JP6813491B2 - サイトカイン融合タンパク質 - Google Patents

Description

発明の技術分野
本発明は、サイトカイン融合タンパク質およびこのようなサイトカイン融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。本発明は、さらに、サイトカイン融合タンパク質またはそれをコードする核酸分子を含む細胞、非ヒト生物、医薬組成物およびキットならびに医薬としてのそれらの使用に関する。

発明の背景
腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)スーパーファミリーのリガンドは、アポトーシス、免疫細胞機能の制御および他の細胞型特異的応答を含む、正常発達過程に重要な役割を有する。それらはまた、癌および自己免疫疾患を含む種々の後天性および遺伝性疾患にも重要な役割を有する。

ＴＮＦリガンドファミリーは、ＴＮＦ相同ドメイン(ＴＨＤ)と称される保存された細胞外Ｃ末端ドメインにより特徴付けられる(Bodmer, J.L. et al. (2002), TRENDS in Biochemical Sciences, 27(1):19-26)。事実上同一の三次折畳みを共有し、ファミリーメンバー間で約２０〜３０％の配列同一性を示すＴＨＤが、(ホモ)三量体複合体を形成するための受容体結合および非共有結合的相互作用を担い、この複合体が次いでその特異的受容体により認識される。大部分のリガンドが膜結合タンパク質、より具体的にII型(すなわち、細胞内Ｎ末端および細胞外Ｃ末端)膜貫通タンパク質として合成されるが、可溶性サイトカインが、ＴＨＤを含む細胞外ドメインのタンパク質切断により産生され得る(Bodmer, J.L. et al. (2002), TRENDS in Biochemical Sciences, 27(1):19-26)。

少なくとも２つの異なるサイトカインを含む、多機能性、特に二機能性または二重作用性、サイトカイン融合タンパク質を提供することが、本発明の目的であった。このようなサイトカイン融合タンパク質をコードする核酸分子、特にＲＮＡ分子を提供することが、本発明のさらなる目的であった。

発明の概要
ある面において、本発明は、(ｉ)第一リガンドの受容体への結合が可能な第一ホモ三量体を形成する、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)スーパーファミリーの第一リガンドの３個の細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントおよび(ii)第二リガンドの受容体への結合が可能な第二ホモ三量体を形成する、ＴＮＦスーパーファミリーの第二リガンドの３個の細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントを含むサイトカイン融合タンパク質に関し、ここで、第一リガンドと第二リガンドは異なり、第一ホモ三量体および第二ホモ三量体は、好ましくは１以上のペプチドリンカーを経て、共有結合的に結合する。

ある態様において、第一リガンドの該３個の細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントおよび／または第二リガンドの該３個の細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントは、共有結合的に結合する。

ある態様において、サイトカイン融合タンパク質は、一般式
〔式中、Ａは第一リガンドの細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントを含み、Ｂは第二リガンドの細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントを含み、
ここで、Ｌはペプチドリンカーを含み、
Ｌ_ＡおよびＬ_Ｂは、各々、独立して共有結合およびペプチドリンカーから選択される。〕
を有する、分子／構造を含む。

ある態様において、Ｌはさらに多量体化ドメイン、好ましくは二量体化ドメインを含み、サイトカイン融合タンパク質の多量体化、好ましくは二量体化を可能とする。

ある態様において、二量体化ドメインは、ＩｇＥ重鎖ドメイン２(ＥＨＤ２)、ＩｇＭ重鎖ドメイン２(ＭＨＤ２)、ＩｇＧ重鎖ドメイン３(ＧＨＤ３)、ＩｇＡ重鎖ドメイン３(ＡＨＤ２)、ＩｇＤ重鎖ドメイン３(ＤＨＤ３)、ＩｇＥ重鎖ドメイン４(ＥＨＤ４)、ＩｇＭ重鎖ドメイン４(ＭＨＤ４)、Ｆｃドメイン、ウテログロビン二量体化ドメインおよび前記のいずれかの機能的バリアントからなる群から選択される。

ある態様において、サイトカイン融合タンパク質は、多量体、好ましくは二量体、複合体として存在する。

他の態様において、サイトカイン融合タンパク質は、一般式
〔式中、Ａは第一リガンドの細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントを含み、Ｂは第二リガンドの細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントを含み、
ここで、Ｌはペプチドリンカーを含む。〕
を有する少なくとも１、好ましくは３サブユニットを含み、ここで、好ましくは、該３サブユニットがサイトカイン融合タンパク質を形成する。

他の面において、本発明は、共有結合により結合している腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)スーパーファミリーの第一リガンドの３個の細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントを含む第一ブロックおよび共有結合により結合しているＴＮＦスーパーファミリーの第二リガンドの３個の細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントを含む第二ブロックを含むサイトカイン融合タンパク質に関し、ここで、第一リガンドと第二リガンドは異なり、第一ブロックおよび第二ブロックは、共有結合により結合する。

ある態様において、第一リガンドの該３個の細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントは、第一リガンドの受容体に結合できる第一ホモ三量体を形成し、第二リガンドの該３個の細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントは、第二リガンドの受容体に結合できる第二ホモ三量体を形成する。

ある態様において、第一リガンドの該３個の細胞外ドメインおよび／または第二リガンドの該３個の細胞外ドメインおよび／または第一ブロックおよび第二ブロックは、ペプチドリンカーを経て共有結合により結合する。

ある態様において、サイトカイン融合タンパク質は、一般式
〔式中、Ａは第一リガンドの細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントを含み、Ｂは第二リガンドの細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントを含み、
ここで、Ｌはペプチドリンカーを含み、
Ｌ_ＡおよびＬ_Ｂは、各々、独立して共有結合およびペプチドリンカーから選択される。〕
を有する、分子／構造を含む。

ある態様において、Ｌはさらに多量体化ドメイン、好ましくは二量体化ドメインを含み、サイトカイン融合タンパク質の多量体化、好ましくは二量体化を可能とする。

ある態様において、二量体化ドメイは、ＩｇＥ重鎖ドメイン２(ＥＨＤ２)、ＩｇＭ重鎖ドメイン２(ＭＨＤ２)、ＩｇＧ重鎖ドメイン３(ＧＨＤ３)、ＩｇＡ重鎖ドメイン３(ＡＨＤ２)、ＩｇＤ重鎖ドメイン３(ＤＨＤ３)、ＩｇＥ重鎖ドメイン４(ＥＨＤ４)、ＩｇＭ重鎖ドメイン４(ＭＨＤ４)、Ｆｃドメイン、ウテログロビン二量体化ドメインおよび前記のいずれかの機能的バリアントからなる群から選択される。

ある態様において、サイトカイン融合タンパク質は、多量体、好ましくは二量体、複合体として呈示される。

他の面において、本発明は、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)スーパーファミリーの第一リガンドの細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントおよびＴＮＦスーパーファミリーの第二リガンドの細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントを含むサイトカイン融合タンパク質に関し、ここで、第一リガンドと第二リガンドは異なり、細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントは、共有結合により結合する。

ある態様において、細胞外ドメインは、ペプチドリンカーを経て共有結合により結合する。

ある態様において、サイトカイン融合タンパク質は、一般式
〔式中、Ａは第一リガンドの細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントを含み、Ｂは第二リガンドの細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントを含み、
ここで、Ｌはペプチドリンカーを含む。〕
を有する分子／構造を含む。

ある態様において、サイトカイン融合タンパク質は三量体複合体として提供され、ここで、第一リガンドの３個の細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントは第一リガンドの受容体に結合できる第一ホモ三量体を形成し、第二リガンドの３個の細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントは第二リガンドの受容体に結合できる第二ホモ三量体を形成する。

本発明により、第一リガンドおよび第二リガンドは、このましくは、好ましくはＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＥＤＡ−Ａ１、ＥＤＡ−Ａ２、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴ−アルファ、ＴＬ１Ａ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬおよびＴＷＥＡＫからなる群から選択され、より好ましくはＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、４−１ＢＢＬおよびＯＸ４０Ｌからなる群から選択される。

ある態様において、
− 第一リガンドはＣＤ４０Ｌであり、第二リガンドはＣＤ２７Ｌである；
− 第一リガンドはＣＤ２７Ｌであり、第二リガンドはＣＤ４０Ｌである；
− 第一リガンドはＣＤ４０Ｌであり、第二リガンドは４−１ＢＢＬである；
− 第一リガンドは４−１ＢＢＬであり、第二リガンドはＣＤ４０Ｌである；
− 第一リガンドはＣＤ２７Ｌであり、第二リガンドは４−１ＢＢＬである；
− 第一リガンドは４−１ＢＢＬであり、第二リガンドはＣＤ２７Ｌである；
− 第一リガンドはＣＤ４０Ｌであり、第二リガンドはＯＸ４０Ｌである；
− 第一リガンドはＯＸ４０Ｌであり、第二リガンドはＣＤ４０Ｌである；
− 第一リガンドはＣＤ２７Ｌであり、第二リガンドはＯＸ４０Ｌである；
− 第一リガンドはＯＸ４０Ｌであり、第二リガンドはＣＤ２７Ｌである；
− 第一リガンドはＯＸ４０Ｌであり、第二リガンドは４−１ＢＢＬである；または
− 第一リガンドは４−１ＢＢＬであり、第二リガンドはＯＸ４０Ｌである。

ある態様において、ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインは、配列番号１のアミノ酸残基５１〜２６１または１１６〜２６１を含みまたはこれからなり、ＣＤ２７Ｌの細胞外ドメインは、配列番号２のアミノ酸残基５２〜１９３を含みまたはこれからなり、４−１ＢＢＬの細胞外ドメインは、配列番号３のアミノ酸残基７１〜２５４を含みまたはこれからなりおよび／またはＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインは、配列番号４のアミノ酸残基５１〜１８３を含みまたはこれからなる。

ある態様において、サイトカイン融合タンパク質は、さらにサイトカイン融合タンパク質の検出および／または単離を可能にする少なくとも一つの標識またはタグを含む。

ある態様において、サイトカイン融合タンパク質は、さらにサイトカイン融合タンパク質の安定性を高める１以上の修飾を含む。

他の面において、本発明は、上に定義したサイトカイン融合タンパク質またはそのサブユニットをコードする核酸分子に関する。

ある態様において、核酸分子は、発現制御配列に操作可能に結合する。
ある態様において、核酸分子は、ベクターに含まれる。

ある態様において、核酸分子は、ＲＮＡ分子、好ましくはインビトロ転写(ＩＶＴ)ＲＮＡ分子である。

他の面において、本発明は、上に定義した核酸分子でトランスフォームまたはトランスフェクトされた細胞に関する。

ある態様において、細胞は原核細胞である。
ある態様において、細胞は真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞である。

他の面において、本発明は、上に定義した核酸分子でトランスフォームまたはトランスフェクトされた非ヒト生物に関する。

他の面において、本発明は、活性剤として、上に定義したサイトカイン融合タンパク質、上に定義した核酸分子または上に定義した細胞を含む、医薬組成物に関する。

ある態様において、医薬組成物は、さらに薬学的に許容される担体および／または添加物を含む。

他の面において本発明は、上に定義したサイトカイン融合タンパク質、上に定義した核酸分子、上に定義した細胞または上に定義した医薬組成物を含む、キットに関する。

他の面において、本発明は、医薬として使用するための、上に定義したサイトカイン融合タンパク質、上に定義した核酸分子、上に定義した細胞または上に定義した医薬組成物に関する。

他の面において、本発明は、癌、感染症、炎症性疾患、代謝疾患、自己免疫障害、変性疾患、アポトーシス関連疾患および移植片拒絶からなる群から選択される疾患の処置に使用するための、上に定義したサイトカイン融合タンパク質、上に定義した核酸分子、上に定義した細胞または上に定義した医薬組成物に関する。

他の面において、本発明は、癌、感染症、炎症性疾患、代謝疾患、自己免疫障害、変性疾患、アポトーシス関連疾患および移植片拒絶からなる群から選択される疾患の処置用医薬の製造における、上に定義したサイトカイン融合タンパク質、上に定義した核酸分子、上に定義した細胞または医薬組成物の使用に関する。

他の面において、本発明は、処置を必要とする対象に、有効量の上に定義したサイトカイン融合タンパク質、上に定義した核酸分子、上に定義した細胞または上に定義した医薬組成物を投与することを含む、癌、感染症、炎症性疾患、代謝疾患、自己免疫障害、変性疾患、アポトーシス関連疾患および移植片拒絶からなる群から選択される疾患の処置法に関する。

Ｄｕｏｋｉｎｅ、ｓｃＤｕｏｋｉｎｅおよびＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅの模式的集合体である。

１２％ポリアクリルアミドゲルを使用する還元および非還元条件下の精製ＤｕｏｋｉｎｅのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す(１、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ２７Ｌ；２、ＣＤ２７Ｌ−ＣＤ４０Ｌ；３、ＣＤ４０Ｌ−４−１ＢＢＬ；４、４−１ＢＢＬ−ＣＤ４０Ｌ；５、ＣＤ２７Ｌ−４−１ＢＢＬ；６、４−１ＢＢＬ−ＣＤ２７Ｌ；７、ＣＤ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｌ；８、ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ４０Ｌ；９、ＣＤ２７Ｌ−ＯＸ４０Ｌ；１０、ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ２７Ｌ；１１、４−１ＢＢＬ−ＯＸ４０Ｌ；１２、ＯＸ４０Ｌ−４−１ＢＢＬ)。タンパク質をクーマシーブリリアントブルーＧ２５０での染色により可視化した。

融合タンパク質の完全性を示す、Ｄｕｏｋｉｎｅのサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)分析を示す。高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)をYarra SEC-2000(Phenomenex)で、流速０.５mL／分で実施した。サイログロブリン、アルコールデヒドロゲナーゼ、ウシ血清アルブミン、炭酸脱水酵素およびＦＬＡＧペプチドを標準タンパク質として使用した。

ＥＬＩＳＡにおけるＤｕｏｋｉｎｅ(１００nM)の固定化ＣＤ４０−、ＣＤ２７−、４−１ＢＢ−およびＯＸ４０−Ｆｃ融合タンパク質への結合を示す。全Ｄｕｏｋｉｎｅは各受容体−Ｆｃ融合タンパク質に結合し、交差反応性は検出されなかった。

ＥＬＩＳＡにおけるＤｕｏｋｉｎｅの固定化ＣＤ４０−、ＣＤ２７−、４−１ＢＢ−およびＯＸ４０−Ｆｃ融合タンパク質への結合を示す(ｎ＝３±ＳＤ)。Ｄｕｏｋｉｎｅを、３１６nM濃度で開始して、デュプリケートでタイトレートした。全Ｄｕｏｋｉｎｅは各受容体−Ｆｃ融合タンパク質に用量依存的方法で結合し、ＥＣ_５０値は低ナノモル範囲であった。タンパク質濃度は三量体分子による。

フローサイトメトリーで分析した、Ｄｕｏｋｉｎｅ(１００nM)のＣＤ４０−、ＣＤ２７−、４−１ＢＢ−およびＯＸ４０発現ＨＴ１０８０細胞への結合を示す。結合ＤｕｏｋｉｎｅをＰＥ標識抗ＦＬＡＧ抗体で検出した(灰色、細胞単独；細線、ＰＥ標識抗ＦＬＡＧ抗体とインキュベートした細胞；太線、Ｄｕｏｋｉｎｅとインキュベートした細胞)。

Ｄｕｏｋｉｎｅの特異性をフローサイトメトリーにより分析した。Ｄｕｏｋｉｎｅ(１００nM)のＣＤ４０−、ＣＤ２７−、４−１ＢＢ−およびＯＸ４０発現ＨＴ１０８０細胞への結合後、Ｄｕｏｋｉｎｅを、対応する受容体−Ｆｃ融合タンパク質(１０nM)およびＰＥ標識抗ヒトＦｃ抗体を使用して検出した。ＴＮＦＲ１−Ｆｃを陰性対照として含めた(灰色、ＰＥ標識抗ヒトＦｃ抗体とインキュベートした細胞；細線、ＤｕｏｋｉｎｅおよびＴＮＦＲ１−Ｆｃとインキュベートした細胞；太線、ＣＤ４０−、ＣＤ２７−、４−１ＢＢ−またはＯＸ４０−Ｆｃとインキュベートした細胞)。

１０％ポリアクリルアミドゲルを使用する還元および非還元条件下での精製一本鎖ＤｕｏｋｉｎｅのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す(１、ｓｃＣＤ４０Ｌ−ｓｃＣＤ２７Ｌ；２、ｓｃＣＤ２７Ｌ−ｓｃＣＤ４０Ｌ；３、ｓｃＣＤ４０Ｌ−ｓｃ４−１ＢＢＬ；４、ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＣＤ４０Ｌ；５、ｓｃＣＤ２７Ｌ−ｓｃ４−１ＢＢＬ；６、ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＣＤ２７Ｌ；７、ｓｃＣＤ４０Ｌ−ｓｃＯＸ４０Ｌ；８、ｓｃＯＸ４０Ｌ−ｓｃＣＤ４０Ｌ；９、ｓｃＣＤ２７Ｌ−ｓｃＯＸ４０Ｌ；１０、ｓｃＯＸ４０Ｌ−ｓｃＣＤ２７Ｌ；１１、ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＯＸ４０Ｌ；１２、ｓｃＯＸ４０Ｌ−ｓｃ４−１ＢＢＬ)。タンパク質をクーマシーブリリアントブルーＧ２５０での染色により可視化した。

融合タンパク質の完全性を示す、一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅのサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)分析を示す。高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を、Yarra SEC-2000(Phenomenex)で、流速０.５mL／分で実施した。サイログロブリン、アルコールデヒドロゲナーゼ、ウシ血清アルブミン、炭酸脱水酵素およびＦＬＡＧペプチドを標準タンパク質として使用した。

ＥＬＩＳＡにおける一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅ(１００nM)の固定化ＣＤ４０−、ＣＤ２７−、４−１ＢＢ−およびＯＸ４０−Ｆｃ融合タンパク質への結合を示す(ｎ＝３±ＳＤ)。全一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅは各受容体−Ｆｃ融合タンパク質に結合し、交差反応性は検出されなかった。

ＥＬＩＳＡにおける一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅの固定化ＣＤ４０−、ＣＤ２７−、４−１ＢＢ−およびＯＸ４０−Ｆｃ融合タンパク質の結合を示す(ｎ＝３±ＳＤ)。Ｄｕｏｋｉｎｅを、３１６nM濃度で開始して、デュプリケートでタイトレートした。全一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅは各受容体−Ｆｃ融合タンパク質に用量依存的方法で結合し、ＥＣ_５０値は低ナノモル範囲であった。

フローサイトメトリーにより分析した、一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅ(１００nM)のＣＤ４０−、ＣＤ２７−、４−１ＢＢ−およびＯＸ４０発現ＨＴ１０８０細胞への結合を示す。結合一本鎖ＤｕｏｋｉｎｅをＰＥ標識抗ＦＬＡＧ抗体で検出した(灰色、細胞単独；細線、ＰＥ標識抗ＦＬＡＧ抗体とインキュベートした細胞；太線、一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅとインキュベートした細胞)。

一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅの特異性をフローサイトメトリーにより分析した。一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅ(１００nM)のＣＤ４０−、ＣＤ２７−、４−１ＢＢ−およびＯＸ４０発現ＨＴ１０８０細胞への結合後、一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅを、対応する受容体−Ｆｃ融合タンパク質(１０nM)およびＰＥ標識抗ヒトＦｃ抗体を使用して検出した。ＴＮＦＲ１−Ｆｃを陰性対照として含めた(灰色、ＰＥ標識抗ヒトＦｃ抗体とインキュベートした細胞；細線、一本鎖ＤｕｏｋｉｎｅおよびＴＮＦＲ１−Ｆｃとインキュベートした細胞；太線、一本鎖ＤｕｏｋｉｎｅおよびＣＤ４０−、ＣＤ２７−、４−１ＢＢ−またはＯＸ４０−Ｆｃとインキュベートした細胞)。

４〜１５％ポリアクリルアミドゲルを使用する還元および非還元条件下の精製一本鎖ＤｕｏｋｉｎｅのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す(１、ｓｃ４−１ＢＢＬ−ＥＨＤ２−ｓｃＣＤ４０Ｌ；２、ｓｃ４−１ＢＢＬ−ＥＨＤ２−ｓｃＣＤ２７Ｌ；３、ｓｃＣＤ４０Ｌ−ｓｃＣＤ２７Ｌ)。タンパク質をクーマシーブリリアントブルーＧ２５０での染色により可視化した。

融合タンパク質の完全性を示す、ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅのサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)分析を示す。高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を、Yarra SEC-2000(Phenomenex)で、流速０.５mL／分で実施した。サイログロブリン、アルコールデヒドロゲナーゼ、ウシ血清アルブミン、炭酸脱水酵素およびＦＬＡＧペプチドを標準タンパク質として使用した。

ＥＬＩＳＡにおけるＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅ(１００nM)の固定化ＣＤ４０−、ＣＤ２７−、４−１ＢＢ−およびＯＸ４０−Ｆｃ融合タンパク質への結合を示す。全ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅは各受容体−Ｆｃ融合タンパク質に結合し、交差反応性は検出されなかった。

ＥＬＩＳＡにおけるＥＨＤ２連結一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅの固定化ＣＤ４０−、ＣＤ２７−、４−１ＢＢ−およびＯＸ４０−Ｆｃ融合タンパク質への結合を示す(ｎ＝３±ＳＤ)。ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅを、３１６nM濃度で開始して、デュプリケートでタイトレートした。全ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅは各受容体−Ｆｃ融合タンパク質に用量依存的方法で結合し、ＥＣ_５０値は低ナノモル範囲であった。

フローサイトメトリーにより分析した、ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅ(１００nM)のＣＤ４０−、ＣＤ２７−、４−１ＢＢ発現ＨＴ１０８０細胞への結合を示す。結合ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅをＰＥ標識抗ＦＬＡＧ抗体で検出した(灰色、細胞単独；細線、ＰＥ標識抗ＦＬＡＧ抗体とインキュベートした細胞；太線、ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅとインキュベートした細胞)。

ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅの特異性をフローサイトメトリーにより分析した。ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅ(１００nM)のＣＤ４０−、ＣＤ２７−、４−１ＢＢ−およびＯＸ４０発現ＨＴ１０８０細胞への結合後、ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅを、対応する受容体−Ｆｃ融合タンパク質(１０nM)およびＰＥ標識抗ヒトＦｃ抗体を使用して検出した。ＴＮＦＲ１−Ｆｃを陰性対照として含めた(灰色、ＰＥ標識抗ヒトＦｃ抗体とインキュベートした細胞；細線、ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅおよびＴＮＦＲ１−Ｆｃとインキュベートした細胞；太線、ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅおよびＣＤ４０−、ＣＤ２７−、４−１ＢＢ−またはＯＸ４０−Ｆｃとインキュベートした細胞)。

ＣＤ４０−および４−１ＢＢ発現ＨＴ１０８０細胞(ｎ＝３±ＳＤ)またはＣＤ２７発現ＨＴ１０８０細胞(ｎ＝１±ＳＤ)からのＩＬ−８遊離により分析したＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅの受容体活性化を示す。２×１０^４ ＨＴ１０８０細胞を連続希釈したＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅとインキュベートし、上清中のＩＬ−８の量を、１８時間インキュベーション後ＥＬＩＳＡで検出した。単量体リガンドおよびその一本鎖誘導体を対照として含めた。

Ｄｕｏｋｉｎｅまたは一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅで刺激後のＴ細胞の増殖を示す。１.５×１０^５ ＣＦＳＥ染色ヒトＰＢＭＣ(混合集団)を、一次準最適刺激としての架橋抗ヒトＣＤ３抗体存在下、連続希釈したＤｕｏｋｉｎｅまたは一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅとインキュベートした。６日後、Ｔ細胞の増殖をフローサイトメトリーで評価した。

ＴＮＦＲリガンドおよびその融合タンパク質の細胞外ドメインをコードするｍＲＮＡのインビトロ転写のためのベクター設計を示す。プラスミド構築物ｐＳＴ１−ｈＡｇ−コザック−ｓｅｃ(ｏｐｔ)−インサート−２ｈＢｇＵＴＲ−Ａ１２０を、ＴＮＦ受容体(ＴＮＦＲ)リガンドおよびその融合タンパク質をコードするＲＮＡのインビトロ転写の鋳型として使用した。インサートは、ホモ三量体として機能的活性である、ＴＮＦＲリガンドの細胞外ドメインをコードした。これらＴＮＦ受容体リガンドのための２種の異なるコード配列を産生した：(ｉ)ＴＮＦ受容体の一つの単一細胞外ドメインを含み、それゆえ非共有結合三量体をコードするインサートおよび(ii)インサートが短リンカードメイン(コード化アミノ酸：Ｇ_３ＳＧ_３)により分離される３コピーの細胞外ドメインを含み、それゆえ共有結合三量体をコードする一本鎖構築物。２ＴＮＦＲリガンドの融合タンパク質を産生するために、これらをリンカーで接続した。命名法：ヒトタンパク質配列をコードする構築物は“ｈ”と略し、マウスタンパク質配列は“ｍ”と略した。数字“１”および“３”は、コードされるＴＮＦＲリガンド細胞外ドメインのコピーの量を示す。

ＩＶＴ−ＲＮＡエレクトロポレーション後の融合タンパク質の細胞内発現を示す。Ｋ５６２細胞をＴＮＦＲリガンドまたはその融合タンパク質の細胞外ドメインをコードするＩＶＴ−ＲＮＡで電気穿孔した。エレクトロポレーション６時間後、タンパク質排出をＧｏｌｇｉＰｌｕｇおよびＧｏｌｇｉＳＴＯＰで遮断し、インキュベーション１２時間後、細胞を、それぞれＣＤ２７Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌまたは４−１ＢＢＬで細胞内染色した。陰性対照として、Ｋ５６２細胞を、ＲＮＡを用いずに電気穿孔し(ＭＯＣＫ)、それに応じて染色した。(Ａ)ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−およびｈ３＿ＣＤ４０Ｌ−単一構築物と比較した、ｈ３＿ＣＤ４０Ｌ−ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ構築物のエレクトロポレーションによるＴＮＦＲリガンドの細胞内染色。(Ｂ)ｈ３＿ＯＸ４０Ｌ−およびｈ３＿ＣＤ４０Ｌ−単一構築物と比較した、ｈ３＿ＣＤ４０Ｌ−ｈ３＿ＯＸ４０Ｌ構築物のエレクトロポレーションによるＴＮＦＲリガンドの細胞内染色。(Ｃ)ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−およびｈ３＿４−１ＢＢＬ−単一構築物と比較した、ｈ３＿４−１ＢＢＬ−ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ構築物のエレクトロポレーションによるＴＮＦＲリガンドの細胞内染色。(Ｄ)ｈ１＿ＣＤ４０Ｌ−ｈ１＿ＣＤ２７Ｌ、ｈ１＿４−１ＢＢＬ−ｈ１＿ＣＤ４０Ｌおよびｈ１＿４−１ＢＢＬ−ｈ１＿ＣＤ２７Ｌ構築物のエレクトロポレーションによるＴＮＦＲリガンドの細胞内染色。

一過性トランスフェクション後のＨＴ１０８０およびＫ５６２の安定なトランスフェクタント上のＴＮＦ受容体の細胞表面発現を示す。(Ａ)ＨＴ１０８０の安定なＴＮＦ受容体トランスフェクタントを抗ＣＤ２７−ＰＥ、抗ＣＤ４０−ＦＩＴＣ、抗４−１ＢＢ−ＰＥおよび抗ＯＸ４０−ＰＥで染色した。(Ｂ)Ｋ５６２細胞を、ヒトＣＤ２７、ＣＤ４０、４−１ＢＢおよびＯＸ４０の完全長コード配列をコードするプラスミドで電気穿孔した。エレクトロポレーション１日後、細胞をそれぞれ抗ＣＤ２７−ＰＥ、抗ＣＤ４０−ＦＩＴＣ、抗４−１ＢＢ−ＰＥおよび抗ＯＸ４０−ＰＥで染色した。

トランスプレゼンテーション条件下、ＴＮＦＬ(１)−ＴＮＦＬ(２)−融合構築物により増強されたＴＮＦ受容体活性化を示す。Ｋ５６２細胞を、多ウェルエレクトロポレーションプレート(９６ウェル)中、種々の量のＴＮＦＲリガンドまたはその融合タンパク質の細胞外ドメインをコードするＩＶＴ−ＲＮＡで電気穿孔した。ＲＮＡ量を、対応するコード化タンパク質を参照して、ＲＮＡのpmolとして示す。一夜インキュベーション後、上清を、ＨＴ１０８０細胞株の二つの対応する安定なＴＮＦ受容体トランスフェクタントのコンフルエント細胞層に移した(図２４Ａ参照)。１日前にＭＯＣＫ−電気穿孔(対照として)または対応するＴＮＦ受容体−プラスミドで電気穿孔したＫ５６２細胞を、融合タンパク質のためのトランスプレゼンテーション条件(細胞−細胞トランス活性化)を産生するために、ＨＴ１０８０−ＴＮＦＲ−トランスフェクタントおよび上清のコンフルエント細胞層に添加した。８時間の共インキュベーション後、無細胞上清を回収し、ＴＮＦ受容体依存的ＮＦ−カッパＢ活性化によりＨＴ１０８０細胞から遊離するＩＬ−８の濃度を測定した。(Ａ)は、Ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＣＤ４０ＬをコードするＩＶＴ−ＲＮＡで電気穿孔したＫ５６２細胞からの上清とインキュベーション後のＨＴ１０８０＿ＣＤ４０の活性化によるＩＬ−８遊離を示す。トランスプレゼンテーションを伴わない(＋Ｋ５６２＿ＭＯＣＫ)ｈ３＿ＣＤ４０Ｌ単一構築物および融合構築物ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＣＤ４０Ｌは、コード化タンパク質に対して、少なくとも１pmol ＲＮＡのエレクトロポレーションによりＩＬ−８分泌を生じた。Ｋ５６２＿ＣＤ２７が介在するトランスプレゼンテーション条件下、融合構築物ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＣＤ４０Ｌは、コード化タンパク質に関して約１／１００倍の量のＩＶＴ−ＲＮＡで同程度のＣＤ４０活性化を誘発した。(Ｂ)トランスプレゼンテーション条件無しでのｈ３＿ＣＤ２７Ｌまたはｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＣＤ４０ＬをコードするＩＶＴ−ＲＮＡのエレクトロポレーションによるＣＤ２７−活性化は、ＩＬ−８分泌の測定により検出されなかった。Ｋ５６２＿ＣＤ４０によるトランスプレゼンテーションを用いて、ＣＤ２７−活性化は、ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＣＤ４０Ｌ融合構築物のＫ５６２−エレクトロポレーションにより検出された。(Ｃ)は、ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＯＸ４０ＬをコードするＩＶＴ−ＲＮＡの上清とのインキュベーションによるＨＴ１０８０＿ＯＸ４０の活性化によるＩＬ−８遊離を示す。トランスプレゼンテーション無し(＋Ｋ５６２＿ＭＯＣＫ)でのｈ３＿ＯＸ４０Ｌ単一構築物および融合構築物ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＯＸ４０Ｌは、コード化タンパク質に対して約１pmol以上のＲＮＡのエレクトロポレーションによりＩＬ−８分泌をもたらした。Ｋ５６２＿ＣＤ２７が介在するトランスプレゼンテーション条件下、融合構築物ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＯＸ４０Ｌは、コード化タンパク質に関して、ＩＶＴ−ＲＮＡの約１／１０の量で同程度のＣＤ４０活性化を誘発した。(Ｄ)トランスプレゼンテーション条件無しでのｈ３＿ＣＤ２７Ｌまたはｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＯＸ４０ＬをコードするＩＶＴ−ＲＮＡのエレクトロポレーションによるＣＤ２７−活性化は、ＩＬ−８分泌の測定により検出されなかった。Ｋ５６２＿ＯＸ４０によるトランスプレゼンテーションを用いて、ＣＤ２７−活性化は、ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＣＤ４０Ｌ ＲＮＡ構築物のＫ５６２−エレクトロポレーションにより検出された。(Ｅ)は、ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿４−１ＢＢＬをコードするＩＶＴ−ＲＮＡの上清とのインキュベーションによるＨＴ１０８０＿ＣＤ２７の活性化によるＩＬ−８濃縮を示す。トランスプレゼンテーション無し(＋Ｋ５６２＿ＭＯＣＫ)でのｈ３＿ＣＤ２７Ｌ単一構築物および融合構築物ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿４−１ＢＢＬは、ＩＬ−８分泌を誘発しなかった。Ｋ５６２＿４−１ＢＢが介在するトランスプレゼンテーション条件下、融合構築物ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿４−１ＢＢＬは、ＣＤ２７の活性化を誘発した。(Ｆ)トランスプレゼンテーション無し(＋Ｋ５６２＿ＭＯＣＫ)でのｈ３＿４−１ＢＢＬ単一構築物および融合構築物ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿４−１ＢＢＬは、ＩＬ−８分泌を誘発しなかった。Ｋ５６２＿ＣＤ２７が介在するトランスプレゼンテーション条件下、融合構築物ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿４−１ＢＢＬは４−１ＢＢの活性化を誘発した。(Ｇ)は、ｈ３＿４１ＢＢＬ−ｈ３＿ＣＤ４０Ｌおよびｈ１＿４１ＢＢＬ−ｈ１＿ＣＤ４０ＬをコードするＩＶＴ−ＲＮＡで電気穿孔したＫ５６２からの上清とのインキュベーションによるＨＴ１０８０＿ＣＤ４０の活性化によるＩＬ−８遊離を示す。トランスプレゼンテーション無し(＋Ｋ５６２＿ＭＯＣＫ)でのｈ３＿ＣＤ４０Ｌ単一構築物および両融合構築物は、コード化タンパク質に対して、少なくとも１pmol ＲＮＡのエレクトロポレーションによりＩＬ−８分泌を生じた。Ｋ５６２＿４１ＢＢが介在するトランスプレゼンテーション条件下、両融合構築物、ｈ３＿４１ＢＢＬ−ｈ３＿ＣＤ４０Ｌおよびｈ１＿４１ＢＢＬ−ｈ１＿ＣＤ４０Ｌは、約１／１０量のＩＶＴ−ＲＮＡで同程度のＣＤ４０活性化を誘発した(コード化タンパク質に対して)。(Ｈ)トランスプレゼンテーション無し(＋Ｋ５６２＿ＭＯＣＫ)でのｈ３＿４−１ＢＢＬ単一構築物および両融合構築物、ｈ３＿４１ＢＢＬ−ｈ３＿ＣＤ４０Ｌおよびｈ１＿４１ＢＢＬ−ｈ１＿ＣＤ４０Ｌは、ＩＬ−８分泌を誘発しなかった。Ｋ５６２＿ＣＤ４０が介在するトランスプレゼンテーション条件下、両融合構築物は、同程度に４−１ＢＢの活性化を誘発した。

ＣＤ８^＋ Ｔ細胞増殖に対するｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＣＤ４０Ｌおよびｈ３＿ＣＤ４０Ｌ−ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ融合構築物の効果を示す。ｉＤＣを、それぞれクローディン−６ ＩＶＴ−ＲＮＡ＋Ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＣＤ４０Ｌ、ｈ３＿ＣＤ４０Ｌ−ｈ３＿ＣＤ２７Ｌおよび単一構築物ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ＋ｈ３＿ＣＤ４０ＬをコードするＩＶＴ−ＲＮＡまたは対照ＲＮＡで電気穿孔した。ＣＤ８^＋ Ｔ細胞(ＨＬＡ−Ａ２^＋ドナー)を、クローディン−６特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞受容体をコードするまたはＴＰＴＥ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞受容体をコードするＩＶＴ−ＲＮＡで電気穿孔し、その後ＣＦＳＥで染色した。電気穿孔したｉＤＣおよびＣＤ８^＋ Ｔ細胞を１：１０比で５日共培養し、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の増殖をＦＡＣＳで分析した。クローディン−６−ＴＣＲ^＋ ＣＤ８^＋ Ｔ細胞のＣＦＳＥ分析の代表的ヒストグラムプロットを(Ａ)に示し、ＴＰＴＥ−ＴＣＲ^＋ ＣＤ８^＋ Ｔ細胞のものを(Ｂ)に示す。細胞分裂を示すピークに基づく増殖の詳細な分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより行った。この方法で、“分裂細胞％”により示す分裂に入ったＴ細胞のパーセンテージおよび“増殖指数”により示す分裂に入った細胞の分裂の平均数を計算しており、両方(Ｃ)に示す。ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＣＤ４０Ｌおよびｈ３＿ＣＤ４０Ｌ−ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ融合構築物の両者の適用は抗原特異的方法でのＣＤ８^＋ Ｔ細胞の増殖増加をもたらし、一方２つの対応するＴＮＦＲリガンドをコードする２つのＲＮＡの適用は、増殖に効果がなかった。

ＣＤ８^＋ Ｔ細胞増殖に対するｈ３＿４−１ＢＢＬ−ｈ３＿ＣＤ２７Ｌおよびｈ１＿４−１ＢＢＬ−ｈ１＿ＣＤ２７Ｌ融合構築物の効果を示す。ｉＤＣを、それぞれ、ｈ３＿４−１ＢＢＬ−ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ、ｈ１＿４−１ＢＢＬ−ｈ１＿ＣＤ２７Ｌおよび単一構築物ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ＋ｈ３＿４−１ＢＢＬをコードするクローディン−６ ＩＶＴ−ＲＮＡ＋ＩＶＴ−ＲＮＡまたは対照ＲＮＡで電気穿孔した。ＣＤ８^＋ Ｔ細胞(ＨＬＡ−Ａ２^＋ドナー)をクローディン−６特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞受容体をコードするまたはＴＰＴＥ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞受容体をコードするＩＶＴ−ＲＮＡで電気穿孔し、その後ＣＦＳＥで染色した。電気穿孔したｉＤＣおよびＣＤ８^＋ Ｔ細胞を１：１０比で５日共培養し、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の増殖をＦＡＣＳで分析した。クローディン−６−ＴＣＲ^＋ ＣＤ８^＋ Ｔ細胞のＣＦＳＥ分析の代表的ヒストグラムプロットを(Ａ)に示し、ＴＰＴＥ−ＴＣＲ^＋ ＣＤ８^＋ Ｔ細胞のものを(Ｂ)に示す。細胞分裂を示すピークに基づく増殖の詳細な分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより行った。この方法で、“分裂細胞％”により示す分裂に入ったＴ細胞のパーセンテージおよび“増殖指数”により示す分裂に入った細胞の分裂の平均数を計算しており、両方(Ｃ)に示す。ｈ３＿４−１ＢＢＬ−ｈ３＿ＣＤ２７Ｌおよびｈ１＿４−１ＢＢＬ−ｈ１＿ＣＤ２７Ｌ融合構築物両者の適用は抗原特異的方法でのＣＤ８^＋ Ｔ細胞の増殖増加をもたらし、一方２つの対応するＴＮＦＲリガンドをコードする２つのＲＮＡの適用は、増殖に効果がなかった。

ＣＤ８^＋ Ｔ細胞増殖に対する組み換えＤｕｏｋｉｎｅの効果を示す。ｉＤＣをクローディン−６ ＩＶＴ−ＲＮＡで電気穿孔した。ＣＤ８^＋ Ｔ細胞(ＨＬＡ−Ａ２^＋ドナー)をクローディン−６特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞受容体をコードするＩＶＴ−ＲＮＡで電気穿孔し、その後ＣＦＳＥで染色した。エレクトロポレーション１日後、ｉＤＣおよびＣＤ８^＋ Ｔ細胞を、１：１０比で４日共培養した；各記載した組み換えタンパク質の１０nMを共培養に添加した。ＣＤ８^＋ Ｔ細胞増殖をＦＡＣＳにより分析した。クローディン−６−ＴＣＲ^＋ ＣＤ８^＋ Ｔ細胞のＣＦＳＥ分析の代表的ヒストグラムプロットを(Ａ)に示す。細胞分裂を示すピークに基づく増殖の詳細な分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより行った。この方法で、“分裂細胞％”により示す分裂に入ったＴ細胞のパーセンテージおよび“増殖指数”により示す分裂に入った細胞の分裂の平均数を計算しており、両者をそれぞれ(Ｂ)および(Ｃ)に示す。全３つのＤｕｏｋｉｎｅの添加は、抗原特異的方法でのＣＤ８^＋ Ｔ細胞の増殖増加をもたらし、一方、２つの対応する単一ＴＮＦＲリガンドの添加は、増殖に影響を有さなかった。

活性化およびＴ細胞の増殖に至る、固定化受容体およびＰＢＭＣへのＤｕｏｋｉｎｅの同時結合を示す。２００ng／ウェル受容体−Ｆｃを、マイクロタイタープレートに一夜、４℃で固定化した。残存結合部位をＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＣＳで１時間遮断した。連続希釈したＤｕｏｋｉｎｅを固定化受容体と１時間インキュベートし、その後未結合タンパク質を洗い流した。１.５×１０^５ ＣＦＳＥ染色ヒトＰＢＭＣ(混合集団)を、一次準最適刺激としての架橋抗ヒトＣＤ３抗体の存在下(または非存在下)、マイクロタイタープレートに添加した。６日後、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞の増殖を、ＣＦＳＥ希釈によるフローサイトメトリーで評価した。

活性化およびＴ細胞の増殖に至る、固定化受容体およびＰＢＭＣへの一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅの同時結合を示す。２００ng／ウェル受容体−Ｆｃを、マイクロタイタープレートに一夜、４℃で固定化した。残存結合部位を、ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＣＳで１時間遮断した。連続希釈したｓｃＤｕｏｋｉｎｅを固定化受容体と１時間インキュベートし、その後未結合タンパク質を洗い流した。１.５×１０^５ ＣＦＳＥ染色ヒトＰＢＭＣ(混合集団)を、一次準最適刺激としての架橋抗ヒトＣＤ３抗体の存在下(または非存在下)、マイクロタイタープレートに添加した。６日後、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞の増殖を、ＣＦＳＥ希釈によるフローサイトメトリーで評価した。

ヒト血漿における選択Ｄｕｏｋｉｎｅおよび一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅの安定性を示す。精製Ｄｕｏｋｉｎｅおよび一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅの２００nM(機能的ＴＮＦリガンド単位)を、５０％ヒト血漿中調製した。サンプルを、調製後すぐ(０日)または３７℃で１日、３日および７日インキュベート後に−２０℃で凍結させた。インタクトなタンパク質のレベルを、ＥＬＩＳＡでＣ末端ホモ三量体リガンド単位の固定化受容体(１５０ng／ウェル)への結合およびＮ末端ＦＬＡＧタグの検出により決定した。希釈血漿サンプル中のタンパク質濃度を、精製タンパク質の標準曲線から内挿した。０日の検出融合タンパク質量を１００％と設定した。

ＣＤ１マウスにおける選択マウスｄｕｏｋｉｎｅおよび一本鎖ｄｕｏｋｉｎｅの薬物動態性質を示す。２５μgの精製タンパク質を、１５０μl総量で雌ＣＤ１マウス(１２〜１６週齢、３０〜３５ｇ、３マウス／構築物)の尾静脈に注射した。血液サンプルを注射後３分、３０分、１時間、２時間、６時間、１日および３日に採り、氷上で３０分インキュベートし、１３,０００ｇで３０分、４℃で遠心分離した。血清サンプルを−２０℃で保存した。融合タンパク質の血清レベルを、Ｃ末端リガンドに対応する固定化受容体(１５０ng／ウェル)への結合を経るＥＬＩＳＡおよびＮ末端ＦＬＡＧタグ検出により決定した。全タンパク質の血清濃度を、精製タンパク質の標準曲線からの内挿により得た。比較のために、３分での濃度を１００％と設定した。初期相および終末相半減期(ｔ_１／２α_{３−６０分}、ｔ_１／２β_{１−２４時間})およびＡＵＣをエクセルで計算した。

ヒトＰＢＭＣ上への受容体発現および一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅの免疫細胞亜集団への結合を示す。２.５×１０^５ ヒトＰＢＭＣ(混合集団)を、一次準最適刺激としての架橋抗ヒトＣＤ３抗体の存在下または非存在下、１０nM 一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅとインキュベートした。３日、３７℃の後、種々の亜集団をＣＤマーカー染色(抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ２０および抗ＣＤ５６)によるフローサイトメトリーで同定し、種々の亜集団への一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅの結合を、ＦＬＡＧタグ検出により評価した。さらに、刺激および非刺激ＰＢＭＣを、一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅを伴わずにもインキュベートし、亜集団を培養３日後に同定し、ＣＤ４０、ＣＤ２７、４−１ＢＢおよびＯＸ４０の表面発現を抗体染色により決定した。

シス作用性一本鎖ｄｕｏｋｉｎｅのヒト免疫細胞への結合およびＴ細胞増殖の誘発を示す。２.５×１０^５ ヒトＰＢＭＣ(混合集団)を、一次準最適刺激としての架橋抗ヒトＣＤ３抗体の存在下または非存在下、１０nM ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＣＤ２７Ｌとインキュベートした。３日、３７℃の後、種々の亜集団をＣＤマーカー染色(抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２０および抗ＣＤ５６)によるフローサイトメトリーで同定し、ＣＤ２７および４−１ＢＢの表面発現を抗体染色により決定し、一本鎖ｄｕｏｋｉｎｅの結合を、ＦＬＡＧタグ検出により評価した。１.５×１０^５ ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣ(混合集団、種々のＰＢＭＣバッチ)を、一次準最適刺激としての架橋抗ヒトＣＤ３抗体の存在下または非存在下、３０nM、３nM、０.３nMまたは０nM ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＣＤ２７Ｌとインキュベートした。６日後、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞の増殖は、ＣＦＳＥ希釈によるフローサイトメトリーで決定した。

トランス作用性一本鎖ｄｕｏｋｉｎｅのヒト免疫細胞への結合およびＴ細胞増殖の誘発を示す。２.５×１０^５ ヒトＰＢＭＣ(混合集団)を、一次準最適刺激としての架橋抗ヒトＣＤ３抗体の存在下または非存在下、１０nM ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＣＤ４０Ｌとインキュベートした。３日、３７℃の後、種々の亜集団をＣＤマーカー染色(抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２０および抗ＣＤ５６)によるフローサイトメトリーで同定し、ＣＤ４０および４−１ＢＢの表面発現を抗体染色により決定し、一本鎖ｄｕｏｋｉｎｅの結合を、ＦＬＡＧタグ検出により評価した。１.５×１０^５ ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣ(混合集団、種々のＰＢＭＣバッチ)を、一次準最適刺激としての架橋抗ヒトＣＤ３抗体の存在下または非存在下、３０nM、３nM、０.３nMまたは０nM ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＣＤ４０Ｌとインキュベートした。６日後、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖は、ＣＦＳＥ希釈によるフローサイトメトリーで決定した。

トランス作用性一本鎖ｄｕｏｋｉｎｅのヒト免疫細胞への結合およびＴ細胞増殖の誘発を示す。２.５×１０^５ ヒトＰＢＭＣ(混合集団)を、一次準最適刺激としての架橋抗ヒトＣＤ３抗体の存在下または非存在下、１０nM ｓｃＣＤ４０Ｌ−ｓｃＣＤ２７Ｌとインキュベートした。３日、３７℃の後、種々の亜集団をＣＤマーカー染色(抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２０および抗ＣＤ５６)によるフローサイトメトリーで同定し、ＣＤ４０およびＣＤ２７の表面発現を抗体染色により決定し、一本鎖ｄｕｏｋｉｎｅの結合を、ＦＬＡＧタグ検出により評価した。１.５×１０^５ ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣ(混合集団、種々のＰＢＭＣバッチ)を、一次準最適刺激としての架橋抗ヒトＣＤ３抗体の存在下または非存在下、３０nM、３nM、０.３nMまたは０nM ｓｃＣＤ４０Ｌ−ｓｃＣＤ２７Ｌとインキュベートした。６日後、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞の増殖は、ＣＦＳＥ希釈によるフローサイトメトリーで決定した。

発明の詳細な記載
本発明を下に詳細に記載するが、本発明は、方法、プロトコールおよび試薬が変わり得るために、ここに記載する特定のものに限定されないことは理解されるべきである。ここで使用する用語は、特定の態様を記載するのみの目的であり、本発明の範囲を限定する意図はなく、それは添付する特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に断らない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。

下記において、本発明の要素を記載する。これらの要素は具体的態様と共に列記されるが、これらは、さらなる態様を作るために、あらゆる方法でおよびあらゆる数で組み合わせてよいことは理解されるべきである。種々に記載する例および好ましい態様は、本発明を、明記した態様にのみ限定すると解釈すべきではない。この記載は、明記した態様と、任意の数の開示した、または好ましい要素を組み合わせた態様を支持し、含むと理解すべきである。さらに、本明細書における記載した全要素のあらゆる置換および組み合わせは、文脈に反しない限り、本明細書の記載により開示されたとみなされる。

好ましくは、ここで使用する用語は、“A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)に記載のとおりに定義される。

本発明の実施は、特に断らない限り、当分野の文献(例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989参照)に記載されている、化学、生化学、細胞生物学、免疫学および組み換えＤＮＡ技術の慣用法を用いる。

本明細書および添付する特許請求の範囲をとおして、文脈上別段の解釈が必要でない限り、用語“含む”および“含み”および”含んで”のようなその変形は、記載するメンバー、整数もしくは工程またはメンバー、整数もしくは工程の群の包含を含意するが、他のメンバー、整数もしくは工程またはメンバー、整数もしくは工程の群を除外するものではないが、ある態様においてこのような他のメンバー、整数もしくは工程またはメンバー、整数もしくは工程の群は除外され得る、すなわち対象物は、記載するメンバー、整数もしくは工程またはメンバー、整数もしくは工程の群にある。本発明を記載する文脈での単数表現(特に特許請求の範囲の文脈で)は、ここで特に断らない限りまたは文脈に明らかに反しない限り、単数および複数の両者を包含すると解釈される。ここでの値の範囲の引用は、単に、当該範囲内に入る各別個の値を個々に記載する省略表現であることを意図する。ここで特に断らない限り、各個々の値が、個々の値が本明細書に個々に記載されるかのように、本明細書に取り込まれる。ここに記載する全方法は、ここで特に断らない限りまたは文脈に明らかに反しない限り、任意の適当な順番で実施できる。ここに提供する任意かつ全ての例または例示的用語(例えば、“のような”)は、単に本発明のよりよい説明を意図するものであり、他に規定しない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書における用語は、本発明の実施に必須のあらゆる非請求要素を示すとして解釈すべきではない。

いくつかの文献が、本明細書の記載で引用される。ここで引用する文献(全ての特許、特許出願、科学的刊行物、製造者の明細、指示書など)の各々は、本明細書中の記載位置にかかわりなく、本明細書に、その全体を引用により包含させる。本明細書中のいかなるものも、本発明が、先行発明によって、そのような開示よりも先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。

用語“サイトカイン”は、一般に細胞シグナル伝達に重要であり、受容体を介して作用するタンパク質をいう。本発明において、本用語は、特にＴＮＦスーパーファミリーのリガンド、より具体的に可溶性活性ホモ三量体を形成するこれらのリガンドの細胞外ドメインをいう。

ここで使用する用語“ＴＮＦスーパーファミリーのリガンド”は、バリアントが機能的であるならば、より具体的にリガンドの受容体と結合できるホモ三量体を形成できる細胞外ドメインを有するならば、あるＴＮＦスーパーファミリーのリガンドのバリアントも含む。

本発明により、用語“ＴＮＦスーパーファミリーのリガンドのバリアント”は、特に、変異体、スプライスバリアント、配座、アイソフォーム、アレルバリアント、種バリアントおよび種ホモログ、特に天然に存在するものをいう。アレルバリアントは、遺伝子の正常配列における改変をいい、その意義はしばしば明確でない。完全遺伝子配列決定は、しばしば、ある遺伝子の多数のアレルバリアントを同定する。種ホモログは、ある核酸またはアミノ酸配列の起源と異なる種の核酸またはアミノ酸配列である。用語“ＴＮＦスーパーファミリーのリガンドのバリアント”は、あらゆる翻訳後修飾バリアントおよび配座バリアントを含む。

本発明により、ＴＮＦスーパーファミリーの第一リガンドおよび第二リガンドは、好ましくはＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＥＤＡ−Ａ１、ＥＤＡ−Ａ２、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴ−アルファ、ＴＬ１Ａ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬおよびＴＷＥＡＫからなる群から、より好ましくはＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、４−１ＢＢＬおよびＯＸ４０Ｌからなる群から選択される。

ＣＤ４０リガンド(ＣＤ４０Ｌ)はまたＣＤ１５４、ＴＮＦＳＦ５、ＴＲＡＰまたはｇｐ３９としても知られ、ＴＮＦスーパーファミリーに属するII型膜貫通糖タンパク質である。ある態様において、ここで使用する用語ＣＤ４０ＬはヒトＣＤ４０Ｌをいう。ヒトＣＤ４０ＬのＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号はＰ２９９６５である。ある態様において、ＣＤ４０Ｌは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。

ＣＤ２７リガンド(ＣＤ２７Ｌ)はＣＤ７０またはＴＮＦＳＦ７としても知られ、ＴＮＦスーパーファミリーに属するII型膜貫通糖タンパク質である。ある態様において、ここで使用する用語ＣＤ２７Ｌは、ヒトＣＤ２７Ｌをいう。ヒトＣＤ２７ＬのＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号はＰ３２９７０である。ある態様において、ＣＤ２７Ｌは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。

４−１ＢＢリガンド(４−１ＢＢＬ)は、ＴＮＦスーパーファミリーに属するII型膜貫通糖タンパク質であり、ＴＮＦＳＦ９とも称される。ある態様において、ここで使用する用語４−１ＢＢＬは、ヒト４−１ＢＢＬをいう。ヒト４−１ＢＢＬのＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号は、Ｐ４１２７３である。ある態様において、４−１ＢＢＬは、配列番号３のアミノ酸配列を有する。

ｇｐ３４またはＴＮＦＳＦ４としても知られるＯＸ４０リガンド(ＯＸ４０Ｌ)は、ＴＮＦスーパーファミリーに属するII型膜貫通糖タンパク質である。ある態様において、ここで使用する用語ＯＸ４０Ｌは、ヒトＯＸ４０Ｌをいう。ヒトＯＸ４０ＬのＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号は、Ｐ２３５１０である。ある態様において、ＯＸ４０Ｌは、配列番号４のアミノ酸配列を有する。

ＴＡＬＬ−２、ＴＲＤＬ−１またはＴＮＦＳＦ１３としても知られる増殖誘発リガンド(ＡＰＲＩＬ)は、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであるII型膜貫通タンパク質である。ある態様において、ここで使用する用語ＡＰＲＩＬは、ヒトＡＰＲＩＬをいう。ヒトＡＰＲＩＬのＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号は、Ｏ７５８８８である。

ＴＮＦＳＦ８としても知られるＣＤ３０リガンド(ＣＤ３０Ｌ)は、ＴＮＦスーパーファミリーに属するII型膜タンパク質である。ある態様において、ここで使用する用語ＣＤ３０Ｌは、ヒトＣＤ３０Ｌをいう。ヒトＣＤ３０ＬのＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号は、Ｐ３２９７１である。

エクトジスプラシン−Ａ１(ＥＤＡ−Ａ１)は、ＴＮＦスーパーファミリーに属するII型膜貫通タンパク質である。エクトジスプラシン−Ａ(ＥＤＡ)のスプライスバリアントである。ある態様において、ここで使用する用語ＥＤＡ−Ａ１は、ヒトＥＤＡ−Ａ１である。ヒトＥＤＡ−Ａ１のＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号は、Ｑ９２８３８−１である。

エクトジスプラシン−Ａ２(ＥＤＡ−Ａ２)は、ＴＮＦスーパーファミリーに属するII型膜貫通タンパク質である。エクトジスプラシン−Ａ(ＥＤＡ)のスプライスバリアントでる。ある態様において、ここで使用する用語ＥＤＡ−Ａ２は、ヒトＥＤＡ−Ａ２をいう。ヒトＥＤＡ−Ａ２のＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号は、Ｑ９２８３８−３である。

Ｆａｓリガンド(ＦａｓＬ)はＣＤ９５ＬまたはＴＮＦＳＦ６としても知られ、ＴＮＦスーパーファミリーに属するII型膜貫通タンパク質である。ある態様において、ここで使用する用語ＦａｓＬは、ヒトＦａｓＬをいう。ヒトＦａｓＬのＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号は、Ｐ４８０２３である。

ＧＩＴＲリガンド(ＧＩＴＲＬ)は、ＴＮＦスーパーファミリーに属するII型膜貫通タンパク質であり、ＴＮＦＳＦ１８と呼ばれている。ある態様において、ここで使用する用語ＧＩＴＲＬは、ヒトＧＩＴＲＬをいう。ヒトＧＩＴＲＬのＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号は、Ｑ９ＵＮＧ２である。

ＬＩＧＨＴはＨＶＥＭＬまたはＴＮＦＳＦ１４としても知られ、ＴＮＦスーパーファミリーに属するII型膜貫通タンパク質である。ある態様において、ここで使用する用語ＬＩＧＨＴは、ヒトＬＩＧＨＴをいう。ヒトＬＩＧＨＴのＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号は、Ｏ４３５５７である。

リンフォトキシン−アルファ(ＬＴ−アルファ)はＴＮＦ−ベータまたはＴＮＦＳＦ１としても知られ、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーである。ある態様において、ここで使用する用語ＬＴ−アルファは、ヒトＬＴ−アルファをいう。ヒトＬＴ−アルファのＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号は、Ｐ０１３７４である。

ＴＬ１Ａは、ＴＮＦスーパーファミリーに属するII型膜貫通タンパク質であり、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー１５(ＴＮＦＳＦ１５)と称される。ある態様において、ここで使用する用語ＴＬ１Ａは、ヒトＴＬ１Ａをいう。ヒトＴＬ１ＡのＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号は、Ｏ９５１５０−１である。

腫瘍壊死因子アルファ(ＴＮＦ−アルファ)は、カケクチンまたはＴＮＦＳＦ２としても知られ、ＴＮＦスーパーファミリーに属するII型膜貫通タンパク質である。ある態様において、ここで使用する用語ＴＮＦ−アルファは、ヒトＴＮＦ−アルファをいう。ヒトＴＮＦ−アルファのＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号は、Ｐ０１３７５である。

ＴＮＦ関連アポトーシス誘発リガンド(ＴＲＡＩＬ)は、Ａｐｏ−２リガンドまたはＴＮＦＳＦ１０としても知られ、ＴＮＦスーパーファミリーに属するII型膜貫通タンパク質である。ある態様において、ここで使用する用語ＴＲＡＩＬは、ヒトＴＲＡＩＬをいう。ヒトＴＲＡＩＬのＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号は、Ｐ５０５９１である。

ＮＦ−ｋＢの受容体アクティベーター(ＲＡＮＫ)リガンド(ＲＡＮＫＬ)は、ＴＲＡＮＣＥ、ＯＤＦ、ＯＰＧＬまたはＴＮＦＳＦ１１とも呼ばれ、ＴＮＦスーパーファミリーに属するII型膜貫通タンパク質である。ある態様において、ここで使用する用語ＲＡＮＫＬは、ヒトＲＡＮＫＬをいう。ヒトＲＡＮＫＬのＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号は、Ｏ１４７８８である。

ＴＷＥＡＫは、ＴＮＦスーパーファミリーに属するII型膜貫通タンパク質であり、ＡＰＯ３リガンドまたはＴＮＦＳＦ１２とも呼ばれる。ある態様において、ここで使用する用語ＴＷＥＡＫは、ヒトＴＷＥＡＫをいう。ヒトＴＷＥＡＫのＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号は、Ｏ４３５０８である。

ある態様において、第一リガンドの受容体および第二リガンドの受容体は、同じ細胞に位置し(“シス”)、ここで、好ましくは、第一リガンドおよび第二リガンドはＣＤ２７Ｌ、４−１ＢＢＬおよびＯＸ４０Ｌからなる群から選択される。ある態様において、該細胞はＴ細胞、好ましくはＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋ Ｔ細胞である。ある態様において、該Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞である。

他の態様において、第一リガンドの受容体および第二リガンドの受容体は、異なる細胞に位置する(“トランス”)。該異なる細胞は、同じタイプでも異なるタイプでもよい。ある態様において、該異なる細胞は、樹状細胞およびＴ細胞のような抗原提示細胞(ＡＰＣ)である。他の態様において、該異なる細胞は、Ｂ細胞およびＴ細胞である。ある態様において、第一リガンドまたは第二リガンドはＣＤ４０Ｌであり、各他のリガンドはＣＤ２７Ｌ、４−１ＢＢＬおよびＯＸ４０Ｌからなる群から選択される。ある態様において、該Ｔ細胞はＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋ Ｔ細胞である。ある態様において、該Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞である。

ある態様において、サイトカイン融合タンパク質は、第一リガンドの受容体および／または第二リガンドの受容体を活性化する。ある態様において、サイトカイン融合タンパク質は、同じ細胞に位置する第一リガンドの受容体および第二リガンドの受容体を同時に活性化する、シス活性化サイトカイン融合タンパク質である。他の態様において、サイトカイン融合タンパク質は、異なる細胞に位置する第一リガンドの受容体および第二リガンドの受容体を同時に活性化する、トランス活性化サイトカイン融合タンパク質である。ある態様において、サイトカイン融合タンパク質は、第一リガンドおよび／または第二リガンドの受容体を発現する細胞におけるＮＦ−カッパＢ経路を誘発するおよび／またはそこからのＩＬ−８遊離を誘発する。

ある態様において、サイトカイン融合タンパク質は、Ｔ細胞を活性化するおよび／またはＴ細胞の増殖を誘発する。ある態様において、サイトカイン融合タンパク質は、抗原特異的Ｔ細胞の増殖を誘発する。ある態様において、該Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋ Ｔ細胞である。ある態様において、該Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞である。

ここで使用する用語“細胞外ドメイン”は、ＴＮＦ相同ドメイン(ＴＨＤ)を含む、ＴＮＦスーパーファミリーのリガンドの細胞外Ｃ末端部分をいう。細胞外ドメインは、リガンドの受容体に結合できる(ホモ)三量体を形成する能力により特徴付けられ、“受容体結合ドメイン”とも呼ばれる。

本発明により使用できる細胞外ドメインの“フラグメントまたはバリアント”は、リガンドの受容体と結合できる(ホモ)三量体を形成する能力を有する、細胞外ドメインの機能的フラグメントまたはバリアントである。それゆえに、適当なフラグメントまたはバリアントは、少なくとも一つの機能的ＴＮＦ相同ドメイン(ＴＨＤ)を含む。

用語“部分”または“フラグメント”は、ここでは相互交換可能に使用し、連続的要素をいう。例えば、アミノ酸配列またはタンパク質のような構造の部分は、該構造の連続的要素をいう。タンパク質配列の部分またはフラグメントは、好ましくは、タンパク質配列の少なくとも６、特に少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０または少なくとも２００連続アミノ酸の配列を含む。

本発明の目的で、アミノ酸配列の“バリアント”は、アミノ酸挿入バリアント、アミノ酸付加バリアント、アミノ酸欠失バリアントおよび／またはアミノ酸置換バリアントを含む。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失バリアントは、Ｎ末端および／またはＣ末端短縮化バリアントとも呼ばれる。

アミノ酸挿入バリアントは、特定のアミノ酸配列に１個または２個またはそれを超えるアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列バリアントの場合、１以上のアミノ酸残基が、アミノ酸配列における特定の部位に挿入されるが、得られた産物の適切なスクリーニングを伴う無作為挿入も可能である。

アミノ酸付加バリアントは、１、２、３、５、１０、２０、３０、５０以上のアミノ酸のような１以上のアミノ酸のアミノおよび／またはカルボキシ末端融合を含む。

アミノ酸欠失バリアントは、１、２、３、５、１０、２０、３０、５０以上のアミノ酸のような、１以上のアミノ酸の配列の除去により特徴付けられる。欠失は、タンパク質の任意の位置であり得る。

アミノ酸置換バリアントは、配列中の少なくとも１残基が除去され、他の残基がその場所に挿入されることにより特徴付けられる。相同タンパク質またはペプチドで保存されていないアミノ酸配列および／または類似の性質を有するものへアミノ酸を置換する修飾が優先される。好ましくは、タンパク質バリアントにおけるアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸の、同じアミノ酸ファミリーの他のもの、すなわち、(例えば、電荷および／またはサイズの観点で)側鎖が関連しているアミノ酸への置換を含む。天然に存在するアミノ酸は、一般に４ファミリーに分けられる：酸性(アスパラギン酸、グルタミン酸)、塩基性(リシン、アルギニン、ヒスチジン)、非極性(アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)および非荷電極性(グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン)アミノ酸。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、まとめて芳香族アミノ酸と分類されることもある。

好ましくは、あるアミノ酸配列と当該アミノ酸配列のバリアントであるアミノ酸配列の間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。類似性または同一性の程度は、好ましくは対照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％であるアミノ酸領域について示す。例えば、対照アミノ酸配列が２００アミノ酸からなるならば、類似性または同一性の程度は、好ましくは少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０または約２００アミノ酸、好ましくは連続アミノ酸について示す。好ましい態様において、類似性または同一性の程度は、対照アミノ酸配列の全長について示す。配列類似性、好ましくは配列同一性決定のためのアラインメントは、既知ツールを使用して、好ましくは最良配列アラインメントを使用して、例えば、Ａｌｉｇｎを使用して、標準設定を使用して、好ましくはEMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5で実施できる。

“配列類似性”は、同一であるか保存的アミノ酸置換を示すアミノ酸のパーセンテージを示す。２アミノ酸配列間の“配列同一性”は、配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。

用語“同一性パーセンテージ”は、最良アラインメントで得られた、比較する２配列間で同一であるアミノ酸残基のパーセンテージを意味することを意図し、このパーセンテージは純粋に統計的であり、２配列間の差異は、無作為にその全長にわたり分散している。２アミノ酸配列間の配列比較は、これらを最適にアラインした後に配列の比較により実施し、該比較は、局所領域の配列類似性の同定および比較のために、セグメントまたは“比較のウインドウ”により実施する。比較のための配列の最適アラインメントは、マニュアル以外に、Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482の局所相同アルゴリズムの手段により、Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443による局所相同アルゴリズムの手段により、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444の類似性サーチ法またこれらのアルゴリズムを使用するコンピューター法(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ ＮおよびＴＦＡＳＴＡ)の手段により、作成し得る。

同一性パーセンテージは、比較する２配列間の同一の位置の数を決定し、この数を、比較する位置の総数で除し、これら２配列間の同一性パーセンテージを得るために、得られた結果を１００倍して計算する。

用語“融合タンパク質”は、一般に、好ましくは頭−尾(すなわち、Ｎ末端とＣ末端またはその逆)で、２以上の異なる(ポリ)ペプチドまたはタンパク質を結合させることにより創成したタンパク質をいい、元のタンパク質の各々由来の機能的性質を備えた単一タンパク質をもたらす。本発明により、用語“サイトカイン融合タンパク質”はまた、ここでは、“サブユニット”と称する、異なる融合タンパク質の多量体、例えば、二量体または三量体、複合体を含む。好ましくは、サブユニットは、非共有結合によりまたは共有結合により(例えば、ジスルィド結合を経て)結合して、サイトカイン融合タンパク質を形成する。

本発明の好ましいサブユニットは、ここで定義する一般式
を有し、ここで、好ましくは、これらのサブユニットの３個が、第一リガンドの細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントおよび第二リガンドの細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントを経て非共有結合により結合し、サイトカイン融合タンパク質を形成する。

本発明による他の好ましいサブユニットは、ここ定義する一般式
を有し、ここで、Ｌはさらに多量体化ドメイン、好ましくは二量体化ドメインを含み、多量体、好ましくは二量体、サイトカイン融合タンパク質の形成を可能にする。

ここで使用する用語“ブロック”は、ＴＮＦスーパーファミリーのリガンドの３個の共有結合により結合した細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントを含む、分子単位／エンティティをいう。ある態様において、ブロックは、一般式Ａ−Ｌ_Ａ−Ａ−Ｌ_Ａ−ＡまたはＢ−Ｌ_Ｂ−Ｂ−Ｌ_Ｂ−Ｂを有し、ここで、Ａ、Ｂ、Ｌ_ＡおよびＬ_Ｂは、ここに定義したとおりである。ある態様において、ブロックは、配列番号９〜１２のいずれか一つのアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。

ここで使用する用語“共有結合により結合”は、共有結合またはペプチドリンカーのような共有結合リンカー分子を経る結合をいう。

ここで使用する用語“ペプチドリンカー”は、タンパク質部分構造、例えば、ＴＮＦスーパーファミリーのリガンドの細胞外ドメインまたはそのブロックまたはこれら細胞外ドメインから形成されるホモ三量体の接続／結合に適合するペプチドをいう。本発明のペプチドリンカーは如何なる長さであってもよく、すなわち、如何なる数のアミノ酸残基を含んでもよい。しかしながら、好ましくは、例えば、立体障害により、接続／結合した部分構造が互いに活性 − 例えば、ＴＮＦスーパーファミリーのリガンドの細胞外ドメインが、リガンドの受容体に結合できるホモ三量体を形成する能力および／または２つの異なるホモ三量体が同じ細胞(“シス”)または異なる細胞(“トランス”)上の２つの異なる受容体に結合する能力 − を妨害することを妨げる適度な可動性を提供し、かつ適切なタンパク質折り畳みを可能にするために十分長く；さらに、好ましくは細胞に安定性(例えば、タンパク分解に対する安定性)を提供するのに十分短い。

好ましい態様において、ペプチドリンカーは、１〜３０アミノ酸長を有する。それゆえに、本発明により、ペプチドリンカーは、単一アミノ酸残基からなり得る。好ましくは、長ペプチドリンカーは、第一リガンドの細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントと、第二リガンドの細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアント、例えば、第一ホモ三量体と第二ホモ三量体または第一ブロックと第二ブロックを結合するのに使用し、一方、一般に、短ペプチドリンカーは、それぞれ第一または第二リガンドの２細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアント、すなわち同じリガンドの２細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントの結合に使用する。リガンド４−１ＢＢＬの場合、好ましくは長ペプチドリンカーを、その細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントの二つの結合に使用する。短ペプチドリンカーは、１２または１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１のようにそれより少ないアミノ酸、好ましくは、１〜７アミノ酸からなり得る。長ペプチドリンカーは、１２または１２〜３０または１２〜２５または１２〜２０のようにそれより多いアミノ酸からなり得る。

ペプチドリンカーのアミノ酸は、全ての天然に存在するまたは存在しないアミノ酸から選択でき、ここで、アミノ酸グリシン(Ｇｌｙ、Ｇ)、セリン(Ｓｅｒ、Ｓ)およびスレオニン(Ｔｈｒ、Ｔ)が好ましい。ある態様において、ペプチドリンカーはグリシン−セリン−スレオニン富リンカーまたはグリシン−セリン富リンカーであり、ここで、アミノ酸の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％が、それぞれグリシンまたはセリンまたはスレオニン残基またはグリシンまたはセリン残基である。他の態様において、アミノ酸は、グリシン、セリンおよびスレオニンから選択され、すなわち、ペプチドリンカーは、排他的にグリシン、セリンおよびスレオニン残基からなる(グリシン−セリン−スレオニンリンカーと称する)。さらに他の態様において、ペプチドリンカーは、排他的にグリシンおよびセリン残基からなる(グリシン−セリンリンカーと称する)。

本発明による好ましいペプチドリンカーは一般式(ＧＧＧＧＸ)_ｎ(ここで、Ｘは、各々、ＳおよびＴから独立して選択され、ｎは１〜６、好ましくは１〜５から選択される整数である)；またはＧＸＧ、ＧＧＸＧＧおよびＧＧＧＸＧＧＧからなる群から選択される一般式(ここで、ＸはＳまたはＴである)を有する。

好ましい短ペプチドリンカーは、ＧＸＧ、ＧＧＸＧＧ、ＧＧＧＸＧＧＧおよびＧＧＧＧＸＧＧＧＧからなる群から選択される一般式を有し、ここで、ＸはＳまたはＴ、好ましくはＳである。特に好ましい短ペプチドリンカーはＧＧＧＸＧＧＧであり、ここで、ＸはＳまたはＴ、好ましくはＳである。

好ましい長ペプチドリンカーは、一般式(ＧＧＧＧＸ)_ｎを有し、ここで、Ｘは、各々、ＳおよびＴから独立して選択され、ｎは３〜６、好ましくは３〜５、より好ましくは３および４から選択される整数である。特に好ましい長ペプチドリンカーは、(ＧＧＧＧＳ)_３(配列番号１９)、ＧＧＧＧＳＧＧＧＴＧＧＧＧＳ(配列番号２０)および(ＧＧＧＧＳ)_４(配列番号２１)からなる群から選択される。

好ましくは、サイトカイン融合タンパク質がここに定義する式Ｉの一般式を有する分子／構造を含む場合、
Ｌはここに定義する長ペプチドリンカーを含むおよび／または
Ｌ_ＡおよびＬ_Ｂは、各々、共有結合(例えば、ペプチド結合)、ここに定義する短ペプチドリンカーおよびここに定義する長ペプチドリンカーから独立して選択される。

好ましくは、ＡまたはＢが４−１ＢＢＬの細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントを含む場合、Ｌ_ＡまたはＬ_Ｂは、各々、ここに定義する長ペプチドリンカーから独立して選択される。好ましくは、ＡもＢも４−１ＢＢＬの細胞外ドメインまたはそのフラグメントもしくはバリアントを含まないとき、Ｌ_ＡおよびＬ_Ｂは、各々、共有結合(例えば、ペプチド結合)およびここに定義する短ペプチドリンカーから独立して選択される。

本発明により、Ｌ_ＡおよびＬ_Ｂは、同一でも異なってもよい。

本発明により、サイトカイン融合タンパク質がここに定義する式Ｉの一般式を有する分子／構造を含む場合、
Ｌは、さらにサイトカイン融合タンパク質の多量体化を可能とする多量体化ドメインを含み得る。

このような場合、Ｌは、多量体化ドメインが挿入されている、ここに定義するペプチドリンカーを含み得る。代替的態様において、Ｌは、多量体化ドメインを挟む、２個のここに定義するペプチドリンカーを含んでよく、ここで、２個のペプチドリンカーは同一でも異なってもよい。ある態様において、２個のペプチドリンカーは、ここに定義する短ペプチドリンカーから選択される。さらに他の態様において、多量体化ドメインは、Ｌに含まれるペプチドリンカーを表す。

多量体化は、複数の(例えば、２、３または４、好ましくは２または３、より好ましくは２)多量体化ドメイン間の非共有結合による相互作用および／または共有結合による相互作用、特に１以上のジスルィド結合を経て起こり得る。

適当な多量体化ドメインは当業者に知られ、例えば、テネイシン三量体化モチーフ、コレクチン三量体化ドメインおよびストレプトアビジンのような三量体化ドメインおよびＩｇＥ重鎖ドメイン２(ＥＨＤ２)、ＩｇＭ重鎖ドメイン２(ＭＨＤ２)、ＩｇＧ重鎖ドメイン３(ＧＨＤ３)、ＩｇＡ重鎖ドメイン３(ＡＨＤ２)、ＩｇＤ重鎖ドメイン３(ＤＨＤ３)、ＩｇＥ重鎖ドメイン４(ＥＨＤ４)、ＩｇＭ重鎖ドメイン４(ＭＨＤ４)、Ｆｃドメインおよびウテログロビン二量体化ドメインのような二量体化ドメインを含む。ある態様において、二量体化ドメインは、例えば、ＷＯ２０１３／１５６１４８Ａ１号に記載の、ＥＨＤ２ドメインまたはＭＨＤ２ドメインである。ある態様において、二量体化ドメインは、好ましくは、配列番号２３のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる、ヒトＥＨＤ２ドメインである。また包含されるのは、前記のいずれかの機能的バリアントドメイン、例えば、半減期を延長するおよび／または効力を増加させるために修飾されている、ドメインである。適当な修飾は当業者に知られ、例えば、Zalevsky, J. et al. (2010), Nature Biotechnology, 28(2):157-9に記載のように、ＦｃＲｎに対する親和性を高めるＦｃドメインの修飾を含むが、これに限定されない(例えば、Ｎ４３４Ｓ、Ｖ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳおよびＶ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ／Ｍ４２８Ｌ)。

サイトカイン融合タンパク質が、ここに定義する式IIの一般式を有する分子／構造(または少なくとも１、好ましくは３、サブユニット)を含むとき、
Ｌは、好ましくはここに定義する長ペプチドリンカーを含む。

ここに記載するペプチドリンカーを、適当な長さの非ペプチド性分子、例えば、非ペプチド性オリゴマーおよびポリマーに置き換え得る。このような等価な態様は、本発明に明示的に包含させる。

好ましくは、本発明のサイトカイン融合タンパク質において、
− 第一リガンドはＣＤ４０Ｌであり、第二リガンドはＣＤ２７Ｌである；
− 第一リガンドはＣＤ２７Ｌであり、第二リガンドはＣＤ４０Ｌである；
− 第一リガンドはＣＤ４０Ｌであり、第二リガンドは４−１ＢＢＬである；
− 第一リガンドは４−１ＢＢＬであり、第二リガンドはＣＤ４０Ｌである；
− 第一リガンドはＣＤ２７Ｌであり、第二リガンドは４−１ＢＢＬである；
− 第一リガンドは４−１ＢＢＬであり、第二リガンドはＣＤ２７Ｌである；
− 第一リガンドはＣＤ４０Ｌであり、第二リガンドはＯＸ４０Ｌである；
− 第一リガンドはＯＸ４０Ｌであり、第二リガンドはＣＤ４０Ｌである；
− 第一リガンドはＣＤ２７Ｌであり、第二リガンドはＯＸ４０Ｌである；
− 第一リガンドはＯＸ４０Ｌであり、第二リガンドはＣＤ２７Ｌである；
− 第一リガンドはＯＸ４０Ｌであり、第二リガンドは４−１ＢＢＬである；または
− 第一リガンドは４−１ＢＢＬであり、第二リガンドはＯＸ４０Ｌである。

ある態様において、サイトカイン融合タンパク質は、ここに定義する式IIの一般式を有する分子／構造(または少なくとも１、好ましくは３、サブユニット)を含み、ここで、第二リガンド、すなわち、Ｃ末端リガンドはＣＤ４０Ｌである。

“サイトカイン融合タンパク質の検出および／または単離を可能にする標識またはタグ”は、このような目的について当分野で知られるあらゆる標識／タグを含むことを意図する。特に好ましいのは、キチン結合タンパク質(ＣＢＰ)、マルトース結合タンパク質(ＭＢＰ)、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)およびポリ(Ｈｉｓ)(例えば、Ｈｉｓ_６)のような親和性タグ；チオレドキシン(ＴＲＸ)およびポリ(ＮＡＮＰ)のような可溶化タグ；ＦＬＡＧタグのようなクロマトグラフィータグ；Ｖ５タグ、ｍｙｃタグおよびＨＡタグのようなエピトープタグ；および蛍光タンパク質(例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰなど)、蛍光色素およびルシフェラーゼのような蛍光または発光標識またはタグである。ある態様において、標識／タグはＦＬＡＧタグである。

(ポリ)ペプチド標識またはタグのアミノ酸配列は、サイトカイン融合タンパク質のアミノ酸配列の任意の場所に挿入でき、例えば、コード化タンパク質構造内でループの形をとり得る(例えば、標識／タグが機能を妨害しない限り、ここに記載するペプチドリンカー内または第一および第二リガンドの細胞外ドメイン内)またはＮ末端またはＣ末端に融合し得る。標識またはタグは、標識またはタグのサイトカイン融合タンパク質からの除去を可能にする開裂部位をさらに含み得る。同様に、非ペプチド性標識またはタグ、例えば、蛍光色素を、サイトカイン融合タンパク質に任意の適当な場所でコンジュゲートさせ得る。

本発明のサイトカイン融合タンパク質はまた、Ｎ末端分泌シグナルのような、分子の分泌を促進するアミノ酸配列も含み得る。好ましくは、分泌シグナルは、分泌経路を十分に通過させるおよび／または細胞外環境への分泌を可能にするシグナル配列である。好ましくは、分泌シグナル配列は開裂可能であり、成熟サイトカイン融合タンパク質から除去される。分泌シグナル配列は、好ましくはサイトカイン融合タンパク質が産生される細胞または生物に関して選択される。ある態様において、分泌シグナル配列は、配列番号１５または配列番号２２のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。

本発明のサイトカイン融合タンパク質は、例えば、特異的細胞型への選択性増強に作用する結合ドメインをさらに含み得る。これは、例えば、該細胞型の表面に発現される特異的抗原と結合する結合ドメインの提供により達成できる。

本発明のサイトカイン融合タンパク質は、さらにサイトカイン融合タンパク質の安定性を高める１以上の修飾を含み得る。サイトカイン融合タンパク質の“安定性”なる用語は、例えば、インビボでの、サイトカイン融合タンパク質の“半減期”に関する。“半減期”は、分子の活性、量または数の半分が排除されるのに必要な時間に関する。

サイトカイン融合タンパク質は、例えば、半減期延長モジュールにコンジュゲートさせ得る。このようなモジュールは当業者に知られ、例えば、アルブミン、アルブミン結合ドメイン、免疫グロブリン結合ドメイン、ＦｃＲｎ結合モチーフ、および、特に、ポリマーを含む。特に好ましいポリマーは、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ヒドロキシエチルデンプン(ＨＥＳ)、ポリシアル酸およびＰＥＧ模倣ペプチド配列を含む。

本発明における用語“結合”は、好ましくは特異的結合に関する。本発明のサイトカイン融合タンパク質のような結合剤は、予定された標的に結合できるが、他の標的に結合できないならば、該予定された標的に特異的である。

“核酸分子”は、本発明においては、好ましくはデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)またはリボ核酸(ＲＮＡ)、より好ましくはＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)、最も好ましくはインビトロ転写ＲＮＡ(ＩＶＴ ＲＮＡ)または合成ＲＮＡである。核酸分子は、本発明により、一本鎖または二本鎖であり、直鎖状であるか、または共有結合により閉環して環を形成している。

本発明において、用語“ＤＮＡ”は、デオキシリボヌクレオチド残基を含み、好ましくは完全にまたは実質的にデオキシリボヌクレオチド残基からなる、分子である。“デオキシリボヌクレオチド”は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２’位のヒドロキシル基を欠くヌクレオチドである。用語“ＤＮＡ”は、部分的にまたは完全に精製されたＤＮＡ、本質的に純粋なＤＮＡ、合成ＤＮＡおよび組み換えにより産生されたＤＮＡのような単離ＤＮＡを含み、１以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変により天然に存在するＤＮＡと異なる修飾ＤＮＡを含む。このような改変は、ＤＮＡの末端または内部に、例えばＤＮＡの１以上のヌクレオチドへの非ヌクレオチド物質の付加を含んでよい。ＤＮＡ分子におけるヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学合成ヌクレオチドのような、非標準的ヌクレオチドも含み得る。これらの改変ＤＮＡは、アナログまたは天然に存在するＤＮＡのアナログと指称され得る。

本発明において、用語“ＲＮＡ”は、リボヌクレオチド残基を含み、好ましくは完全にまたは実質的にリボヌクレオチド残基からなる分子をいう。“リボヌクレオチド”は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２’位のヒドロキシル基を有するヌクレオチドをいう。用語“ＲＮＡ”は、部分的にまたは完全に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡおよび組み換えにより産生されたＲＮＡのような単離ＲＮＡを含み、天然に存在するＲＮＡと１以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変により異なる修飾ＲＮＡを含む。このような改変は、ＲＮＡの末端または内部に例えばＲＮＡの１以上のヌクレオチドへの非ヌクレオチド物質の付加を含んでよい。ＲＮＡ分子におけるヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学合成ヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのような、非標準的ヌクレオチドを含むこともできる。これらの改変ＲＮＡは、アナログまたは天然ＲＮＡのアナログと指称され得る。本発明おいて、“ＲＮＡ”は、一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡをいう。

本発明において、用語“メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)”は、ＤＮＡ鋳型を使用して産生され、ペプチドまたはタンパク質をコード化し得る、“トランスクリプト”に関する。一般に、ｍＲＮＡは、５’非翻訳領域、タンパク質コード領域および３’非翻訳領域を含む。本発明において、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写により産生され得る。インビトロ転写方法は当業者に知られている。例えば、多種類のインビトロ転写キットが市販されている。

本発明により、ＲＮＡは、修飾され得る。例えば、ＲＮＡは、ＲＮＡに安定化効果を有する１以上の修飾により安定化され得る。

本発明によるＲＮＡに係る用語“修飾”は、該ＲＮＡについての天然に存在しないあらゆる修飾を含む。

本発明のある態様において、本発明により使用されるＲＮＡは、キャップのない５’−三リン酸を含まない。このようなキャップのない５’−三リン酸の除去は、ＲＮＡをホスファターゼで処理することにより達成できる。

本発明のＲＮＡは、安定性増加および／または細胞毒性低減および／または免疫賦活能調節のために、天然に存在するまたは天然に存在しない(合成)リボヌクレオチドが修飾されていてよい。例えば、ある態様において、本発明により使用されるＲＮＡにおいて、ウリジンが、部分的にまたは完全に、好ましくは完全に、シュードウリジンに置換される。

ある態様において、用語“修飾”は、５’キャップまたは５’キャップアナログを備えたＲＮＡの提供に関する。用語“５’キャップ”は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に見られるキャップ構造をいい、一般に異常５’から５’三リン酸結合を経てｍＲＮＡに接続されるグアノシンヌクレオチドからなる。ある態様において、このグアノシンは、７位でメチル化される。用語“慣用の５’キャップ”は、天然に存在するＲＮＡ ５’キャップ、好ましくは７−メチルグアノシンキャップ(ｍ^７Ｇ)をいう。本発明において、用語“５’キャップ”は、ＲＮＡキャップ構造を模倣し、好ましくはインビボでおよび／または細胞で、結合したときＲＮＡを安定化する能力を有するように修飾された、５’キャップアナログを含む。５’キャップまたは５’キャップアナログを有するＲＮＡの提供は、該５’キャップまたは５’キャップアナログ存在下でのＤＮＡテンプレートのインビトロ転写により達成でき、ここで該５’キャップは、産生された該ＲＮＡ鎖に共転写的に取り込まれるかまたはＲＮＡを、例えば、インビトロ転写により産生し、５’キャップを、キャッピング酵素、例えば、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して、転写後的に産生し得る。

ＲＮＡは、さらなる修飾を含み得る。例えば、本発明において使用するｍＲＮＡの修飾は、天然に存在するポリ(Ａ)テイルの伸長または短縮化であり得る。

ＲＮＡの“安定性”なる用語は、ＲＮＡの“半減期”に関する。“半減期”は、分子の活性、量または数の半分の排除に必要な時間に関する。本発明において、ＲＮＡの半減期は、該ＲＮＡの安定性の指標である。

本発明において、ＲＮＡの安定性の低減が望ましいならば、ＲＮＡの安定性を増加させる、上記要素の機能を妨害するようにＲＮＡを修飾することも可能である。

本発明により、ＲＮＡは化学合成または適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写により得ることができる。本発明において、用語“転写”はＤＮＡ配列の遺伝コードがＲＮＡに転写される過程に関する。続いて、ＲＮＡはタンパク質に翻訳され得る。本発明において、用語“転写”は“インビトロ転写”を含み、ここで、用語“インビトロ転写”は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが、好ましくは適切な細胞抽出物を使用して、無細胞系でインビトロ合成される過程に関する。好ましくは、クローニングベクターが、トランスクリプトの産生に適用される。これらのクローニングベクターは、一般に転写ベクターと呼ばれ、本発明においては用語“ベクター”に含まれる。転写制御用プロモーターは、あらゆるＲＮＡポリメラーゼのための、あらゆるプロモーターであり得る。ＲＮＡポリメラーゼの具体例は、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである。インビトロ転写のためのＤＮＡテンプレートは、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに挿入することにより得ることができる。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写により得ることができる。好ましくは、クローニングベクターは、一般に転写ベクターと呼ばれる、トランスクリプトの産生に使用する。

本発明による用語“翻訳”は、メッセンジャーＲＮＡの鎖が、ペプチドまたはタンパク質を形成するためのアミノ酸配列の集合を指示する、細胞のリボソームにおける過程に関する。

本発明による用語“ペプチド”は、オリゴおよびポリペプチドを含み、ペプチド結合により共有結合により結合した２以上、好ましくは３以上、好ましくは４以上、好ましくは６以上、好ましくは８以上、好ましくは９以上、好ましくは１０以上、好ましくは１３以上、好ましくは１６以上、好ましくは２１以上かつ好ましくは８、１０、２０、３０、４０または５０、特に１００までのアミノ酸を含む、物質をいう。用語“タンパク質”は、大ペプチド、好ましくは１００を超えるアミノ酸残基を有するペプチドをいうが、一般に用語“ペプチド”および“タンパク質”は同義であり、ここで相互交換可能に使用する。

ここで使用する用語“発現制御配列”は、所望の宿主細胞中またはインビトロ条件下で、操作可能に結合した核酸分子の発現を可能にする核酸配列をいうことを意図する。適当な発現制御配列は当業者に知られ、プロモーター、例えばＴ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーターのようなＲＮＡプロモーターを含む。

本発明の核酸分子は、ベクターに含まれ得る／包含され得る。ここで使用する用語“ベクター”は、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージのようなファージベクター、アデノウイルスまたはバキュロウイルスベクターのようなウイルスベクターまたは細菌人工染色体(ＢＡＣ)、酵母人工染色体(ＹＡＣ)またはＰ１人工染色体(ＰＡＣ)のような人工染色体ベクターを含む、当業者に知られるあらゆるベクターを含む。該ベクターは、発現ならびにクローニングベクターを含む。発現ベクターは、プラスミドならびにウイルスベクターを含み、一般に所望のコード配列および特定の宿主生物(例えば、細菌、酵母、植物、昆虫または哺乳動物)またはインビトロ発現系における操作可能に結合したコード配列の発現に必要な適切なＤＮＡ配列を含む。クローニングベクターは、一般にある所望のＤＮＡフラグメントの操作および増幅に使用し、所望のＤＮＡフラグメントの発現に必要な機能的配列を欠き得る。

用語“細胞”または“宿主細胞”は、好ましくはインタクト細胞、すなわち酵素、オルガネラまたは遺伝子材料のような通常の細胞内成分を排出していない、インタクト膜を備えた細胞である。インタクト細胞は、好ましくは生存可能細胞、すなわち正常代謝機能を実施できる生存細胞である。好ましくは、該用語は、本発明においては外来核酸でトランスフェクトまたはトランスフォームできるあらゆる細胞である。好ましくは、外来核酸でトランスフェクトまたはトランスフォームされ、レシピエントに伝達されたとき、細胞は、該レシピエントで核酸を発現できる。用語“細胞”は、細菌細胞のような原核細胞および酵母細胞、真菌細胞または哺乳動物細胞のような真核細胞を含む。適当な細菌細胞は、大腸菌、プロテウスおよびシュードモナスの株のようなグラム陰性細菌株およびバチルス、ストレプトマイセス、スタフィロコッカスおよびラクトコッカスの株のようなグラム陽性細菌株からの細胞を含む。適当な真菌細胞は、トリコデルマ、ニューロスポラおよびアスペルギルスの種からの細胞を含む。適当な酵母細胞は、サッカロマイセス(例えば、サッカロマイセス・セレビシエ)、シゾサッカロミセス(例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ)、ピキア(例えば、ピキア・パストリスおよびピキア・メタノリカ)およびハンゼヌラの種からの細胞を含む。適当な哺乳動物細胞は、例えばＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３ＨＥＫなどを含む。しかしながら、両生類細胞、昆虫細胞、植物細胞および異種タンパク質の発現に当分野で使用されるあらゆる他の細胞を同様に使用できる。哺乳動物細胞は、ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギおよび霊長類からの細胞のような、養子移植に特に好ましい。細胞は、多数の組織タイプに由来でき、一次細胞および細胞株、例えば、免疫系の細胞、特に抗原提示細胞(ＡＰＣ)、例えば樹状細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞、幹細胞、例えば造血幹細胞および間葉性幹細胞および他の細胞型を含む。抗原提示細胞は、主要組織適合性複合体という文脈では、表面に抗原を提示する細胞である。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)を使用して、この複合体を認識し得る。

ここで使用する用語“非ヒト生物”は、非ヒト霊長類または他の動物、特に哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスターまたは齧歯類、例えばマウスおよびラットを含むことを意図する。

本発明の医薬組成物は、好ましくは無菌であり、所望の反応または所望の効果を産生するのに有効な量の、ここに記載するサイトカイン融合タンパク質、核酸分子または細胞を含む。

医薬組成物は、通常均一用量形態で提供され、それ自体既知の方法で製造できる。医薬組成物は、例えば溶液または懸濁液の形であり得る。

医薬組成物は、さらに１以上の担体および／または添加物を含んでよく、その全てが、好ましくは薬学的に許容される。ここで使用する用語“薬学的に許容される”は、毒性のない物質であって、好ましくは、医薬組成物の活性剤の作用と相互作用しない物質をいう。

用語“担体”は、適用を促進、強化または可能とするために、活性成分と組み合わされる、天然または合成の有機または無機成分をいう。本発明において、用語“担体”はまた、対象への投与に適する、１以上の適合性固体または液体充填剤、希釈剤または封入物質をいう。

非経腸投与のための可能な担体物質は、例えば、無菌水、リンゲル、乳酸リンゲル、無菌塩化ナトリウム溶液、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレンおよび、特に、生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシ−プロピレンコポリマーである。

ここで使用する用語“添加物”は、塩、結合剤、滑沢剤、濃厚剤、界面活性剤、防腐剤、乳化剤、緩衝液物質、風味剤または着色剤のような、医薬組成物中に存在でき、活性成分ではない全ての物質を含むことを意図する。

薬学的に許容される塩の製造に使用できる薬学的に許容されない塩は、、本発明の範囲に含まれる。この種の薬学的に許容される塩は、非限定的方法で、次の酸から製造されるものを含む：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロンギ酸、コハク酸など。薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩のようなアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としても製造され得る。

医薬組成物において使用するための適当な防腐剤は、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールを含む。

医薬組成物において使用するための適当な緩衝液物質は、酢酸の塩、クエン酸の塩、ホウ酸の塩およびリン酸の塩を含む。

ここに記載する薬剤および組成物を、注射または点滴を含む、非経腸投与のようなあらゆる慣用の経路で投与し得る。投与は、好ましくは非経腸的、例えば、静脈内、動脈内、皮下、皮内または筋肉内である。

非経腸投与に適する医薬組成物は、通常レシピエントの血液と好ましくは等張である、活性化合物の無菌水性または非水性製剤を含む。適合性担体／溶媒／希釈剤の例は、リンゲル溶液および等張塩化ナトリウム溶液を含む。さらに、通常無菌、固定油が溶液または懸濁液媒体として使用される。

ここに記載する薬剤および組成物を、有効量で投与する。“有効量”は、単独でまたはさらなる薬剤と共に、所望の反応または所望の効果を達成する量をいう。特定の疾患または特定の状態の処置において、所望の反応は、好ましくは疾患の経過の阻止である。これは疾患進行の遅延、特に、疾患進行の阻止または逆転を含む。疾患または状態の処置における所望の反応はまた、該疾患または該状態の発症遅延または発症予防でもあり得る。ここに記載する薬剤または組成物の有効量は、処置する状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、体格および体重のような対象の個々のパラメータ、処置期間、併用治療のタイプ(存在するならば)、具体的投与経路および類似の因子による。従って、ここに記載する薬剤を投与する用量は、このような種々のパラメータに依存し得る。対象における反応が初期用量で不十分である場合、高用量(または異なる、さらに局所的な投与経路により達成される効率的な高用量)を使用し得る。

ここで記載する用語“キット・オブ・パーツ(略して：キット)”は、１以上の容器および、所望により、データ媒体を含む、製品をいう。該１以上の容器は、上記手段または薬物の１以上で満たされる。例えば、希釈剤、緩衝液およびさらなる薬物を含むさらなる容器が、キットに含まれ得る。該データ媒体は、非電子的データ媒体、例えば、情報リーフレット、情報シート、バーコードまたはアクセスコードのような図表データ媒体またはフロッピーディスク、コンパクトディスク(ＣＤ)、デジタル多用途ディスク(ＤＶＤ)、マイクロチップまたは他の半導体ベースの電子的データ媒体のような電子的データ媒体であり得る。アクセスコードは、データベース、例えば、インターネットデータベース、集中または分散データベースへのアクセスを可能とし得る。該データ媒体は、本発明のサイトカイン融合タンパク質、核酸分子、細胞および／または医薬組成物の使用の指示を含み得る。

ここに記載する薬剤および組成物は、対象に、例えば、インビボで、投与して、ここに記載するような多様な障害を処置または予防できる。

本発明により、用語“疾患”は、あらゆる病的状態、特に癌、感染症、炎症性疾患、代謝疾患、自己免疫障害、変性疾患、アポトーシス関連疾患および移植片拒絶をいう。

ここで使用する用語“癌”は、異常に制御された細胞成長、増殖、分化、接着および／または遊走により特徴付けられる疾患を含む。“癌細胞”は、急速な、制御されない細胞増殖により成長し、新規成長を開始させた刺激が消滅した後も成長を続ける、異常細胞を意味する。本発明による用語“癌”は、白血病、精上皮腫、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽腫、神経膠腫、直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、副腎癌、甲状腺癌、血液癌、皮膚癌、脳癌、子宮頸癌、消化器系癌、肝臓癌、結腸癌、胃癌、腸管癌、頭頸部癌、消化器癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵臓癌、耳鼻咽喉(ＥＮＴ)癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌および肺癌およびこれらの転移を含む。例は、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、腎臓細胞癌、子宮頸癌または上記癌タイプまたは腫瘍の転移である。

本発明による用語“癌”はまた、癌転移を含む。“転移”は、癌細胞の元の場所から体の他の部位への拡散を意味する。転移の形成は極めて複雑な過程であり、原発腫瘍からの悪性細胞の脱離、細胞外マトリクスの侵襲、内皮基底膜の体腔および血管に入るための浸透、次いで、血流により輸送された後、標的臓器の浸潤に依存する。最後に、標的部位での新規腫瘍、すなわち二次性腫瘍または転移腫瘍の成長は、血管形成による。腫瘍転移は、しばしば、腫瘍細胞または成分が残り、転移能を発展させ得るため、原発腫瘍除去後でも生じ得る。ある態様において、本発明による用語“転移”は、原発腫瘍および局所リンパ節系から遠く離れた転移である“遠隔転移”である。

用語“感染性疾患”は、個体から個体または生物から生物に伝播され、微生物が原因であるあらゆる疾患をいう(例えば風邪)。感染症の例は、ウイルス感染症、例えば、ＡＩＤＳ(ＨＩＶ)、Ａ型、Ｂ型またはＣ型肝炎、ヘルペス、帯状疱疹(水痘)、風疹(風疹ウイルス)、黄色熱、デングなど、フラビウイルス、インフルエンザウイルス、出血性感染症(マールブルグまたはエボラウイルス)および重症急性呼吸器症候群(ＳＡＲＳ)、細菌感染症、例えば、在郷軍人病(レジオネラ)、性感染疾患(例えばクラミジアまたは淋病)、胃潰瘍(ヘリコバクター)、コレラ(ビブリオ)、結核、ジフテリア、大腸菌、ブドウ球菌、サルモネラまたは連鎖球菌による感染(テタヌス)；マラリアのような寄生虫病原体による感染、睡眠病、リーシュマニア症；トキソプラズマ症、すなわちプラスモジウム、トリパノソーマ、リーシュマニアおよびトキソプラズマによる感染；または、例えば、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、コクシジオイデス・イミチス、ブラストミセス・デルマチチジスまたはカンジダ・アルビカンスが原因の、真菌感染を含む。

用語“炎症性疾患”は、組織、特に結合組織における高レベルの炎症またはこれらの組織の変性により特徴付けられるまたはそれと関係するあらゆる疾患をいう。慢性炎症性疾患は、永続性炎症により特徴付けられる医学的状態である。(慢性)炎症性疾患の例は、セリアック病、脈管炎、狼瘡、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、過敏性腸疾患、アテローム性動脈硬化症、関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、大腸炎、慢性活動性肝炎、皮膚炎および乾癬を含む。

用語“代謝疾患”は、正常代謝を妨害するあらゆる疾患または障害をいう。例は、シスチン症、糖尿病、異脂肪血症、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、高脂血症、低脂血症、ガラクトース血症、ゴーシェ病、肥満およびフェニルケトン尿症を含む。

用語“自己免疫障害”は、体が、自己組織のある構成要素に対する免疫原性(すなわち免疫系)応答を生じる、あらゆる疾患／障害をいう。換言すると、免疫系は、ある組織または系を自己として認識する能力を失い、それが異物であるかのように標的とし、攻撃する。自己免疫疾患は、主に一臓器が影響を受けるもの(例えば溶血性貧血および抗免疫甲状腺炎)および自己免疫疾患過程が、多組織にわたり汎発性であるもの(例えば全身性エリテマトーデス)に分類され得る。例えば、多発性硬化症は、Ｔ細胞の脳および脊髄の神経線維を囲む鞘への攻撃が原因であると考えられる。これは、協調性喪失、脱力および霧視をおこす。自己免疫疾患は当分野で知られ、例えば、橋本甲状腺炎、グレーブス病、狼瘡、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、溶血性貧血、抗免疫甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、大腸炎、糖尿病、強皮症、乾癬などを含む。

用語“変性疾患”は、罹患組織または臓器の機能または構造が、経時的に徐々に変質するあらゆる疾患をいう。例は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、ハンチントン病、黄斑変性症、多発性硬化症、筋ジストロフィー、ニーマン・ピック病、骨粗鬆症およびリウマチ性関節炎を含む。

用語“アポトーシス関連疾患”は、アポトーシスの変化が関与するあらゆる疾患をいう。例は、癌、神経学的障害、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)および卒中、心疾患、例えば虚血再灌流および慢性心不全、感染症および自己免疫疾患を含む。

用語“移植片拒絶”は、レシピエントの免疫系による移植組織または臓器の拒絶をいい、これは、最終的に、移植組織または臓器を破壊し得る。

ここで使用する用語“医薬”は、治療で、すなわち、疾患の処置で使用する物質／組成物をいう。

“処置”は、対象における腫瘍サイズまたは腫瘍数の低減；対象における疾患の停止または減速；対象における新規疾患の発生の阻止または遅延；疾患を現在有するまたは以前に有していた対象における症状および／または再発の頻度または重症度の低減；および／または対象の寿命の長期化、すなわち延長を含む、疾患を予防または排除するために、対象に化合物もしくは組成物または化合物もしくは組成物の組み合わせを投与することを意味する。

特に、用語“疾患の処置”は、疾患またはその症状の治癒、期間の短縮、改善、予防、減速または進行または悪化阻止または発症の阻止または遅延を含む。

用語“対象”は、本発明により、ヒト、非ヒト霊長類または多の動物、特に哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスターまたは齧歯類、例えば、マウスおよびラットを含む、処置の対象、特に罹患対象(“患者”とも称する)を意味する。特に好ましい態様において、対象／患者はヒトである。

実施例１：Ｄｕｏｋｉｎｅのクローニング、産生および精製
ヒトＣＤ４０Ｌ(ａａ １１６〜２６１)、ヒトＣＤ２７Ｌ(ａａ ５２〜１９３)、ヒト４−１ＢＢＬ(ａａ ７１〜２５４)およびヒトＯＸ４０Ｌ(ａａ ５１〜１８３)の細胞外部分をコードするＤＮＡを、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化し、適切なクローニング部位を付加して、Ｇｅｎｅａｒｔ(Life Technologies, Carlsbad, USA)により合成した。Ｄｕｏｋｉｎｅを、１５アミノ酸(４−１ＢＢＬ欠失Ｄｕｏｋｉｎｅの場合)または２０アミノ酸(４−１ＢＢＬ含有Ｄｕｏｋｉｎｅの場合)グリシン−セリン富リンカーによりこれらの異なるサイトカインの２個の単一サブユニットに融合し、発現プラスミドｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３(Clontech, Mountain View, USA)にクローニングすることにより産生した。Ｎ末端的に、Ｄｕｏｋｉｎｅは、分泌のためのＶＨリーダー配列ならびに精製および検出用ＦＬＡＧタグを備えた。次のＤｕｏｋｉｎｅを産生した：ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ２７Ｌ−ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ−４−１ＢＢＬ、４−１ＢＢＬ−ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ−４−１ＢＢＬ、４−１ＢＢＬ−ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ−ＯＸ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ２７Ｌ、４−１ＢＢＬ−ＯＸ４０ＬおよびＯＸ４０Ｌ−４−１ＢＢＬ(表１)。全Ｄｕｏｋｉｎｅを、安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から産生し、一工程ＦＬＡＧ親和性クロマトグラフィー(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)により細胞培養上清から精製し、０.３〜１.９mg／Ｌ上清の収率を達成した。

Ｄｕｏｋｉｎｅを１２％ポリアクリルアミドゲルを使用して還元および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、クマシーブリリアントブルーＧ２５０での染色により可視化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＣＤ４０Ｌ(１部位；ａａ ２４０)、ＣＤ２７Ｌ(２部位；ａａ ６３および１７０)およびＯＸ４０Ｌ(４部位；ａａ ９０、１１４、１５２および１５７)における潜在的Ｎ−グリコシル化部位の存在を考慮した単量体ポリペプチド鎖の予測分子量(４−１ＢＢＬ欠失Ｄｕｏｋｉｎｅについて約３３kDaおよび４−１ＢＢＬ含有Ｄｕｏｋｉｎｅについて３７kDa)を示した(図２、表１)。さらに、非還元条件下、すべてのタンパク質は、二量体の分子量に対応する第二の小バンドを示した。Yarra SEC-2000(Phenomenex)上の流速０.５mL／分を用いる高速液体クロマトグラフィーを使用するサイズ排除クロマトグラフィーＤｕｏｋｉｎｅのホモ三量体集合体を確認した。Ｄｕｏｋｉｎｅ ＣＤ４０Ｌ−４−１ＢＢＬ、４−１ＢＢＬ−ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ−４−１ＢＢＬおよび４−１ＢＢＬ−ＣＤ２７Ｌは、８０〜１００kDa範囲の見かけの分子量を有する主ピークとして溶出され、おそらく４−１ＢＢＬ含有Ｄｕｏｋｉｎｅのより小型の構造のために、それゆえ１１２kDaの計算値より少し小さかった。全ての他のＤｕｏｋｉｎｅは、１３０〜１６０kDaの見かけの分子量を有する主ピークとして溶出され、これは、おそらくＮ−グリコシル化により、計算値より３０〜５０％大きな分子量に対応した。さらに、Ｄｕｏｋｉｎｅ ４−１ＢＢＬ−ＣＤ２７Ｌ、４−１ＢＢＬ−ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ４０ＬおよびＯＸ４０Ｌ−４−１ＢＢＬは、高分子量複合体に対応する可能性が高い小さなピークを示した(図３ＡＢ)。

実施例２：Ｄｕｏｋｉｎｅの受容体結合性質
Ｄｕｏｋｉｎｅの受容体結合を、ＥＬＩＳＡにより、それぞれＣＤ４０、ＣＤ２７、４−１ＢＢおよびＯＸ４０の細胞外領域と、共有結合集合体のためのヒンジ領域を含むヒトＦｃγ１領域の融合タンパク質(ＣＤ４０−Ｆｃ、ＣＤ２７−Ｆｃ、４−１ＢＢ−Ｆｃ、ＯＸ４０−Ｆｃ)を使用して分析した。受容体−Ｆｃ融合タンパク質(２００ng／ウェル)を一夜、４℃でコートし、残存結合部位を、ＰＢＳ、２％脱脂粉乳(２％ＭＰＢＳ)でブロックした。Ｄｕｏｋｉｎｅを、３１６nM濃度で開始して、デュプリケートでタイトレートし、結合Ｄｕｏｋｉｎｅを、ＨＲＰ接合マウス抗ＦＬＡＧ抗体で検出した。全Ｄｕｏｋｉｎｅはそれらの各受容体への特異的結合を示し、他の受容体−Ｆｃ融合タンパク質との交差反応性は観察されなかった(図４)。Ｄｕｏｋｉｎｅ受容体相互作用は用量依存的であり、ＥＣ_５０値は低ナノモル範囲であった(図５ＡＢ、表１)。

さらに、Ｄｕｏｋｉｎｅを、それぞれＣＤ４０、ＣＤ２７、４−１ＢＢまたはＯＸ４０受容体を発現するように操作した線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０(ＨＴ１０８０−ＣＤ４０、ＨＴ１０８０−ＣＤ２７、ＨＴ１０８０−４−１ＢＢ、ＨＴ１０８０−ＯＸ４０)への結合についてフローサイトメトリーで分析した。ここで、１.５×１０^５細胞を１００nM Ｄｕｏｋｉｎｅとインキュベートし、結合をＰＥ標識マウス抗ＦＬＡＧ抗体を使用して検出した。細胞をMACSQuant 10アナライザー(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)を使用して分析し、データをＦｌｏｗＪｏ(Tree Star, Ashland, USA)を使用して解析した。フローサイトメトリーは、全Ｄｕｏｋｉｎｅがそれぞれ各受容体を発現する細胞株と結合したことを示した(図６ＡＢ)。

実施例３：Ｄｕｏｋｉｎｅの二特異的受容体結合性質
Ｄｕｏｋｉｎｅの特異性をフローサイトメトリーで評価した。ＣＤ４０、ＣＤ２７、４−１ＢＢまたはＯＸ４０受容体を発現する１.５×１０^５ ＨＴ１０８０細胞(ＨＴ１０８０−ＣＤ４０、ＨＴ１０８０−ＣＤ２７、ＨＴ１０８０−４−１ＢＢ、ＨＴ１０８０−ＯＸ４０)を１００nM Ｄｕｏｋｉｎｅとインキュベートし、続いて対応する受容体−Ｆｃ融合タンパク質(１０nM)とインキュベートして、第二結合部位を検出した。細胞結合Ｄｕｏｋｉｎｅ受容体−複合体をＰＥ標識マウス抗ヒトＦｃ抗体を使用して検出し、それゆえに一方が細胞上、他方が可溶性Ｆｃ融合タンパク質として提供される両受容体を認識するＤｕｏｋｉｎｅのみが、蛍光シグナルを発生できる。細胞をMACSQuant 10アナライザー(Miltenyi Biotec)を使用して分析し、データをＦｌｏｗＪｏ(Tree Star, Ashland, USA)を使用して解析した。ここで、全Ｄｕｏｋｉｎｅが両受容体に同時に結合できることを示し、Ｄｕｏｋｉｎｅのデュアル結合能力を証明した(図７ＡＢ)。

実施例４：一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅ(ｓｃＤｕｏｋｉｎｅ)のクローニング、産生および精製
ヒトＣＤ４０Ｌ(ａａ １１６〜２６１)、ヒトＣＤ２７Ｌ(ａａ ５２〜１９３)、ヒト４−１ＢＢＬ(ａａ ７１〜２５４)およびヒトＯＸ４０Ｌ(ａａ ５１〜１８３)の細胞外部分の一本鎖誘導体をコードするＤＮＡをヒト細胞における発現のためにコドン最適化し、適切なクローニング部位を付加して、Geneart(Life Technologies)により合成した。ｓｃＣＤ４０Ｌ、ｓｃＣＤ２７ＬおよびｓｃＯＸ４０Ｌの場合、サイトカインの３個の単一サブユニットをＧＧＧＳＧＧＧリンカーで接続し、ｓｃ４−１ＢＢＬのために(ＧＧＧＧＳ)_３リンカーを使用した。一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅ(ｓｃＤｕｏｋｉｎｅ)を、これらの異なる一本鎖サイトカインの２個を１５アミノ酸グリシン−セリン富リンカーで融合させ、発現プラスミドｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３(Clontech)にクローニングして、産生した。Ｎ末端的に、ｓｃＤｕｏｋｉｎｅは、分泌のためのＶＨリーダー配列ならびに精製および検出用ＦＬＡＧタグを備えた。次のｓｃＤｕｏｋｉｎｅを産生した：ｓｃＣＤ４０Ｌ−ｓｃＣＤ２７Ｌ、ｓｃＣＤ２７Ｌ−ｓｃＣＤ４０Ｌ、ｓｃＣＤ４０Ｌ−ｓｃ４−１ＢＢＬ、ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＣＤ４０Ｌ、ｓｃＣＤ２７Ｌ−ｓｃ４−１ＢＢＬ、ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＣＤ２７Ｌ、ｓｃＣＤ４０Ｌ−ｓｃＯＸ４０Ｌ、ｓｃＯＸ４０Ｌ−ｓｃＣＤ４０Ｌ、ｓｃＣＤ２７Ｌ−ｓｃＯＸ４０Ｌ、ｓｃＯＸ４０Ｌ−ｓｃＣＤ２７Ｌ、ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＯＸ４０ＬおよびｓｃＯＸ４０Ｌ−ｓｃ４−１ＢＢＬ(表２)。全ｓｃＤｕｏｋｉｎｅを、安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から産生し、一工程ＦＬＡＧ親和性クロマトグラフィー(Sigma-Aldrich)により細胞培養上清から精製し、１.４〜４.０mg／Ｌ上清の収率を達成した。

一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅを、１０％ポリアクリルアミドゲルを使用して還元および非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分析し、クマシーブリリアントブルーＧ２５０での染色により可視化した。還元および非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＣＤ４０Ｌ(１部位；ａａ ２４０)、ＣＤ２７Ｌ(２部位；ａａ ６３および１７０)およびＯＸ４０Ｌ(４部位；ａａ ９０、１１４、１５２および１５７)における潜在的Ｎ−グリコシル化部位を考慮した三量体ポリペプチド鎖の予測分子量(４−１ＢＢＬ欠失Ｄｕｏｋｉｎｅについて約９７kDaおよび４−１ＢＢＬ含有Ｄｕｏｋｉｎｅについて１１１kDa)を示した(図８、表２)。さらに、還元条件下、全タンパク質は、高分子量複合体に対応する第二バンドを示した。高分子量複合体の出現は、ｓｃＯＸ４０Ｌ含有ｓｃＤｕｏｋｉｎｅで特に顕著であった。Yarra SEC-2000(Phenomenex)上の流速０.５mL／分を用いる高速液体クロマトグラフィーを使用するサイズ排除クロマトグラフィーは、ｓｃＤｕｏｋｉｎｅの優先的ホモ三量体集合体を確認した。ＳｃＣＤ４０Ｌ−ｓｃＣＤ２７ＬおよびｓｃＣＤ２７Ｌ−ｓｃＣＤ４０Ｌは、１２５kDaの見かけの分子量を有する主ピークとして溶出され、それゆえ９８kDaの計算値よりわずかに大きかった。ｓｃＯＸ４０Ｌを含む全ｓｃＤｕｏｋｉｎは、１４０および１６０kDaに対応する主ピークを示し、おそらくｓｃＯＸ４０Ｌの構造のために、長い保持時間を伴った。ｓｃＣＤ４０Ｌ、ｓｃ４−１ＢＢＬおよびｓｃＣＤ２７ＬからなるｓｃＤｕｏｋｉｎｅは、１１０kDaの計算値に対応する主ピークとして溶出された。さらに、ｓｃＤｕｏｋｉｎｅ ｓｃＣＤ４０Ｌ−ｓｃ４−１ＢＢＬ、ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＣＤ４０Ｌ、ｓｃＣＤ４０Ｌ−ｓｃＯＸ４０Ｌ、ｓｃＯＸ４０Ｌ−ｓｃＣＤ４０Ｌ、ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＯＸ４０ＬおよびｓｃＯＸ４０Ｌ−ｓｃ４−１ＢＢＬは、高分子量複合体に対応する可能性が高い小さなピークを示した(図９ＡＢ)。

実施例５：一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅの受容体結合性質
一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅの受容体結合を、ＥＬＩＳＡにより、それぞれＣＤ４０、ＣＤ２７、４−１ＢＢおよびＯＸ４０の細胞外領域と共有結合集合体のヒンジ領域を含むヒトＦｃγ１領域の融合タンパク質(ＣＤ４０−Ｆｃ、ＣＤ２７−Ｆｃ、４−１ＢＢ−Ｆｃ、ＯＸ４０−Ｆｃ)を使用して分析した。受容体−Ｆｃ融合タンパク質(２００ng／ウェル)を一夜、４℃でコートし、残存結合部位を、ＰＢＳ、２％脱脂粉乳(２％ＭＰＢＳ)でブロックした。一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅを、３１６nM濃度で開始して、デュプリケートでタイトレートし、結合ｓｃＤｕｏｋｉｎｅを、ＨＲＰ接合マウス抗ＦＬＡＧ抗体で検出した。全ｓｃＤｕｏｋｉｎｅはそれらの各受容体への特異的結合を示し、他の受容体−Ｆｃ融合タンパク質との交差反応性は観察されなかった(図１０)。ｓｃＤｕｏｋｉｎｅと受容体の相互作用は用量依存的であり、ＥＣ_５０値は低ナノモル範囲であった(図１１ＡＢ、表２)。

さらに、一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅを、それぞれＣＤ４０、ＣＤ２７、４−１ＢＢまたはＯＸ４０受容体を発現するように操作した線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０(ＨＴ１０８０−ＣＤ４０、ＨＴ１０８０−ＣＤ２７、ＨＴ１０８０−４−１ＢＢ、ＨＴ１０８０−ＯＸ４０)への結合についてフローサイトメトリーで分析した。ここで、１.５×１０^５細胞を１００nM ｓｃＤｕｏｋｉｎｅとインキュベートし、結合をＰＥ標識マウス抗ＦＬＡＧ抗体を使用して検出した。細胞をMACSQuant 10アナライザー(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)を使用して分析し、データをＦｌｏｗＪｏ(Tree Star, Ashland, USA)を使用して解析した。フローサイトメトリーは、全ｓｃＤｕｏｋｉｎｅがそれぞれ各受容体を発現する細胞株と結合したことを示した(図１２ＡＢ)。

実施例６：一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅの二特異的受容体結合性質
一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅの特異性をフローサイトメトリーで評価した。ＣＤ４０、ＣＤ２７、４−１ＢＢまたはＯＸ４０受容体を発現する１.５×１０^５ ＨＴ１０８０細胞(ＨＴ１０８０−ＣＤ４０、ＨＴ１０８０−ＣＤ２７、ＨＴ１０８０−４−１ＢＢ、ＨＴ１０８０−ＯＸ４０)を１００nM ｓｃＤｕｏｋｉｎｅとインキュベートし、続いて対応する受容体−Ｆｃ融合タンパク質(１０nM)とインキュベートして、第二結合部位を検出した。ｓｃＤｕｏｋｉｎｅ受容体−複合体をＰＥ標識マウス抗ヒトＦｃ抗体を使用して検出し、それゆえに一方が細胞上、他方が可溶性Ｆｃ融合タンパク質として提供される両受容体を認識するｓｃＤｕｏｋｉｎｅのみが、蛍光シグナルを発生できる。細胞をMACSQuant 10アナライザー(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)を使用して分析し、データをＦｌｏｗＪｏ(Tree Star, Ashland, USA)を使用して解析した。ここで、全ｓｃＤｕｏｋｉｎｅが両受容体に同時に結合できることを示し、一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅのデュアル結合能力を証明した(図１３ＡＢ)。

実施例７：ＥＨＤ２連結一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅ(ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅ)のクローニング、産生および精製
ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅを、一つの一本鎖サイトカインをＮ末端的におよび第二一本鎖サイトカインをＣ末端的に、ＧＧＳＧＧリンカーを経てＩｇＥ重鎖ドメイン２(ＥＨＤ２)に融合させ、発現プラスミドｐＳｅｃＴａｇＡ(Life Technologies, Carlsbad, USA)にクローニングすることにより産生した。Ｎ末端的に、ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅは、分泌用Ｉｇκリーダー配列ならびに精製および検出用ＦＬＡＧタグを備えた。次のＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅを産生した：ｓｃ４−１ＢＢＬ−ＥＨＤ２−ｓｃＣＤ４０Ｌ、ｓｃ４−１ＢＢＬ−ＥＨＤ２−ｓｃＣＤ２７ＬおよびｓｃＣＤ４０Ｌ−ＥＨＤ２−ｓｃＣＤ２７Ｌ(表３)。全ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅを、安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から産生し、一工程ＦＬＡＧ親和性クロマトグラフィー(Sigma-Aldrich)により細胞培養上清から精製し、３.７〜８.０mg／Ｌ上清の収率を達成した。

ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅを、４〜１５％ポリアクリルアミドゲルを使用して還元および非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、クマシーブリリアントブルーＧ２５０での染色により可視化した。還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＣＤ４０Ｌ(１部位；ａａ ２４０)およびＣＤ２７Ｌ(２部位；ａａ ６３および１７０)における潜在的Ｎ−グリコシル化部位を考慮した六価ポリペプチド鎖の予測分子量(約１２０kDa)を示した(図１４、表３)。さらに、非還元条件下、全タンパク質は、ＥＨＤ２ドメイン間のジスルィド結合により形成された二量体に対応する第二バンドを示した。ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅの約５０％が、共有結合による結合を示した。Yarra SEC-2000(Phenomenex)上の流速０.５mL／分を用いる高速液体クロマトグラフィーを使用するサイズ排除クロマトグラフィーは、ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅのホモ二量体集合体を確認した。Ｓｃ４−１ＢＢＬ−ＥＨＤ２−ｓｃＣＤ２７Ｌは、六価単量体(計算分子量１２２kDa)に対応する見かけの分子量１２０kDaを有する主ピークおよびジスルフィド結合二量体(計算分子量２４５kDa)に対応する可能性が最も高い見かけの分子量２００kDaを有する小さなピークとして溶出された。同様に、ｓｃＣＤ４０Ｌ−ＥＨＤ２−ｓｃＣＤ２７Ｌは、単量体に対応する見かけの分子量１５０kDaを有する主ピークおよび二量体に対応する見かけの分子量２７０kDaを有する第二副ピークとして溶出されたが、しかしながら、ＳＥＣにより決定された分子量は、計算値よりわずかに高かった(それぞれ１１０kDaおよび２２０kDa)。ｓｃ４−１ＢＢＬ−ＥＨＤ２−ｓｃＣＤ４０Ｌについて、単量体と小フラグメントの間の分布は１２３kDaおよび７４kDaの見かけの分子量で溶出される２主ピークに等しかった。さらに、全ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅは、高分子量複合体に対応する可能性が高い小さなピークを示した(図１５)。

実施例８：ＥＨＤ２連結一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅ(ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅ)の受容体結合性質
ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅの受容体結合を、ＥＬＩＳＡにより、それぞれ、ＣＤ４０、ＣＤ２７および４−１ＢＢの細胞外領域と共有結合集合体のヒンジ領域を含むヒトＦｃγ１領域の融合タンパク質(ＣＤ４０−Ｆｃ、ＣＤ２７−Ｆｃ、４−１ＢＢ−Ｆｃ)を使用して分析した。受容体−Ｆｃ融合タンパク質(２００ng／ウェル)を一夜、４℃でコートし、残存結合部位を、ＰＢＳ、２％脱脂粉乳(２％ＭＰＢＳ)でブロックした。ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅを、３１６nM濃度で開始して、デュプリケートでタイトレートし、結合ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅを、ＨＲＰ接合マウス抗ＦＬＡＧ抗体で検出した。全ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅはそれらの各受容体への特異的結合を示し、他の受容体−Ｆｃ融合タンパク質との交差反応性は観察されなかった(図１６)。ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅと受容体の相互作用は用量依存的であり、ＥＣ_５０値は低ナノモル範囲であった(図１７、表３)。

さらに、ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅを、それぞれＣＤ４０、ＣＤ２７または４−１ＢＢ受容体を発現するように操作した線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０(ＨＴ１０８０−ＣＤ４０、ＨＴ１０８０−ＣＤ２７、ＨＴ１０８０−４−１ＢＢ)への結合についてフローサイトメトリーで分析した。ここで、１.５×１０^５細胞を１００nM ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅとインキュベートし、結合をＰＥ標識マウス抗ＦＬＡＧ抗体を使用して検出した。細胞をMACSQuant 10アナライザー(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)を使用して分析し、データをＦｌｏｗＪｏ(Tree Star, Ashland, USA)を使用して解析した。フローサイトメトリーは、全ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅがそれぞれ各受容体を発現する細胞株と結合したことを示した(図１８)。

実施例９：ＥＨＤ２連結一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅ(ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅ)の二特異的受容体結合性質
ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅの特異性をフローサイトメトリーで評価した。ＣＤ４０、ＣＤ２７または４−１ＢＢ受容体(ＨＴ１０８０−ＣＤ４０、ＨＴ１０８０−ＣＤ２７、ＨＴ１０８０−４−１ＢＢ)を発現する１.５×１０^５ ＨＴ１０８０細胞を１００nM ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅとインキュベートし、続いて対応する受容体−Ｆｃ融合タンパク質(１０nM)とインキュベートして、第二結合部位を検出した。ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅ受容体−複合体をＰＥ標識マウス抗ヒトＦｃ抗体を使用して検出し、それゆえに一方が細胞上、他方が可溶性Ｆｃ融合タンパク質として提供される両受容体を認識するＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅのみが、蛍光シグナルを発生できる。細胞をMACSQuant 10アナライザー(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)を使用して分析し、データをＦｌｏｗＪｏ(Tree Star, Ashland, USA)を使用して解析した。ここで、全ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅが両受容体に同時に結合できることを示し、ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅのデュアル結合能力を証明した(図１９)。

実施例１０：ＥＨＤ２連結一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅ(ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅ)の受容体活性化
ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅの生理活性を評価するために、受容体活性化を、ＨＴ１０８０細胞からのＩＬ−８のＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅ介在分泌により分析した(図２０、表３)。それゆえに、それぞれＣＤ４０、ＣＤ２７または４−１ＢＢを発現する２×１０^４ ＨＴ１０８０細胞を一夜、９６ウェルマイクロタイタープレートに播種し、翌日上清を構成的に産生されたＩＬ−８を除去するために交換した。その後、細胞を、３１６nM濃度から始めて連続希釈したＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅとデュプリケートで１８時間インキュベートした。上清中のＩＬ−８の量を、製造業者の指示に従いＩＬ−８ ＥＬＩＳＡキット(Immunotools, Freiburg, Germany)を使用して測定した。比較のために、対応する単特異的三量体、可溶性リガンド(ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ)またはそれらの可溶性一本鎖誘導体(ｓｃＣＤ４０Ｌ、ｓｃＣＤ２７Ｌ、ｓｃ４−１ＢＢＬ)を含めた。ＨＴ１０８０−ＣＤ４０細胞で、試験したＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅは、用量依存的態様でＩＬ−８分泌を強く誘発し、最大２２５ng／mLのＩＬ−８濃度をもたらした。ｓｃＣＤ４０Ｌを含む両ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅ(ｓｃ４−１ＢＢＬ−ＥＨＤ２−ｓｃＣＤ４０ＬおよびｓｃＣＤ４０Ｌ−ＥＨＤ２−ｓｃＣＤ２７Ｌ)は、単特異的、可溶性ｓｃＣＤ４０Ｌより強いＣＤ４０受容体活性化をもたらした。４−１ＢＢの活性化により誘発されるＩＬ−８分泌が、４−１ＢＢを標的とする両ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅで観察されたが、ｓｃ４−１ＢＢＬ−ＥＨＤ２−ｓｃＣＤ４０Ｌは、単特異的、可溶性ｓｃ４−１ＢＢＬと同程度の活性であるｓｃ４−１ＢＢＬ−ＥＨＤ２−ｓｃＣＤ２７Ｌと比較して、かなりの活性増加を示した。Ｓｃ４−１ＢＢＬ−ＥＨＤ２−ｓｃＣＤ２７ＬおよびｓｃＣＤ４０Ｌ−ＥＨＤ２−ｓｃＣＤ２７Ｌは、両者ともＣＤ２７活性化によりＩＬ−８分泌を誘発できたが、ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎ内のｓｃ４−１ＢＢＬとｓｃＣＤ２７Ｌの組み合わせは、ＩＬ−８遊離の強い誘発を示した(図２０)。これらの実験は、ＥＨＤ２−ｓｃＤｕｏｋｉｎｅが、本アッセイ系でＩＬ−８遊離をもたらす受容体活性化を誘発できることを証明した。

実施例１１：Ｔ細胞増殖に対するＤｕｏｋｉｎｅおよび一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅの効果
ＤｕｏｋｉｎｅおよびｓｃＤｕｏｋｉｎｅの増殖能を評価するために、混合ＰＢＭＣ集団におけるＴ細胞の増殖を分析した。この目的のために、ヒトＰＢＭＣを健常ドナーから単離し、−８０℃で凍結保存し、実験１日前に融解した。ＰＢＭＣを、製造業者の指示に従い、CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit(Life Technologies)を使用して６２５nM カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(ＣＦＳＥ)で、１×１０^６細胞／mL濃度で染色した。Ｔ細胞の一次刺激のために、架橋抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体(ＵＣＨＴ−１、R&D systems, Minneapolis, USA)を使用した。溶液中の融合タンパク質により誘発された増殖を、１.５×１０^５ ＰＢＭＣ／ウェルを、連続希釈した種々のＤｕｏｋｉｎｅまたはｓｃＤｕｏｋｉｎｅと６日インキュベートし、続くフローサイトメトリー分析により評価した。さらなる抗体介在染色を、Ｔ細胞同定のために実施した(ＣＤ３−ＰＥ、Immunotools, Friesoythe, Germany)。

試験した全ＰＢＭＣバッチは、増殖のために架橋抗ヒトＣＤ３ ｍＡｂでの一次刺激が必要であった。ここで、準最適抗体濃度(５−３０ng／ml)を、Ｔ細胞の２０％までしかＴ細胞増殖を誘発しないように使用した。全ての試験したＤｕｏｋｉｎｅおよびｓｃＤｕｏｋｉｎｅ(ＣＤ４０Ｌおよび４−１ＢＢＬ、ＣＤ２７Ｌおよび４−１ＢＢＬまたはＣＤ４０ＬおよびＯＸ４０Ｌの組み合わせ)は、一次刺激無しで適用したとき不活性であったが、架橋抗ヒトＣＤ３ ｍＡｂと組み合わせて適用したとき、用量依存的方法でＴ細胞増殖を誘発した。ここで、増殖は、低ナノモル濃度の融合タンパク質ですでに２〜３倍増強された。全例で、増殖効果の差異は、Ｄｕｏｋｉｎｅまたは一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅ内のサイトカインの異なる配向の間で検出不可能であった。ＣＤ４０Ｌおよび４−１ＢＢＬまたはＣＤ２７Ｌおよび４−１ＢＢＬを含む融合タンパク質は、試験方法と無関係に同じ増殖能を示した(図２１)。

実施例１２：インビトロ転写ＲＮＡ(ＩＶＴ−ＲＮＡ)のベクター設計、クローニングおよび産生 − ｍＲＮＡコード化ＤｕｏｋｉｎｅおよびｓｃＤｕｏｋｉｎｅ
腫瘍壊死因子受容体(ＴＮＦＲ)リガンドおよびその融合タンパク質をコードするＲＮＡのインビトロ転写のための鋳型として使用したプラスミド構築物(ｐＳＴ１−ｈＡｇ−コザック−ｓｅｃ−２ｈＢｇＵＴＲ−Ａ１２０)は、ｐＳＴ１−２ｈＢｇＵＴＲ−Ａ１２０に基づいた(Holtkamp S. et al. (2006), Blood, 108 (13):4009-17)。プラスミド主鎖は、Ｔ７プロモーター、５’−ヒトアルファ−グロブリンＵＴＲ、コザック配列、ＭＨＣクラスＩ分子由来７８bpシグナルペプチド(Ｓｅｃ；分泌シグナル)、２コピーのヒト３’ベータ−グロブリンＵＴＲ、１２０bpポリ(Ａ)テイルおよびカナマイシン耐性遺伝子の挿入により、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ(Stratagene, La Jolla/CA, USA)に由来した。ＴＮＦＲリガンドまたはその融合タンパク質(ＤｕｏｋｉｎｅまたはｓｃＤｕｏｋｉｎｅに一致)をコードするインサートを、ＰＣＲ産物と冷融合反応により導入した(Cold fusion kit、Biocat)。適切なタンパク質コード化セクションのＤＮＡ配列を表４に挙げる(表４)。

三量体ヒトＴＮＦＲリガンド(ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＯＸ４０Ｌおよび４−１ＢＢＬ)のコード配列は、次のとおりの２つの異なる戦略により導入した：(ｉ)ｈ１＿ＴＮＦＲ−リガンド(ｈ１＿ＣＤ２７Ｌ、ｈ１＿ＣＤ４０Ｌ、ｈ１＿ＯＸ４０Ｌまたはｈ１＿４１ＢＢＬ)と特定する、記載するヒトＴＮＦＲリガンドの１コピーの細胞外配列および(ii)直線で結合し、ＧＳ−リンカーにより分離された、記載するヒトＴＮＦＲリガンドの３コピーの細胞外配列(このようなヒトインサートはｈ３＿ＴＮＦＲ−リガンド(ｈ３＿ＣＤ４０Ｌ、ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ、ｈ３＿ＯＸ４０Ｌまたはｈ３＿４１ＢＢＬ)と特定し、上記一本鎖タンパク質に対応)。融合タンパク質のコード配列を得るために、２個のｈ１＿ＴＮＦＲ−リガンドまたはｈ３＿ＴＮＦＲ−リガンド配列をそれぞれ１５アミノ酸リンカー((Ｇ４Ｓ)_３−リンカー)により結合した(図２２)。ＲＮＡ−トランスクリプトｈ１＿ＴＮＦＲ−Ｌ(１)−ｈ１＿ＴＮＦＲ−Ｌ(２)はＤｕｏｋｉｎｅに対応し、トランスクリプトｈ３＿ＴＮＦＲ−Ｌ(１)−ｈ３＿ＴＮＦＲ−Ｌ(２)はｓｃＤｕｏｋｉｎｅに対応する。単一ｈ１＿ＴＮＦＲ−リガンドおよびｈ３＿ＴＮＦＲ−リガンドのタンパク質配列を表５に挙げる(表５)。

ＩＶＴ−ＲＮＡの産生のために、プラスミドを、クラスII制限エンドヌクレアーゼを使用して、ポリ(Ａ)テイル下流で直線化した。直線化プラスミドを磁気ビーズ(Dynabeads(登録商標)MyOneTM Carboxylic Acid; Invitrogen)により精製し、分光光度的に定量し、製造業者の指示に従いＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ(Thermo Scientific)でのインビトロ転写に付した。さらに、キャップアナログβ−Ｓ−ＡＲＣＡ(Ｄ２)を取り込ませ、最後にＲＮＡをＭＥＧＡキット(Ambion)を使用して精製した。

実施例１３：ＩＶＴ−ＲＮＡエレクトロポレーション後のＴＮＦ受容体リガンドの細胞内発現
慢性骨髄性白血病由来ヒト細胞株であるＫ５６２(ATCC, Manassas, Va., USAから入手)を、５％ＦＣＳ(Gibco)、１００ＩＵ／mLペニシリンおよび１００μg／mLストレプトマイシン(Gibco)添加ＲＰＭＩ １６４０ ＧｌｕｔａＭＡＸ(Gibco)で培養した。９６ウェルプレート系でのＫ５６２のエレクトロポレーションのために、細胞をＸ−Ｖｉｖｏ１５培地(Lonza)で１回洗浄し、５００.０００細胞／１５０μlでＸ−Ｖｉｖｏ１５に再懸濁させた。１５０μlの細胞懸濁液を、多ウェル−エレクトロポレーションに必要なＩＶＴ−ＲＮＡ(Biorad)をすでに含む９６ウェルプレートにピペットで移した。混合後、エレクトロポレーションを９６ウェルエレクトロポレーションデバイスであるBioradからのGene Pulser MXcellエレクトロポレーション系(２５０Ｖ、１×３０msパルス)で実施した。エレクトロポレーション直後、細胞を１００μlの新鮮培地添加により新規培養プレートに移し、インキュベーター中約６時間休息させた。次いで、Ｋ５６２の細胞内染色のために、細胞を、製造業者のプロトコールに従い１６時間(一夜)ＧｏｌｇｉＰｌｕｇおよびＧｏｌｇｉＳｔｏｐ(BD Biosciences, San Jose, CA)とインキュベートした。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ緩衝液(BD Biosciences)で室温で２０分固定した。その後、細胞をＰＢＳで再洗浄し、細胞を１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液(BD Biosciences)で洗浄し、１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液(BD Biosciences)に移すことにより透過処理した。１０分インキュベーション後細胞を、１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で希釈した抗ＴＮＦＲ−リガンド抗体で３０分、室温で暗所で染色し、続いて１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で３洗浄工程を行った。次いで、細胞をFACS Canto IIフローサイトメーター(BD Biosciences)を使用するフローサイトメトリーで直接分析した。分析をＦｌｏｗＪｏソフトウェア(Tree Star, Ashland, Oregon, USA)を使用して実施した。

ＴＮＦＲリガンド、ＤｕｏｋｉｎｅおよびｓｃＤｕｏｋｉｎｅをコードするｍＲＮＡのエレクトロポレーションは細胞内タンパク質発現をもたらし、これは細胞内抗体染色により染色可能であった。単一ＴＮＦＲリガンド構築物のエレクトロポレーションにより、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌおよび４−１ＢＢＬは対応する抗体により検出された(図２３Ａ〜Ｃ)。ｈ３＿ＣＤ４０Ｌ−ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ、ｈ３＿ＣＤ４０Ｌ−ｈ３＿ＯＸ４０Ｌおよびｈ３＿４−１ＢＢＬ−ｈ３＿ＣＤ２７ＬによりコードされるｓｃＤｕｏｋｉｎｅは、２個の対応する抗ＴＮＦＲ−リガンド抗体の各々に応じて検出された(図２３Ａ〜Ｃ)。ｈ１＿ＣＤ４０Ｌ−ｈ１＿ＣＤ２７Ｌ、ｈ１＿４１ＢＢＬ−ｈ１＿ＣＤ４０Ｌおよびｈ１＿４−１ＢＢＬ−ｈ１＿ＣＤ２７ＬによりコードされるＤｕｏｋｉｎｅは、２個の対応する抗ＴＮＦＲ−リガンド抗体の各々に応じて検出された(図２３Ｄ)。

実施例１４：ＴＮＦＬ(１)−ＴＮＦＬ(２)融合構築物(それぞれＤｕｏｋｉｎｅおよびｓｃＤｕｏｋｉｎｅに対応する)をコードするＩＶＴ−ＲＮＡのエレクトロポレーションにより発現されるタンパク質の受容体活性化性質
ＴＮＦ受容体(ＴＮＦＲ)発現細胞株／細胞の製造：ＨＴ１０８０細胞株およびその安定なＴＮＦＲトランスフェクタントを、５％ＦＣＳ、１００ＩＵ／mLペニシリンおよび１００μg／mLストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ １６４０ ＧｌｕｔａＭＡＸで培養した。ＨＴ１０８０−トランスフェクタント上のＴＮＦ受容体の細胞表面発現をＦＡＣＳにより分析した。この目的のために、細胞を、ＣＤ４０−ＦＩＴＣ(Biolegend)、ＣＤ２７−ＰＥ(ＢＤ)、ＯＸ４０−ＰＥ(ＢＤ)および４１ＢＢ−ＰＥ(ＢＤ)に対する抗体を使用して染色した(図２４Ａ)。
ＴＮＦ受容体を一過性に発現するＫ５６２を産生するために、Ｋ５６２細胞をＸ−Ｖｉｖｏ１５培地(Lonza)で１回洗浄し、最終濃度８×１０^６細胞／２５０μlでＸ−Ｖｉｖｏ１５に再懸濁させた。８×１０^６ Ｋ５６２細胞を、２５０μl培地中、ヒトＣＤ４０、ＣＤ２７、ＯＸ４０または４−１ＢＢの完全長ＴＮＦ受容体をコードする２０〜４０μgのプラスミドＤＮＡで電気穿孔した。エレクトロポレーションを、４mmエレクトロポレーションキュベットでの２５０μl Ｘ−ＶＩＶＯ １５中、ＢＴＸ ＥＣＭ(登録商標)８３０エレクトロポレーション系(BTX, Holliston, Mass., USA)デバイス(２００Ｖ、３×８msパルス)を使用して実施した。エレクトロポレーション直後、細胞を、抗生物質を含まない新鮮培地含有新規培養プレートに移した。翌日、ＴＮＦ受容体の細胞表面発現をＦＡＣＳ分析で確認した(図２４Ｂ)。

ＴＮＦＲ−リガンド融合タンパク質含有上清の産生：Ｋ５６２多エレクトロポレーションを上記のとおり実施した。エレクトロポレーション直後、細胞を１００μlの新鮮培地添加により新規培養プレートに移し、インキュベーター中約３時間休息させた。次いで、細胞を遠心分離し、細胞ペレットを、０.５％ＦＣＳ含有２５０μl ＲＰＭＩ １６４０ ＧｌｕｔａＭＡＸに、一夜インキュベーション(約１６時間)のために再懸濁した。翌日、分泌融合タンパク質を含む１００μlの上清を、ＨＴ１０８０−ＴＮＦ受容体トランスフェクタントのコンフルエント層に移した。

ＨＴ１０８０細胞のＩＬ−８遊離により測定されるＴＮＦ受容体活性化によるＮＦ−カッパＢ経路活性化：ＨＴ１０８０細胞株のＴＮＦ受容体トランスフェクタントを、ＴＮＦ受容体活性化測定のためにレポーターアッセイに使用した。ヒトＴＮＦ受容体を発現する次の安定なトランスフェクタントを使用した：ＨＴ１０８０＿ＣＤ４０、ＨＴ１０８０＿ＣＤ２７、ＨＴ１０８０＿ＯＸ４０およびＨＴ１０８０＿４−１ＢＢ；レポーターアッセイ前の細胞表面発現をＦＡＣＳ分析で確認した(図２４Ａ)。細胞を、９６ウェル組織培養プレートで５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地に播種し(２×１０^４細胞／ウェル)、一夜増殖させた。培地を抽出し、電気穿孔Ｋ５６２からの１００μlの細胞培養上清を添加した。望むならば、記載するＴＮＦ受容体を発現するＫ５６２を、さらに０.５％ＦＣＳ含有１００μl ＲＰＭＩ １６４０ ＧｌｕｔａＭＡＸ培地に添加した。６〜８時間のインキュベーション後、無細胞上清を回収し、製造業者のプロトコールに従いＩＬ−８ ＥＬＩＳＡキット(Biolegend)によりＩＬ８−濃度を測定した。

ＨＴ１０８０＿ＣＤ４０のＣＤ４０受容体の活性化を、ｈ３＿ＣＤ４０Ｌおよびｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＣＤ４０Ｌのエレクトロポレーションで検出した。しかしながら、ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＣＤ４０Ｌ適用により、適用したＲＮＡ量と相関するＣＤ４０活性化の強い増加が、トランスプレゼンテーション条件下で検出され、これは、Ｋ５６２−ＣＤ２７添加により達成され、それゆえに翻訳されたＤｕｏｋｉｎｅが介在する細胞−細胞−相互作用を可能にする(図２５Ａ)。トランスプレゼンテーション条件を伴わないｈ３＿ＣＤ２７Ｌまたはｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＣＤ４０ＬをコードするＩＶＴ−ＲＮＡのエレクトロポレーションによるＣＤ２７−活性化は、ＩＬ−８分泌測定では検出されなかった。Ｋ５６２＿ＣＤ４０が介在するトランスプレゼンテーション条件下、ＣＤ２７−活性化は、ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＣＤ４０Ｌ融合構築物のＫ５６２−エレクトロポレーションにより検出された(図２５Ｂ)。

ｈ３＿ＯＸ４０Ｌおよびｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＯＸ４０Ｌ構築物は、ＯＸ４０受容体の活性化に介在した。再び、ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＯＸ４０Ｌの適用により、適用したＲＮＡ量と相関するＯＸ４０活性化の明確な増加が、Ｋ５６２＿ＣＤ２７が介在するトランスプレゼンテーション条件下、観察された(図２５Ｃ)。ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＯＸ４０ＬによるＣＤ２７活性化は、Ｋ５６２＿ＯＸ４０が介在するトランスプレゼンテーション条件下のみ検出可能であった(図２５Ｄ)。

ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿４−１ＢＢＬ適用による４１ＢＢ−およびＣＤ２７−活性化は、それぞれＫ５６２＿ＣＤ２７およびＫ５６２＿４−１ＢＢが介在するトランスプレゼンテーション条件下の両者で明確に検出可能であった(図２５ＥＦ)。

ｈ３＿４−１ＢＢＬ−ｈ３＿ＣＤ４０Ｌおよびｈ１＿４−１ＢＢＬ−ｈ１＿ＣＤ４０Ｌ構築物は、トランスプレゼンテーション非存在下でもＣＤ４０受容体活性化に介在した。しかしながら、Ｋ５６２＿４−１ＢＢが介在するトランスプレゼンテーション条件下、適用したＲＮＡ量に相関するＣＤ４０活性化の強い増加が検出された(図２５Ｇ)。ｈ３＿４−１ＢＢＬ−ｈ３＿ＣＤ４０Ｌおよびｈ１＿４−１ＢＢＬ−ｈ１＿ＣＤ４０Ｌ適用による４１ＢＢの活性化は、Ｋ５６２＿ＣＤ４０が介在するトランスプレゼンテーション条件下、明確に検出可能であった(図２５Ｈ)。

実施例１５：抗原特異的ＣＤ８ ^＋ Ｔ細胞増殖に対するＤｕｏｋｉｎｅおよびｍＲＮＡコード化ｓｃＤｕｏｋｉｎｅの効果
ＨＬＡ−Ａ２^＋末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)を、Transfusionszentrale at the University Hospital in Mainz, Germanyの献血血液から得た。単球を、抗ＣＤ１４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ(Miltenyi)を使用する磁気活性化細胞選別(ＭＡＣＳ)テクノロジーによりＰＢＭＣから単離した；末梢血リンパ球(ＰＢＬ、ＣＤ１４⁻画分)を後のＴ細胞−単離のために凍結した。未成熟ＤＣ(ｉＤＣ)への分化のために、単球を、５％ヒトＡＢ−血清(Gibco)、ピルビン酸ナトリウム(Gibco)、非必須アミノ酸、１００ＩＵ／mLペニシリンおよび１００μg／mLストレプトマイシン、１０００ＩＵ／mL 顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子および１０００ＩＵ／mL ＩＬ−４(両者ともMiltenyi)含有ＲＰＭＩ ＧｌｕｔａＭＡＸで４〜５日培養した。培地の半分を、この４〜５日の間に１回新鮮培地に置き換えた。ｉＤＣを回収し、エレクトロポレーション前に、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５培地で１回洗浄し、３００.０００〜５００.０００細胞／１５０μlでＸ−Ｖｉｖｏ１５に再懸濁した。１５０μlの細胞懸濁液を、多ウェル−エレクトロポレーション用９６ウェルプレートにピペットで移し、該プレートは、すでに、必要なＩＶＴ−ＲＮＡ、すなわち、それぞれ、抗原クローディン−６をコードするＲＮＡと記載するＴＮＦＲ−リガンド−融合タンパク質をコードするＲＮＡまたは対照用の無関係ＲＮＡ(ルシフェラーゼをコード)を含んだ。ＲＮＡ含有細胞懸濁液を混合後、エレクトロポレーションを多ウェルエレクトロポレーションデバイス(３００Ｖ、１×１２msパルス)で実施した。エレクトロポレーション直後、細胞を、５％ヒトＡＢ血清添加１００μlのＩＭＤＭ培地の添加により新規培養プレートに移し、インキュベーターで約１〜３時間休息させた。

ＣＤ８^＋ Ｔ細胞を、残存ＨＬＡ−Ａ２^＋末梢血リンパ球から抗ＣＤ８ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ(Miltenyi)を使用するＭＡＣＳテクノロジーで分離し、これをＣＤ１４^＋−ＭＡＣＳ−単離後凍結させた。ＣＤ８^＋ Ｔ細胞をＸ−ｖｉｖｏ１５培地で１回洗浄し、最終濃度１０×１０^６細胞／２５０μlでＸ−Ｖｉｖｏ１５に再懸濁させた。１０×１０^６ ＣＤ８^＋ Ｔ細胞を、２５０μl培地中、１０μgのクローディン−６−ＴＣＲのアルファ鎖をコードするＩＶＴ−ＲＮＡと１０μgのクローディン−６−ＴＣＲのベータ鎖をコードするＩＶＴ−ＲＮＡ(ＨＬＡ−Ａ２^＋に限定)で電気穿孔した。対照として、ＴＰＴＥ−ＴＣＲをコードするＲＮＡ(ＨＬＡ−Ａ２^＋に限定)を使用した。エレクトロポレーションを、４mmエレクトロポレーションキュベットで、ＢＴＸ ＥＣＭ(登録商標)８３０エレクトロポレーション系デバイス(５００Ｖ、１×３msパルス)を使用して、２５０μl Ｘ−Ｖｉｖｏ１５中実施した。エレクトロポレーション直後、細胞を５％ヒトＡＢ血清添加新鮮ＩＭＤＭ培地に移し、インキュベーターで少なくとも１時間休息させた。次いで、Ｔ細胞を、製造業者(Invitrogen)のプロトコールに従い、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(ＣＦＳＥ)で染色した。

ＴＮＦＲ−リガンド構築物(ＩＶＴ−ＲＮＡ)が介在する効果を分析するために、ＣＦＳＥ−増殖アッセイを実施した。この目的のために、計５.０００個の電気穿孔ＤＣを、すでにそれぞれＣＬＤ６−ＴＣＲまたはＴＰＴＥ−ＴＣＲをコードするＲＮＡで電気穿孔されている５０.０００ Ｔ細胞をすでに含む９６ウェルプレートに添加した。インキュベーションを、５％ヒトＡＢ血清１００ＩＵ／mLペニシリンおよび１００mg／mLストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ １６４０ ＧｌｕｔａＭＡＸ中で実施した。ＰＢＭＣ増殖を、インキュベーション５日後フローサイトメトリーにより測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。

ＤＣのクローディン−６抗原−ＲＮＡおよびｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＣＤ４０Ｌ ＲＮＡまたはｈ３＿ＣＤ４０Ｌ−ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ ＲＮＡとの共エレクトロポレーションは、ＣＤ８^＋−Ｔ細胞の増殖を増加させ、より具体的に、より多くのＴ細胞が分裂状態となり(“分裂細胞％”増加)、次いでまた分裂がより頻繁になった(“増殖指数”増加)(図２６Ａ〜Ｃ)。対照的に、クローディン−６抗原−ＲＮＡおよび二つの別々のタンパク質ｈ３＿ＣＤ４０Ｌおよびｈ３＿ＣＤ２７Ｌをコードする単一構築物との共エレクトロポレーションは、Ｔ細胞増殖を増加させなかった(図２６Ａ)。さらに、ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＣＤ４０Ｌは、対照Ｔ細胞、ＴＰＴＥ−ＴＣＲ^＋ ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の相当な増殖を誘発せず、該構築物が抗原非特異的方式でＴ細胞増殖を活性化しないことが示された(図２６Ｂ)。ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＣＤ４０Ｌおよびｈ３＿ＣＤ４０Ｌ−ｈ３＿ＣＤ２７Ｌは、同等な効果に介在した(図２６Ａ)。ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ−ｈ３＿ＣＤ４０Ｌは、一方でＤＣに発現されるＣＤ４０に結合し、活性化でき、他方でＴ細胞に構成的に発現されるＣＤ２７に結合し、活性化でき、それにより、これらの細胞をトランスで架橋する、融合タンパク質の例である。

同じ方法で、ＤＣと抗原−ＲＮＡおよびｈ３＿４−１ＢＢＬ−ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ ＲＮＡの共エレクトロポレーションは、ＣＤ８^＋−Ｔ細胞の増殖を増加させ、一方抗原−ＲＮＡおよび二つの別々のタンパク質ｈ３＿４−１ＢＢＬおよびｈ３＿ＣＤ２７Ｌをコードする単一構築物との共エレクトロポレーションは、Ｔ細胞増殖を増加させなかった(図２７Ａ)。さらに、ｈ３＿４−１ＢＢＬ−ｈ３＿ＣＤ２７Ｌは、対照Ｔ細胞、ＴＰＴＥ−ＴＣＲ^＋ ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の増殖を誘発せず、該構築物が抗原非特異的方式でＴ細胞増殖を活性化しないことを示した(図２７Ｂ)。

ｈ３＿４−１ＢＢＬ−ｈ３＿ＣＤ２７Ｌ(ｓｃＤｕｏｋｉｎｅに対応)およびｈ１＿４−１ＢＢＬ−ｈ１＿ＣＤ２７Ｌ(Ｄｕｏｋｉｎｅに対応)は、同等な効果に介在した(図２７Ａ)。ｈ３＿４−１ＢＢＬ−ｈ３＿ＣＤ２７Ｌは、Ｔ細胞に構成的に発現されるＣＤ２７に結合し、活性化でき、活性化によりＴ細胞に発現する４−１ＢＢに結合し、活性化でき、それにより、おそらく、該受容体をシスで架橋する融合タンパク質の例である。

組み換えＤｕｏｋｉｎｅの効果を分析するために、ｉＤＣとＴ細胞の共培養をエレクトロポレーション１日後に、上記細胞数および比で開始した。同時に、組み換えタンパク質を記載したとおり添加した。次いで、ＰＢＭＣ増殖をインキュベーション４日後測定した。

組み換え融合タンパク質ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ２７Ｌ、４１ＢＢＬ−ＣＤ４０Ｌおよび４−１ＢＢＬ−ＣＤ２７ＬのＴ細胞：ＤＣ共培養への添加は、ＣＤ８^＋−Ｔ細胞の増殖を増加させた(図２８Ａ)。より多くのＴ細胞が分裂状態となり(“分裂細胞％”増加)、次いでまた分裂がより頻繁となった(“増殖指数”増加)(図２８Ｂ)。対照的に、ＴＮＦＲリガンドタンパク質の別々の添加は、Ｔ細胞増殖を増加させなかった。

実施例１６：固定化受容体およびＰＢＭＣへのＤｕｏｋｉｎｅの同時結合はＴ細胞の活性化および増殖に至る
溶液中の４−１ＢＢＬ／ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ／ＣＤ２７ＬおよびＣＤ４０Ｌ／ＣＤ２７ＬからなるＤｕｏｋｉｎｅがＴ細胞を活性化できることが示された。さらなる実験として、これらのＤｕｏｋｉｎｅが、第二受容体結合特異性への活性化を制限する、プラスチック表面へ固定化された受容体への結合により提示されたときにも、Ｔ細胞を活性化するか否かを分析した。それゆえに、２００ng／ウェル受容体−Ｆｃ(ＣＤ４０−Ｆｃ、ＣＤ２７−Ｆｃ、４−１ＢＢ−Ｆｃ、ＯＸ４０−Ｆｃ)を、マイクロタイタープレートに一夜、４℃で固定化した。残存結合部位を、ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＣＳで１時間遮断した。連続希釈したＤｕｏｋｉｎｅ(ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ２７Ｌ、４−１ＢＢＬ−ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ−ＣＤ２７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ４０ＬおよびＯＸ４０Ｌ−ＣＤ２７Ｌ)を固定化受容体と１時間インキュベートし、次いで未結合タンパク質を洗い流した。その間、ヒトＰＢＭＣを、製造業者の指示に従い、CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit(Life Technologies)を使用して６２５nM カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(ＣＦＳＥ)で、１×１０^６細胞／mL濃度で染色した。Ｔ細胞の一次刺激のために、抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体(ＵＣＨＴ−１、R&D systems, Minneapolis, USA)を、１：３モル比で抗マウスＩｇＧと架橋させた。ＰＢＭＣ(１.５×１０^５細胞／ウェル)を、固定化受容体に結合したＤｕｏｋｉｎｅを含むアッセイプレートに一次刺激と共に添加した。６日後、Ｔ細胞の増殖をフローサイトメトリーにより決定した。Ｔ細を、ＣＤ３−ＰＥ、ＣＤ４−ＶｉｏＢｌｕｅおよびＣＤ８−ＰＥ−Ｖｉｏ７７０での抗体染色により同定した。全Ｄｕｏｋｉｎｅに次いで、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞の増殖の増加が観察され、Ｄｕｏｋｉｎｅの両結合部位が機能的であり、それらが、ＣＤ３により提供される一次刺激と共にＴ細胞の共刺激を誘発できることをさらに示した(図２９)。ＣＤ３刺激非存在下では増殖は観察されず、ＤｕｏｋｉｎｅによるＴ細胞活性化の一次活性化への依存を支持した。

実施例１７：固定化受容体およびＰＢＭＣへの一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅの同時結合はＴ細胞の活性化および増殖に至る
溶液中の４−１ＢＢＬ／ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ／ＣＤ２７ＬおよびＣＤ４０Ｌ／ＣＤ２７Ｌからなる一本鎖ＤｕｏｋｉｎｅがＴ細胞を活性化できることが示された。さらなる実験として、これらの一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅが、第二受容体結合特異性への活性化を制限する、プラスチック表面へ固定化された受容体への結合により提示されたときにも、Ｔ細胞を活性化するか否かを分析した。それゆえに、２００ng／ウェル受容体−Ｆｃ(ＣＤ４０−Ｆｃ、ＣＤ２７−Ｆｃ、４−１ＢＢ−Ｆｃ、ＯＸ４０−Ｆｃ)を、マイクロタイタープレートに一夜、４℃で固定化した。残存結合部位を、ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＣＳで１時間遮断した。連続希釈した一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅ(ｓｃＣＤ４０Ｌ−ｓｃＣＤ２７Ｌ、ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＣＤ４０Ｌ、ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＣＤ２７Ｌ、ｓｃＯＸ４０Ｌ−ｓｃＣＤ４０ＬおよびｓｃＯＸ４０Ｌ−ｓｃＣＤ２７Ｌ)を固定化受容体と１時間インキュベートし、その後未結合タンパク質を洗い流した。その間、ヒトＰＢＭＣを、製造業者の指示に従い、CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit(Life Technologies)を使用して６２５nM カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(ＣＦＳＥ)で、１×１０^６細胞／mL濃度で染色した。Ｔ細胞の一次刺激のために抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体(ＵＣＨＴ−１、R&D systems, Minneapolis, USA)を、１：３モル比で抗マウスＩｇＧと架橋させた。１.５×１０^５ ＰＢＭＣ／ウェルを、固定化受容体に結合した一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅを含むアッセイプレートに一次刺激と共に添加した。６日後、Ｔ細胞の増殖をフローサイトメトリーにより決定した。Ｔ細を、ＣＤ３−ＰＥ、ＣＤ４−ＶｉｏＢｌｕｅおよびＣＤ８−ＰＥ−Ｖｉｏ７７０での抗体染色により同定した。全一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅについて、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞の増殖の増加が観察され、一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅの両結合部位が機能的であり、それらが、ＣＤ３により提供される一次刺激と共にＴ細胞の共刺激を誘発できることをさらに示した(図３０)。ＣＤ３刺激非存在下では増殖は観察されず、一本鎖ＤｕｏｋｉｎｅによるＴ細胞活性化の一次活性化への依存を支持した。

実施例１８：ヒト血漿における選択したＤｕｏｋｉｎｅおよび一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅの安定性
Ｄｕｏｋｉｎｅおよび一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅの安定性を、ヒト血漿を使用してインビトロで試験した。２００nMの精製Ｄｕｏｋｉｎｅおよび一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅを、健常ドナーからの５０％ヒト血漿中調製した。サンプルを、調製後すぐ(０日)または３７℃で１日、３日および７日インキュベート後に−２０℃で凍結させた。インタクトなタンパク質のレベルを、Ｃ末端ホモ三量体リガンド単位の固定化受容体(１５０ng／ウェル)への結合を経るＥＬＩＳＡおよびＮ末端ＦＬＡＧタグの検出を使用して測定した。希釈血漿サンプル中のタンパク質濃度を、精製タンパク質の標準曲線から内挿した。０日の検出融合タンパク質量を１００％と設定した。全ての可能なリガンド組み合わせをカバーする６個のＤｕｏｋｉｎｅおよび６個の一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅを使用し、受容体結合アッセイにより確認されるとおり、全ての構築物はインタクトタンパク質レベルの時間依存的減少を示した。７日後、大部分のリガンド組み合わせについて５０〜７０％インタクトＤｕｏｋｉｎｅが血漿サンプルで検出可能であった(図３１、左側)。４−１ＢＢＬ−ＣＤ２７Ｌの場合のみ、インタクトタンパク質の量が、７日後１０％未満まで減少し、第一日目の減少は４０％であった。一般に、一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅは、７日後２０〜５０％インタクトタンパク質残存という減少した安定性を示した(図３１、右側)。

実施例１９：ＣＤ１マウスにおける選択したマウスｄｕｏｋｉｎｅおよびマウス一本鎖ｄｕｏｋｉｎｅの薬物動態性質
選択したマウス特異的ｄｕｏｋｉｎｅおよびその対応する一本鎖ｄｕｏｋｉｎｅのインビボバイオアベイラビリティを、１回ｉ.ｖ.注射後の血清濃度測定により試験した。雌ＣＤ１マウス(１２〜１６週齢、３０〜３５ｇ、３マウス／ｄｕｏｋｉｎｅ)は、それぞれ、２５μg ｍ４−１ＢＢＬ−ｍＣＤ４０Ｌおよびｍｓｃ４−１ＢＢＬ−ｍｓｃＣＤ４０Ｌの１回静脈内注射を、総体積各１５０μlで受けた。血液サンプルを、注射３分、３０分、１時間、２時間、６時間、１日および３日後に尾静脈から採り、氷上で３０分インキュベートし、１３,０００ｇで３０分、４℃で遠心分離した。血清を細胞成分から分離し、サンプルを−２０℃で保存した。融合タンパク質の血清レベルを、ＥＬＩＳＡにおいてＣ末端リガンドに対応する固定化受容体(１５０ng／ウェル)への結合およびＮ末端ＦＬＡＧタグを経る検出により決定した。全タンパク質の血清濃度を、精製タンパク質の標準曲線からの内挿により得た。比較のために、３分での濃度を１００％と設定した。初期相および終末相半減期(ｔ_１／２α_{３−６０分}、ｔ_１／２β_{１−２４時間})をエクセルで計算した。ｍ４−１ＢＢＬ−ｍＣＤ４０Ｌおよびｍｓｃ４−１ＢＢＬ−ｍｓｃＣＤ４０Ｌの両者は、３.８時間(一本鎖ｄｕｏｋｉｎｅ)および５.６時間(ｄｕｏｋｉｎｅ)の終末相半減期を示し、両者共、１０〜１３分の短初期相半減期で血流からのクリアランスを示した(図３２)。ＦｃＲｎ介在再循環を利用する完全長ＩｇＧ(セツキシマブ)と比較して、両構築物は急速に除去された。６.６時間の終末相半減期を有するｓｃＦｖ−４−１ＢＢＬ融合タンパク質(データは示していない)との比較は、ｍ４−１ＢＢＬ−ｍＣＤ４０Ｌおよびｍｓｃ４−１ＢＢＬ−ｍｓｃＣＤ４０Ｌの半減期が、これらの機能的に関係する、免疫賦活性融合タンパク質と類似範囲内であることを示す。Ｄｕｏｋｉｎｅを含む免疫賦活性融合タンパク質の一般の迅速なクリアランスは、標的細胞(すなわち免疫細胞)特異的消費を指す。

実施例２０：ヒトＰＢＭＣの受容体発現および免疫細胞亜集団への一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅの結合
一本鎖ＤｕｏｋｉｎｅのＰＢＭＣ集団内の可能な標的細胞集団および実際の標的細胞を決定するために、ヒトＰＢＭＣを、詳細に特徴付けした。健常ドナーからのＰＢＭＣを融解し、細胞培養皿で一夜、４℃でインキュベートした。翌日、２.５×１０^５ ヒトＰＢＭＣを、１０nM 一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅと、応答制限、一次刺激としての準最適濃度の架橋抗ヒトＣＤ３抗体の存在下または非存在下、インキュベートした。３日、３７℃の後、種々の亜集団をＣＤマーカー染色(抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ２０および抗ＣＤ５６)によるフローサイトメトリーで同定し、種々の亜集団への一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅの結合を、ＦＬＡＧタグ検出により評価した。さらに、刺激および非刺激ＰＢＭＣを一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅを伴わずにもインキュベートし、亜集団を培養３日後に同定し、ＣＤ４０、ＣＤ２７、４−１ＢＢおよびＯＸ４０の表面発現を抗体染色により決定した。非刺激ＰＢＭＣは約４０％ＣＤ８^＋ Ｔ細胞、４０％ＣＤ４^＋ Ｔ細胞、１５％Ｂ細胞および５％ＮＫ細胞からなった(図３３、上部左)。ＰＢＭＣの処理により、全ての単球はプラスチック表面に付着し、実験系には存在しなかった。抗ＣＤ３ ｍＡｂでの刺激３日後、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の量は、全ての他の細胞型のパーセンテージのわずかな減少を伴い、約８０％増加した(図３３、下部左)。受容体ＣＤ４０およびＣＤ２７は、Ｂ細胞(ＣＤ４０)および両タイプのＴ細胞(ＣＤ２７)に、刺激と無関係に構成的に発現された。４−１ＢＢおよびＯＸ４０はあらゆる非刺激ＰＢＭＣに存在しなかったが、約８０％刺激ＣＤ４^＋ Ｔ細胞および４０％刺激ＣＤ８^＋ Ｔ細胞が両受容体を発現した(図３３、中部パネル)。受容体発現に一致して、３個の試験したトランス作用性一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅ(ｓｃＣＤ４０Ｌ−ｓｃＣＤ２７Ｌ、ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＣＤ４０ＬおよびｓｃＯＸ４０Ｌ−ｓｃＣＤ４０Ｌ)は、刺激および非刺激Ｂ細胞にほぼ排他的に結合した(図３３、上部右)。シス作用性一本鎖Ｄｕｏｋｉｎｅ(ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＣＤ２７ＬおよびｓｃＯＸ４０Ｌ−ｓｃＣＤ２７Ｌ)は、非刺激条件においてＣＤ４^＋ Ｔ細胞の画分にのみおよび刺激後ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞の大部分に結合した(図３３、下部右)。要約すると、これらの実験は、トランス作用性分子が刺激と無関係にＢ細胞を標的とし、一方シス作用性構築物は活性化ＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋ Ｔ細胞を標的とすることを示す。

実施例２１：シス作用性一本鎖ｄｕｏｋｉｎｅのヒト免疫細胞への結合およびＴ細胞増殖の誘発
ヒト免疫細胞への結合とＴ細胞増殖の誘発の関連を、ある選択したシス作用性一本鎖ｄｕｏｋｉｎｅで試験した。このために、２.５×１０^５ ヒトＰＢＭＣ(混合集団)を、一次準最適刺激としての架橋抗ヒトＣＤ３抗体の存在下または非存在下、１０nM ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＣＤ２７Ｌとインキュベートした。３日、３７℃の後、種々の亜集団をＣＤマーカー染色(抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２０および抗ＣＤ５６)によるフローサイトメトリーで同定した。ＣＤ２７および４−１ＢＢの表面発現を抗体染色により決定し、一本鎖ｄｕｏｋｉｎｅの結合を、ＦＬＡＧタグ検出により評価した。１.５×１０^５ ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣ(混合集団、種々のＰＢＭＣバッチ)を、一次準最適刺激としての架橋抗ヒトＣＤ３抗体の存在下または非存在下、３０nM、３nM、０.３nMまたは０nM ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＣＤ２７Ｌとインキュベートした。６日後、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞の増殖は、ＣＦＳＥ希釈によるフローサイトメトリーで決定した。一次刺激として架橋抗ヒトＣＤ３抗体との組み合わせで適用したとき、ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＣＤ２７Ｌは、初期ＣＤ３介在ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞増殖を、０.３nMの低濃度ですでに３０％増強した(図３４、下部右)。一般に、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞(６０％)よりもＣＤ８^＋ Ｔ細胞(８０％)が増殖を始めた。この増殖プロファイルは、ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＣＤ２７Ｌが刺激条件において４−１ＢＢおよびＣＤ２７発現ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞の両者に結合するとの発見と一致する(図３４、下部左)。抗ＣＤ３刺激無しで、増殖ＣＤ８^＋ Ｔ細胞は全く観察されず、約１０％ＣＤ４^＋ Ｔ細胞のわずかに最低限度の増殖が観察された(図３４、上部右)。この規定増殖速度は、ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＣＤ２７Ｌにより増強されなかったが、ＣＤ２７発現ＣＤ４^＋ Ｔ細胞への結合が示され(図３４、上部左)、シス作用性Ｄｕｏｋｉｎｅが休止Ｔ細胞に作用しないことを示す。

実施例２２：トランス作用性一本鎖ｄｕｏｋｉｎｅのヒト免疫細胞への結合およびＴ細胞増殖の誘発
ヒト免疫細胞への結合とＴ細胞増殖の誘発の関連を、ある選択したトランス作用性一本鎖ｄｕｏｋｉｎｅで試験した。このために、２.５×１０^５ ヒトＰＢＭＣ(混合集団)を、一次準最適刺激としての架橋抗ヒトＣＤ３抗体の存在下または非存在下、１０nM ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＣＤ４０Ｌとインキュベートした。３日、３７℃の後、種々の亜集団をＣＤマーカー染色(抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２０および抗ＣＤ５６)によるフローサイトメトリーで同定した。ＣＤ４０および４−１ＢＢの表面発現を抗体染色により決定し、一本鎖ｄｕｏｋｉｎｅの結合を、ＦＬＡＧタグ検出により評価した。１.５×１０^５ ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣ(混合集団、種々のＰＢＭＣバッチ)を、一次準最適刺激としての架橋抗ヒトＣＤ３抗体の存在下または非存在下、３０nM、３nM、０.３nMまたは０nM ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＣＤ４０Ｌとインキュベートした。６日後、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞の増殖は、ＣＦＳＥ希釈によるフローサイトメトリーで決定した。一次刺激として架橋抗ヒトＣＤ３抗体との組み合わせで適用したとき、ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＣＤ４０Ｌは、初期ＣＤ３介在ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞増殖を、０.３nMの低濃度ですでに５０〜６０％強く増強した。一般に、ほぼ全てのＣＤ８^＋ Ｔ細胞(９０％)および約７０％ＣＤ４^＋ Ｔ細胞が増殖を開始した(図３５、下部右)。ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４０を構成的に発現するＢ細胞に最初に結合し、初回抗原刺激を受けた４−１ＢＢ発現Ｔ細胞へのこの一本鎖ｄｕｏｋｉｎｅの４−１ＢＢＬモジュールのトランスプレゼンテーションを可能とする(図３５、下部右)。ＣＤ３刺激無しで、わずかに最低限度の(３％)ＣＤ８^＋ Ｔ細胞増殖が観察でき、９％増殖細胞までのわずかな増加が、ｓｃ４−１ＢＢＬ−ｓｃＣＤ４０Ｌの添加により観察され、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の微量画分が、意図的ＣＤ３誘発非存在下で、トランス活性化に応答できることを示し(図３５、上部パネル)、これらの細胞が前活性化状態であることを示唆した。

実施例２３：トランス作用性一本鎖ｄｕｏｋｉｎｅのヒト免疫細胞への結合およびＴ細胞増殖の誘発
ヒト免疫細胞への結合とＴ細胞増殖の誘発の関連を、第二選択トランス作用性一本鎖ｄｕｏｋｉｎｅで試験した。このために、２.５×１０^５ ヒトＰＢＭＣ(混合集団)を、一次準最適刺激としての架橋抗ヒトＣＤ３抗体の存在下または非存在下、１０nM ｓｃＣＤ４０Ｌ−ｓｃＣＤ２７Ｌとインキュベートした。３日、３７℃の後、種々の亜集団をＣＤマーカー染色(抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２０および抗ＣＤ５６)によるフローサイトメトリーで同定した。ＣＤ４０およびＣＤ２７の表面発現を抗体染色により決定し、一本鎖ｄｕｏｋｉｎｅの結合を、ＦＬＡＧタグ検出により評価した。１.５×１０^５ ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣ(混合集団、種々のＰＢＭＣバッチ)を、一次準最適刺激としての架橋抗ヒトＣＤ３抗体の存在下または非存在下、３０nM、３nM、０.３nMまたは０nM ｓｃＣＤ４０Ｌ−ｓｃＣＤ２７Ｌとインキュベートした。６日後、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞の増殖は、ＣＦＳＥ希釈によるフローサイトメトリーで決定した。一次刺激として架橋抗ヒトＣＤ３抗体との組み合わせで適用したとき、ｓｃＣＤ４０Ｌ−ｓｃＣＤ２７Ｌは、初期ＣＤ３介在ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞の増殖を、０.３nMの低濃度ですでに２０〜３５％増強した(図３６、下部右)。一般に、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞(４５％)よりわずかに多いＣＤ８^＋ Ｔ細胞(６０％)が増殖を開始した。ＣＤ２７は、抗体染色により確認されたとおり全ＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋ Ｔ細胞に構成的に発現され、ｓｃＣＤ４０Ｌ−ｓｃＣＤ２７Ｌ ｄｕｏｋｉｎｅの結合は、全ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の５０％で検出されたが、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞では検出レベル限界未満であった。ｓｃＣＤ４０Ｌ−ｓｃＣＤ２７ＬはまたＣＤ４０を構成的に発現するＢ細胞の完全集団に結合することも判明した(図３６、下部左)。従って、ＣＤ２７^＋ ＣＤ４細胞−ＣＤ４０^＋ Ｂ細胞相互作用によるｓｃＣＤ４０Ｌ−ｓｃＣＤ２７Ｌの直接トランス活性化は、容易にＣＤ４^＋ Ｔ細胞増殖の原因となるが、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の場合、さらなる、今までのところ特定されていない機構／細胞が、この一本鎖ｄｕｏｋｉｎｅによる強いトランス活性化を可能にするために必要であると考えられる。ＣＤ３刺激無しで、ｄｕｏｋｉｎｅ ｓｃＣＤ４０Ｌ−ｓｃＣＤ２７Ｌに応答したＴ細胞増殖は、ＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋ Ｔ細胞でそれぞれ１％から約１０％および５％から２５％に増加し(図３６、上部右)、あるＴ細胞が、意図的ＣＤ３活性化無しで共刺激性シグナルに応答できることを示し、同様に、前活性化細胞の亜集団の存在を示唆する。

要約すると、ｓｃＣＤ４０Ｌ−ｓｃＣＤ２７Ｌが介在する可成りのＴ細胞活性化は、全Ｔ細胞上のＣＤ２７および全Ｂ細胞上のＣＤ４０の構成的発現に起因するものであり(図３６、上部左)、他の免疫細胞の拡張されたクロストークおよび活性化に至り得る。

Claims (16)

1. Ａ）腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)スーパーファミリーの第一リガンドの細胞外ドメインおよびＴＮＦスーパーファミリーの第二リガンドの細胞外ドメインを含むサイトカイン融合タンパク質であって、ここで、第一リガンドと第二リガンドが異なり、これらの細胞外ドメインが共有結合により結合している、サイトカイン融合タンパク質；および
   Ｂ）（ｉ）第一リガンドの受容体への結合が可能な第一ホモ三量体を形成する、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーの第一リガンドの３個の細胞外ドメインおよび（ｉｉ）第二リガンドの受容体への結合が可能な第二ホモ三量体を形成する、ＴＮＦスーパーファミリーの第二リガンドの３個の細胞外ドメインを含むサイトカイン融合タンパク質であって、ここで、第一リガンドと第二リガンドが異なり、第一ホモ三量体および第二ホモ三量体が、共有結合により結合している、サイトカイン融合タンパク質、
   からなる群から選択されるサイトカイン融合タンパク質であって、
   サイトカイン融合タンパク質Ａ）およびＢ）において、第一リガンドがＣＤ４０Ｌであり、第二リガンドが４−１ＢＢＬであり、ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインが配列番号１のアミノ酸残基５１〜２６１または１１６〜２６１を含むかまたはこれからなり、４−１ＢＢＬの細胞外ドメインが配列番号３のアミノ酸残基７１〜２５４を含むかまたはこれからなり、
   サイトカイン融合タンパク質Ａ）は、一般式
   〔式中、Ａは第一リガンドの細胞外ドメインを含み、Ｂは第二リガンドの細胞外ドメインを含み、Ｌはペプチドリンカーを含む。〕
   を有する３サブユニットを含み、サイトカイン融合タンパク質Ａ）は、三量体複合体として存在し、ここで、第一リガンドの該３個の細胞外ドメインが第一リガンドの受容体に結合できる第一ホモ三量体を形成し、第二リガンドの該３個の細胞外ドメインが第二リガンドの受容体に結合できる第二ホモ三量体を形成する、および
   サイトカイン融合タンパク質Ｂ）は、一般式
   〔式中、Ａは第一リガンドの細胞外ドメインを含み、Ｂは第二リガンドの細胞外ドメインを含み、Ｌはペプチドリンカーを含み、Ｌ_ＡおよびＬ_Ｂは、各々、独立して共有結合およびペプチドリンカーから選択される。〕
   を有する分子／構造を有する、
   ものである、サイトカイン融合タンパク質。
2. Ｌがさらに、サイトカイン融合タンパク質の多量体化を可能とする多量体化ドメインを含む、請求項１に記載のサイトカイン融合タンパク質。
3. 多量体化ドメインが、ＩｇＥ重鎖ドメイン２、ＩｇＭ重鎖ドメイン２、ＩｇＧ重鎖ドメイン３、ＩｇＡ重鎖ドメイン３、ＩｇＤ重鎖ドメイン３、ＩｇＥ重鎖ドメイン４、ＩｇＭ重鎖ドメイン４、Ｆｃドメイン、およびウテログロビン二量体化ドメインからなる群から選択される、請求項２に記載のサイトカイン融合タンパク質。
4. 多量体として存在する、請求項２または３に記載のサイトカイン融合タンパク質。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載のサイトカイン融合タンパク質またはそのサブユニットをコードする、核酸分子。
6. 発現制御配列に操作可能に結合した、請求項５に記載の核酸分子。
7. ベクターに含まれている、請求項５または６に記載の核酸分子。
8. ＲＮＡ分子である、請求項７に記載の核酸分子。
9. 請求項５〜８のいずれかに記載の核酸分子を含む、細胞。
10. 活性剤として、請求項１〜４のいずれか１項に記載のサイトカイン融合タンパク質、請求項５〜８のいずれか１項に記載の核酸分子または請求項９に記載の細胞を含み、任意に薬学的に許容される担体および／または添加物を含む、医薬組成物。
11. 請求項１〜４のいずれか１項に記載のサイトカイン融合タンパク質、請求項５〜８のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項９に記載の細胞または請求項１０に記載の医薬組成物を含む、キット。
12. 医薬として使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載のサイトカイン融合タンパク質。
13. 医薬として使用するための、請求項５〜８のいずれか１項に記載の核酸分子。
14. 医薬として使用するための、請求項９に記載の細胞。
15. 医薬として使用するための、請求項１０に記載の医薬組成物。
16. 癌、感染症、炎症性疾患、代謝疾患、自己免疫障害、変性疾患、アポトーシス関連疾患および移植片拒絶からなる群から選択される疾患の処置または予防に使用するための医薬の製造のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載のサイトカイン融合タンパク質、請求項５〜８のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項９に記載の細胞または請求項１０に記載の医薬組成物、の使用。