3 ou (GGGS)4. 2

6. Método de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por os componentes A e os componentes B formarem uma estrutura de proteína trimérica.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por os componentes A e os componentes B formarem uma estrutura de proteína trimérica.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por os componentes A e os componentes B formarem uma estrutura de proteína heterotrimérica.

9. Método de acordo com uma reivindicações anteriores, caracterizado por os componentes B serem iguais ou diferentes.

10. Método de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por os componentes B terem a sua origem no mesmo organismo ou em organismos diferentes.

11. Método de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o polipéptideo compreender uma seguência Tag, de preferência, N-terminal, em particular uma sequência His-Tag ou uma sequência Flag-Tag.

12. Método de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o polipeptídeo apresentar uma sequência de peptídeo líder, de preferência, N-terminal. 3

13. Método de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o polipeptideo compreender, pelo menos, um outro componente C, que é um fragmento de anticorpo ou uma outra proteína ou peptídeo diferente, que reconhece seletivamente uma molécula alvo específica numa superfície celular.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o componente C ser um fragmento de anticorpo de um mamífero, em particular, de origem murina ou humana, ou um fragmento de anticorpo humanizado.

15. Método de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado por o fragmento de anticorpo poder estar presente em vários formatos de anticorpo, tais como scFv, especialmente scFv40.

16. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o componente C ser uma proteína ou um peptídeo com especificidade para uma molécula de superfície celular, em particular um recetor de citocina, um recetor do fator de crescimento, uma integrina ou uma molécula de adesão celular.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o recetor de citocina ser selecionado a partir do grupo da família genética do TNFR.