JP2022537066A - キメラタンパク質を発現するｔ細胞 - Google Patents

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Abstract

本発明は、特に、がんの治療における使用が見出される、キメラ抗原受容体及び異種キメラタンパク質を発現する操作されたＴ細胞を含む、組成物及び方法に関する。

Description

本発明は、特に、がんの治療における使用が見出される、キメラ抗原受容体及び異種キメラタンパク質を発現する操作されたＴ細胞を含む、組成物及び方法に関する。
優先権
本出願は、２０１９年６月２１日に出願された米国出願第６２／８６４，７９１号の利益及び優先権を主張し、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
電子的に提出されたテキストファイルの記載
本出願は、配列表を含む。それは、「ＳＨＫ－０２１ＰＣ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」と題されたＡＳＣＩＩテキストファイルとして、ＥＦＳ－Ｗｅｂを経由して電子的に送信されている。配列表は、サイズが５７，７８２バイトであり、２０２０年６月１７日に作成された。配列表は、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
がんは、がん細胞が制御不能に分裂及び増殖する、調節解除された細胞増殖を伴う広範な疾患群である。ヒトに影響を与える２００以上の既知のがんの種類のうち、安全かつ効果的な治療オプションは、がんの種類のサブセットに対してのみ利用可能である。ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む操作されたＴ細胞ベースの免疫療法は、いくつかのがんの種類に対して成功裏に使用されている。しかしながら、操作されたＴ細胞は、活性がインビボで長期間維持されず、及び／または操作されたＴ細胞の抗がん活性が比較的低い。改善された抗がん活性を有する組成物及び方法に対する満たされていないニーズが残っている。
様々な態様では、本発明は、がん免疫療法に有用な組成物及び方法を提供する。例えば、本発明は、部分的に、キメラ抗原受容体を発現し、異種キメラタンパク質を発現する、操作されたＴ細胞に関する。キメラ抗原受容体及び異種キメラタンパク質は、各々、がん細胞と操作されたＴ細胞との間でシナプスを形成することが可能であり、それによって、抗がん標的化及び機能の改善を可能にする。本発明の組成物及び方法は、がんの分野における様々な欠点を克服する。
本発明の一態様は、キメラ抗原受容体及び異種キメラタンパク質を発現する操作されたＴ細胞である。キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、細胞内ドメインは、共刺激ドメイン及び／またはシグナル伝達ドメインを含む。異種キメラタンパク質は、一般構造：Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、式中、（ａ）は、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、（ｃ）は、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインである。
本発明の一態様は、異種キメラタンパク質を発現する操作されたＴ細胞であり、異種キメラタンパク質は、一般構造：Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、式中、（ａ）は、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、（ｃ）は、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインである。
一態様では、本発明は、操作されたＴ細胞を製造するための方法を提供する。本方法は、（ｉ）対象からＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞を得るステップと、（ｉｉ）キメラ抗原受容体をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第１のＤＮＡ分子で、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップと、（ｉｉｉ）異種キメラタンパク質をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第２のＤＮＡ分子で、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップと、を含む。この態様の異種キメラタンパク質は、一般構造：Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、そのうち、（ａ）は、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｃ）は、第１及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、（ｂ）は、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインである。実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉｉｉ）に先行する。実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉｉ）に先行する。実施形態では、ステップ（ｉｉ）及びステップ（ｉｉｉ）は、同時である。
別の態様では、本発明は、操作されたＴ細胞を製造するための別の方法を提供する。本方法は、（ｉ）キメラ抗原受容体をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第１のＤＮＡ分子でトランスフェクトされた、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を得るステップと、（ｉｉ）異種キメラタンパク質をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第２のＤＮＡ分子で、ステップ（ｉ）のＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップと、を含む。この態様では、異種キメラタンパク質は、一般構造：Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、式中、（ａ）は、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、（ｃ）は、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインである。
さらに別の態様では、本発明は、操作されたＴ細胞を製造するためのさらに別の方法を提供する。本方法は、（ｉ）異種キメラタンパク質をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第１のＤＮＡ分子でトランスフェクトされた、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を得るステップと、（ｉｉ）キメラ抗原受容体をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第２のＤＮＡ分子で、ステップ（ｉ）のＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップと、を含む。この態様では、異種キメラタンパク質は、一般構造：Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、式中、（ａ）は、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、（ｃ）は、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインである。
さらに別の態様では、本発明は、操作されたＴ細胞を製造するためのさらに別の方法を提供する。本方法は、（ｉ）Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を得るステップと、（ｉｉ）キメラ抗原受容体をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計されたＤＮＡ分子で、ステップ（ｉ）のＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップと、を含む。この態様では、異種キメラタンパク質は、一般構造：Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、式中、（ａ）は、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、（ｃ）は、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインである。
さらに別の態様では、本発明は、操作されたＴ細胞を分析する方法を提供する。本方法は、（Ａ）操作されたＴ細胞を製造するステップと、（Ｂ）操作されたＴ細胞を培養するステップと、（Ｃ）操作されたＴ細胞の培養上清を単離し、任意選択的に、培養上清を濃縮または部分的に精製するステップと、（Ｄ）操作されたＴ細胞の培養上清を、第２の細胞と接触させることと、及び（Ｅ）第２の細胞によるサイトカインまたはケモカインの発現を分析するステップと、を含む。実施形態では、操作されたＴ細胞は、本明細書に開示される実施形態のいずれかに従って製造される。実施形態では、第２の細胞は、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＡＣＶＲ１ｂ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＸＬ、Ｂ７－Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ３Ａ１、ＢＴＮＬ３Ａ２、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）、ＣＤ５８（ＬＦＡ３）、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２２６（ＰＴＡＵＤＮＡＭＩ）、ＣＤ２４４、ＣＤ２４７、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）、ＣＴＬＡ－４、ＤｃＲ３、Ｆａｓ、ＦＧＦＲ３、Ｆｎ１４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲＤＬ２、ＬＡＧ－３、ＬＡＰ、ＬＡＹＮ、ＬＴｂＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ４６（ＮＣＲ１）、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＴＢ－Ａ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＶＲ、ＲＡＮＫ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）、ＳＬＡＭＦ６、ＴＡＣＩ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＭＩＧＤ２、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＲＡＩＬ－Ｒ、ＶＩＳＴＡ、またはＶＳＩＧ８から選択される膜貫通タンパク質の受容体を発現する。実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２２、ＣＸＣＬ８、ＩＬ－１α／ＩＬ－１Ｆ１、ＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｆ２、ＬＡＰ（ＴＧＦ－β１）、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ Ｌ、またはそれらの任意の２つ以上の組み合わせから選択される。実施形態では、発現は、ｍＲＮＡの検出及び／または定量化によって分析される。実施形態では、発現は、タンパク質の検出及び／または定量化によって分析される。
さらに別の態様では、本発明は、操作されたＴ細胞を分析する方法を提供する。本方法は、（Ａ）操作されたＴ細胞を製造するステップと、（Ｂ）操作されたＴ細胞を、第２の細胞と共培養するステップと、（Ｃ）第２の細胞によるサイトカインの発現を分析するステップと、を含む。実施形態では、操作されたＴ細胞は、本明細書に開示される実施形態のいずれかに従って製造される。実施形態では、第２の細胞は、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＡＣＶＲ１ｂ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＸＬ、Ｂ７－Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ３Ａ１、ＢＴＮＬ３Ａ２、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）、ＣＤ５８（ＬＦＡ３）、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２２６（ＰＴＡＵＤＮＡＭＩ）、ＣＤ２４４、ＣＤ２４７、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）、ＣＴＬＡ－４、ＤｃＲ３、Ｆａｓ、ＦＧＦＲ３、Ｆｎ１４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲＤＬ２、ＬＡＧ－３、ＬＡＰ、ＬＡＹＮ、ＬＴｂＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ４６（ＮＣＲ１）、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＴＢ－Ａ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＶＲ、ＲＡＮＫ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）、ＳＬＡＭＦ６、ＴＡＣＩ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＭＩＧＤ２、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＲＡＩＬ－Ｒ、ＶＩＳＴＡ、またはＶＳＩＧ８から選択される膜貫通タンパク質の受容体を発現する。実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２２、ＣＸＣＬ８、ＩＬ－１α／ＩＬ－１Ｆ１、ＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｆ２、ＬＡＰ（ＴＧＦ－β１）、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ Ｌ、またはそれらの任意の２つ以上の組み合わせから選択される。実施形態では、発現は、ｍＲＮＡの検出及び／または定量化によって分析される。実施形態では、発現は、タンパク質の検出及び／または定量化によって分析される。
本発明の一態様は、操作されたＴ細胞の集団を得るための方法である。本方法は、本明細書で開示される方法により製造される操作されたＴ細胞を得ることと、操作されたＴ細胞の増殖を増強する培地中で、操作されたＴ細胞を培養することとを含み、それによって、操作されたＴ細胞の集団を得る。
本発明の他の態様は、本明細書に開示される操作されたＴ細胞を含む組成物と、組成物及び薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物と、を含む。
別の態様は、がんの治療において薬剤として使用するための、本明細書に開示される操作されたＴ細胞である。
さらに別の態様は、薬剤の製造における、本明細書に開示される操作されたＴ細胞の使用である。
別の態様では、本発明は、本明細書に開示される方法によって得られる操作されたＴ細胞の集団を提供する。
別の態様は、本明細書に開示される操作されたＴ細胞の集団及び薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物である。
別の態様では、本発明は、がんの治療を必要とする対象におけるがんを治療するための方法を提供する。本方法は、対象に、治療有効量の本明細書に開示される薬学的組成物を投与することを含む。
本明細書に開示される任意の態様または実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様または実施形態と組み合わせることができる。
キメラ抗原受容体及び異種キメラタンパク質を発現する操作されたＴ細胞、ならびにそれらのがん細胞との相互作用の非限定的な概略図を示す。 Ａ～Ｄは、Ｉ型膜貫通タンパク質（Ａ及びＢ、左のタンパク質）及びＩＩ型膜貫通タンパク質（Ａ及びＢ、右のタンパク質）の概略図を示す。Ｉ型膜貫通タンパク質及びＩＩ型膜貫通タンパク質は、それらの膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインが取り除かれ、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインがリンカー配列を使用して隣接し、単一のキメラタンパク質を生成するように操作され得る。Ｃ及びＤに示されるように、Ｉ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、及びＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、単一の異種キメラタンパク質に組み合わされる。 ＥＬＩＳＡアッセイを示し、安定してトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔＴ細胞からのＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ異種キメラタンパク質の発現及び分泌を示す。 ＥＬＩＳＡアッセイを示し、安定してトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔＴ細胞からのＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ異種キメラタンパク質の発現及び分泌を示す。 Ｊｕｒｋａｔ細胞によって分泌される、ヒトＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬの、異種キメラタンパク質のＩ型細胞外ドメイン（ＥＣＤ）及びＩＩ型ＥＣＤの存在を示す。Ｊｕｒｋａｔ親細胞、ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬキメラタンパク質を分泌するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞）、ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を分泌するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞）、またはｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質を分泌するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞）を培養した。「ニート（ｎｅａｔ）培養上清」は、実施例２に記載されるように調製された濃縮及び脱塩された培養上清である。点線は、ＭＳＤシグナルのバックグラウンドレベルを示している。Ａの場合、ヒトＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬタンパク質を、陽性対照として使用した。抗ヒトＰＤ－１抗体を、プレート上にコーティングした。示された量のｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬタンパク質、またはＪｕｒｋａｔ親細胞もしくはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞の示された希釈のニート培養上清を、プレートに添加した。プレートをインキュベートして、プレートに結合された抗ヒトＰＤ－１抗体による、いずれのタンパク質の捕捉を可能にした。抗ヒトＰＤ－１抗体結合キメラタンパク質は、ＭＥＳＯ ＳＣＡＬＥ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（ＭＳＤ）のプラットフォームを使用して、抗ヒト４－１ＢＢＬ抗体を使用して検出した。 Ｊｕｒｋａｔ細胞によって分泌される、ＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌの、異種キメラタンパク質のＩ型細胞外ドメイン（ＥＣＤ）及びＩＩ型ＥＣＤの存在を示す。Ｊｕｒｋａｔ親細胞、ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬキメラタンパク質を分泌するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞）、ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を分泌するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞）、またはｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質を分泌するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞）を培養した。「ニート（ｎｅａｔ）培養上清」は、実施例２に記載されるように調製された濃縮及び脱塩された培養上清である。点線は、ＭＳＤシグナルのバックグラウンドレベルを示している。Ｂの場合、ヒトＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌタンパク質を、陽性対照として使用した。抗ヒトＰＤ－１抗体を、プレート上にコーティングした。示された量のｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌタンパク質、またはＪｕｒｋａｔ親細胞もしくはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞の示された希釈のニート培養上清を、プレートに添加した。プレートをインキュベートして、プレートに結合された抗ヒトＰＤ－１抗体による、いずれのタンパク質の捕捉を可能にした。抗ヒトＰＤ－１抗体結合キメラタンパク質は、ＭＳＤプラットフォームを使用して、抗ヒトＯＸ４０Ｌ抗体を使用して検出した。 Ｊｕｒｋａｔ細胞によって分泌される、ＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌの、異種キメラタンパク質のＩ型細胞外ドメイン（ＥＣＤ）及びＩＩ型ＥＣＤの存在を示す。Ｊｕｒｋａｔ親細胞、ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬキメラタンパク質を分泌するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞）、ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を分泌するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞）、またはｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質を分泌するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞）を培養した。「ニート（ｎｅａｔ）培養上清」は、実施例２に記載されるように調製された濃縮及び脱塩された培養上清である。点線は、ＭＳＤシグナルのバックグラウンドレベルを示している。Ｃの場合、ヒトＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌタンパク質を、陽性対照として使用した。抗ヒトＣＳＦ１Ｒ抗体を、プレート上にコーティングした。示された量のｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌタンパク質、またはＪｕｒｋａｔ親細胞もしくはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞の示された希釈のニート培養上清を添加した。プレートをインキュベートして、プレートに結合された抗ヒトＣＳＦ１Ｒ抗体による、いずれのタンパク質の捕捉を可能にした。抗ヒトＣＳＦ１Ｒ抗体結合キメラタンパク質は、ＭＳＤプラットフォームを使用して、抗ヒトＣＤ４０Ｌ抗体を使用して検出した。 ＣＨＯ－Ｋ１親細胞と比較して、ヒトＣＤ４０（ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＤ４０細胞）、ヒトＰＤ－Ｌ１（ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＰＤ－Ｌ１細胞）、またはヒトＯＸ４０（ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＯＸ４０細胞）を過剰発現するように設計され、それぞれ、抗ＣＤ４０、抗ＰＤ－Ｌ１、及び抗ＯＸ４０抗体で染色されたＣＨＯ－Ｋ１細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す。Ａは、ＣＨＯ－Ｋ１親細胞と比較した、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＤ４０細胞におけるヒトＣＤ４０の過剰発現を示す。 ＣＨＯ－Ｋ１親細胞と比較して、ヒトＣＤ４０（ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＤ４０細胞）、ヒトＰＤ－Ｌ１（ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＰＤ－Ｌ１細胞）、またはヒトＯＸ４０（ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＯＸ４０細胞）を過剰発現するように設計され、それぞれ、抗ＣＤ４０、抗ＰＤ－Ｌ１、及び抗ＯＸ４０抗体で染色されたＣＨＯ－Ｋ１細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す。Ｂは、ＣＨＯ－Ｋ１親細胞と比較した、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＰＤ－Ｌ１細胞におけるヒトＰＤ－Ｌ１の過剰発現を示す。 ＣＨＯ－Ｋ１親細胞と比較して、ヒトＣＤ４０（ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＤ４０細胞）、ヒトＰＤ－Ｌ１（ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＰＤ－Ｌ１細胞）、またはヒトＯＸ４０（ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＯＸ４０細胞）を過剰発現するように設計され、それぞれ、抗ＣＤ４０、抗ＰＤ－Ｌ１、及び抗ＯＸ４０抗体で染色されたＣＨＯ－Ｋ１細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す。Ｃは、ＣＨＯ－Ｋ１親細胞と比較した、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＯＸ４０細胞におけるヒトＯＸ４０の過剰発現を示す。 Ａ及びＢは、フローサイトメトリーによって決定される、ヒト４－１ＢＢを過剰発現するＨＴ１０８０／細胞（ＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞）上のヒト４－１ＢＢ（Ａ）及びＯＸ４０（Ｂ）受容体の発現を示す。 Ａ及びＢは、フローサイトメトリーによって決定される、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞によって産生されたｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬキメラタンパク質に存在するヒトＰＤ－１及び４－１ＢＢＬのＥＣＤの、４－１ＢＢまたはＰＤ－Ｌ１を発現する細胞への結合の定量を示す。点線は、バックグラウンドシグナルを示す。Ａは、Ｊｕｒｋａｔ親細胞（黒色の棒）またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞（灰色の棒）のニート培養上清中のキメラタンパク質による、ヒト４－１ＢＢ（ＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞）を過剰発現するＨＴ１０８０細胞への結合を示す。Ｂは、Ｊｕｒｋａｔ親細胞（黒色の棒）またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ（灰色の棒）のニート培養上清中のキメラタンパク質による、ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞への結合を示す。 Ａ及びＢは、フローサイトメトリーによって決定される、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞によって産生されたｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質に存在するヒトＰＤ－１及びＯＸ４０ＬのＥＣＤの、ＯＸ４０またはＰＤ－Ｌ１を発現する細胞への結合の定量を示す。点線は、バックグラウンドシグナルを示す。Ａは、Ｊｕｒｋａｔ親細胞（黒色の棒）またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞（灰色の棒）のニート培養上清中のキメラタンパク質による、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＰＤ－Ｌ１細胞への結合を示す。Ｂは、Ｊｕｒｋａｔ親細胞（黒色の棒）またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ（灰色の棒）のニート培養上清中のキメラタンパク質による、ヒトＯＸ４０を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞への結合を示す。 Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞によって産生されるｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質に存在するヒトＣＳＦ１Ｒ及びＣＤ４０ＬのＥＣＤの、それらのそれぞれのリガンドへの結合の定量を示す。点線は、バックグラウンドシグナルを示す。Ａは、フローサイトメトリーによって測定される、Ｊｕｒｋａｔ親細胞（黒色の棒）またはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞（灰色の棒）のニート培養上清中のキメラタンパク質による、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＤ４０細胞への結合の定量を示す。 Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞によって産生されるｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質に存在するヒトＣＳＦ１Ｒ及びＣＤ４０ＬのＥＣＤの、それらのそれぞれのリガンドへの結合の定量を示す。点線は、バックグラウンドシグナルを示す。Ｂは、ＭＳＤプラットフォームを使用して検出される、Ｊｕｒｋａｔ親細胞（黒色の棒）またはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞のニート培養上清中のｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の、ヒトＣＳＦ１タンパク質への結合を示す。ヒト組換えＣＳＦ１でコーティングされたＭＳＤプレートを、実施例２で論じたように産生されたＪｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞の培養上清を増やしながら培養した。結合を、抗ヒトＣＤ４０Ｌ－ビオチン、続いてＭＳＤストレプトアビジン試薬を使用して検出した。 Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞によって産生されるキメラｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬタンパク質によるサイトカイン遺伝子の誘導を示す。２５０，０００個のＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞を培養した。Ｊｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞の示された量のニート培養上清を、ＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞培養物に添加した。３時間後、ＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞からＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成し、ＡＣＴＢ（Ａ）の遺伝子発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって評価した。ＧＡＰＤＨを使用して、デルタデルタＣＴ法に従って遺伝子発現及び倍率誘導を正規化した。点線は、Ｊｕｒｋａｔ親細胞のニート培養上清で処理されたＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞からのバックグラウンドシグナルを示す。 Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞によって産生されるキメラｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬタンパク質によるサイトカイン遺伝子の誘導を示す。２５０，０００個のＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞を培養した。Ｊｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞の示された量のニート培養上清を、ＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞培養物に添加した。３時間後、ＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞からＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成し、ＣＸＣＬ８（Ｂ）の遺伝子発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって評価した。ＧＡＰＤＨを使用して、デルタデルタＣＴ法に従って遺伝子発現及び倍率誘導を正規化した。点線は、Ｊｕｒｋａｔ親細胞のニート培養上清で処理されたＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞からのバックグラウンドシグナルを示す。 Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞によって産生されるキメラｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬタンパク質によるサイトカイン遺伝子の誘導を示す。２５０，０００個のＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞を培養した。Ｊｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞の示された量のニート培養上清を、ＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞培養物に添加した。３時間後、ＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞からＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成し、ＣＣＬ２（Ｃ）の遺伝子発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって評価した。ＧＡＰＤＨを使用して、デルタデルタＣＴ法に従って遺伝子発現及び倍率誘導を正規化した。点線は、Ｊｕｒｋａｔ親細胞のニート培養上清で処理されたＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞からのバックグラウンドシグナルを示す。 Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞によって産生されるキメラｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬタンパク質によるＩＬ－８の誘導を示す。２５０，０００個のＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞を培養した。Ｊｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞のニート培養上清を、ＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞培養物に２５％添加した。３時間後、ＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞培養物から培地を取り出し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ－８を評価した。点線は、Ｊｕｒｋａｔ親細胞のニート培養上清で処理されたＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞からのバックグラウンドシグナルを示す。 Ａ及びＢは、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞によって産生されるキメラｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌタンパク質によるＣＣＬ２発現の誘導を示す。２５０，０００個のＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞を培養した。Ｊｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞の示された量のニート培養上清を、ＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞培養物に添加した。３時間後、ＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞からＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成し、ＡＣＴＢ（ハウスキーピング対照遺伝子、Ａ）及びＣＣＬ２（Ｂ）の遺伝子発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって評価した。ＧＡＰＤＨを使用して、デルタデルタＣＴ法に従って遺伝子発現及び倍率誘導を正規化した。点線は、Ｊｕｒｋａｔ親細胞のニート培養上清で処理されたＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞からのバックグラウンドシグナルを示す。 Ａ及びＢは、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞による、ＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ Ｕ２ＯＳ－ＮＩＫ／ＮＦκＢレポーター細胞（ＤＩＳＣＯＶＥＲＸ）におけるシグナル伝達の誘導を示す。点線は、バックグラウンドシグナルを示す。Ａは、ＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ Ｕ２ＯＳ－ＮＩＫ／ＮＦκＢレポーター細胞がヒトＣＤ４０（ｈＣＤ４０）を発現することを示す。ＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ Ｕ２ＯＳ－ＮＩＫ／ＮＦκＢレポーター細胞を、ＡＰＣ結合アイソタイプ抗体または抗ヒトＣＤ４０－ＡＰＣ抗体を使用して染色し、フローサイトメトリーによって分析した。Ｂは、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞によるＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ Ｕ２ＯＳ－ＮＩＫ／ＮＦκＢレポーター細胞におけるＮＦκＢシグナル伝達の誘導を示す。示される数のＪｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞を、ＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ Ｕ２ＯＳ－ＮＩＫ／ＮＦκＢレポーター細胞と共培養した。１５μｇ／ｍＬの精製ＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の３倍段階希釈を、陽性対照として使用した。培養６時間後、ＤＩＳＣＯＶＥＲＸ発光試薬を添加し、ＰＲＯＭＥＧＡ ＧＬＯＭＡＸ機器を使用して生物発光を決定した。 ４－１ＢＢを発現する細胞と共培養した場合のＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞によるＩＬ－８分泌の誘導を示す。２５０，０００個のＨＴ１０８０／４－１ＢＢ細胞を、一晩培養した。翌日、Ｊｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞のいずれかを、ＨＴ１０８０／４－１ＢＢ細胞に、示された比率で添加した。共培養６時間後、上清を除去し、ＩＬ－８をＥＬＩＳＡによって評価した。点線は、未処理のＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞からのバックグラウンドシグナルを示す。
本発明は、部分的に、キメラ抗原受容体を発現し、異種キメラタンパク質を発現する、操作されたＴ細胞の作製に基づく。
本発明及びその利点を図１に示す。キメラ抗原受容体を発現し、異種キメラタンパク質を発現する操作されたＴ細胞を示す。少なくとも抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体は、それらの抗原結合ドメインが細胞外空間に位置する膜貫通タンパク質である。ここで、抗原結合ドメインは、がん細胞の表面上に提示される抗原に結合することができる。抗原結合ドメインが、がん細胞に結合すると、操作されたＴ細胞とがん細胞との間に安定したシナプスが形成され、この安定したシナプスは、操作されたＴ細胞による抗がん効果／腫瘍縮小に有利に働く（結合シグナルがキメラ抗原受容体の細胞内ドメインを介して細胞に伝達すると、活性化される）。図１に示されるように、いくつかのがん細胞は、操作されたＴ細胞に、キメラ抗原受容体を介して結合し、一部のがん細胞は、追加的／代替的に、操作されたＴ細胞に、異種キメラタンパク質を介して結合する。異種キメラタンパク質は、少なくとも第１のドメイン（がん細胞上のリガンド／受容体に結合する第１の膜貫通タンパク質の一部分を含む）、リンカードメイン、及び第２のドメイン（Ｔ細胞上のリガンド／受容体に結合する第２の膜貫通タンパク質の一部分を含む）を含み、操作されたＴ細胞によって発現及び分泌される。第１のドメインが、がん細胞に結合し、第２のドメインが、操作されたＴ細胞に結合すると、操作されたＴ細胞とがん細胞との間に安定したシナプスも形成される。また、この安定したシナプスは、操作されたＴ細胞による抗がん効果／腫瘍縮小に有利に働き（操作されたＴ細胞への第２のドメインの結合に応答して活性化される）、阻害シグナルを遮断する（がん細胞によって提示される第１の膜貫通タンパク質のリガンド／受容体によって伝達される）。示されるように、安定したシナプスは、キメラ抗原受容体のみを含んで形成され得、安定したシナプスは、異種キメラタンパク質のみを含んで形成され得、またはキメラ抗原受容体及び異種キメラタンパク質の両方と相乗的な安定したシナプスを形成することができる。キメラ抗原受容体及び異種キメラタンパク質は、各々、がん細胞と操作されたＴ細胞との間でシナプスを形成することが可能であるため、これは、抗がん標的化及び抗がん機能の改善を可能にする。したがって、本発明の操作されたＴ細胞、それを含む組成物、及びそれらを使用する治療方法は、優れたがん細胞殺傷及び腫瘍縮小を提供し、がん治療の分野における様々な欠点を克服する。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明は、特に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び異種キメラタンパク質を発現する操作されたＴ細胞を提供する。キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、細胞内ドメインは、共刺激ドメイン及び／またはシグナル伝達ドメインを含む。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ、キメラ免疫受容体、キメラＴ細胞受容体、または人工Ｔ細胞受容体としても知られる）は、Ｔ細胞に特定のタンパク質を標的化する新たな能力を付与するように操作された受容体タンパク質である。受容体は、抗原結合及びＴ細胞活性化機能の両方を単一の受容体に組み合わせるため、キメラである。
キメラ抗原受容体にはいくつかの世代が存在する。例えば、「第１世代」キメラ抗原受容体は、典型的には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の細胞質／細胞内シグナル伝達ドメインに融合される、膜貫通ドメインに融合された細胞外抗原結合ドメイン（例えば、短鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含む。「第１世代」キメラ抗原受容体は、典型的には、ＣＤ３ζ鎖からの細胞内シグナル伝達ドメインを有し、これは、内因性ＴＣＲからのシグナルの主要な伝達因子である。「第１の世代」キメラ抗原受容体は、天然のＴＣＲによって必要とされるように、ＨＬＡ媒介性抗原提示に依存しない、単一の融合分子におけるそれらのＣＤ３ζ鎖シグナル伝達ドメインを介して、デノボ抗原認識を提供し、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の活性化を引き起こし得る。「第２世代」キメラ抗原受容体は、様々な共刺激分子（例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、及びＯＸ４０）からの細胞内シグナル伝達ドメインを、キメラ抗原受容体の細胞質テールに付加して、Ｔ細胞に追加のシグナルを提供する。「第２世代」キメラ抗原受容体は、共刺激（例えば、ＣＤ２８または４－１ＢＢ）及び活性化（ＣＤ３ζ）ドメインの両方を含む。前臨床研究は、「第２世代」キメラ抗原受容体が、Ｔ細胞の抗がん活性を向上させることができることを示している。例えば、「第２世代」キメラ抗原受容体操作Ｔ細胞の堅牢な有効性は、慢性リンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）及び急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する患者におけるＣＤ１９分子を標的とする臨床試験で使用されている。「第３世代」キメラ抗原受容体は、複数の共刺激（例えば、ＣＤ２８及び４－１ＢＢ）及び活性化（ＣＤ３ζ）ドメインを含む。「第４世代」キメラ抗原受容体は、キメラ抗原受容体で操作されたＴ細胞によって共発現される炎症誘発性サイトカインまたは共刺激性リガンドを含む。本明細書に開示されるキメラ抗原受容体は、上記に記載されるように、任意の世代のキメラ抗原受容体を含み得る。
実施形態では、操作されたＴ細胞が提供され、柔軟なリンカーによって特異的抗体のＶＨに連結されたＶＬを含む抗原結合ドメイン（例えば、単鎖Ｆｖドメイン（ｓｃＦｖ））をコードする第１のＤＮＡセグメントと、内因性タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを部分的または完全にコードする第２のＤＮＡセグメントと、本明細書に記載の異種キメラタンパク質のいずれかをコードする第３のＤＮＡセグメントと、を含み、内因性タンパク質は、リンパ球の表面に発現され、当該リンパ球の活性化及び／または増殖を引き起こす。実施形態では、リンパ球にトランスフェクションすると、リンパ球は、ｓｃＦｖドメイン及び当該内因性タンパク質のドメインの両方を、単一の連続した鎖で、トランスフェクトされたリンパ球の表面に発現する。実施形態では、トランスフェクトされたリンパ球は、発現されたｓｃＦｖドメインがその抗原に結合すると、活性化及び／または増殖を誘発され、ＭＨＣ非制限抗体型特異性を有する。実施形態では、内因性タンパク質は、リンパ球受容体鎖、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のポリペプチド、またはＦｃもしくはＩＬ－２受容体のサブユニットである。
実施形態では、操作されたＴ細胞は、同種使用を可能にするように操作される（例えば、本明細書に記載の治療方法において）。実施形態では、操作されたＴ細胞は、機能的に障害されるか、もしくは内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現を低減させるように修飾され、及び／またはＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに結合されたＮＫＧ２Ｄリガンド結合ドメインを含むキメラ受容体を任意選択的に含む、少なくとも１つの機能的な外因性非ＴＣＲを発現するように修飾される。実施形態では、操作されたＴ細胞は、ヒト療法での使用に好適であり、例えば、操作されたＴ細胞は、修飾されていないか、または少なくとも１つの機能的な外因性非ＴＣＲだけを発現するように修飾されている、同じヒトドナーから単離された初代ヒトＴ細胞によって誘発されたＧＶＨＤ応答と比較して、組織不適合性ヒトレシピエントにおいて、ＧＶＨＤ応答が誘発されないか、または低減される。
キメラ抗原受容体の抗原結合ドメイン
本明細書で開示されるキメラ抗原受容体は、抗原結合ドメインを含み、がん細胞によって発現される抗原と結合することが可能である。
実施形態では、本発明において有用なキメラ抗原受容体の抗原結合ドメインは、がん細胞特異的抗原（例えば、ヒトのがん細胞特異的抗原）に特異的に結合する。
実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＳＤＡＢ）、ＶＨもしくはＶＬドメイン、またはラクダ科ＶＨＨドメイン、例えば、ヒトｓｃＦｖ、ヒトＦｖ、ヒトＦａｂ、ヒト（Ｆａｂ’）２、ヒト単一ドメイン抗体（ＳＤＡＢ）、またはヒトＶＨもしくはＶＬドメイン、またはヒト化ｓｃＦｖ、ヒト化Ｆｖ、ヒト化Ｆａｂ、ヒト化（Ｆａｂ’）２、ヒト化単一ドメイン抗体（ＳＤＡＢ）、またはヒト化ＶＨもしくはＶＬドメインである。
実施形態では、がん細胞によって発現される抗原（抗原結合ドメインによって認識される）は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ８０／８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＳ１／ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ７、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、ＥｐｈＡ２、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＨＥＲ２、インテグリンβ７、ルイス－Ｙ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＰＤ－Ｌ１、及び前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）からなる群から選択される。
任意選択的に、キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメインと操作されたＴ細胞の外膜との間にスペーサーを含む。理想的なスペーサーは、受容体の残部と比較して、抗原結合ドメインの柔軟性を増強し、それによって、受容体とその標的抗原との間の空間的制約を低減する。この柔軟性は、操作されたＴ細胞とがん細胞との間の抗原結合及びシナプス形成を促進する。スペーサーは、ＩｇＧまたはＣＤ８からのヒンジドメインを含み得る。
抗原結合ドメインによるがん細胞抗原の結合は、操作されたＴ細胞とがん細胞との間の安定したシナプスを形成する第１のステップである。
キメラ抗原受容体の膜貫通ドメイン
実施形態では、本発明において有用なキメラ抗原受容体の膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、Ｔ細胞受容体のベータ鎖、もしくはＴ細胞受容体のζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤｌｌａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌｌｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及びＮＫＧ２Ｃ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。
実施形態では、本発明において有用なキメラ抗原受容体の膜貫通ドメインは、膜の少なくとも一部にわたる疎水性アルファヘリックスを含む。膜貫通ドメインは、受容体全体の安定性に不可欠である。異なる膜貫通ドメインは、異なる受容体安定性をもたらす。ＣＤ２８膜貫通ドメインは、高度に発現された安定した受容体をもたらすことが知られている。
操作されたＴ細胞とがん細胞との間に安定したシナプスが形成された後、近くのキメラ抗原受容体クラスター。
キメラ抗原受容体の細胞内ドメイン
実施形態では、本発明において有用なキメラ抗原受容体の細胞内ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－ＩＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３の細胞内ドメインの一部分、もしくはＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、またはそれらの組み合わせを含む共刺激ドメインを含む。
実施形態では、本発明において有用なキメラ抗原受容体の細胞内ドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、及び／または４－１ＢＢからの共刺激ドメインを含む。
実施形態では、本発明において有用なキメラ抗原受容体の細胞内ドメインは、ＣＤ３－ζの細胞質ドメインの一部分を含むシグナル伝達ドメインを含む。正常なＴ細胞受容体の活性化は、ＣＤ３－ζの細胞質ドメインに存在する免疫受容活性化チロシンベースモチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化に依存する。このプロセスを模倣するために、ＣＤ３－ζを含むシグナル伝達ドメインは、抗原がキメラ抗原受容体の抗原結合ドメインに結合すると、操作されたＴ細胞に活性化シグナルを伝達することができる。
実施形態では、本発明において有用なキメラ抗原受容体の細胞内ドメインは、ＣＤ３－ζからのシグナル伝達ドメインを含む。
実施形態では、本発明において有用なキメラ抗原受容体の細胞内ドメインは、共刺激ドメイン及びシグナル伝達ドメインの両方を含む。
操作されたＴ細胞とがん細胞との間に安定したシナプスが形成され、近くのキメラ抗原受容体がクラスター化された後、シグナルがその細胞内ドメインを介して細胞に伝達される。
本発明の一態様は、異種キメラタンパク質を発現する操作されたＴ細胞であり、異種キメラタンパク質は、一般構造：Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、式中、（ａ）は、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、（ｃ）は、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインである。実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞前駆細胞である。実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞は、患者から得られる。実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞は、がん抗原に特異的である。
異種キメラタンパク質
本発明の一態様は、キメラ抗原受容体及び異種キメラタンパク質を発現する操作されたＴ細胞である。異種キメラタンパク質は、一般構造：Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、式中、（ａ）は、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、（ｃ）は、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインである。
実施形態では、第１のドメインは、実質的に、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン全体を含み、及び／または第２のドメインは、実質的に、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン全体を含む。
実施形態では、第１のドメインは、第１の膜貫通タンパク質のリガンド／受容体と結合することが可能であり、第２のドメインは、第２の膜貫通タンパク質のリガンド／受容体と結合することが可能である。
実施形態では、第１のドメインは、そのリガンド／受容体に結合した場合、免疫抑制シグナルを阻害することが可能であり、及び／または第２のドメインは、そのリガンド／受容体に結合した場合、免疫刺激シグナルを活性化することが可能である。
実施形態では、第１の膜貫通タンパク質のリガンド／受容体は、がん細胞によって発現され、及び／または第２の膜貫通タンパク質のリガンド／受容体は、操作されたＴ細胞及び／または天然Ｔ細胞によって発現される。
本発明に関連する一回膜貫通タンパク質は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、可溶性受容体／リガンドまたは膜結合型受容体／リガンド（すなわち、隣接する細胞の膜）との相互作用に関連する。膜貫通ドメインは、膜貫通タンパク質の原形質膜への局在化に関連する。また、細胞内ドメインは、細胞外ドメインとそのリガンド／受容体との接触に応答して、細胞の内部へのシグナル伝達に関連する。
シングルパス膜貫通タンパク質には、一般的に２つの種類があり、細胞外アミノ末端及び細胞内カルボキシ末端を有するＩ型膜貫通タンパク質（図２Ａ及び図２Ｂ、左のタンパク質を参照）、及び細胞外カルボキシ末端及び細胞内アミノ末端を有するＩＩ型膜貫通タンパク質（図２Ａ及び図２Ｂ、右のタンパク質を参照）である。膜貫通タンパク質は、受容体またはリガンドのいずれかであり得る。Ｉ型膜貫通タンパク質の場合、タンパク質のアミノ末端は、細胞の外側に向いており、したがって、細胞外環境に、他の結合パートナー（リガンドまたは受容体のいずれか）との相互作用に関与する機能ドメインを含む。ＩＩ型膜貫通タンパク質の場合、タンパク質のカルボキシ末端は、細胞の外側に向いており、したがって、細胞外環境に、他の結合パートナー（リガンドまたは受容体のいずれか）との相互作用に関与する機能ドメインを含む。したがって、これらの２つの種類の膜貫通タンパク質は、細胞膜に対して互いに反対の配向を有する。
本発明において有用な異種キメラタンパク質は、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、及びリンカーを介して直接接続される第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む。図２Ｃ及び図２Ｄに示されるように、ドメインがアミノ末端からカルボキシ末端への配向で連結される場合、第１のドメインは、キメラタンパク質の「左」側に位置し、かつ「外向き」となり、第２のドメインは、キメラタンパク質の「右」側に位置し、かつ「外向き」となる。
重要なことに、本発明において有用な異種キメラタンパク質は、免疫抑制シグナルの伝達を妨害、遮断、低減、阻害、及び／または隔離し、また、免疫刺激シグナルを伝達、提供、及び／または活性化するため、それは、２つの異なる経路によって抗がん効果を提供する。この二重作用は、例えば、異種キメラタンパク質のリガンド／受容体、または異種キメラタンパク質の単一のリガンド／受容体結合ドメインを各々含む２つの融合タンパク質のいずれかに結合する２つの抗体（そのいずれも、がん細胞と操作されたＴ細胞との間に安定したシナプスを生成することができない）を含む治療薬と比較した場合、患者において治療効果を提供する、及び／または患者において増強された治療効果を提供する可能性がより高い。さらに、このような異種キメラタンパク質は、２つの異なる経路を介して作用することができるため、少なくとも、２つの経路のうちの１つを標的とする治療に対して不十分に応答する患者において有効であり得る。したがって、２つの経路のうちの１つを介して作用する治療に対して不十分な応答者である患者は、他の経路を標的とすることによって治療効果を享受することができる。
本発明において有用な異種キメラタンパク質は、その第１のドメインが、がん細胞によって発現される第１の膜貫通タンパク質のリガンド／受容体に結合し、かつ第２のドメインが、操作されたＴ細胞によって発現される第２の膜貫通タンパク質のリガンド／受容体に結合した場合、がん細胞と操作されたＴ細胞との間に安定なシナプスを形成することが可能である。安定したシナプスは、操作されたＴ細胞による腫瘍の縮小に有利な空間的配向を提供する。
本発明において有用な異種キメラタンパク質では、第１の膜貫通タンパク質は、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＡＣＶＲ１ｂ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＸＬ、Ｂ７－Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ３Ａ１、ＢＴＮＬ３Ａ２、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）、ＣＤ５８（ＬＦＡ３）、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２２６（ＰＴＡＵＤＮＡＭＩ）、ＣＤ２４４、ＣＤ２４７、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）、ＣＴＬＡ－４、ＤｃＲ３、Ｆａｓ、ＦＧＦＲ３、Ｆｎ１４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲＤＬ２、ＬＡＧ－３、ＬＡＰ、ＬＡＹＮ、ＬＴｂＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ４６（ＮＣＲ１）、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＴＢ－Ａ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＶＲ、ＲＡＮＫ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）、ＳＬＡＭＦ６、ＴＡＣＩ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＭＩＧＤ２、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＲＡＩＬ－Ｒ、ＶＩＳＴＡ、またはＶＳＩＧ８であり得る。
実施形態では、第１の膜貫通タンパク質は、ＰＤ－１、ＣＳＦ１Ｒ、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、Ｂ７－Ｈ３、ＴＭＩＧＤ２、ＴＩＧＩＴ、ＳＩＲＰα、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ３Ａ１、ＢＴＮＬ３Ａ２、またはＶＳＩＧ８である。
本発明において有用な異種キメラタンパク質では、第２の膜貫通タンパク質は、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＢＴＮＬ２、ＣＤ２８、ＣＤ３０リガンド（ＣＤ３０Ｌ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ７０、Ｃ型レクチンドメイン（ＣＬＥＣ）ファミリーメンバー、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）、ＬＩＧＨＴ（ＣＤ２５８）、ＬＴａ、ＬＴａ１ｂ２、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＲＡＮＫＬ、ＴＬ１Ａ、ＴＮＦａ、またはＴＲＡＩＬであり得る。
実施形態では、第２の膜貫通タンパク質は、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、またはＴＬ１Ａである。
実施形態では、本発明の方法において有用なキメラタンパク質は、ＰＤ－１の細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、ＰＤ－１の既知のアミノ酸配列、例えば、ヒトＰＤ－１と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
実施形態では、ヒトＰＤ－１の細胞外ドメインは、以下のアミノ酸配列を含む：
ＬＤＳＰＤＲＰＷＮＰＰＴＦＳＰＡＬＬＶＶＴＥＧＤＮＡＴＦＴＣＳＦＳＮＴＳＥＳＦＶＬＮＷＹＲＭＳＰＳＮＱＴＤＫＬＡＡＦＰＥＤＲＳＱＰＧＱＤＣＲＦＲＶＴＱＬＰＮＧＲＤＦＨＭＳＶＶＲＡＲＲＮＤＳＧＴＹＬＣＧＡＩＳＬＡＰＫＡＱＩＫＥＳＬＲＡＥＬＲＶＴＥＲＲＡＥＶＰＴＡＨＰＳＰＳＰＲＰＡＧＱＦＱ（配列番号５７）
実施形態では、異種キメラタンパク質は、ＰＤ－１の細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号５７と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
実施形態では、異種キメラタンパク質の第１のドメインは、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
当業者は、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ－１”Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００４ Ｍａｒ；２０（３）：３３７－４７、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ“Ｔｈｅ ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅｓｅｍｂｌｅｓ ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ Ｆｖ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００８ Ｆｅｂ ２６；１０５（８）：３０１１－６、Ｚａｋ ｅｔ ａｌ“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ １，ＰＤ－１，ａｎｄ Ｉｔｓ Ｌｉｇａｎｄ ＰＤ－Ｌ１”，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２０１５ Ｄｅｃ １；２３（１２）：２３４１－２３４８、及びＣｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ １ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ”，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１３ Ａｐｒ ２６；２８８（１７）：１１７７１－８５などの文献（それらの各々は、その全体が参照により組み込まれる）を参照することによって、ＰＤ－１の既知のアミノ酸配列のバリアントを選択することができる。
実施形態では、本発明の方法において有用な異種キメラタンパク質は、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、ＯＸ４０Ｌの既知のアミノ酸配列、例えば、ヒトＯＸ４０Ｌと少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
実施形態では、ヒトＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインは、以下のアミノ酸配列を含む：
ＱＶＳＨＲＹＰＲＩＱＳＩＫＶＱＦＴＥＹＫＫＥＫＧＦＩＬＴＳＱＫＥＤＥＩＭＫＶＱＮＮＳＶＩＩＮＣＤＧＦＹＬＩＳＬＫＧＹＦＳＱＥＶＮＩＳＬＨＹＱＫＤＥＥＰＬＦＱＬＫＫＶＲＳＶＮＳＬＭＶＡＳＬＴＹＫＤＫＶＹＬＮＶＴＴＤＮＴＳＬＤＤＦＨＶＮＧＧＥＬＩＬＩＨＱＮＰＧＥＦＣＶＬ（配列番号５８）。
実施形態では、異種キメラタンパク質は、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号５８と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
実施形態では、異種キメラタンパク質の第２のドメインは、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
当業者は、例えば、ＣＲＯＦＴ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ＯＸ４０ ａｎｄ ＯＸ４０Ｌ ｔｏ Ｔ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．，２２９（１），ＰＰ．１７３－１９１，２００９、及びＢＡＵＭ，ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ＯＸ４０／０Ｘ４０ ｌｉｇａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｓ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ＯＸ４０ ｌｉｇａｎｄ ａｓ ｔｈｅ ＨＴＬＶ－１－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｐ３４，”Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．７７，ＰＰ．３９９２－４００１，１９９４などの文献（それらの各々は、その全体が参照により組み込まれる）を参照することによって、ＯＸ４０Ｌの既知のアミノ酸配列のバリアントを選択することができる。
実施形態では、本発明において有用な異種キメラタンパク質は、（ａ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む第１のドメインと、（ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む第２のドメインと、（ｃ）配列番号１、配列番号２、または配列番号３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むリンカーと、を含む。かかる異種キメラタンパク質は、「ＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ」と称され得る。
実施形態では、本発明において使用されるＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＬＤＳＰＤＲＰＷＮＰＰＴＦＳＰＡＬＬＶＶＴＥＧＤＮＡＴＦＴＣＳＦＳＮＴＳＥＳＦＶＬＮＷＹＲＭＳＰＳＮＱＴＤＫＬＡＡＦＰＥＤＲＳＱＰＧＱＤＣＲＦＲＶＴＱＬＰＮＧＲＤＦＨＭＳＶＶＲＡＲＲＮＤＳＧＴＹＬＣＧＡＩＳＬＡＰＫＡＱＩＫＥＳＬＲＡＥＬＲＶＴＥＲＲＡＥＶＰＴＡＨＰＳＰＳＰＲＰＡＧＱＦＱＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＱＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＳＧＫＥＹＫＣＫＶＳＳＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＮＡＴＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＩＥＧＲＭＤＱＶＳＨＲＹＰＲＩＱＳＩＫＶＱＦＴＥＹＫＫＥＫＧＦＩＬＴＳＱＫＥＤＥＩＭＫＶＱＮＮＳＶＩＩＮＣＤＧＦＹＬＩＳＬＫＧＹＦＳＱＥＶＮＩＳＬＨＹＱＫＤＥＥＰＬＦＱＬＫＫＶＲＳＶＮＳＬＭＶＡＳＬＴＹＫＤＫＶＹＬＮＶＴＴＤＮＴＳＬＤＤＦＨＶＮＧＧＥＬＩＬＩＨＱＮＰＧＥＦＣＶＬ（配列番号５９）。
実施形態では、本発明の方法において有用な異種キメラタンパク質は、４－１ＢＢＬの細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、４－１ＢＢＬの既知のアミノ酸配列、例えば、ヒト４－１ＢＢＬと少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
実施形態では、４－１ＢＢＬの細胞外ドメインは、以下のアミノ酸配列を含む：
ＱＶＳＨＲＹＰＲＩＱＳＩＫＶＱＦＴＥＹＫＫＥＫＧＦＩＬＴＳＱＫＥＤＥＩＭＫＶＱＮＮＳＶＩＩＮＣＤＧＦＹＬＩＳＬＫＧＹＦＳＱＥＶＮＩＳＬＨＹＱＫＤＥＥＰＬＦＱＬＫＫＶＲＳＶＮＳＬＭＶＡＳＬＴＹＫＤＫＶＹＬＮＶＴＴＤＮＴＳＬＤＤＦＨＶＮＧＧＥＬＩＬＩＨＱＮＰＧＥＦＣＶＬ（配列番号６０）。
実施形態では、異種キメラタンパク質は、４－１ＢＢＬの細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号６０と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
実施形態では、異種キメラタンパク質の第２のドメインは、配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
コードされる４－１ＢＢＬタンパク質は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドファミリーに属するサイトカインである。この膜貫通サイトカインは、Ｔリンパ球の共刺激受容体分子であるＴＮＦＲＳＦ９／４－１ＢＢのリガンドとして機能する双方向シグナル伝達因子である。このサイトカイン及びその受容体は、抗原提示プロセス及び細胞傷害性Ｔ細胞の生成に関与している。ＴＮＦＲＳＦ９／４－１ＢＢ受容体は、静止Ｔリンパ球には存在しないが、抗原刺激時に急速に発現する。この遺伝子によってコードされるリガンド、ＴＮＦＳＦ９／４－１ＢＢＬは、Ｔリンパ球の増殖を促進することに加えて、アネルギー性Ｔリンパ球を再活性化することが示されている。このサイトカインはまた、ＣＤ８Ｔ細胞における最適なＣＤ８応答に必要であることが示されている。このサイトカインは、がん細胞株で発現し、Ｔ細胞とがん細胞との相互作用に関与していると考えられている。
当業者は、例えば、Ｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒｉｍｅｒ ｏｆ ｈｕｍａｎ ４－１ＢＢ ｌｉｇａｎｄ ｉｓ ｕｎｉｑｕｅ ａｍｏｎｇ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（１２），９２０２－９２１０（２０１０）、Ａｌｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ４－１ＢＢ ａｎｄ ｉｔｓ ｌｉｇａｎｄ．”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（９），２２１９－２２２７（１９９４）、及びＡｒｃｈ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ “４－１ＢＢ ａｎｄ ＯＸ４０ ａｒｅ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ａ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）－ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｔｈａｔ ｂｉｎｄ ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａＢ．”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（１），５５８－５６５（１９９８）などの文献（それらの各々は、その全体が参照により組み込まれる）を参照することによって、４－１ＢＢＬの既知のアミノ酸配列のバリアントを選択することができる。
実施形態では、本発明において有用な異種キメラタンパク質は、（ａ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む第１のドメインと、（ｂ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む第２のドメインと、（ｃ）配列番号１、配列番号２、または配列番号３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むリンカーと、を含む。かかる異種キメラタンパク質は、「ＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ」と称され得る。
実施形態では、本発明で使用されるＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬキメラタンパク質は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＬＤＳＰＤＲＰＷＮＰＰＴＦＳＰＡＬＬＶＶＴＥＧＤＮＡＴＦＴＣＳＦＳＮＴＳＥＳＦＶＬＮＷＹＲＭＳＰＳＮＱＴＤＫＬＡＡＦＰＥＤＲＳＱＰＧＱＤＣＲＦＲＶＴＱＬＰＮＧＲＤＦＨＭＳＶＶＲＡＲＲＮＤＳＧＴＹＬＣＧＡＩＳＬＡＰＫＡＱＩＫＥＳＬＲＡＥＬＲＶＴＥＲＲＡＥＶＰＴＡＨＰＳＰＳＰＲＰＡＧＱＦＱＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＱＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＳＧＫＥＹＫＣＫＶＳＳＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＮＡＴＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＩＥＧＲＭＤＤＡＣＰＷＡＶＳＧＡＲＡＳＰＧＳＡＡＳＰＲＬＲＥＧＰＥＬＳＰＤＤＰＡＧＬＬＤＬＲＱＧＭＦＡＱＬＶＡＱＮＶＬＬＩＤＧＰＬＳＷＹＳＤＰＧＬＡＧＶＳＬＴＧＧＬＳＹＫＥＤＴＫＥＬＶＶＡＫＡＧＶＹＹＶＦＦＱＬＥＬＲＲＶＶＡＧＥＧＳＧＳＶＳＬＡＬＨＬＱＰＬＲＳＡＡＧＡＡＡＬＡＬＴＶＤＬＰＰＡＳＳＥＡＲＮＳＡＦＧＦＱＧＲＬＬＨＬＳＡＧＱＲＬＧＶＨＬＨＴＥＡＲＡＲＨＡＷＱＬＴＱＧＡＴＶＬＧＬＦＲＶＴＰＥＩＰＡＧＬＰＳＰＲＳＥ（配列番号６１）。
実施形態では、本発明の方法において有用な異種キメラタンパク質は、ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、ＣＳＦ１Ｒの既知のアミノ酸配列、例えば、ヒトＣＳＦ１Ｒと少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
実施形態では、ヒトＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメインは、以下のアミノ酸配列を含む：
ＩＰＶＩＥＰＳＶＰＥＬＶＶＫＰＧＡＴＶＴＬＲＣＶＧＮＧＳＶＥＷＤＧＰＰＳＰＨＷＴＬＹＳＤＧＳＳＳＩＬＳＴＮＮＡＴＦＱＮＴＧＴＹＲＣＴＥＰＧＤＰＬＧＧＳＡＡＩＨＬＹＶＫＤＰＡＲＰＷＮＶＬＡＱＥＶＶＶＦＥＤＱＤＡＬＬＰＣＬＬＴＤＰＶＬＥＡＧＶＳＬＶＲＶＲＧＲＰＬＭＲＨＴＮＹＳＦＳＰＷＨＧＦＴＩＨＲＡＫＦＩＱＳＱＤＹＱＣＳＡＬＭＧＧＲＫＶＭＳＩＳＩＲＬＫＶＱＫＶＩＰＧＰＰＡＬＴＬＶＰＡＥＬＶＲＩＲＧＥＡＡＱＩＶＣＳＡＳＳＶＤＶＮＦＤＶＦＬＱＨＮＮＴＫＬＡＩＰＱＱＳＤＦＨＮＮＲＹＱＫＶＬＴＬＮＬＤＱＶＤＦＱＨＡＧＮＹＳＣＶＡＳＮＶＱＧＫＨＳＴＳＭＦＦＲＶＶＥＳＡＹＬＮＬＳＳＥＱＮＬＩＱＥＶＴＶＧＥＧＬＮＬＫＶＭＶＥＡＹＰＧＬＱＧＦＮＷＴＹＬＧＰＦＳＤＨＱＰＥＰＫＬＡＮＡＴＴＫＤＴＹＲＨＴＦＴＬＳＬＰＲＬＫＰＳＥＡＧＲＹＳＦＬＡＲＮＰＧＧＷＲＡＬＴＦＥＬＴＬＲＹＰＰＥＶＳＶＩＷＴＦＩＮＧＳＧＴＬＬＣＡＡＳＧＹＰＱＰＮＶＴＷＬＱＣＳＧＨＴＤＲＣＤＥＡＱＶＬＱＶＷＤＤＰＹＰＥＶＬＳＱＥＰＦＨＫＶＴＶＱＳＬＬＴＶＥＴＬＥＨＮＱＴＹＥＣＲＡＨＮＳＶＧＳＧＳＷＡＦＩＰＩＳＡＧＡＨＴＨＰＰＤＥＦＬＦＴＰ（配列番号６２）。
実施形態では、異種キメラタンパク質は、ＣＳＦ１Ｒの細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号６２と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
実施形態では、異種キメラタンパク質の第１のドメインは、配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
当業者は、例えば、Ｔａｐ，ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ＣＳＦ１Ｒ Ｋｉｎａｓｅ ｉｎ Ｔｅｎｏｓｙｎｏｖｉａｌ Ｇｉａｎｔ－Ｃｅｌｌ Ｔｕｍｏｒ”，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１５ Ｊｕｌ ３０；３７３（５）：４２８－３７；Ｓｃｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ－１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｃＦＭＳ）ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｔｗｏ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（６），４０９４－４１０１（２００７）；Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ２．７ Ａ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｕｔｏｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｃ－Ｆｍｓ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６７（３），８３９－８４７（２００７）；ａｎｄ Ｍａｓｈｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ－１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１８（５），１７８９－１７９７（２０１０）などの文献（その各々は、全体が参照により組み込まれる）を参照することにより、ＣＳＦ１Ｒの既知のアミノ酸配列のバリアントを選択することができる。
実施形態では、本発明の方法において有用な異種キメラタンパク質は、ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、ＣＤ４０Ｌの既知のアミノ酸配列、例えば、ヒトＣＤ４０Ｌと少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
実施形態では、ヒトＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインは、以下のアミノ酸配列を含む：
ＨＲＲＬＤＫＩＥＤＥＲＮＬＨＥＤＦＶＦＭＫＴＩＱＲＣＮＴＧＥＲＳＬＳＬＬＮＣＥＥＩＫＳＱＦＥＧＦＶＫＤＩＭＬＮＫＥＥＴＫＫＥＮＳＦＥＭＱＫＧＤＱＮＰＱＩＡＡＨＶＩＳＥＡＳＳＫＴＴＳＶＬＱＷＡＥＫＧＹＹＴＭＳＮＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＡＳＬＣＬＫＳＰＧＲＦＥＲＩＬＬＲＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ（配列番号６３）。
実施形態では、異種キメラタンパク質は、ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号６３と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
実施形態では、異種キメラタンパク質の第２のドメインは、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
当業者は、例えば、Ｏｇａｎｅｓｙａｎ Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｄｏｍａｉｎｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｏ ｂｉｎｄ ＣＤ４０Ｌ：ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｘ－ｒａｙ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｗｏ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ”，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｓｅｃｔ Ｆ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１３ Ｓｅｐ；６９（Ｐｔ ９）：１０４５－８、Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｐ３９，ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＴＮＦ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ，ｉｓ ａ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ＣＤ４０ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｏｒｍ ｏｆ ｇｐ３９ ｗｉｔｈ Ｂ ｃｅｌｌ ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ．”ＥＭＢＯ Ｊ．１１（１２），４３１３－４３２１（１９９２）、Ｇａｕｃｈａｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｕｍａｎ ＣＤ４０－ｌｉｇａｎｄ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｆａｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ＩｇＥ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．”ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３１５（３），２５９－２６６（１９９３）、Ｋａｒｐｕｓａｓ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ４０ ｌｉｇａｎｄ．”Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３（１０），１０３１－１０３９（１９９５）、及びＳｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｏｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４０Ｌ ｗｉｔｈ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ４０．”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．７（５），１１２４－１１３５（１９９８）などの文献（それらの各々は、その全体が参照により組み込まれる）を参照することによって、ＣＤ４０Ｌの既知のアミノ酸配列のバリアントを選択することができる。
実施形態では、本発明において有用な異種キメラタンパク質は、（ａ）配列番号６２のアミノ酸配列を含む第１のドメインと、（ｂ）配列番号６３のアミノ酸配列を含む第２のドメインと、（ｃ）配列番号１、配列番号２、または配列番号３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むリンカーと、を含む。かかるキメラタンパク質は、「ＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ」と称され得る。
実施形態では、本発明において使用されるＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＩＰＶＩＥＰＳＶＰＥＬＶＶＫＰＧＡＴＶＴＬＲＣＶＧＮＧＳＶＥＷＤＧＰＰＳＰＨＷＴＬＹＳＤＧＳＳＳＩＬＳＴＮＮＡＴＦＱＮＴＧＴＹＲＣＴＥＰＧＤＰＬＧＧＳＡＡＩＨＬＹＶＫＤＰＡＲＰＷＮＶＬＡＱＥＶＶＶＦＥＤＱＤＡＬＬＰＣＬＬＴＤＰＶＬＥＡＧＶＳＬＶＲＶＲＧＲＰＬＭＲＨＴＮＹＳＦＳＰＷＨＧＦＴＩＨＲＡＫＦＩＱＳＱＤＹＱＣＳＡＬＭＧＧＲＫＶＭＳＩＳＩＲＬＫＶＱＫＶＩＰＧＰＰＡＬＴＬＶＰＡＥＬＶＲＩＲＧＥＡＡＱＩＶＣＳＡＳＳＶＤＶＮＦＤＶＦＬＱＨＮＮＴＫＬＡＩＰＱＱＳＤＦＨＮＮＲＹＱＫＶＬＴＬＮＬＤＱＶＤＦＱＨＡＧＮＹＳＣＶＡＳＮＶＱＧＫＨＳＴＳＭＦＦＲＶＶＥＳＡＹＬＮＬＳＳＥＱＮＬＩＱＥＶＴＶＧＥＧＬＮＬＫＶＭＶＥＡＹＰＧＬＱＧＦＮＷＴＹＬＧＰＦＳＤＨＱＰＥＰＫＬＡＮＡＴＴＫＤＴＹＲＨＴＦＴＬＳＬＰＲＬＫＰＳＥＡＧＲＹＳＦＬＡＲＮＰＧＧＷＲＡＬＴＦＥＬＴＬＲＹＰＰＥＶＳＶＩＷＴＦＩＮＧＳＧＴＬＬＣＡＡＳＧＹＰＱＰＮＶＴＷＬＱＣＳＧＨＴＤＲＣＤＥＡＱＶＬＱＶＷＤＤＰＹＰＥＶＬＳＱＥＰＦＨＫＶＴＶＱＳＬＬＴＶＥＴＬＥＨＮＱＴＹＥＣＲＡＨＮＳＶＧＳＧＳＷＡＦＩＰＩＳＡＧＡＨＴＨＰＰＤＥＦＬＦＴＰＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＱＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＳＧＫＥＹＫＣＫＶＳＳＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＮＡＴＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＩＥＧＲＭＤＨＲＲＬＤＫＩＥＤＥＲＮＬＨＥＤＦＶＦＭＫＴＩＱＲＣＮＴＧＥＲＳＬＳＬＬＮＣＥＥＩＫＳＱＦＥＧＦＶＫＤＩＭＬＮＫＥＥＴＫＫＥＮＳＦＥＭＱＫＧＤＱＮＰＱＩＡＡＨＶＩＳＥＡＳＳＫＴＴＳＶＬＱＷＡＥＫＧＹＹＴＭＳＮＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＡＳＬＣＬＫＳＰＧＲＦＥＲＩＬＬＲＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ（配列番号６４）。
実施形態では、キメラタンパク質は、持続的な免疫調節効果を提供することが可能である。
実施形態では、リンカーは、柔軟なアミノ酸配列、ＩｇＧヒンジ領域、または抗体配列から選択されるポリペプチドである。
実施形態では、リンカーは、単一のアミノ酸リンカーではなく、例えば、限定されないが、リンカーは、１つ以上のアミノ酸長である。実施形態では、リンカーは、１～６個のアミノ酸を超える長さを有し、例えば、限定されないが、リンカーは、７個のアミノ酸を超える長さである。実施形態では、リンカーは、２つ以上の単一のグリシン残基を含む。
実施形態では、本発明において有用な異種キメラタンパク質は、タンパク質の第１及び第２のドメインに隣接するリンカードメインを含む。
実施形態では、リンカーは、ジスルフィド結合を形成することが可能である少なくとも１つのシステイン残基を含み、及び／または（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥに由来する）ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。実施形態では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４から選択され、ＩｇＡは、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２から選択される。実施形態では、ＩｇＧは、ＩｇＧ４（例えば、ヒトＩｇＧ４）である。実施形態では、リンカーが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
実施形態では、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥに由来する。実施形態では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４から選択され、ＩｇＡは、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２から選択される。実施形態では、ＩｇＧは、ＩｇＧ４（例えば、ヒトＩｇＧ４）である。実施形態では、リンカーが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
本発明において有用な異種キメラタンパク質では、異種キメラタンパク質は、組換え融合タンパク質、例えば、本明細書に開示される細胞外ドメインを有する単一のポリペプチドである。例えば、実施形態では、異種キメラタンパク質は、原核細胞、真核細胞、または無細胞発現系において単一の単位として翻訳される。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、分泌可能で完全な機能性単一ポリペプチド鎖として、哺乳動物宿主細胞（すなわち、本発明の操作されたＴ細胞）において生成可能である。
実施形態では、異種キメラタンパク質は、複数のポリペプチド、例えば、本明細書に開示される複数の細胞外ドメインの組換えタンパク質を指し、それらを組み合わせて（共有または非共有結合を介して）、例えば、インビトロで単一の単位（例えば、本明細書に開示される１つ以上の合成リンカーとともに）を生成する。
本発明において有用な異種キメラタンパク質は、そのリガンド／受容体と立体的に結合することが可能である第１のドメインと、そのリガンド／受容体と立体的に結合することが可能である第２のドメインと、を有する。これは、細胞外ドメインのリガンド／受容体結合ドメインがそのリガンド／受容体の結合を立体的に妨げられないように、キメラタンパク質及び／または細胞外ドメイン（またはその部分）と残りのキメラタンパク質との間の物理的距離に十分な全体的な柔軟性があることを意味する。この柔軟性及び／または物理的距離（本明細書では「緩み」と称される）は通常、細胞外ドメイン（複数可）に存在し、通常はリンカーに存在し、及び／または通常はキメラタンパク質に（全体として）存在し得る。代替的にまたは追加的に、キメラタンパク質は、立体障害を回避するために必要な追加の緩みを提供する１つ以上の追加のアミノ酸配列（例えば、以下に記載される結合リンカー）または合成リンカー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー）を含むことによって修飾され得る。
任意の本明細書に開示される態様及び実施形態では、本発明において有用な異種キメラタンパク質は、本明細書に開示されるタンパク質配列のうちのいずれかと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含み得る。実施形態では、１つ以上のアミノ酸変異は独立して、置換、挿入、欠失、及び短縮から選択され得る。
実施形態では、アミノ酸変異は、アミノ酸置換であり、保存的及び／または非保存的置換を含み得る。「保存的置換」は、例えば、関与するアミノ酸残基の極性、電荷、サイズ、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性の類似性に基づいて行ってもよい。２０個の天然に存在するアミノ酸は、以下の６つのグループの標準的なアミノ酸：（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ，Ｇｌｕ；（４）Ｂａｓｉｃ：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び（６）芳香族：Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ、に分類され得る。本明細書で使用される場合、「保存的置換」は、上記の６つの標準的なアミノ酸グループの同じグループ内に列挙される別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。例えば、ＧｌｕによるＡｓｐの交換は、そのように修飾されたポリペプチド内に１つの負電荷を保持する。さらに、グリシン及びプロリンは、α－ヘリックスを破壊するそれらの能力に基づいて互いに置換され得る。本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、上記の６つの標準的なアミノ酸グループ（１）～（６）の異なるグループに列挙される別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。
実施形態では、置換はまた、非古典的なアミノ酸も含み得る（例えば、セレノシステイン、ピロリシン、Ｎ－ホルミルメチオニンβ－アラニン、ＧＡＢＡ及びδ－アミノレブリン酸、４－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、一般的なアミノ酸のＤ－異性体、２，４－ジアミノ酪酸、α－アミノイソ酪酸、４－アミノ酪酸、Ａｂｕ、２－アミノ酪酸、γ－Ａｂｕ、ε－Ａｈｘ、６－アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２－アミノイソ酪酸、３－アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコスメ、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β－アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えば、βメチルアミノ酸、Ｃ α－メチルアミノ酸、Ｎ α－メチルアミノ酸、及び一般的なアミノ酸類似体）。
コドン縮重を考慮に入れることを含めて、遺伝暗号を参照することによって、異種キメラタンパク質のヌクレオチド配列に変異を作製することもできる。
実施形態では、本発明において有用な異種キメラタンパク質は、ヒトリガンド（複数可）／受容体（複数可）と結合することが可能である。
実施形態では、本発明において有用な異種キメラタンパク質は、マウスリガンド（複数可）／受容体（複数可）と結合することが可能である。
実施形態では、異種キメラタンパク質の各細胞外ドメイン（またはそのバリアント）は、約１ｎＭ～約５ｎＭ、例えば、約１ｎＭ、約１．５ｎＭ、約２ｎＭ、約２．５ｎＭ、約３ｎＭ、約３．５ｎＭ、約４ｎＭ、約４．５ｎＭ、または約５ｎＭのＫＤでその同族の受容体またはリガンドと結合する。実施形態では、キメラタンパク質は、約５ｎＭ～約１５ｎＭ、例えば、約５ｎＭ、約５．５ｎＭ、約６ｎＭ、約６．５ｎＭ、約７ｎＭ、約７．５ｎＭ、約８ｎＭ、約８．５ｎＭ、約９ｎＭ、約９．５ｎＭ、約１０ｎＭ、約１０．５ｎＭ、約１１ｎＭ、約１１．５ｎＭ、約１２ｎＭ、約１２．５ｎＭ、約１３ｎＭ、約１３．５ｎＭ、約１４ｎＭ、約１４．５ｎＭ、または約１５ｎＭのＫＤで同族の受容体またはリガンドと結合する。
実施形態では、異種キメラタンパク質の各細胞外ドメイン（またはそのバリアント）は、約１μＭ未満、約９００ｎＭ、約８００ｎＭ、約７００ｎＭ、約６００ｎＭ、約５００ｎＭ、約４００ｎＭ、約３００ｎＭ、約２００ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７０ｎＭ、約６０ｎＭ、約５５ｎＭ、約５０ｎＭ、約４５ｎＭ、約４０ｎＭ、約３５ｎＭ、約３０ｎＭ、約２５ｎＭ、約２０ｎＭ、約１５ｎＭ、約１０ｎＭ、または約５ｎＭ、または約１ｎＭのＫＤで（例えば、表面プラズモン共鳴または生体層干渉法によって測定される）その同族の受容体またはリガンドと結合する。実施形態では、異種キメラタンパク質は、約１ｎＭ未満、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５５ｐＭ、約５０ｐＭ、約４５ｐＭ、約４０ｐＭ、約３５ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、または約１０ｐＭ、または約１ｐＭのＫＤで（例えば、表面プラズモン共鳴または生体層干渉法によって測定される）ヒトＣＳＦ１と結合する。
本明細書で使用される場合、本発明において有用な細胞外ドメインのバリアントは、天然の細胞外ドメインの受容体／リガンドと結合することが可能である。例えば、バリアントは、その受容体／リガンドとのその結合親和性に影響を及ぼさない細胞外ドメインの１つ以上の変異を含み得、代替的に、細胞外ドメインにおける１つ以上の変異は、受容体／リガンドに対する結合親和性を改善し得るか、または細胞外ドメインにおける１つ以上の変異は、受容体／リガンドに対する結合親和性を低下させ得るが、結合を完全に排除しない。実施形態では、１つ以上の変異は、細胞外ドメインがその受容体／リガンドと相互作用する結合ポケットの外側に位置する。実施形態では、１つ以上の変異は、変異が結合を完全に排除しない限り、細胞外ドメインがその受容体／リガンドと相互作用する結合ポケットの内側に位置する。受容体－リガンド結合に関する当業者の知識及び当技術分野の知識に基づいて、どの変異が結合を可能にし、どれが結合を排除するかを理解するであろう。
実施形態では、キメラタンパク質は、増強された安定性及びタンパク質半減期を示す。
本発明において有用な異種キメラタンパク質は、２つを超える細胞外ドメインを含み得る。例えば、キメラタンパク質は、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０つ、またはそれ以上の細胞外ドメインを含み得る。本明細書に開示されるように、第２の細胞外ドメインは、リンカーを介して第３の細胞外ドメインから分離され得る。代替的に、第２の細胞外ドメインは、第３の細胞外ドメインと直接的に連結され得る（例えば、ペプチド結合を介して）。実施形態では、本明細書に開示されるように、異種キメラタンパク質は、直接的に連結される細胞外ドメイン及びリンカーを介して間接的に連結される細胞外ドメインを含む。
リンカー
実施形態では、本発明において有用な異種キメラタンパク質は、リンカーを含む。
実施形態では、リンカーは、ジスルフィド結合を形成することが可能な少なくとも１つのシステイン残基を含む。少なくとも１つのシステイン残基は、異種キメラタンパク質の一対（またはそれ以上）の間にジスルフィド結合を形成することが可能である。理論に拘束されることを望まないが、かかるジスルフィド結合の形成は、異種キメラタンパク質の有用な多量体状態及び／または必要な多量体状態の維持に関与する。これらは、（例えば、非機能的なタンパク質凝集体を形成しない）機能的な異種キメラタンパク質の効率的な産生、及びインビトロ及びインビボでの所望の活性を可能とする。
本発明において有用な異種キメラタンパク質では、リンカーは、柔軟なアミノ酸配列、ＩｇＧヒンジ領域、または抗体配列から選択されるポリペプチドである。
実施形態では、リンカーは、天然に存在するマルチドメインタンパク質に由来するか、または、例えば、Ｃｈｉｃｈｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１３），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２２（２）：１５３－１６７、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１３），Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９に記載されるような経験的なリンカーであり、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。実施形態では、リンカーは、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１３），Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９、及びＣｒａｓｔｏ ｅｔ．ａｌ．，（２０００），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３（５）：３０９－３１２に記載されるようなものなどのリンカー設計データベース及びコンピュータプログラムを使用して設計することができ、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
実施形態では、リンカーは、ポリペプチドを含む。実施形態では、ポリペプチドは、約５００アミノ酸長、約４５０アミノ酸長、約４００アミノ酸長、約３５０アミノ酸長、約３００アミノ酸長、約２５０アミノ酸長、約２００アミノ酸長、約１５０アミノ酸長、または約１００アミノ酸長未満である。例えば、リンカーは、約１００、約９５、約９０、約８５、約８０、約７５、約７０、約６５、約６０、約５５、約５０、約４５、約４０、約３５、約３０、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、または約２アミノ酸長未満であり得る。
実施形態では、リンカーは、柔軟性である。
実施形態では、リンカーは、剛性である。
実施形態では、リンカーは、実質的にグリシン及びセリン残基からなる（例えば、約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９７％、または約９８％、または約９９％、または約１００％のグリシン及びセリン）。
実施形態では、リンカーは、抗体（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）のヒンジ領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥクラス抗体に見られるヒンジ領域は、柔軟なスペーサーとして機能し、Ｆａｂ部分が空間内を自由に移動することを可能とする。定常領域とは対照的に、ヒンジドメインは、構造的に多様であり、免疫グロブリンクラス及びサブクラス間で配列及び長さの両方が異なる。例えば、ヒンジ領域の長さ及び柔軟性は、ＩｇＧサブクラス間で異なる。ＩｇＧ１のヒンジ領域はアミノ酸２１６～２３１を包括し、自由に柔軟であるため、Ｆａｂ断片はその対称軸を中心に回転し、２つの重鎖間ジスルフィド架橋の第１の中心にある球内を移動できる。ＩｇＧ２は、ＩｇＧ１よりも短いヒンジを有し、１２個のアミノ酸残基及び４個のジスルフィド架橋を有する。ＩｇＧ２のヒンジ領域は、グリシン残基を欠いており、比較的短く、余分な重鎖間ジスルフィド架橋によって安定化された剛性のポリプロリン二重らせんを含む。これらの特性は、ＩｇＧ２分子の柔軟性を制限する。ＩｇＧ３は、６２個のアミノ酸（２１個のプロリン及び１１個のシステインを含む）を含み、柔軟性がないポリプロリン二重らせんを形成する、その固有の拡張ヒンジ領域（ＩｇＧ１ヒンジの約４倍の長さ）が他のサブクラスと異なる。ＩｇＧ３では、Ｆａｂ断片は、Ｆｃ断片から比較的離れているため、分子の柔軟性が高まる。ＩｇＧ３における細長いヒンジは、他のサブクラスと比較してその高分子量の原因でもある。ＩｇＧ４のヒンジ領域は、ＩｇＧ１よりも短く、その柔軟性は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２の中間である。ヒンジ領域の柔軟性は、ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４＞ＩｇＧ２の順に減少すると報告されている。実施形態では、リンカーは、ヒトＩｇＧ４に由来し、二量体形成（Ｓ２２８Ｐを含む）またはＦｃＲｎ結合を増強するための１つ以上の変異を含み得る。
結晶学的研究によると、免疫グロブリンヒンジ領域は、機能的に、上部ヒンジ領域、コア領域、及び下部ヒンジ領域の３つの領域にさらに細分することができる。Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ１３０：８７を参照されたい。上部ヒンジ領域には、ＣＨ１のカルボキシル末端から、動きを制限するヒンジにおける第１の残基、通常は２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合を形成する第１のシステイン残基までのアミノ酸が含まれる。上部ヒンジ領域の長さは、抗体のセグメントの柔軟性と相関する。コアヒンジ領域には、重鎖間ジスルフィド架橋が含まれ、下部ヒンジ領域には、ＣＨ２ドメインのアミノ末端と結合し、ＣＨ２の残基が含まれる（同上）。野生型ヒトＩｇＧ１のコアヒンジ領域は、配列ＣＰＰＣ（配列番号２４）を含み、これは、ジスルフィド結合の形成によって二量体化されると、回転軸として機能すると考えられる環状オクタペプチドをもたらし、したがって、柔軟性が与えられる。実施形態では、本発明のリンカーは、任意の抗体（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）の上部ヒンジ領域、コア領域、及び下部ヒンジ領域のうちの１つ、２つ、または３つを含む。ヒンジ領域はまた、１つ以上のグリコシル化部位を含み得、これは、炭水化物付着のためのいくつかの構造的に異なる種類の部位を含む。例えば、ＩｇＡ１は、ヒンジ領域の１７個のアミノ酸セグメント内に５つのグリコシル化部位を含み、分泌型免疫グロブリンにとって有利な特性と考えられる、腸のプロテアーゼに対するヒンジ領域ポリペプチドの抵抗性を付与する。実施形態では、本発明において有用なリンカーは、１つ以上のグリコシル化部位を含む。
実施形態では、リンカーは、抗体（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）のＦｃドメインを含む。
本発明において有用な異種キメラタンパク質では、リンカーは、ＩｇＧ４に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。実施形態では、リンカーは、ヒトＩｇＧ４に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。実施形態では、リンカーは、配列番号１～配列番号３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、例えば、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。実施形態では、リンカーは、１つ以上の結合リンカーを含み、かかる結合リンカーは独立して、配列番号４～配列番号５０（またはそのバリアント）から選択される。実施形態では、リンカーは、２つ以上の結合リンカーを含み、各結合リンカーは独立して、配列番号４～配列番号５０（またはそのバリアント）から選択され、一方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＮ末端であり、他方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＣ末端である。
実施形態では、リンカーは、ヒトＩｇＧ１抗体に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。実施形態では、Ｆｃドメインは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して増加した親和性及び増強した結合を示す。実施形態では、Ｆｃドメインは、ＦｃＲｎに対する親和性を増加させ、ＦｃＲｎとの結合を増強する１つ以上の変異を含む。理論に拘束されることを望まないが、ＦｃＲｎとの増加した親和性及び増強した結合は、本発明の異種キメラタンパク質のインビボでの半減期を増加させると考えられる。
実施形態では、リンカーにおけるＦｃドメインは、アミノ酸残基２５０、２５２、２５４、２５６、３０８、３０９、３１１、４１６、４２８、４３３、もしくは４３４（参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）の場合と同様に、Ｋａｂａｔの番号付けに従って）、またはそれらの同等物での１つ以上のアミノ酸置換を含む。実施形態では、アミノ酸残基２５０でのアミノ酸置換は、グルタミンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基２５２でのアミノ酸置換は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはスレオニンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基２５４でのアミノ酸置換は、スレオニンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基２５６でのアミノ酸置換は、セリン、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはスレオニンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基３０８でのアミノ酸置換は、スレオニンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基３０９でのアミノ酸置換は、プロリンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基３１１でのアミノ酸置換は、セリンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基３８５でのアミノ酸置換は、アルギニン、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、ヒスチジン、リジン、アラニン、またはグリシンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基３８６でのアミノ酸置換は、スレオニン、プロリン、アスパラギン酸、セリン、リジン、アルギニン、イソロイシン、またはメチオニンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基３８７でのアミノ酸置換は、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、またはアラニンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基３８９でのアミノ酸置換は、プロリン、セリン、またはアスパラギンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基４１６でのアミノ酸置換は、セリンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基４２８でのアミノ酸置換は、ロイシンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基４３３でのアミノ酸置換は、アルギニン、セリン、イソロイシン、プロリン、またはグルタミンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基４３４でのアミノ酸置換は、ヒスチジン、フェニルアラニン、またはチロシンによる置換である。
実施形態では、Ｆｃドメインリンカー（例えば、ＩｇＧ定常領域を含む）は、アミノ酸残基２５２、２５４、２５６、４３３、４３４、または４３６（参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）の場合と同様に、Ｋａｂａｔの番号付けに従って）での置換などの１つ以上の変異を含む。実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、トリプルＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異またはＹＴＥ変異を含む。実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、トリプルＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ／Ｙ４３６Ｈ変異またはＫＦＨ変異を含む。実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、ＹＴＥ及びＫＦＨ変異の組み合わせを含む。
実施形態では、リンカーは、アミノ酸残基２５０、２５３、３０７、３１０、３８０、４２８、４３３、４３４、及び４３５（参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）の場合と同様に、Ｋａｂａｔの番号付けに従って）での置換などの１つ以上の変異を含む。例示的な変異には、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ４２８Ｌ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ｓ、及びＨ４３５Ａが含まれる。実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異またはＬＳ変異を含む。実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ変異またはＱＬ変異を含む。実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｎ４３４Ａ変異を含む。実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ ／Ｎ４３４Ａ変異またはＡＡＡ変異を含む。実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ変異またはＩＨＨ変異を含む。実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ変異を含む。実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ及びＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ変異の組み合わせを含む。
ＩｇＧ定常領域における追加の例示的な変異は、例えば、Ｒｏｂｂｉｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（２０１３），５７（１２）：６１４７－６１５３、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ（２００６），２８１（３３）：２３５１４－２４、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２），１６９：５１７１－８０、Ｋｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１４）５１４：６４２－６４５、Ｇｒｅｖｙｓ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．（２０１５），１９４（１１）：５４９７－５０８、及び米国特許第７，０８３，７８４号に記載されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
例示的なＦｃ安定化変異体は、Ｓ２２８Ｐである。例示的なＦｃ半減期延長変異体は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ３０８Ｔ、Ｌ３０９Ｐ、及びＱ３１１Ｓであり、本発明のリンカーは、これらの変異体の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つを含み得る。
実施形態では、キメラタンパク質は、高い親和性でＦｃＲｎと結合する。実施形態では、キメラタンパク質は、約１ｎＭ～約８０ｎＭのＫＤでＦｃＲｎと結合し得る。例えば、キメラタンパク質は、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約３ｎＭ、約４ｎＭ、約５ｎＭ、約６ｎＭ、約７ｎＭ、約８ｎＭ、約９ｎＭ、約１０ｎＭ、約１５ｎＭ、約２０ｎＭ、約２５ｎＭ、約３０ｎＭ、約３５ｎＭ、約４０ｎＭ、約４５ｎＭ、約５０ｎＭ、約５５ｎＭ、約６０ｎＭ、約６５ｎＭ、約７０ｎＭ、約７１ｎＭ、約７２ｎＭ、約７３ｎＭ、約７４ｎＭ、約７５ｎＭ、約７６ｎＭ、約７７ｎＭ、約７８ｎＭ、約７９ｎＭ、または約８０ｎＭのＫＤでＦｃＲｎと結合し得る。実施形態では、キメラタンパク質は、約９ｎＭのＫＤでＦｃＲｎと結合し得る。実施形態では、キメラタンパク質は、エフェクター機能を有する他のＦｃ受容体（すなわち、ＦｃＲｎ以外）と実質的に結合しない。
実施形態では、リンカーにおけるＦｃドメインは、配列番号１（以下の表１を参照されたい）、またはそれと少なくとも９０％、または９３％、または９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一性のアミノ酸配列を有する。実施形態では、変異は、安定性及び／または半減期を増加させるために、配列番号１に対して作製される。例えば、実施形態では、リンカーにおけるＦｃドメインは、配列番号２（以下の表１を参照されたい）、またはそれと少なくとも９０％、または９３％、または９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一性のアミノ酸配列を含む。例えば、実施形態では、リンカーにおけるＦｃドメインは、配列番号３（以下の表１を参照されたい）、またはそれと少なくとも９０％、または９３％、または９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一性のアミノ酸配列を含む。
さらに、１つ以上の結合リンカーは、リンカーにおけるＦｃドメイン（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、またはそれと少なくとも９０％、または９３％、または９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一性であるもののうちの１つ）及び細胞外ドメインを接続するために使用され得る。例えば、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、またはそのバリアントのうちのいずれか１つが、本明細書に開示される細胞外ドメイン、及び本明細書に開示されるリンカーにおけるＦｃドメインを接続し得る。任意で、配列番号４～配列番号５０、またはそのバリアントのうちのいずれか１つは、本明細書に開示される細胞外ドメインと本明細書に開示されるＦｃドメインとの間に位置する。
実施形態では、本発明の異種キメラタンパク質は、以下の表１に開示される結合リンカーのバリアントを含み得る。例えば、リンカーは、配列番号４～配列番号５０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
実施形態では、第１及び第２の結合リンカーは異なっていてもよく、またはそれらは同じであってもよい。
理論に拘束されることを望まないが、異種キメラタンパク質においてＦｃドメインの少なくとも一部を含むリンカーを含めることは、不溶性であり、おそらく、非機能的なタンパク質コンカテマー及び／または凝集体の形成を回避するのに役立つ。これは、一部には、異種キメラタンパク質間にジスルフィド結合を形成することが可能であるＦｃドメイン内にシステインが存在するためである。
実施形態では、異種キメラタンパク質は、本明細書に開示されるように、１つ以上の結合リンカーを含み得、本明細書に開示されるように、Ｆｃドメインリンカーを欠き得る。
実施形態では、第１及び／または第２の結合リンカーは独立して、配列番号４～配列番号５０のアミノ酸配列から選択され、以下の表１に提供される：

Figure 2022537066000002
Figure 2022537066000003
実施形態では、結合リンカーは、実質的にグリシン及びセリン残基を含む（例えば、約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９７％、または約９８％、または約９９％、または約１００％のグリシン及びセリン）。例えば、実施形態では、結合リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎであり、ここで、ｎは、約１～約８、例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８（配列番号２５～配列番号３２のそれぞれ）である。実施形態では、結合リンカー配列は、ＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３）である。追加の例示的な結合リンカーには、これらに限定されないが、配列ＬＥ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎ＝１～３）（配列番号３６～配列番号３８）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２～５）（配列番号３９～配列番号４２）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａ（配列番号４３）、ＰＡＰＡＰ（配列番号４４）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号４５）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号４６）、及びＸが、例えば、Ａｌａ、Ｌｙｓ、またはＧｌｕなどの任意のアミノ酸を示す、（ＸＰ）ｎを有するリンカーが含まれる。実施形態では、結合リンカーは、ＧＧＳである。実施形態では、結合リンカーは、配列（Ｇｌｙ）ｎを有し、ここで、ｎは、１～１００の任意の数、例えば、（Ｇｌｙ）８（配列番号３４）及び（Ｇｌｙ）６（配列番号３５）である。
実施形態では、結合リンカーは、ＧＧＧＳＥ（配列番号４７）、ＧＳＥＳＧ（配列番号４８）、ＧＳＥＧＳ（配列番号４９）、ＧＥＧＧＳＧＥＧＳＳＧＥＧＳＳＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＳ（配列番号５０）、ならびに４アミノ酸間隔ごとにランダムに配置されるＧ、Ｓ、及びＥの結合リンカーのうちの１つ以上である。
第１の結合リンカー、Ｆｃドメインリンカー、及び第２の結合リンカーの組み合わせは、本明細書において「モジュラーリンカー」と称される。実施形態では、異種キメラタンパク質は、表２に示されるようなモジュラーリンカーを含む。

Figure 2022537066000004

Figure 2022537066000005

Figure 2022537066000006
実施形態では、本発明の異種キメラタンパク質は、上記の表２に開示されるモジュラーリンカーのバリアントを含み得る。例えば、リンカーは、配列番号５１～配列番号５６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
実施形態では、リンカーは、高い柔軟性であることを含むがこれに限定されない柔軟性であり得る。実施形態では、リンカーは、剛性アルファヘリックスを含むがこれに限定されない剛性であり得る。例示的な結合リンカーの特徴を以下の表３に示す。
Figure 2022537066000007
実施形態では、リンカーは、機能性であり得る。例えば、限定されないが、リンカーは、本発明の異種キメラタンパク質の折り畳み及び／または安定性を改善し、発現を改善し、薬物動態を改善し、及び／または生物活性を改善するように機能し得る。別の例では、リンカーは、異種キメラタンパク質を特定の細胞型または位置に標的化するように機能し得る。
実施形態では、本発明の異種キメラタンパク質は、１つの結合リンカーのみを含む。
実施形態では、異種キメラタンパク質は、結合リンカーを欠く。
実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの合成リンカーである。
実施形態では、異種キメラタンパク質は、そのリガンド／受容体と立体的に結合することが可能である第１のドメイン、及び／またはそのリガンド／受容体と立体的に結合することが可能である第２のドメインを有する。したがって、細胞外ドメインのリガンド／受容体結合ドメインがそのリガンド／受容体の結合を立体的に妨げられないように、キメラタンパク質及び／または細胞外ドメイン（またはその部分）と残りのキメラタンパク質との間の物理的距離に十分な全体的な柔軟性がある。この柔軟性及び／または物理的距離（「緩み」と称される）は通常、細胞外ドメイン（複数可）に存在し、通常はリンカーに存在し、及び／または通常はキメラタンパク質に（全体として）存在し得る。代替的にまたは追加的に、アミノ酸配列（例えば）は、立体障害を回避するために必要な緩みを提供するために、１つ以上の細胞外ドメイン及び／またはリンカーに追加され得る。緩みを提供する任意のアミノ酸配列が追加され得る。実施形態では、追加されるアミノ酸配列は、配列（Ｇｌｙ）ｎを含み、ここで、ｎは、１～１００の任意の数である。追加可能なアミノ酸配列の追加の例には、表１及び表３に記載される結合リンカーが含まれる。実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーは、立体障害を回避するために必要な緩みを提供するために、細胞外ドメインとリンカーとの間に追加され得る。かかるＰＥＧリンカーは、当技術分野において周知である。
操作されたＴ細胞
本明細書に開示されるのは、キメラ抗原受容体及び異種キメラタンパク質を発現する操作されたＴ細胞である。キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、細胞内ドメインは、共刺激ドメイン及び／またはシグナル伝達ドメインを含む。異種キメラタンパク質は、一般構造：Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、式中、（ａ）は、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、（ｃ）は、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインである。図１は、本発明の操作されたＴ細胞を例示する。
実施形態では、異種キメラタンパク質の第１のドメインは、実質的に、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン全体を含み、及び／または異種キメラタンパク質の第２のドメインは、実質的に、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン全体を含む。
実施形態では、第１のドメインは、第１の膜貫通タンパク質のリガンド／受容体と結合することが可能であり、第２のドメインは、第２の膜貫通タンパク質のリガンド／受容体と結合することが可能である。
実施形態では、第１のドメインは、そのリガンド／受容体に結合した場合、免疫抑制シグナルを阻害することが可能であり、及び／または第２のドメインは、そのリガンド／受容体に結合した場合、免疫刺激シグナルを活性化することが可能である。
実施形態では、第１の膜貫通タンパク質のリガンド／受容体は、がん細胞によって発現され、及び／または第２の膜貫通タンパク質のリガンド／受容体は、操作されたＴ細胞及び／または天然Ｔ細胞によって発現される。
実施形態では、異種キメラタンパク質は、操作されたＴ細胞によって分泌される。実施形態では、異種キメラタンパク質は、操作されたＴ細胞によって発現されるキメラ抗原受容体の活性化に応答して分泌される。一実施形態では、キメラ抗原受容体の活性化は、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）プロモーターなどのキメラ抗原受容体関連プロモーターを刺激する。
実施形態では、キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、細胞内ドメインは、共刺激ドメイン及び／またはシグナル伝達ドメインを含む。
実施形態では、キメラ抗原受容体の抗原結合ドメインは、がん細胞、例えば、ヒトがん細胞特異的抗原によって発現される抗原に結合することが可能である。
実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞内ドメインは、共刺激ドメイン及びシグナル伝達ドメインの一方または両方を含む。
実施形態では、異種キメラタンパク質及び／またはキメラ抗原受容体は、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の亜集団を増加させるか、またはその低減を防止することが可能である。
実施形態では、異種キメラタンパク質は、がん細胞／腫瘍部位の近くに存在する操作されていないＴ細胞クローンの数を増加させる。
異種キメラタンパク質は、その第１のドメインが、がん細胞によって発現される第１の膜貫通タンパク質のリガンド／受容体に結合し、第２のドメインが、操作されたＴ細胞によって発現される第２の膜貫通タンパク質のリガンド／受容体に結合した場合、がん細胞と操作されたＴ細胞との間に安定したシナプスを形成することが可能であり、及び／またはキメラ抗原受容体は、がん細胞によって発現される抗原に結合した場合、がん細胞と操作されたＴ細胞との間に安定したシナプスを形成することが可能である。安定したシナプスは、操作されたＴ細胞による抗がん効果／腫瘍縮小に有利な空間的配向を提供する。実施形態では、空間的配向は、がん細胞を攻撃するように操作されたＴ細胞を配置する。実施形態では、安定したシナプスは、がん細胞の近くで、操作されたＴ細胞の増殖を可能にする。実施形態では、安定したシナプスは、がん細胞／腫瘍部位の近くの操作されていない天然Ｔ細胞の動員及び増殖を可能にする。実施形態では、安定なシナプスは、刺激シグナル（例えば、サイトカイン）の発現及び／または放出を提供するのに十分なシグナル伝達を可能にする。
実施形態では、本発明の操作されたＴ細胞によって発現及び分泌される異種キメラタンパク質は、以下の表４から選択される。
Figure 2022537066000008
実施形態では、本発明の操作されたＴ細胞によって発現されるキメラ抗原受容体は、以下の表５から選択される：
Figure 2022537066000009
実施形態では、本明細書に開示される操作されたＴ細胞は、表４からの１つ以上の異種キメラタンパク質を発現及び分泌し、表５からの１つ以上のキメラ抗原受容体を発現する。実施形態では、操作されたＴ細胞は、表４からの１つの異種キメラタンパク質を発現及び分泌し、表５からの１つ以上のキメラ抗原受容体を発現する。実施形態では、操作されたＴ細胞は、表４からの１つ以上の異種キメラタンパク質を発現及び分泌し、表５からの１つのキメラ抗原受容体を発現する。実施形態では、操作されたＴ細胞は、表４からの２つ以上の異種キメラタンパク質を発現及び分泌し、表５からの２つ以上のキメラ抗原受容体を発現する。
例として、操作されたＴ細胞は、ＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ異種キメラタンパク質及び／またはＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ異種キメラタンパク質を発現及び分泌し、がん細胞及び／または操作されたＴ細胞によって提示されるＣＤ１９に結合するキメラ抗原受容体を発現し、ＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ異種キメラタンパク質を発現及び分泌し、がん細胞によって提示されるＣＤ１９に結合するキメラ抗原受容体を発現する。
本明細書で開示される対象の操作されたＴ細胞は、リンパ系譜の細胞であり得る。Ｂ細胞及びＴ細胞を含むリンパ系譜は、抗体の産生、細胞免疫系の調節、血液中の外来物質の検出、宿主にとって外来の細胞の検出など、を提供する。リンパ系譜の操作されたＴ細胞の非限定的な例としては、Ｔ細胞、胚性幹細胞、及び多能性幹細胞（例えば、リンパ球が分化し得るもの）が挙げられる。Ｔ細胞は、胸腺で成熟し、細胞媒介性免疫に主に関与するリンパ球であり得る。Ｔ細胞は適応免疫系に関与している。本明細書に開示される対象のＴ細胞は、任意のタイプのＴ細胞であり得、Ｔヘルパー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞（セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞様メモリーＴ細胞（または幹様メモリーＴ細胞）、及び２つのタイプのエフェクターメモリーＴ細胞：例えば、ＴＥＭ細胞及びＴＥＭＲＡ細胞、調節性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞としても知られる）、粘膜関連インバリアントＴ細胞、及びγδＴ細胞を含むが、これらに限定されない。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬまたはキラーＴ細胞）は、感染した体細胞またはがん細胞の死を誘導することができるＴリンパ球のサブセットである。患者自身のＴ細胞は、ＣＡＲの導入を通して、特定の抗原を標的とするように遺伝子改変され得る。
本発明のヒトリンパ球のタイプには、限定されないが、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変された末梢ドナーリンパ球（Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．２００３ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ３：３５－４５）、α及びβヘテロ二量体を含む全長抗原認識Ｔ細胞受容体複合体を発現するように遺伝子改変された末梢ドナーリンパ球（Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．２００６ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１４：１２６－１２９）、腫瘍生検における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に由来するリンパ球培養物（Ｐａｎｅｌｌｉ，Ｍ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．２０００ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：４９５－５０４；Ｐａｎｅｌｌｉ，Ｍ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．２０００ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：４３８２－４３９２）、及び、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）またはパルス樹状細胞（Ｄｕｐｏｎｔ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．２００５ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５：５４１７－５４２７；Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ，Ｇ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．２００３ Ｂｌｏｏｄ １０２：２４９８－２５０５）を用いる選択的にインビトロ増殖された抗原特異的末梢血液白血球が含まれる。Ｔ細胞は、自己の、同種の、またはインビトロで操作された前駆細胞もしくは幹細胞に由来するＴ細胞であってもよい。
実施形態では、操作されたＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
実施形態では、操作されたＴ細胞は、アルファ／ベータＴ細胞のいずれか１項に記載を発現する。
実施形態では、操作されたＴ細胞は、ガンマ／デルタＴ細胞受容体を発現する。
実施形態では、操作されたＴ細胞は、同種Ｔ細胞、自己Ｔ細胞、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に由来する。実施形態では、操作されたＴ細胞は、ヒト細胞である。
実施形態では、操作されたＴ細胞は、対象、例えば、抗がん療法を必要とする対象から得られたＴ細胞またはＴ細胞前駆体に由来する。実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、自己供給源から（例えば、抗がん療法を必要とする同じ対象から）得られる。実施形態では、自己Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、対象から得られ、インビトロで培養及び増殖される。実施形態では、培養及び／または増殖された自己Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、本明細書に開示されるように、キメラＴ細胞受容体及び／または異種キメラタンパク質を発現するように操作される。実施形態では、自己Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、キメラＴ細胞受容体を発現するように操作され、及び／または異種キメラタンパク質は、本明細書に開示される方法を使用して分析される。実施形態では、自己Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、キメラＴ細胞受容体を発現するように操作され、及び／または異種キメラタンパク質は、任意選択的に、インビトロで培養及び／または増殖され、それを必要とする対象に投与される。実施形態では、自己Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、キメラＴ細胞受容体を発現するように操作され、及び／または異種キメラタンパク質は、本明細書に開示されるように製造され、任意選択的に、本明細書に開示される方法を使用して分析され、それを必要とする対象に投与される。
実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、患者の必要性に先立って安価に製造され得る単離されたヒトＴ細胞（すなわち、ＴＣＲ欠損Ｔ細胞）の同種源から得られる。実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、同種源から得られ、単一の部位での単一の治療用製品の作製を可能にする。実施形態では、本明細書に開示されるように修飾される同種Ｔ細胞は、機能的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現しない。理論に拘束されることなく、宿主において、ＴＣＲサブユニット／二量体の一部またはさらに全ては細胞表面上で発現され得るが、Ｔ細胞が、望ましくない反応を誘発するのに十分な機能的ＴＣＲを発現しないことを理解されたい。それらの表面上に機能的なＴＣＲがなければ、同種Ｔ細胞は宿主細胞に対する望ましくない免疫応答を開始することができない。実施形態では、本明細書に開示されるように修飾されるＴＣＲ欠損異種Ｔ細胞は、例えば、宿主ＭＨＣ分子を認識できないため、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こすことができない。加えて、これらのＴＣＲ欠損Ｔ細胞は、機能的、非ＴＣＲ、疾患特異的受容体を同時に発現するように操作され得る。
当業者に周知であるように、対象から同種Ｔ細胞を単離するための様々な方法が、容易に利用可能である。例えば、細胞表面マーカーの発現を使用するか、または市販のキット（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．からのＩＳＯＣＥＬＬ）を使用する。
実施形態では、同種Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、対象から得られ、インビトロで培養及び増殖される。実施形態では、培養及び／または増殖された同種Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、本明細書に開示されるように、キメラＴ細胞受容体及び／または異種キメラタンパク質を発現するように操作される。実施形態では、同種Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、キメラＴ細胞受容体を発現するように操作され、及び／または異種キメラタンパク質は、本明細書に開示される方法を使用して分析される。実施形態では、同種Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、キメラＴ細胞受容体を発現するように操作され、及び／または異種キメラタンパク質は、任意選択的に、インビトロで培養及び／または増殖され、それを必要とする対象に投与される。実施形態では、同種Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、キメラＴ細胞受容体を発現するように操作され、及び／または異種キメラタンパク質は、本明細書に開示されるように製造され、任意選択的に、本明細書に開示される方法を使用して分析され、それを必要とする対象に投与される。
操作されたＴ細胞を製造する方法
本発明の一態様は、操作されたＴ細胞を製造するための方法である。本方法は、（ｉ）対象からＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞を得るステップと、（ｉｉ）キメラ抗原受容体をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第１のＤＮＡ分子で、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップと、（ｉｉｉ）異種キメラタンパク質をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第２のＤＮＡ分子で、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップと、を含む。この態様の異種キメラタンパク質は、一般構造：Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、式中、（ａ）は、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、（ｃ）は、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインである。実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉｉｉ）に先行する。実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉｉ）に先行する。実施形態では、ステップ（ｉｉ）及びステップ（ｉｉｉ）は、同時である。
本発明の別の態様は、操作されたＴ細胞を製造するための別の方法である。本方法は、（ｉ）キメラ抗原受容体をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第１のＤＮＡ分子でトランスフェクトされた、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を得るステップと、（ｉｉ）異種キメラタンパク質をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第２のＤＮＡ分子で、ステップ（ｉ）のＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップと、を含む。この態様では、異種キメラタンパク質は、一般構造：Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、式中、（ａ）は、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、（ｃ）は、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインである。
本発明のさらに別の態様は、操作されたＴ細胞を製造するためのさらに別の方法である。本方法は、（ｉ）異種キメラタンパク質をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第１のＤＮＡ分子でトランスフェクトされた、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を得ることと、（ｉｉ）キメラ抗原受容体をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第２のＤＮＡ分子で、ステップ（ｉ）のＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトすることと、を含む。この態様では、異種キメラタンパク質は、一般構造：Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、式中、（ａ）は、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、（ｃ）は、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインである。
さらに別の態様では、本発明は、操作されたＴ細胞を製造するためのさらに別の方法を提供する。本方法は、（ｉ）Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を得るステップと、（ｉｉ）キメラ抗原受容体をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計されたＤＮＡ分子で、ステップ（ｉ）のＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップと、を含む。この態様では、異種キメラタンパク質は、一般構造：Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、式中、（ａ）は、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、（ｃ）は、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインである。実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞前駆細胞である。実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞は、患者から得られる。実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞は、がん抗原に特異的である。
これらの態様は、本明細書に開示されるキメラ抗原受容体のうちのいずれか、及び本明細書に開示される異種キメラタンパク質のうちのいずれかを発現する操作されたＴ細胞の製造を含む。
実施形態では、キメラ抗原受容体は、操作されたＴ細胞のゲノムのゲノムセーフハーバー（ＧＳＲ）に導入される核酸によってコードされる。実施形態では、ＧＳＲは、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子、またはＲＯＳＡ２６遺伝子座／ＲＯＳＡ２６遺伝子座ヒトのオルソログである。
実施形態では、キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞のゲノムの内因性Ｔ細胞受容体遺伝子座に導入される核酸によってコードされる。
任意の標的化されたゲノム編集方法を使用して、キメラ抗原受容体をコードする核酸を操作されたＴ細胞のゲノムの選択された遺伝子座に組み込むことができる。実施形態では、キメラ抗原受容体の発現は、遺伝子座内またはその付近の内因性プロモーター／エンハンサーによって駆動される。実施形態では、キメラ抗原受容体の発現は、遺伝子座に組み込まれた外因性プロモーターによって駆動される。キメラ抗原受容体が組み込まれている遺伝子座は、遺伝子座内の遺伝子の発現レベル、及び遺伝子座内の遺伝子の発現のタイミングに基づいて選択される。発現レベル及びタイミングは、細胞分化及びマイトジェン／サイトカイン微小環境の異なる段階で変化し得、これらは、選択を行う際に考慮されるべき要因のうちの１つである。
実施形態では、クラスター化された規則的な間隔の短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）システムは、操作されたＴ細胞のゲノムの選択された遺伝子座において、キメラ抗原受容体をコードする核酸を組み込むために使用される。ＣＲＩＳＰＲシステムを使用する方法は、例えば、ＷＯ２０１４０９３６６１、ＷＯ２０１５１２３３３９、及びＷＯ２０１５０８９３５４に記載されている（これらの各々は、その全体が参照により組み込まれる）。
実施形態では、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、操作されたＴ細胞のゲノムの選択された遺伝子座において、キメラ抗原受容体をコードする核酸を組み込むために使用される。ＺＦＮ系を使用する方法は、例えば、ＷＯ２００９１４６１７９、ＷＯ２００８０６０５１０、及びＣＮ１０２１７４５７６に記載されている（これらの各々は、その全体が参照により組み込まれる）。
実施形態では、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系は、操作されたＴ細胞のゲノムの選択された遺伝子座において、キメラ抗原受容体をコードする核酸を組み込むために使用される。ＴＡＬＥＮシステムを使用する方法は、例えば、ＷＯ２０１４１３４４１２、ＷＯ２０１３１６３６２８、及びＷＯ２０１４０４０３７０に記載されている（これらの各々は、その全体が参照により組み込まれる）。
ゲノム編集剤を送達するための方法は、必要性に応じて変化し得る。実施形態では、選択されたゲノム編集方法の構成要素は、１つ以上のプラスミド中のＤＮＡ構築物として送達される。一実施形態では、構成要素は、ウイルスベクターを介して送達される。一般的な送達方法には、これらに限定されないが、電気穿孔、微量注入、遺伝子銃、インペールフェクション、静水圧、持続注入、超音波処理、マグネトフェクション、アデノ随伴ウイルス、ウイルスベクターのエンベロープタンパク質シュードタイピング、複製能のあるベクターシス及びトランス作用性エレメント、単純ヘルペスウイルス、ならびに化学ビヒクル（例えば、オリゴヌクレオチド、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、無機ナノ粒子、及び細胞透過性ペプチド）が含まれる。
修飾は、選択された遺伝子座内の任意の場所、または組み込まれたキメラ抗原受容体の遺伝子発現に影響を及ぼし得る任意の場所で行うことができる。実施形態では、修飾は、組み込まれたキメラ抗原受容体の転写開始部位の上流に導入される。実施形態では、修飾は、転写開始部位とキメラ抗原受容体のタンパク質コード領域との間に導入される。実施形態では、修飾は、キメラ抗原受容体のタンパク質コード領域の下流に導入される。
本明細書に開示される異種キメラタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを使用してもよく、または本明細書に開示される異種キメラタンパク質をコードする核酸を、操作されたＴ細胞のゲノム中に安定して組み込んでもよい。
実施形態では、核酸は、ベクター（プラスミド、ウイルス、またはその他）に、３つの断片（第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、続いてリンカー配列、続いて第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン）をコードする。
実施形態では、核酸は、哺乳動物細胞において機能的である発現制御領域またはその相補体に作動可能に連結された異種キメラタンパク質またはその相補体をコードする。
実施形態では、本発明は、合図に応答して一過性で高レベルの発現をもたらすことが可能である誘導性プロモーターの使用を企図する。例えば、がん細胞の近くにある場合、キメラタンパク質の発現ベクターで形質転換された細胞、及び／またはキメラタンパク質をコードし、誘導性プロモーターを含む核酸の安定した組み込みを有する細胞は、トランスフェクトされた細胞を適切な合図（ｃｕｅ）にさらすことによって、一過的に高レベルの薬剤を産生するように誘導される。例示的な誘導性発現制御領域には、低分子化学化合物などの合図で刺激される誘導性プロモーターを含む領域が含まれる。特定の例は、例えば、米国特許第５，９８９，９１０号、同第５，９３５，９３４号、同第６，０１５，７０９号、及び同第６，００４，９４１号に見出すことができ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（キメラ抗原受容体をコードする、及び／または異種キメラタンパク質をコードする）核酸の安定した組み込みは、抗生物質選択を使用するために促進／選択され得る。安定した組み込みの選択のために一般的に使用される抗生物質としては、ブラストサイジン、Ｇ－４１８（別名、ジェネティシン）、ハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシン、及びゼオシンが挙げられる。
核酸を生細胞に導入するために利用可能な様々な技術が存在する。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸の移入に好適な技術には、リポソームの使用、電気穿孔、微量注入、細胞融合、ポリマー系システム、ＤＥＡＥ－デキストラン、ウイルス形質導入、リン酸カルシウム沈降法などが含まれる。インビボでの遺伝子導入のために、リポソーム、キトサン及びゼラチンなどの天然ポリマー系送達ビヒクル、インビボでの形質導入にさらに好適であるウイルスベクターを含む多くの技術及び試薬も使用され得る。いくつかの状況では、がん細胞の表面膜タンパク質に特異的な抗体またはリガンドなどの標的化剤を提供することが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスと関連付けられた細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、例えば、特定の細胞型に向性のカプシドタンパク質またはその断片、循環中の内部化を受けるタンパク質の抗体、細胞内限局化を標的とし、細胞内半減期を強化するタンパク質を標的とするため、及び／またはそれらの取り込みを促進するために使用され得る。受容体を媒介したエンドサイトーシスの技術は、例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９－４４３２（１９８７）、及びＷａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，３４１０－３４１４（１９９０）に記載される。
実施形態では、キメラ抗原受容体をコードする核酸及び／または異種キメラタンパク質をコードする核酸は、ウイルスベクターにパッケージングされ得る。遺伝子治療に有用な多くのウイルスベクターが既知である（例えば、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１：１１７－１２２，２００３を参照されたい）。実施形態では、選択されたベクターは、高効率の感染性及び安定した組み込み及び発現を示す（例えば、Ｃａｙｏｕｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：４２３－４３０，１９９７、Ｋｉｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：８３３－８４４，１９９６、Ｂｌｏｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６６４１－６６４９，１９９７、Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３－２６７，１９９６、及びＭｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１０３１９，１９９７）。使用することができる他のウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、またはヘルペスウイルス（エプスタイン－バーウイルスなど）が挙げられる（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １５－１４，１９９０、Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２７５－１２８１，１９８９、Ｅｇｌｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８－６１４，１９８８、Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １ ：５５－６１，１９９０、Ｓｈａｒｐ，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３３７：１２７７－１２７８，１９９１、Ｃｏｒｎｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３６：３１１－３２２，１９８７、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６：４０１－４０９，１９８４、Ｍｏｅｎ，Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ １７：４０７－４１６，１９９１、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９８０－９９０，１９８９、ＬｅＧａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８－９９０，１９９３、及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｃｈｅｓｔ １０７：７７Ｓ－８３Ｓ，１９９５のベクターも参照されたい）。レトロウイルスベクターは、特によく開発されており、臨床現場で使用されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ ３２３：３７０，１９９０、Ａｎｄｅｒｓｏｎらの米国特許第５，３９９，３４６号、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
キメラ抗原受容体をコードする核酸及び／または異種キメラタンパク質をコードする核酸は、単一のベクターで、もしくは単一のマルチシストロン性発現カセットで、単一のベクターの複数の発現カセットで、または複数のベクターで、構築され得る。ポリシストロン発現カセットを作製するエレメントの例としては、これらに限定されないが、様々な内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ、例えば、ポリオウイルスＩＲＥＳ及び脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ）ならびに２Ａペプチド（例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａペプチド）が挙げられる。レトロウイルスベクターと適切なパッケージング株との組み合わせも好適であり、カプシドタンパク質はヒト細胞に感染するために機能するであろう。様々な両種指向性ウイルス産生細胞株が知られており、これらに限定されないが、ＰＡ１２（Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３１－４３７）、ＰＡ３１７（Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５－２９０２）、及びＣＲＩＰ（Ｄａｎｏｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：６４６０－６４６４）が含まれる。また、非両種指向性粒子、例えば、ＶＳＶＧ、ＲＤ１１４、またはＧＡＬＶエンベロープを有するシュードタイプの粒子、及び当該技術分野で既知の任意の他の粒子も好適である。
キメラ抗原受容体をコードする核酸及び／または異種キメラタンパク質をコードする核酸は、エクスビボでＴ細胞またはＴ細胞前駆体（例えば、自己または異種の初代細胞またはその子孫）にトランスフェクトされてもよく、その後、操作されたＴ細胞（またはその子孫）は、標的組織に注射されるか、または全身的に患者に注射／注入される。
実施形態では、製造方法は、キメラ抗原受容体を発現する細胞及び／または異種キメラタンパク質を発現する細胞の増殖を選択的に増強する培地中で、トランスフェクトされたＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞（ここで、操作されたＴ細胞と称される）を培養するステップをさらに含む。
実施形態では、本方法は、キメラ抗原受容体を発現する、及び／または異種キメラタンパク質を発現する、操作されたＴ細胞を単離するステップをさらに含む。
本発明はまた、操作されたＴ細胞に関し、本明細書に開示される方法によって製造され、及び／または本明細書に開示される方法によって単離される。
本発明の別の態様は、本明細書に開示される方法によって得られる、操作されたＴ細胞の集団である。
操作されたＴ細胞の集団
本発明の態様は、本明細書に開示される操作されたＴ細胞を含む細胞の集団、及びそれを得るための方法を提供する。
本方法は、本明細書で開示される方法により製造される操作されたＴ細胞を得ることと、操作されたＴ細胞の増殖を増強する培地中で、操作されたＴ細胞を培養することとを含み、それによって、操作されたＴ細胞の集団を得る。
実施形態では、集団は、キメラ抗原受容体を発現し、異種キメラタンパク質を発現する操作されたＴ細胞を含み、キメラ抗原受容体を発現し、異種キメラタンパク質を発現しない操作されたＴ細胞をさらに含む。
実施形態では、集団は、キメラ抗原受容体を発現し、異種キメラタンパク質を発現する操作されたＴ細胞を含み、異種キメラタンパク質を発現し、キメラ抗原受容体を発現しない操作されたＴ細胞をさらに含む。
実施形態では、集団は、キメラ抗原受容体を発現し、異種キメラタンパク質を発現する操作されたＴ細胞を含み、異種キメラタンパク質を発現し、キメラ抗原受容体を発現しない操作されたＴ細胞をさらに含む。
実施形態では、集団は、キメラ抗原受容体を発現し、異種キメラタンパク質を発現する操作されたＴ細胞を含み、異種キメラタンパク質もキメラ抗原受容体も発現しないＴ細胞（例えば、天然Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体）をさらに含む。
したがって、集団は、キメラタンパク質の両方を発現する操作されたＴ細胞、及び１つのキメラタンパク質を発現する追加の操作されたＴ細胞、及び／またはどちらのキメラタンパク質も発現しないＴ細胞を含むことができる。
操作されたＴ細胞の分析
さらに別の態様では、本発明は、操作されたＴ細胞を分析する方法を提供する。本方法は、（Ａ）操作されたＴ細胞を製造するステップと、（Ｂ）操作されたＴ細胞を培養するステップと、（Ｃ）操作されたＴ細胞の培養上清を単離し、任意選択的に、培養上清を濃縮または部分的に精製するステップと、（Ｄ）操作されたＴ細胞の培養上清を、第２の細胞と接触させることと、及び（Ｅ）第２の細胞によるサイトカインまたはケモカインの発現を分析するステップと、を含む。実施形態では、操作されたＴ細胞は、本明細書に開示される実施形態のいずれかに従って製造される。実施形態では、第２の細胞は、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＡＣＶＲ１ｂ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＸＬ、Ｂ７－Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ３Ａ１、ＢＴＮＬ３Ａ２、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）、ＣＤ５８（ＬＦＡ３）、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２２６（ＰＴＡＵＤＮＡＭＩ）、ＣＤ２４４、ＣＤ２４７、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）、ＣＴＬＡ－４、ＤｃＲ３、Ｆａｓ、ＦＧＦＲ３、Ｆｎ１４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲＤＬ２、ＬＡＧ－３、ＬＡＰ、ＬＡＹＮ、ＬＴｂＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ４６（ＮＣＲ１）、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＴＢ－Ａ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＶＲ、ＲＡＮＫ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）、ＳＬＡＭＦ６、ＴＡＣＩ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＭＩＧＤ２、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＲＡＩＬ－Ｒ、ＶＩＳＴＡ、またはＶＳＩＧ８から選択される膜貫通タンパク質の受容体を発現する。実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２２、ＣＸＣＬ８、ＩＬ－１α／ＩＬ－１Ｆ１、ＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｆ２、ＬＡＰ（ＴＧＦ－β１）、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ Ｌ、またはそれらの任意の２つ以上の組み合わせから選択される。実施形態では、発現は、ｍＲＮＡの検出及び／または定量（限定されないが、例えば、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を使用すること）によって分析される。実施形態では、発現は、タンパク質の検出及び／または定量化によって分析される。
さらに別の態様では、本発明は、操作されたＴ細胞を分析する方法を提供する。本方法は、（Ａ）操作されたＴ細胞を製造するステップを含み、製造が、（ｉ）対象からＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞を得るステップと、（ｉｉ）キメラ抗原受容体をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第１のＤＮＡ分子で、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップと、（ｉｉｉ）異種キメラタンパク質をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第２のＤＮＡ分子で、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップと、を含む。この態様の異種キメラタンパク質は、一般構造：Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、式中、（ａ）は、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、（ｃ）は、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、（Ｂ）操作されたＴ細胞を培養し、（Ｃ）操作されたＴ細胞の培養上清を単離し、任意選択的に、培養上清を濃縮または部分的に精製し、（Ｄ）操作されたＴ細胞の培養上清を第２の細胞と接触させ、（Ｅ）第２の細胞によるサイトカインまたはケモカインの発現を分析する。実施形態では、第２の細胞は、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＡＣＶＲ１ｂ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＸＬ、Ｂ７－Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ３Ａ１、ＢＴＮＬ３Ａ２、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）、ＣＤ５８（ＬＦＡ３）、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２２６（ＰＴＡＵＤＮＡＭＩ）、ＣＤ２４４、ＣＤ２４７、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）、ＣＴＬＡ－４、ＤｃＲ３、Ｆａｓ、ＦＧＦＲ３、Ｆｎ１４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲＤＬ２、ＬＡＧ－３、ＬＡＰ、ＬＡＹＮ、ＬＴｂＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ４６（ＮＣＲ１）、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＴＢ－Ａ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＶＲ、ＲＡＮＫ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）、ＳＬＡＭＦ６、ＴＡＣＩ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＭＩＧＤ２、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＲＡＩＬ－Ｒ、ＶＩＳＴＡ、またはＶＳＩＧ８から選択される膜貫通タンパク質の受容体を発現する。実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２２、ＣＸＣＬ８、ＩＬ－１α／ＩＬ－１Ｆ１、ＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｆ２、ＬＡＰ（ＴＧＦ－β１）、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ Ｌ、またはそれらの任意の２つ以上の組み合わせから選択される。実施形態では、発現は、ｍＲＮＡの検出及び／または定量化によって分析される。実施形態では、発現は、タンパク質の検出及び／または定量化によって分析される。実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉｉｉ）に先行する。実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉｉ）に先行する。実施形態では、ステップ（ｉｉ）及びステップ（ｉｉｉ）は、同時である。
さらに別の態様では、本発明は、操作されたＴ細胞を分析する方法を提供する。本方法は、（Ａ）操作されたＴ細胞を製造するステップであって、製造が、（ｉ）キメラ抗原受容体をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第１のＤＮＡ分子でトランスフェクトされた、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を得るステップ、及び（ｉｉ）異種キメラタンパク質をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第２のＤＮＡ分子で、ステップ（ｉ）のＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップを含み、異種キメラタンパク質が、一般構造：Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、式中、（ａ）は、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、（ｃ）は、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインである、操作されたＴ細胞を製造するステップと、（Ｂ）操作されたＴ細胞を培養するステップと、（Ｃ）操作されたＴ細胞の培養上清を単離し、任意選択的に、培養上清を濃縮または部分的に精製するステップと、（Ｄ）操作されたＴ細胞の培養上清を第２の細胞と接触させるステップと、（Ｅ）第２の細胞によるサイトカインまたはケモカインの発現を分析するステップと、を含む。実施形態では、第２の細胞は、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＡＣＶＲ１ｂ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＸＬ、Ｂ７－Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ３Ａ１、ＢＴＮＬ３Ａ２、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）、ＣＤ５８（ＬＦＡ３）、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２２６（ＰＴＡＵＤＮＡＭＩ）、ＣＤ２４４、ＣＤ２４７、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）、ＣＴＬＡ－４、ＤｃＲ３、Ｆａｓ、ＦＧＦＲ３、Ｆｎ１４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲＤＬ２、ＬＡＧ－３、ＬＡＰ、ＬＡＹＮ、ＬＴｂＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ４６（ＮＣＲ１）、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＴＢ－Ａ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＶＲ、ＲＡＮＫ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）、ＳＬＡＭＦ６、ＴＡＣＩ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＭＩＧＤ２、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＲＡＩＬ－Ｒ、ＶＩＳＴＡ、またはＶＳＩＧ８から選択される膜貫通タンパク質の受容体を発現する。実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２２、ＣＸＣＬ８、ＩＬ－１α／ＩＬ－１Ｆ１、ＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｆ２、ＬＡＰ（ＴＧＦ－β１）、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ Ｌ、またはそれらの任意の２つ以上の組み合わせから選択される。実施形態では、発現は、ｍＲＮＡの検出及び／または定量化によって分析される。実施形態では、発現は、タンパク質の検出及び／または定量化によって分析される。
さらに別の態様では、本発明は、操作されたＴ細胞を分析する方法を提供する。本方法は、（Ａ）操作されたＴ細胞を製造するステップであって、製造が、（ｉ）異種キメラタンパク質をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第１のＤＮＡ分子でトランスフェクトされた、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を得るステップ、及び（ｉｉ）キメラ抗原受容体をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第２のＤＮＡ分子で、ステップ（ｉ）のＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップを含み、異種キメラタンパク質が、一般構造：Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、式中、（ａ）は、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、（ｃ）は、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインである、操作されたＴ細胞を製造するステップと、（Ｂ）操作されたＴ細胞を培養するステップと、（Ｃ）操作されたＴ細胞の培養上清を単離し、任意選択的に、培養上清を濃縮または部分的に精製するステップと、（Ｄ）操作されたＴ細胞の培養上清を第２の細胞と接触させるステップと、（Ｅ）第２の細胞によるサイトカインまたはケモカインの発現を分析するステップと、を含む。実施形態では、第２の細胞は、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＡＣＶＲ１ｂ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＸＬ、Ｂ７－Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ３Ａ１、ＢＴＮＬ３Ａ２、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）、ＣＤ５８（ＬＦＡ３）、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２２６（ＰＴＡＵＤＮＡＭＩ）、ＣＤ２４４、ＣＤ２４７、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）、ＣＴＬＡ－４、ＤｃＲ３、Ｆａｓ、ＦＧＦＲ３、Ｆｎ１４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲＤＬ２、ＬＡＧ－３、ＬＡＰ、ＬＡＹＮ、ＬＴｂＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ４６（ＮＣＲ１）、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＴＢ－Ａ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＶＲ、ＲＡＮＫ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）、ＳＬＡＭＦ６、ＴＡＣＩ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＭＩＧＤ２、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＲＡＩＬ－Ｒ、ＶＩＳＴＡ、またはＶＳＩＧ８から選択される膜貫通タンパク質の受容体を発現する。実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２２、ＣＸＣＬ８、ＩＬ－１α／ＩＬ－１Ｆ１、ＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｆ２、ＬＡＰ（ＴＧＦ－β１）、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ Ｌ、またはそれらの任意の２つ以上の組み合わせから選択される。実施形態では、発現は、ｍＲＮＡの検出及び／または定量化によって分析される。実施形態では、発現は、タンパク質の検出及び／または定量化によって分析される。
さらに別の態様では、本発明は、操作されたＴ細胞を分析する方法を提供する。本方法は、（Ａ）操作されたＴ細胞を製造するステップを含み、製造が、（ｉ）Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を得るステップ、及び（ｉｉ）キメラ抗原受容体をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計されたＤＮＡ分子で、ステップ（ｉ）のＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップを含み、異種キメラタンパク質が、一般構造：Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、式中、（ａ）は、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、（ｃ）は、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインである。実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞前駆細胞である。実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞は、患者から得られる。実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞は、がん抗原に特異的であり、（Ｂ）操作されたＴ細胞を培養し、（Ｃ）操作されたＴ細胞の培養上清を単離し、任意選択的に、培養上清を濃縮または部分的に精製し、（Ｄ）操作されたＴ細胞の培養上清を第２の細胞と接触させ、（Ｅ）第２の細胞によるサイトカインまたはケモカインの発現を分析する。実施形態では、第２の細胞は、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＡＣＶＲ１ｂ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＸＬ、Ｂ７－Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ３Ａ１、ＢＴＮＬ３Ａ２、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）、ＣＤ５８（ＬＦＡ３）、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２２６（ＰＴＡＵＤＮＡＭＩ）、ＣＤ２４４、ＣＤ２４７、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）、ＣＴＬＡ－４、ＤｃＲ３、Ｆａｓ、ＦＧＦＲ３、Ｆｎ１４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲＤＬ２、ＬＡＧ－３、ＬＡＰ、ＬＡＹＮ、ＬＴｂＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ４６（ＮＣＲ１）、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＴＢ－Ａ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＶＲ、ＲＡＮＫ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）、ＳＬＡＭＦ６、ＴＡＣＩ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＭＩＧＤ２、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＲＡＩＬ－Ｒ、ＶＩＳＴＡ、またはＶＳＩＧ８から選択される膜貫通タンパク質の受容体を発現する。実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２２、ＣＸＣＬ８、ＩＬ－１α／ＩＬ－１Ｆ１、ＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｆ２、ＬＡＰ（ＴＧＦ－β１）、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ Ｌ、またはそれらの任意の２つ以上の組み合わせから選択される。実施形態では、発現は、ｍＲＮＡの検出及び／または定量化によって分析される。実施形態では、発現は、タンパク質の検出及び／または定量化によって分析される。
さらに別の態様では、本発明は、操作されたＴ細胞を分析する方法を提供する。本方法は、（Ａ）操作されたＴ細胞を製造するステップと、（Ｂ）操作されたＴ細胞を、第２の細胞と共培養するステップと、（Ｃ）第２の細胞によるサイトカインの発現を分析するステップと、を含む。実施形態では、操作されたＴ細胞は、本明細書に開示される実施形態のいずれかに従って製造される。実施形態では、第２の細胞は、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＡＣＶＲ１ｂ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＸＬ、Ｂ７－Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ３Ａ１、ＢＴＮＬ３Ａ２、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）、ＣＤ５８（ＬＦＡ３）、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２２６（ＰＴＡＵＤＮＡＭＩ）、ＣＤ２４４、ＣＤ２４７、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）、ＣＴＬＡ－４、ＤｃＲ３、Ｆａｓ、ＦＧＦＲ３、Ｆｎ１４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲＤＬ２、ＬＡＧ－３、ＬＡＰ、ＬＡＹＮ、ＬＴｂＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ４６（ＮＣＲ１）、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＴＢ－Ａ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＶＲ、ＲＡＮＫ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）、ＳＬＡＭＦ６、ＴＡＣＩ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＭＩＧＤ２、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＲＡＩＬ－Ｒ、ＶＩＳＴＡ、またはＶＳＩＧ８から選択される膜貫通タンパク質の受容体を発現する。実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２２、ＣＸＣＬ８、ＩＬ－１α／ＩＬ－１Ｆ１、ＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｆ２、ＬＡＰ（ＴＧＦ－β１）、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ Ｌ、またはそれらの任意の２つ以上の組み合わせから選択される。実施形態では、発現は、ｍＲＮＡの検出及び／または定量化によって分析される。実施形態では、発現は、タンパク質の検出及び／または定量化によって分析される。
さらに別の態様では、本発明は、操作されたＴ細胞を分析する方法を提供する。本方法は、（Ａ）操作されたＴ細胞を製造するステップであって、製造が、（ｉ）対象からＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞を得るステップと、（ｉｉ）キメラ抗原受容体をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第１のＤＮＡ分子で、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップと、（ｉｉｉ）異種キメラタンパク質をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第２のＤＮＡ分子で、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップと、を含む。この態様の異種キメラタンパク質は、一般構造：Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、式中、（ａ）は、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、（ｃ）は、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、（Ｂ）操作されたＴ細胞を第２の細胞と共培養し、（Ｃ）第２の細胞によるサイトカインの発現を分析する。実施形態では、操作されたＴ細胞は、本明細書に開示される実施形態のいずれかに従って製造される。実施形態では、第２の細胞は、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＡＣＶＲ１ｂ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＸＬ、Ｂ７－Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ３Ａ１、ＢＴＮＬ３Ａ２、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）、ＣＤ５８（ＬＦＡ３）、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２２６（ＰＴＡＵＤＮＡＭＩ）、ＣＤ２４４、ＣＤ２４７、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）、ＣＴＬＡ－４、ＤｃＲ３、Ｆａｓ、ＦＧＦＲ３、Ｆｎ１４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲＤＬ２、ＬＡＧ－３、ＬＡＰ、ＬＡＹＮ、ＬＴｂＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ４６（ＮＣＲ１）、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＴＢ－Ａ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＶＲ、ＲＡＮＫ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）、ＳＬＡＭＦ６、ＴＡＣＩ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＭＩＧＤ２、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＲＡＩＬ－Ｒ、ＶＩＳＴＡ、またはＶＳＩＧ８から選択される膜貫通タンパク質の受容体を発現する。実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２２、ＣＸＣＬ８、ＩＬ－１α／ＩＬ－１Ｆ１、ＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｆ２、ＬＡＰ（ＴＧＦ－β１）、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ Ｌ、またはそれらの任意の２つ以上の組み合わせから選択される。実施形態では、発現は、ｍＲＮＡの検出及び／または定量化によって分析される。実施形態では、発現は、タンパク質の検出及び／または定量化によって分析される。実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉｉｉ）に先行する。実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉｉ）に先行する。実施形態では、ステップ（ｉｉ）及びステップ（ｉｉｉ）は、同時である。
さらに別の態様では、本発明は、操作されたＴ細胞を分析する方法を提供する。本方法は、（Ａ）操作されたＴ細胞を製造するステップを含み、製造が、（ｉ）キメラ抗原受容体をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第１のＤＮＡ分子でトランスフェクトされた、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を得るステップ、及び（ｉｉ）異種キメラタンパク質をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第２のＤＮＡ分子で、ステップ（ｉ）のＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップを含み、異種キメラタンパク質が、一般構造：Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、式中、（ａ）は、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、（ｃ）は、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、（Ｂ）操作されたＴ細胞を第２の細胞と共培養し、（Ｃ）第２の細胞によるサイトカインの発現を分析する。実施形態では、操作されたＴ細胞は、本明細書に開示される実施形態のいずれかに従って製造される。実施形態では、第２の細胞は、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＡＣＶＲ１ｂ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＸＬ、Ｂ７－Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ３Ａ１、ＢＴＮＬ３Ａ２、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）、ＣＤ５８（ＬＦＡ３）、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２２６（ＰＴＡＵＤＮＡＭＩ）、ＣＤ２４４、ＣＤ２４７、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）、ＣＴＬＡ－４、ＤｃＲ３、Ｆａｓ、ＦＧＦＲ３、Ｆｎ１４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲＤＬ２、ＬＡＧ－３、ＬＡＰ、ＬＡＹＮ、ＬＴｂＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ４６（ＮＣＲ１）、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＴＢ－Ａ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＶＲ、ＲＡＮＫ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）、ＳＬＡＭＦ６、ＴＡＣＩ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＭＩＧＤ２、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＲＡＩＬ－Ｒ、ＶＩＳＴＡ、またはＶＳＩＧ８から選択される膜貫通タンパク質の受容体を発現する。実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２２、ＣＸＣＬ８、ＩＬ－１α／ＩＬ－１Ｆ１、ＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｆ２、ＬＡＰ（ＴＧＦ－β１）、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ Ｌ、またはそれらの任意の２つ以上の組み合わせから選択される。実施形態では、発現は、ｍＲＮＡの検出及び／または定量化によって分析される。実施形態では、発現は、タンパク質の検出及び／または定量化によって分析される。
さらに別の態様では、本発明は、操作されたＴ細胞を分析する方法を提供する。本方法は、（Ａ）操作されたＴ細胞を製造するステップであって、製造が、（ｉ）異種キメラタンパク質をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第１のＤＮＡ分子でトランスフェクトされた、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を得るステップ、及び（ｉｉ）キメラ抗原受容体をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第２のＤＮＡ分子で、ステップ（ｉ）のＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップを含み、異種キメラタンパク質が、一般構造：Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、式中、（ａ）は、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、（ｃ）は、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインである、操作されたＴ細胞を製造するステップと、（Ｂ）操作されたＴ細胞を第２の細胞と共培養するステップと、（Ｃ）第２の細胞によるサイトカインの発現を分析するステップと、を含む。実施形態では、操作されたＴ細胞は、本明細書に開示される実施形態のいずれかに従って製造される。実施形態では、第２の細胞は、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＡＣＶＲ１ｂ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＸＬ、Ｂ７－Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ３Ａ１、ＢＴＮＬ３Ａ２、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）、ＣＤ５８（ＬＦＡ３）、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２２６（ＰＴＡＵＤＮＡＭＩ）、ＣＤ２４４、ＣＤ２４７、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）、ＣＴＬＡ－４、ＤｃＲ３、Ｆａｓ、ＦＧＦＲ３、Ｆｎ１４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲＤＬ２、ＬＡＧ－３、ＬＡＰ、ＬＡＹＮ、ＬＴｂＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ４６（ＮＣＲ１）、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＴＢ－Ａ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＶＲ、ＲＡＮＫ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）、ＳＬＡＭＦ６、ＴＡＣＩ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＭＩＧＤ２、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＲＡＩＬ－Ｒ、ＶＩＳＴＡ、またはＶＳＩＧ８から選択される膜貫通タンパク質の受容体を発現する。実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２２、ＣＸＣＬ８、ＩＬ－１α／ＩＬ－１Ｆ１、ＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｆ２、ＬＡＰ（ＴＧＦ－β１）、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ Ｌ、またはそれらの任意の２つ以上の組み合わせから選択される。実施形態では、発現は、ｍＲＮＡの検出及び／または定量化によって分析される。実施形態では、発現は、タンパク質の検出及び／または定量化によって分析される。
さらに別の態様では、本発明は、操作されたＴ細胞を分析する方法を提供する。本方法は、（Ａ）操作されたＴ細胞を製造するステップであって、製造が、（ｉ）Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を得るステップ、及び（ｉｉ）キメラ抗原受容体をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計されたＤＮＡ分子で、ステップ（ｉ）のＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップを含み、異種キメラタンパク質が、一般構造：Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、式中、（ａ）は、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第１のドメインであり、（ｂ）は、第１及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、（ｃ）は、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインである。実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞前駆細胞である。実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞は、患者から得られる。実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞は、がん抗原に特異的であり、（Ｂ）操作されたＴ細胞を第２の細胞と共培養し、（Ｃ）第２の細胞によるサイトカインの発現を分析する。実施形態では、操作されたＴ細胞は、本明細書に開示される実施形態のいずれかに従って製造される。実施形態では、第２の細胞は、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＡＣＶＲ１ｂ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＸＬ、Ｂ７－Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ３Ａ１、ＢＴＮＬ３Ａ２、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）、ＣＤ５８（ＬＦＡ３）、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２２６（ＰＴＡＵＤＮＡＭＩ）、ＣＤ２４４、ＣＤ２４７、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）、ＣＴＬＡ－４、ＤｃＲ３、Ｆａｓ、ＦＧＦＲ３、Ｆｎ１４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲＤＬ２、ＬＡＧ－３、ＬＡＰ、ＬＡＹＮ、ＬＴｂＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ４６（ＮＣＲ１）、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＴＢ－Ａ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＶＲ、ＲＡＮＫ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）、ＳＬＡＭＦ６、ＴＡＣＩ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＭＩＧＤ２、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＲＡＩＬ－Ｒ、ＶＩＳＴＡ、またはＶＳＩＧ８から選択される膜貫通タンパク質の受容体を発現する。実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２２、ＣＸＣＬ８、ＩＬ－１α／ＩＬ－１Ｆ１、ＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｆ２、ＬＡＰ（ＴＧＦ－β１）、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ Ｌ、またはそれらの任意の２つ以上の組み合わせから選択される。実施形態では、発現は、ｍＲＮＡの検出及び／または定量化によって分析される。実施形態では、発現は、タンパク質の検出及び／または定量化によって分析される。
実施形態では、発現は、ｍＲＮＡの検出及び／または定量（限定されないが、例えば、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を使用すること）によって分析される。実施形態では、発現は、タンパク質の検出及び／または定量によって分析される（限定されないが、例えば、ＥＬＩＳＡを使用する）。
薬学的組成物
本明細書に開示される操作されたＴ細胞の集団（例えば、キメラタンパク質の両方を発現する操作されたＴ細胞を含み、かつ任意選択的に、追加の１つのキメラタンパク質を発現する操作されたＴ細胞及び／またはどちらのキメラタンパク質も発現しないＴ細胞を含む）は、薬学的組成物の調製に使用され得る。
本発明の態様は、本明細書に開示される操作されたＴ細胞と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む薬学的組成物を含む。
別の態様は、本明細書に開示される操作されたＴ細胞の集団及び薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物である。
実施形態では、薬学的組成物中の少なくとも１つの操作されたＴ細胞は、同種である。
実施形態では、薬学的組成物中の少なくとも１つの操作されたＴ細胞は、自己由来である。
実施形態では、薬学的組成物中の少なくとも１つの操作されたＴ細胞は、同種であり、薬学的組成物中の少なくとも１つの操作されたＴ細胞は、自己由来である。
本明細書に記載の操作されたＴ細胞の集団を含む任意の薬学的組成物は、本明細書に記載の任意の異種キメラタンパク質で補充され得る。補充された異種キメラタンパク質は、操作されたＴ細胞によって発現及び分泌される異種キメラタンパク質と同じであってもよく、及び／または補充された異種キメラタンパク質は、操作されたＴ細胞によって発現及び分泌される異種キメラタンパク質とは異なってもよい。
薬学的組成物は、適切な投与のための形態を提供するために、好適な量の薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。一実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、対象に投与される場合に無菌である。水は、本明細書に開示される組成物が静脈内投与される場合に有用な賦形剤である。食塩水溶液ならびにデキストロース及びグリセロールの水溶液はまた、特に注入溶液のために液体賦形剤として用いられ得る。好適な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなども含まれる。任意の薬学的組成物は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むこともできる。実施形態では、薬学的組成物は、生理食塩水緩衝液（限定されないが、ＴＢＳ、ＰＢＳなどを含む）を含み得る。好適な薬学的賦形剤の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １４４７－１６７６（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｓ．，１９ｔｈ ｅｄ．１９９５）に記載されている（参照により本明細書に組み込まれる）。
実施形態では、本明細書に開示される任意の操作されたＴ細胞またはそれを含む組成物は、本明細書に開示される投与様式に適合した薬学的組成物として、慣例の手順に従って製剤化される。
処置方法
本発明の一態様は、がんの治療を必要とする対象における、がんを治療するための方法である。本方法は、対象に、治療有効量の本明細書に開示される薬学的組成物を投与することを含む。
実施形態では、薬学的組成物中の少なくとも１つの操作されたＴ細胞は、同種である。
実施形態では、薬学的組成物中の少なくとも１つの操作されたＴ細胞は、自己由来である。
実施形態では、薬学的組成物中の少なくとも１つの操作されたＴ細胞は、自己由来であり、薬学的組成物中の少なくとも１つの操作されたＴ細胞は、同種である。
実施形態では、薬学的組成物は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２２、ＣＸＣＬ８、ＩＬ－１α／ＩＬ－１Ｆ１、ＩＬ－１β／ＩＬ－１Ｆ２、ＬＡＰ（ＴＧＦ－β１）、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ Ｌ、またはそれらの任意の２つ以上の組み合わせから選択されるサイトカインの発現を誘導する。実施形態では、発現は、ｍＲＮＡの検出及び／または定量（限定されないが、例えば、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を使用すること）によって分析される。実施形態では、発現は、タンパク質の検出及び／または定量（限定されないが、例えば、ＥＬＩＳＡを使用すること）によって分析される。
実施形態では、本方法は、結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺非小細胞癌、小腸癌、食道癌、黒色腫、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚悪性黒色腫または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰部癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、膀胱癌、腎臓癌または尿管癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発性のがん、当該がんの組み合わせ、及び当該がんの転移巣、またはそれらの組み合わせから選択されるがんを治療する。
実施形態では、がんは、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞型または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常症及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンストレームマクログロブリン血症、及び前白血病、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される血液癌である。
実施形態では、本方法は、本明細書に開示される任意の異種キメラタンパク質を含む薬学的組成物を投与することをさらに含む。異種キメラタンパク質は、操作されたＴ細胞によって発現及び分泌される異種キメラタンパク質と同じであってもよく、及び／または異種キメラタンパク質は、操作されたＴ細胞によって発現及び分泌される異種キメラタンパク質とは異なってもよい。実施形態では、対象に、操作されたＴ細胞の集団を含む薬学的組成物を投与する前に、異種キメラタンパク質を含む薬学的組成物を投与するか、対象に、操作されたＴ細胞の集団を含む薬学的組成物を投与した後に、異種キメラタンパク質を含む薬学的組成物を投与するか、または対象に、操作されたＴ細胞の集団を含む薬学的組成物を投与するのと同時に、異種キメラタンパク質を含む薬学的組成物を投与する。実施形態では、異種キメラタンパク質を含む薬学的組成物の投与量は、操作されたＴ細胞の集団を含む薬学的組成物を投与されたことがないか、または投与されない対象に投与される投与量よりも少ない。
実施形態では、本方法は、対象に、例えば、サイトカイン放出症候群を低減または予防する、免疫抑制薬の治療有効量を投与することをさらに含む。実施形態では、免疫抑制薬物は、インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）、例えば、トシリズマブに対する抗体である。実施形態では、免疫抑制薬は、操作されたＴ細胞の集団を含む薬学的組成物の前に投与されるか、免疫抑制薬は、操作されたＴ細胞の集団を含む薬学的組成物の後に投与されるか、または免疫抑制薬は、操作されたＴ細胞の集団を含む薬学的組成物と同時に投与される。
実施形態では、本明細書に開示される薬学的組成物は、局所注射または局所注入を介して、静脈内注射または静脈内注入を介して、動脈内注射または動脈内注入を介して、またはリンパ内注射またはリンパ内注入を介して投与され得る。
実施形態では、局所注射または局所注入は、腫瘍に直接行われる（すなわち、腫瘍内注射）。
実施形態では、局所注射または局所注入は、免疫系（例えば、骨髄、胸腺、脾臓、咽頭扁桃、扁桃、リンパ節）、皮膚、及び肝臓の臓器に直接行われる。
投与される薬学的組成物中の操作されたＴ細胞の数（すなわち、操作されたＴ細胞の投与量）は、いくつかの要因に依存し得、状態の重症度、状態を治療するのかまたは予防するのか、治療する対象の年齢、体重、健康状態が含まれる。さらに、特定の対象に関する薬理ゲノミクス（治療上の薬物動態、薬力学、または有効性プロファイルに対する遺伝子型の影響）情報は、使用される投与量に影響し得る。さらに、正確な個々の投与量は、投与される特定の薬学的組成物、投与の期間、投与の経路、製剤の性質、治療される特定の疾患、障害の重症度、及び障害の解剖学的位置を含む、様々な要因に応じて若干調整することができる。投与量のいくつかの変動が予想され得る。
本発明の態様は、薬剤（例えば、がんの治療のための薬剤）の製造における、本明細書に開示される操作されたＴ細胞の使用をさらに含む。
本明細書に開示される任意の態様または実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様または実施形態と組み合わせることができる。
本発明は、以下の実施例でさらに記載されるが、これらは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
本明細書の実施例は、本技術の利点及び利益を示し、本技術のキメラタンパク質の調製または使用に関して当業者をさらに支援するために提供される。本発明技術の好ましい態様をより完全に示すために、本明細書の実施例も提示される。実施例は、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではなく、添付の特許請求の範囲によって定義される。実施例は、上に記載の本発明技術の変形例、態様、または実施形態のいずれかを含むか、または組み込むことができる。また、上に記載の変形例、態様または実施形態は、各々、本技術の任意のまたは全ての他の変形例、態様または実施形態の変形例をさらに含むか、または組み込むことができる。
実施例１．例示的な操作されたＴ細胞の構築及び特徴付け
この実施例の実験では、ｐｃＤＮＡ３．４－ＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０ＬまたはｐｃＤＮＡ３．４－ＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌのいずれかをコードする別個のプラスミドを生成した。次いで、ＪｕｒｋａｔＴ細胞を、ｐｃＤＮＡ３．４－ＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０ＬプラスミドＤＮＡ、またはｐｃＤＮＡ３．４－ＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０ＬプラスミドＤＮＡのいずれかで別々にトランスフェクトした。次いで、ＪｕｒｋａｔＴ細胞を、抗生物質選択（Ｇ４１８）を適用する前に４８時間インキュベートして、２週間にわたって安定してトランスフェクトされた細胞を選択した。安定したプールの単一細胞クローニングは、異種キメラタンパク質の高分泌クローンの選択を可能にし、キメラタンパク質産生レベル（ｐｇ／細胞）を計算した。
２週間の選択期間の後、各構築物についてＧ４１８耐性の安定したプールが出現した後、操作されたＴ細胞を高密度に到達させ、次いで、操作されたＴ細胞培養培地を回収し、濃縮し、分泌されたＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ（図３）、または分泌されたＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ（図４）の存在について、標準的なＥＬＩＳＡ法によって試験した。濃縮されたＪｕｒｋａｔ親細胞の培養培地を、陰性対照として使用した。
細胞培養培地中の操作されたＴ細胞からのＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０ＬまたはＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌの分泌を検出するために、二重結合ＥＬＩＳＡ法により、分泌された異種キメラタンパク質の機能性を確認した。ＥＬＩＳＡ法は、ユニバーサルな異種キメラタンパク質特異的抗Ｆｃ抗体を使用して、異種キメラタンパク質を捕捉し、ＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌの場合はビオチン化抗ヒトＯＸ４０Ｌ、ＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌの場合はビオチン化抗ＣＤ４０Ｌ抗体のいずれかを使用して、異種キメラタンパク質を検出することを含む。図３及び図４に示されるように、操作されたＴ細胞は、高レベルのＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ及びＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌを分泌した。
実施例２．Ｔ細胞クローンによって分泌されるキメラタンパク質が、２つのリガンドに同時に結合する能力
この実験の目的は、本明細書に開示されるＴ細胞クローンによって分泌される異種キメラタンパク質に存在するＩ型細胞外ドメイン（ＥＣＤ）及びＩＩ型ＥＣＤが、リガンドに同時に結合することができるかどうかを理解することであった。そのために、二重結合アッセイを、ＭＥＳＯ ＳＣＡＬＥ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（ＭＳＤ）プラットフォームを使用して行った。
濃縮され脱塩された培養上清を、以下のように調製した：４０００万個のＪｕｒｋａｔ親細胞、ヒトＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬキメラタンパク質を発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ）、ヒトＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ）、またはヒトＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質を発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ）を、６０ｍＬの培地中で４８時間培養した。その後、培地を採取し、ＡＭＩＣＯＮ－１５ ５０Ｋカラムを使用して、５０～７５倍に濃縮した。濃縮した上清を、ＺＥＢＡ脱塩カラム上で脱塩するか、またはＰＢＳに直接透析し、実験で使用した。得られた上清は、「ニート（ｎｅａｔ）」上清とも呼ばれた。
ＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬキメラタンパク質は、Ｎ末端またはその近くのＰＤ－１タンパク質ドメインの細胞外ドメインと、Ｃ末端またはその近くの４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）タンパク質ドメインの細胞外ドメインと、を有する。ＰＤ－１及び４－１ＢＢＬが、それぞれの抗体に同時に結合できるかどうかを理解するために、抗ヒトＰＤ－１抗体をプレート上にコーティングした。Ｊｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞の３倍段階希釈ニート培養上清を、プレートに添加した。陽性対照として、０、０．０１３７、０．０４１、０．１２、０．３７、１．１１、３．３３、及び１０μｇ／ｍｌの精製されたＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬキメラタンパク質を添加した。プレートをインキュベートして、プレートに結合された抗ヒトＰＤ－１抗体による、いずれのタンパク質の捕捉を可能にした。プレートに結合された抗ヒトＰＤ－１抗体によるＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬキメラタンパク質の捕捉を検出するために、抗ヒト４－１ＢＢＬ抗体を添加した。このアッセイにおけるシグナルの生成は、ＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬキメラタンパク質による抗ヒトＰＤ－１及び抗ヒト４－１ＢＢＬ抗体の架橋に依存する。ＭＳＤプラットフォームを使用して、結合を検出した。図５Ａに示されるように、Ｊｕｒｋａｔ親細胞のニート培養上清は、バックグラウンドシグナルのみを示した。対照的に、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞の培養上清は、用量依存的なシグナルを生成した。これは、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞が、ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬキメラタンパク質を産生し、抗ヒトＰＤ－１抗体及び抗ヒト４－１ＢＢＬ抗体と同時に結合することが可能であることを示す（図５Ａ）。精製されたｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬキメラタンパク質は、用量依存的かつ飽和性のシグナルを生成した。精製されたｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬキメラタンパク質により生成されたシグナルと、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞の培養上清により生成されたシグナルとを比較することで、ニート培養上清が、０．０１３７μｇ／ｍｌと同等のタンパク質量の精製されたＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬキメラタンパク質を含んでいたことが示された（図５Ａ）。
ＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質は、Ｎ末端またはその近くのＰＤ－１タンパク質ドメインの細胞外ドメインと、Ｃ末端またはその近くのＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）タンパク質ドメインの細胞外ドメインと、を有する。ＰＤ－１及びＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインが、それぞれの抗体に同時に結合できるかどうかを理解するために、抗ヒトＰＤ－１抗体をプレート上にコーティングした。Ｊｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞の３倍段階希釈ニート培養上清を、プレートに添加した。陽性対照として、０、０．０１３７、０．０４１、０．１２、０．３７、１．１１、３．３３、及び１０μｇ／ｍｌの精製されたＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を添加した。プレートをインキュベートして、プレートに結合された抗ヒトＰＤ－１抗体による、いずれのタンパク質の捕捉を可能にした。プレートに結合された抗ヒトＰＤ－１抗体によるＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の捕捉を検出するために、抗ヒトＯＸ４０Ｌ抗体を添加した。このアッセイにおけるシグナルの生成は、ＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質による抗ヒトＰＤ－１及び抗ヒトＯＸ４０Ｌ抗体の架橋に依存する。ＭＳＤプラットフォームを使用して、結合を検出した。図５Ｂに示されるように、Ｊｕｒｋａｔ親細胞のニート培養上清は、抗ヒトＰＤ－１及び抗ヒトＯＸ４０Ｌ抗体と同時に結合することが可能であるバックグラウンドシグナルのみを示した。対照的に、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞の培養上清は、用量依存的なシグナルを生成した。これは、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞が、ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を産生したことを示す（図５Ｂ）。精製されたｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質は、用量依存的かつ飽和性のシグナルを生成した。精製されたｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質により生成されたシグナルと、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞の培養上清により生成されたシグナルとを比較することで、ニート培養上清が、０．０１３７μｇ／ｍｌよりわずかに少ないタンパク質量の精製されたＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質を含んでいたことが示された（図５Ｂ）。
ＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質は、Ｎ末端またはその近くのＣＳＦ１Ｒタンパク質ドメインの細胞外ドメインと、Ｃ末端またはその近くのＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）タンパク質ドメインの細胞外ドメインと、を有する。ＣＳＦ１Ｒ及びＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインが、それぞれの抗体に同時に結合できるかどうかを理解するために、抗ヒトＣＳＦ１Ｒ抗体をプレート上にコーティングした。Ｊｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞の３倍段階希釈ニート培養上清を、プレートに添加した。陽性対照として、０、０．０１３７、０．０４１、０．１２、０．３７、１．１１、３．３３、及び１０μｇ／ｍｌの精製されたＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質を添加した。プレートをインキュベートして、プレートに結合された抗ヒトＣＳＦ１Ｒ抗体による、いずれのタンパク質の捕捉を可能にした。プレートに結合された抗ヒトＣＳＦ１Ｒ抗体によるＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の捕捉を検出するために、抗ヒトＣＤ４０Ｌ抗体を添加した。このアッセイにおけるシグナルの生成は、ＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質による抗ヒトＣＳＦ１Ｒ及び抗ヒトＣＤ４０Ｌ抗体の架橋に依存する。ＭＳＤプラットフォームを使用して、結合を検出した。図５Ｃに示されるように、Ｊｕｒｋａｔ親細胞のニート培養上清は、バックグラウンドシグナルのみを示した。対照的に、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞の培養上清は、用量依存的なシグナルを生成した。これは、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞が、ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質を産生し、抗ヒトＣＳＦ１Ｒ抗体及び抗ヒトＣＤ４０Ｌ抗体と同時に結合することが可能であることを示す（図５Ｃ）。精製されたｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質は、用量依存的かつ飽和性のシグナルを生成した。精製されたｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質により生成されたシグナルと、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞の培養上清により生成されたシグナルとを比較することで、ニート培養上清が、０．１２μｇ／ｍｌと同等のタンパク質量の精製されたＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質を含んでいたことが示された（図５Ｃ）。
これらのデータは、本明細書に開示されるＴ細胞が、２つの細胞外ドメインを介してリガンドに同時に結合及び架橋することができるキメラタンパク質を発現及び分泌することを実証する。
実施例３．細胞外ドメインのリガンドを発現する細胞株の構築
Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ、及びＪｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞により発現されるキメラタンパク質に存在する細胞外ドメインが、それらの同族リガンドを発現する細胞に結合するかどうかを調べるために、モデル細胞株を構築した。具体的には、ＣＨＯ－Ｋ１またはＨＴ１０８０細胞は、その表面に特定のリガンドを過剰発現するように操作された。
ヒトＣＤ４０を安定して発現するＣＨＯ－Ｋ１親細胞を構築した。ＣＤ４０陽性クローンの細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＤ４０細胞と呼ばれた。ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＤ４０細胞及び親ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、抗ＣＤ４０抗体とともにインキュベートした。結合を、フローサイトメトリーを使用して検出した。図６Ａに示されるように、抗ＣＤ４０抗体は、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＤ４０細胞を染色したが、親ＣＨＯ－Ｋ１細胞を染色しなかった。これらのデータは、ヒトＣＤ４０を安定して発現する細胞株の構築が成功したことを示す。
ヒトＰＤ－Ｌ１安定して発現するＣＨＯ－Ｋ１親細胞を構築した。ＰＤ－Ｌ１陽性クローンの細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＰＤ－Ｌ１細胞と呼ばれた。ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＰＤ－Ｌ１細胞及び親ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、抗ＰＤ－Ｌ１抗体とともにインキュベートした。結合を、フローサイトメトリーを使用して検出した。図６Ｂに示されるように、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＰＤ－Ｌ１細胞を染色したが、親ＣＨＯ－Ｋ１細胞を染色しなかった。これらのデータは、ヒトＰＤ－Ｌ１を安定して発現する細胞株の構築が成功したことを示す。
ヒトＯＸ４０を安定して発現するＣＨＯ－Ｋ１親細胞を構築した。ＯＸ４０陽性クローンの細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＯＸ４０細胞と呼ばれた。ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＯＸ４０細胞及び親ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、抗ＯＸ４０抗体とともにインキュベートした。結合を、フローサイトメトリーを使用して検出した。図６Ｃに示されるように、抗ＯＸ４０抗体は、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＯＸ４０細胞を染色したが、親ＣＨＯ－Ｋ１細胞を染色しなかった。これらのデータは、ヒトＯＸ４０を安定して発現する細胞株の構築が成功したことを示す。
ヒト４－１ＢＢを安定して発現するＨＴ１０８０親細胞を構築した。４－１ＢＢ陽性クローンの細胞は、ＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞と呼ばれた。ＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞及び親ＨＴ１０８０細胞を、抗４－１ＢＢ抗体とともにインキュベートした。結合を、フローサイトメトリーを使用して検出した。図７Ａに示されるように、抗４－１ＢＢ抗体は、ＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞を染色したが、親ＨＴ１０８０細胞を染色しなかった。これらのデータは、ヒト４－１ＢＢを安定して発現する細胞株の構築が成功したことを示す。ＨＴ１０８０は、中程度のレベルで他のＴＮＦ受容体（例えば、ｈＯＸ４０）を発現する。これを確認するために、ＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞及び親ＨＴ１０８０細胞を、抗ＯＸ４０抗体とともにインキュベートした。結合を、フローサイトメトリーを使用して検出した。図７Ｂに示されるように、抗ＯＸ４０抗体は、親ＨＴ１０８０細胞及びＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞の両方を染色した。
実施例４．本明細書に開示されるＴ細胞クローンにより分泌されるキメラタンパク質の、細胞外ドメインのリガンドを発現する細胞への結合
この実験の目的は、本明細書に開示されるＴ細胞クローンにより分泌されるキメラタンパク質に存在する両方のＥＣＤの、それらのそれぞれの同族リガンドへの結合を評価することであった。その目的に向けて、各ＥＣＤのリガンドを発現する細胞に結合する程度を、別々に定量した。
一実験では、ＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞を、実施例２で論じたように生成されたＪｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞の漸増量のニート培養上清とともにインキュベートした。フローサイトメトリーを使用して結合を検出し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算し、Ｊｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞のニート培養上清の量の関数としてプロットした。図８Ａに示されるように、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞のニート培養上清は、ＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞への用量依存的な結合を示した。対照的に、Ｊｕｒｋａｔ親細胞のニート培養上清は、バックグラウンドシグナルのみを示した（図８Ａ）。さらに、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＰＤ－Ｌ１細胞を、実施例２で論じたように生成されたＪｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞の漸増量のニート培養上清とともにインキュベートした。フローサイトメトリーを使用して結合を検出し、ＭＦＩを計算し、Ｊｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞のニート培養上清の量の関数としてプロットした。図８Ｂに示されるように、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞のニート培養上清は、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＰＤ－Ｌ１細胞への用量依存的な結合を示した。対照的に、Ｊｕｒｋａｔ親細胞のニート培養上清は、バックグラウンドシグナルのみを示した（図８Ｂ）。これらのデータは、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞が、４－１ＢＢＬの同族リガンドであるヒト４－１ＢＢを発現する細胞、及びＰＤ－１の同族リガンドであるヒトＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に特異的に結合することが可能である、ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ異種キメラタンパク質を産生したことを示す。
別の実験では、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＰＤ－Ｌ１細胞を、実施例２で論じたように生成されたＪｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞の漸増量のニート培養上清とともにインキュベートした。フローサイトメトリーを使用して結合を検出し、ＭＦＩを計算し、Ｊｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞のニート培養上清の量の関数としてプロットした。図９Ａに示されるように、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞のニート培養上清は、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＰＤ－Ｌ１細胞への用量依存的な結合を示した。対照的に、Ｊｕｒｋａｔ親細胞のニート培養上清は、バックグラウンドシグナルのみを示した（図９Ａ）。さらに、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＯＸ４０細胞を、実施例２で論じたように生成されたＪｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞の漸増量のニート培養上清とともにインキュベートした。フローサイトメトリーを使用して結合を検出し、ＭＦＩを計算し、Ｊｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞のニート培養上清の量の関数としてプロットした。図９Ｂに示されるように、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞のニート培養上清は、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＯＸ４０細胞への用量依存的な結合を示した。対照的に、Ｊｕｒｋａｔ親細胞のニート培養上清は、バックグラウンドシグナルのみを示した（図９Ｂ）。これらのデータは、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞が、ＯＸ４０Ｌの同族リガンドであるヒトＯＸ４０を発現する細胞、及びＰＤ－１の同族リガンドであるヒトＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に特異的に結合することが可能である、ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ異種キメラタンパク質を産生したことを示す。
さらに別の実験では、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＤ４０細胞を、実施例２で論じたように生成されたＪｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞の漸増量のニート培養上清とともにインキュベートした。フローサイトメトリーを使用して結合を検出し、ＭＦＩを計算し、Ｊｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞のニート培養上清の量の関数としてプロットした。図１０Ａに示されるように、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞のニート培養上清は、ＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＤ４０細胞への用量依存的な結合を示した。対照的に、Ｊｕｒｋａｔ親細胞のニート培養上清は、バックグラウンドシグナルのみを示した（図１０Ａ）。
Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞により産生されるキメラタンパク質の、可溶性タンパク質であるヒトＣＳＦ１への結合を検出するために、ＭＳＤプラットフォームを使用した。簡潔には、組換えヒトＣＳＦ１タンパク質を、ＭＳＤプレート上にコーティングした。実施例２で論じたように生成されたＪｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞のニート培養上清を、量を増やしながら添加した。プレートをインキュベートして、プレートに結合されたＣＳＦ１による、いずれのＣＳＦ－１結合タンパク質の捕捉を可能にした。プレートに結合されたＣＳＦ１によるｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の捕捉を検出するために、抗ヒトＣＤ４０Ｌ－ビオチン抗体を添加した。検出のために、ＭＳＤストレプトアビジン試薬を添加した。ＭＳＤシグナルを、Ｊｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞のニート培養上清の量の関数としてプロットした。図１０Ｂに示されるように、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞のニート培養上清は、ヒトＣＳＦ１への用量依存的な結合を示した。対照的に、Ｊｕｒｋａｔ親細胞のニート培養上清は、バックグラウンドシグナルのみを示した（図１０Ｂ）。精製されたｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質は、用量依存的かつ飽和性のシグナルを生成した。精製されたｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質により生成されたシグナルと、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞の培養上清により生成されたシグナルとを比較することで、ニート培養上清が、０．３７μｇ／ｍｌと同等のタンパク質量の精製されたＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質を含んでいたことが示された（図５Ｃ）。
これらのデータは、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞が、ＣＤ４０Ｌの同族リガンドであるヒトＣＤ４０を発現する細胞、及びＣＳＦ１Ｒの同族リガンドであるプレートに結合されたヒトＣＳＦ１に特異的に結合することが可能である、ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ異種キメラタンパク質を産生したことを示す。
まとめると、これらのデータは、本明細書に開示されるＴ細胞が、２つのタイプの同族リガンドを発現する細胞に結合することができる、機能的に活性なキメラタンパク質を発現及び分泌したことを示す。したがって、キメラタンパク質は、２つのリガンドが２つの細胞型によって発現される場合、２つの細胞型（例えば、がん細胞及び免疫細胞）を架橋するであろう。
実施例５．本明細書に開示されるＴ細胞クローンによって分泌されるキメラタンパク質によるサイトカイン誘導
この実験の目的は、本明細書に開示されるＴ細胞クローンによって分泌されるキメラタンパク質の、それらの同族リガンドへの結合が、免疫学的効果を生成するかどうかを理解することであった。その目的に向けて、サイトカインの誘導を、ハウスキーピング対照遺伝子と比較して評価した。
ある実験では、２５０，０００個のＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞を、一晩増殖させた。翌日、実施例２に記載されるように生成されたＪｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞の０％または２５％のニート培養上清（総細胞培養量の２５％）を、細胞に添加した。さらに３時間、インキュベーションを継続した。３時間後、ＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞からＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成し、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ（ハウスキーピング対照遺伝子）、ＣＸＣＬ８、及びＣＣＬ２の遺伝子発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって評価した。ＧＡＰＤＨを使用して、デルタデルタＣＴ法に従って遺伝子発現及び倍率誘導を正規化した。図１１Ａに示されるように、Ｊｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞のニート培養上清を添加しても、ＡＣＴＢ遺伝子の発現にそれほど影響を与えなかった。Ｊｕｒｋａｔ親細胞のニート培養上清の添加により、ＣＸＣＬ８及びＣＣＬ２遺伝子がわずかに誘導された（図１１Ｂ及び図１１Ｃ）。これは、Ｊｕｒｋａｔ細胞が分泌する因子によって説明され得る。対照的に、図１１Ｂ及び図１１Ｃに示されるように、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞のニート培養上清は、ＣＸＣＬ８（図１１Ｂ）及びＣＣＬ２（図１１Ｃ）の発現を数倍誘導した。ＣＸＣＬ８（図１１Ｂ）の誘導は（ｐ＜０．０００１）、ウェルチの補正を伴う対応のないｔ検定によって統計的に有意であった。同様に、ＣＣＬ２（図１１Ｃ）の誘導も（ｐ＜０．００１）、ウェルチの補正を伴う対応のないｔ検定によって統計的に有意であった。これらのデータは、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞が、４－１ＢＢの下流へのシグナル伝達を特異的に誘導することができるｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ異種キメラタンパク質を産生したことを示す。
４－１ＢＢの下流へのシグナル伝達を誘導することが実際にサイトカイン産生で頂点に達するかどうかを理解するために、ＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞によるＩＬ－８産生を測定した。２５０，０００個のＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞を、一晩増殖させた。翌日、実施例２に記載されるように生成されたＪｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞の２５％のニート培養上清（総細胞培養量の２５％）を、細胞に添加した。さらに３時間、インキュベーションを継続した。３時間後、ＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞培養物から培地を取り出し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ－８を評価した。図１２に示されるように、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞のニート培養上清は、Ｊｕｒｋａｔ親細胞のニート培養上清と比較して、ＩＬ－８の誘導を引き起こした（ｐ＝０．０６９６、ウェルチの補正を伴う対応のないｔ検定による）。これらのデータは、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞が、サイトカインの発現を誘導することができるｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ異種キメラタンパク質を産生したことを示す。
別の実験では、２５０，０００個のＨＴ１０８０細胞を、一晩増殖させた。翌日、実施例２に記載されているように生成されたＪｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞の２５％のニート培養上清（細胞培養総体積の２５％）を、細胞に添加した。さらに３時間、インキュベーションを継続した。３時間後、ＨＴ１０８０細胞からＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成し、ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、ＣＣＬ２の遺伝子発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって評価した。ＧＡＰＤＨを使用して、デルタデルタＣＴ法に従って遺伝子発現及び倍率誘導を正規化した。Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞のニート培養上清を添加しても、Ｊｕｒｋａｔ親細胞のニート培養上清と比較して、ＡＣＴＢ遺伝子の発現にそれほど影響を与えなかった（図１３Ａ）。しかしながら、図１３Ｂに示されるように、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞のニート培養上清は、Ｊｕｒｋａｔ親細胞のニート培養上清と比較して、ＣＣＬ２の発現を誘導した。ＣＣＬ２（図１１Ｂ）の誘導は（ｐ＜０．０００１）、ウェルチの補正を伴う対応のないｔ検定によって統計的に有意であった。これらのデータは、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞が、ＯＸ４０の下流へのシグナル伝達を特異的に誘導することが可能であるｈＰＤ－１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ異種キメラタンパク質を産生したことを示す。
まとめると、これらのデータは、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ及びＪｕｒｋａｔ／ｈＰＤ１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ細胞が、ヒト４－１ＢＢまたはＯＸ４０（４－１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌの同族リガンド）を発現する細胞に特異的に結合し、４－１ＢＢまたはＯＸ４０の下流へのシグナル伝達を誘導することが可能であるｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ及びｈＰＤ１－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ異種キメラタンパク質をそれぞれ産生し、サイトカインの誘導をもたらすことを示す。
実施例６．共培養中の感受性細胞において本明細書に開示されるＴ細胞クローンによる下流シグナル伝達の誘導
この実験の目的は、本明細書に開示されるＴ細胞と、Ｔ細胞クローンによって分泌されるキメラタンパク質に感受性である細胞との、インビボでの相互作用をより密接に模倣することであった。その目的に向けて、市販の操作されたヒト骨肉腫上皮細胞であるＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ Ｕ２ＯＳ－ＮＩＫ／ＮＦκＢレポーター細胞（ＤＩＳＣＯＶＥＲＸ）を使用した。これらの細胞は、リガンド（例えば、ＣＤ４０Ｌ）で誘導されるＮＦ－κＢシグナル伝達の評価を可能にし、生物発光シグナルの形態で検出され得る。
ＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ Ｕ２ＯＳ－ＮＩＫ／ＮＦκＢレポーター細胞が、ＣＤ４０を発現することを実証するために、これらの細胞をＡＰＣ結合アイソタイプ抗体または抗ヒトＣＤ４０－ＡＰＣ抗体を使用して染色し、未染色細胞と比較して、フローサイトメトリーで分析した。図１４Ａに示されるように、ＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ Ｕ２ＯＳ－ＮＩＫ／ＮＦκＢレポーター細胞を、抗ヒトＣＤ４０－ＡＰＣ抗体によって染色した。これは、ＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ Ｕ２ＯＳ－ＮＩＫ／ＮＦκＢレポーター細胞が、ヒトＣＤ４０（ｈＣＤ４０）を発現することを示した。
Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞が、共培養でＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ Ｕ２ＯＳ－ＮＩＫ／ＮＦκＢレポーター細胞を誘導するかどうかを理解するために、５０，０００個のＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ Ｕ２ＯＳ－ＮＩＫ／ＮＦκＢレポーター細胞を、製造元の推奨に従って一晩培養した。翌日、Ｊｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞の数を増やしながら、ＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ Ｕ２ＯＳ－ＮＩＫ／ＮＦκＢレポーター細胞と共培養した。具体的には、０、約５００、約１，２３０、約３，７００、約１１，１００、約３３，３００、約１００，０００、または約３００，０００のＪｕｒｋａｔ親細胞またはＪｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞を、ＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ Ｕ２ＯＳ－ＮＩＫ／ＮＦκＢレポーター細胞と共培養した。１５μｇ／ｍＬの精製ＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の３倍段階希釈を、陽性対照として使用した。培養６時間後、ＤＩＳＣＯＶＥＲＸ発光試薬を添加し、ＰＲＯＭＥＧＡ ＧＬＯＭＡＸ機器を使用して生物発光を決定した。図１４Ｂに示されるように、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞はまた、生物発光を誘導し、ＣＤ４０Ｌ誘導ＮＦ－κＢシグナル伝達の誘導を示す。陽性対照の精製されたＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質は、生物発光を誘導したが（図１４Ｂ）、Ｊｕｒｋａｔ親細胞は、そのような生物発光を誘導しなかった（図１４Ｂ）。より多数のＪｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞では、生物発光シグナルは、精製されたｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質によって生成される最大誘導に近づいた。図１４Ｂに示されるように、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞によるＮＦκＢシグナル伝達の誘導は、試験した用量ごとに統計的に有意であった。これらの結果は、共培養中に、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌが、ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌタンパク質を産生し、ＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ Ｕ２ＯＳ－ＮＩＫ／ＮＦκＢレポーター細胞によって発現されたＣＤ４０に結合し、ＰＡＴＨＨＵＮＴＥＲ Ｕ２ＯＳ－ＮＩＫ／ＮＦκＢレポーター細胞において、下流のＮＦκＢシグナル伝達を誘導したことを示す。
これらのデータは、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ細胞が、ヒトＣＤ４０（ＣＤ４０Ｌの同族リガンド）を発現する細胞に特異的に結合し、ＣＤ４０の下流へのシグナル伝達を誘導することが可能であるｈＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ異種キメラタンパク質を産生し、サイトカインの誘導をもたらすことを示す。
実施例７．共培養中のＥＣＤリガンドを発現する細胞における、本明細書に開示されるＴ細胞クローンによるサイトカインの誘導
この実験の目的は、開示されたＴ細胞クローンによって分泌されるキメラタンパク質が、免疫学的効果を生成するかどうかを調べることであった。かかる免疫学的効果は、キメラタンパク質のそれらのリガンドへの結合、及び／またはキメラ抗原受容体のそれらが特異的である抗原への結合から生じ得る。その目的に向けて、共培養実験において、ハウスキーピング対照遺伝子と比較して、サイトカインの誘導を評価した。
ある実験では、２５０，０００個のＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞を、一晩増殖させた。翌日、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞を、ＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞上にＨＴ１０８０／ｈ４－１ＢＢ細胞：Ｊｕｒｋａｔ細胞比が１：０（Ｊｕｒｋａｔ細胞を含まない対照）、１：１、１：５、及び１：１０で播種した。さらに６時間、インキュベーションを継続した。６時間後、培地を共培養物から取り出し、ＩＬ－８をＥＬＩＳＡによって評価した。図１５に示されるように、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ親細胞と比較して、ＩＬ－８の誘導を引き起こした（ｐ＝０．０６９６、ウェルチの補正を伴う対応のないｔ検定による）。さらに、図１５に示されるように、ＩＬ－８分泌の誘導は統計的に有意であった。これらのデータは、Ｊｕｒｋａｔ／ｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ細胞が、サイトカインの発現を誘導することができるｈＰＤ－１－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ異種キメラタンパク質を産生したことを示す。
まとめると、これらのデータは、本明細書に開示されるＴ細胞クローンが、キメラタンパク質のリガンド／受容体を発現する細胞に特異的に結合し、リガンド／受容体の下流へのシグナル伝達を誘導することが可能である異種キメラタンパク質を産生し、サイトカインの誘導をもたらすことを示す。
参照による組み込み
本明細書で参照されるすべての特許及び刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示に対してのみ提供される。本明細書におけるいずれの内容も、本技術が先行発明によりそのような刊行物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
本書で使用されるように、すべての表題は単純に組織化するためのものであり、いかなる様式においても開示を制限することを意図したものではない。あらゆる個々のセクションの内容は、すべてのセクションに等しく適用可能であり得る。
均等物
本発明は、その特定の実施形態に関連して開示したが、さらなる修正が可能であること、本出願は、一般に、本発明の原理に従って、本発明の任意の変型、使用、または適応を網羅するものであり、本発明が属する技術分野において知られているか、または慣行に含まれるような本開示からの逸脱、及び前述される本質的な特徴に適用され得るもの、ならびに添付の請求項の範囲に含まれるような本開示からの逸脱を含むことを理解されたい。
当業者であれば、単なる日常的な実験を使用して、本明細書に詳細に記載される特定の実施形態の多数の均等物を認識するか、または確認することができるであろう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲内に包含されることが企図される。

Claims (93)

  1. 操作されたＴ細胞であって、
    抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに共刺激ドメイン及び／またはシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体と、
    異種キメラタンパク質であって、一般構造：
    Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、
    式中、
    （ａ）が、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む、第１のドメインであり、
    （ｂ）が、前記第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、
    （ｃ）が、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む、前記第２のドメインである、前記異種キメラタンパク質と、を発現する、前記操作されたＴ細胞。
  2. 前記第１のドメインが、実質的に、前記第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン全体を含み、及び／または前記第２のドメインが、実質的に、前記第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン全体を含む、請求項１に記載の操作されたＴ細胞。
  3. 前記第１のドメインが、前記第１の膜貫通タンパク質のリガンド／受容体と結合することが可能であり、前記第２のドメインが、前記第２の膜貫通タンパク質のリガンド／受容体と結合することが可能である、請求項１または請求項２に記載の操作されたＴ細胞。
  4. 前記第１のドメインが、そのリガンド／受容体に結合した場合、免疫抑制シグナルを阻害することが可能であり、及び／または前記第２のドメインが、そのリガンド／受容体に結合した場合、免疫刺激シグナルを活性化することが可能である、請求項１～３のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  5. 前記第１の膜貫通タンパク質の前記リガンド／受容体が、がん細胞によって発現され、及び／または前記第２の膜貫通タンパク質の前記リガンド／受容体が、前記操作されたＴ細胞及び／または天然Ｔ細胞によって発現される、請求項１～４のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  6. 前記抗原結合ドメインが、がん細胞によって発現される抗原と結合することが可能である、請求項１～４のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  7. 前記異種キメラタンパク質が、前記操作されたＴ細胞によって発現される前記キメラ抗原受容体の活性化に応答して分泌され、例えば、前記キメラ抗原受容体の活性化が、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）プロモーターを刺激する、請求項１～４のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  8. 前記操作されたＴ細胞が、アルファ／ベータＴ細胞受容体を発現する、請求項１～４のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  9. 前記操作されたＴ細胞が、ガンマ／デルタＴ細胞受容体を発現する、請求項１～４のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  10. 前記異種キメラタンパク質は、その第１のドメインが、前記がん細胞によって発現される前記第１の膜貫通タンパク質のリガンド／受容体に結合し、かつ前記第２のドメインが、前記操作されたＴ細胞によって発現される前記第２の膜貫通タンパク質のリガンド／受容体に結合した場合、前記がん細胞と前記操作されたＴ細胞との間に安定したシナプスを形成することが可能であり、及び／または
    前記キメラ抗原受容体は、前記がん細胞によって発現される前記抗原に結合した場合、前記がん細胞と前記操作されたＴ細胞との間に安定したシナプスを形成することが可能である、請求項５～９のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  11. 前記安定したシナプスが、前記操作されたＴ細胞による抗がん効果／腫瘍縮小に有利な空間的配向を提供する、請求項１０に記載の操作されたＴ細胞。
  12. 前記空間的配向が、前記がん細胞を攻撃するように前記操作されたＴ細胞を配置する、請求項１１に記載の操作されたＴ細胞。
  13. 前記安定なシナプスが、前記がん細胞の近くの前記操作されたＴ細胞の増殖を可能とする、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  14. 前記安定したシナプスが、前記がん細胞／前記腫瘍部位の近くの操作されていない天然Ｔ細胞の動員及び増殖を可能にする、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  15. 前記安定したシナプスが、刺激シグナルの発現及び／または放出を提供するのに十分なシグナル伝達を可能にする、請求項１０～１４のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  16. 前記刺激シグナルが、サイトカインである、請求項１５に記載の操作されたＴ細胞。
  17. 前記異種キメラタンパク質及び／またはキメラ抗原受容体が、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の亜集団を増加させるか、またはその低減を防止することが可能である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  18. 前記異種キメラタンパク質が、前記がん細胞／前記腫瘍部位の近くに存在する操作されていないＴ細胞クローンの数を増加させる、請求項１～１７のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  19. 前記異種キメラタンパク質が、前記操作されたＴ細胞によって分泌される、請求項１～１８のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  20. 前記リンカードメインが、ジスルフィド結合を形成することが可能である少なくとも１つのシステイン残基を含み、及び／またはヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  21. 前記ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインが、ＩｇＧ４、例えば、ヒトＩｇＧ４に由来する、請求項２０に記載の操作されたＴ細胞。
  22. 前記リンカードメインが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２０または請求項２１に記載の操作されたＴ細胞。
  23. 前記第１の膜貫通タンパク質が、ＰＤ－１、ＣＳＦ１Ｒ、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、Ｂ７－Ｈ３、ＴＭＩＧＤ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１７２ａ／ＳＩＲＰα、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ３Ａ１、ＢＴＮＬ３Ａ２、及びＶＳＩＧ８からなる群から選択される、請求項１～２２のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  24. 前記第２の膜貫通タンパク質が、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）、ＬＩＧＨＴ（ＣＤ２５８）、ＣＤ７０、ＣＤ３０リガンド、ＴＲＡＩＬ、及びＴＬ１Ａからなる群から選択される、請求項１～２３のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  25. 前記第１の膜貫通タンパク質が、ＰＤ－１である、請求項２４に記載の操作されたＴ細胞。
  26. 前記第２の膜貫通タンパク質が、ＯＸ４０Ｌである、請求項２５に記載の操作されたＴ細胞。
  27. 前記第２の膜貫通タンパク質が、４－１ＢＢＬである、請求項２５に記載の操作されたＴ細胞。
  28. 前記第１の膜貫通タンパク質が、ＣＳＦ１Ｒである、請求項２４に記載の操作されたＴ細胞。
  29. 前記第２の膜貫通タンパク質が、ＣＤ４０Ｌである、請求項２８に記載の操作されたＴ細胞。
  30. 前記キメラ抗原受容体が、前記操作されたＴ細胞のゲノムのゲノムセーフハーバー（ＧＳＲ）に導入される核酸によってコードされる、請求項１～２９のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  31. 前記ＧＳＲが、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子、またはＲＯＳＡ２６遺伝子座／ＲＯＳＡ２６遺伝子座のヒトのオルソログである、請求項３０に記載の操作されたＴ細胞。
  32. 前記キメラ抗原受容体が、前記Ｔ細胞のゲノムの内因性Ｔ細胞受容体遺伝子座に導入される核酸によってコードされる、請求項１～２９のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  33. 前記抗原結合ドメインが、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＳＤＡＢ）、ＶＨもしくはＶＬドメイン、またはラクダ科ＶＨＨドメインを含む、請求項１～３２のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  34. 前記がん細胞によって発現される前記抗原が、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ８０／８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＳ１／ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ７、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、ＥｐｈＡ２、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＨＥＲ２、インテグリンβ７、ルイス－Ｙ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＰＤ－Ｌ１、及び前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）からなる群から選択される、請求項６～３３のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  35. 前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、Ｔ細胞受容体のベータ鎖、もしくはＴ細胞受容体のゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤｌｌａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌｌｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及びＮＫＧ２Ｃ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項１～３４のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  36. 前記細胞内ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－ＩＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドの細胞内ドメインの一部分を含む共刺激ドメイン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１～３５のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  37. 前記細胞内ドメインの前記部分が、ＣＤ２８及び／または４－１ＢＢ由来である、請求項３６に記載の操作されたＴ細胞。
  38. 前記細胞内ドメインが、ＣＤ３－ζ由来のシグナル伝達ドメインを含む、請求項１～３７のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  39. 前記操作されたＴ細胞が、同種Ｔ細胞、自己Ｔ細胞、または腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）に由来する、請求項１～３８のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  40. 前記操作されたＴ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項３９に記載の操作されたＴ細胞。
  41. 前記操作されたＴ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項３９に記載の操作されたＴ細胞。
  42. 前記操作されたＴ細胞が、インビトロの細胞である、請求項１～４１のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  43. 前記操作されたＴ細胞が、ヒト細胞である、請求項１～４２のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  44. がんの治療における薬剤として使用するための、請求項１～４３のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。
  45. 薬剤の製造における、請求項１～４４のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞の使用。
  46. 請求項１～４４のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞を含む、組成物。
  47. キメラ抗原受容体を発現し、異種キメラタンパク質を発現しない操作されたＴ細胞をさらに含む、請求項４６に記載の組成物。
  48. 異種キメラタンパク質を発現し、キメラ抗原受容体を発現しない操作されたＴ細胞をさらに含む、請求項４７に記載の組成物。
  49. 異種キメラタンパク質を発現し、キメラ抗原受容体を発現しない、操作されたＴ細胞をさらに含む、請求項４６に記載の組成物。
  50. 異種キメラタンパク質もキメラ抗原受容体も発現しないＴ細胞をさらに含む、請求項４６～４９のいずれか１項に記載の組成物。
  51. 請求項４６～５０のいずれか１項に記載の組成物と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
  52. 操作されたＴ細胞を製造するための方法であって、
    （ｉ）対象からＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞を得るステップと、
    （ｉｉ）キメラ抗原受容体をコードし、前記Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第１のＤＮＡ分子で、前記Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップと、
    （ｉｉｉ）異種キメラタンパク質をコードし、前記Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第２のＤＮＡ分子で、前記Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップであって、前記異種キメラタンパク質が、一般構造：
    Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、
    式中、
    （ａ）が、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む、第１のドメインであり、
    （ｂ）が、前記第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、
    （ｃ）が、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む、第２のドメインである、前記Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップと、を含む、前記方法。
  53. ステップ（ｉｉ）が、ステップ（ｉｉｉ）に先行する、請求項５２に記載の方法。
  54. ステップ（ｉｉｉ）が、ステップ（ｉｉ）に先行する、請求項５２に記載の方法。
  55. ステップ（ｉｉ）及びステップ（ｉｉｉ）が同時である、請求項５２に記載の方法。
  56. 操作されたＴ細胞を製造するための方法であって、
    （ｉ）キメラ抗原受容体をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第１のＤＮＡ分子でトランスフェクトされた、前記Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を得るステップと、
    （ｉｉ）異種キメラタンパク質をコードし、前記Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第２のＤＮＡ分子で、ステップ（ｉ）の前記Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップであって、前記異種キメラタンパク質が、一般構造：
    Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、
    式中、
    （ａ）が、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む、第１のドメインであり、
    （ｂ）が、前記第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、
    （ｃ）が、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む、第２のドメインである、前記Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップと、を含む、前記方法。
  57. 操作されたＴ細胞を製造するための方法であって、
    （ｉ）異種キメラタンパク質をコードし、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第１のＤＮＡ分子でトランスフェクトされた、前記Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を得るステップであって、前記異種キメラタンパク質が、一般構造：
    Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端を含み、
    式中、
    （ａ）が、第１の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む、第１のドメインであり、
    （ｂ）が、前記第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカードメインであり、
    （ｃ）が、第２の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む、第２のドメインである、前記Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を得るステップと、
    （ｉｉ）キメラ抗原受容体をコードし、前記Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計された第２のＤＮＡ分子で、ステップ（ｉ）の前記Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞をトランスフェクトするステップと、を含む、前記方法。
  58. 前記リンカードメインが、ジスルフィド結合を形成することが可能な少なくとも１つのシステイン残基を含み、及び／またはヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、請求項５２～５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記第１の膜貫通タンパク質が、ＰＤ－１、ＣＳＦ１Ｒ、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、Ｂ７－Ｈ３、ＴＭＩＧＤ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１７２ａ／ＳＩＲＰα、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ３Ａ１、ＢＴＮＬ３Ａ２、及びＶＳＩＧ８からなる群から選択される、請求項５２～５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. 前記第２の膜貫通タンパク質が、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）、ＬＩＧＨＴ（ＣＤ２５８）、ＣＤ７０、ＣＤ３０リガンド、ＴＲＡＩＬ、及びＴＬ１Ａからなる群から選択される、請求項５２～５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 前記キメラ抗原受容体をコードする前記ＤＮＡ分子が、ゲノムセーフハーバー（ＧＳＲ）で、前記Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計される、請求項５２～６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 前記ＧＳＲが、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子、またはＲＯＳＡ２６遺伝子座／ＲＯＳＡ２６遺伝子座のヒトのオルソログである、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記キメラ抗原受容体をコードする前記ＤＮＡ分子が、内因性Ｔ細胞受容体の遺伝子座で、前記Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込まれるように設計される、請求項５２～６０のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記トランスフェクションが、前記第１のＤＮＡ分子及び／または前記第２のＤＮＡ分子を前記Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体のゲノムに組み込むために、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの構成要素を添加することを含む、請求項５２～６３のいずれか１項に記載の方法。
  65. 前記トランスフェクトされたＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞を、キメラ抗原受容体を発現する細胞及び／または異種キメラタンパク質を発現する細胞の増殖を選択的に増強する培地中で培養するステップをさらに含む、請求項５２～６４のいずれか１項に記載の方法。
  66. 前記キメラ抗原受容体及び／または前記異種キメラタンパク質を発現する操作されたＴ細胞を単離するステップをさらに含む、請求項６５に記載の方法。
  67. 請求項６６に記載の方法によって単離された操作されたＴ細胞。
  68. 操作されたＴ細胞の集団を得るための方法であって、
    請求項６７に記載の操作されたＴ細胞を得ることと、
    前記操作されたＴ細胞を、前記操作されたＴ細胞の増殖を増強する培地中で培養し、
    それによって、操作されたＴ細胞の集団を得ることと、を含む、前記方法。
  69. 請求項６８に記載の方法によって得られた操作されたＴ細胞の集団。
  70. 請求項６９に記載の操作されたＴ細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
  71. 治療を必要とする対象におけるがんを治療するための方法であって、治療有効量の請求項７０に記載の薬学的組成物を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
  72. 前記Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体が、前記対象から得られた、請求項７１に記載の方法。
  73. 治療を必要とする対象におけるがんを治療するための方法であって、治療有効量の請求項５１に記載の薬学的組成物を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
  74. 前記薬学的組成物中の少なくとも１つの操作されたＴ細胞が、同種である、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記薬学的組成物中の少なくとも１つの操作されたＴ細胞が、自己由来である、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記薬学的組成物中の少なくとも１つの操作されたＴ細胞が、自己由来である、請求項７３に記載の方法。
  77. 前記がんが、結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺非小細胞癌、小腸癌、食道癌、黒色腫、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚悪性黒色腫または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰部癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、膀胱癌、腎臓癌または尿管癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発性のがん、前記がんの組み合わせ、及び前記がんの転移巣、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７１～７６のいずれか１項に記載の方法。
  78. 前記がんが、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞型または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常症及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンストレームマクログロブリン血症、及び前白血病、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される血液癌である、請求項７１～７６のいずれか１項に記載の方法。
  79. 前記異種キメラタンパク質の前記第１の膜貫通タンパク質がＰＤ－１を含み、前記異種キメラタンパク質の前記第２の膜貫通タンパク質がＯＸ４０Ｌを含む、請求項７１～７８のいずれか１項に記載の方法。
  80. 前記異種キメラタンパク質の前記第１の膜貫通タンパク質がＰＤ－１を含み、前記異種キメラタンパク質の前記第２の膜貫通タンパク質が４－１ＢＢＬを含む、請求項７１～７８のいずれか１項に記載の方法。
  81. 前記異種キメラタンパク質の前記第１の膜貫通タンパク質がＣＳＦ１Ｒを含み、前記異種キメラタンパク質の前記第２の膜貫通タンパク質がＣＤ４０Ｌを含む、請求項７１～７８のいずれか１項に記載の方法。
  82. 前記異種キメラタンパク質を含む薬学的組成物を、それを必要とする前記対象に投与することをさらに含む、請求項７１～８１のいずれか１項に記載の方法。
  83. 前記対象が、前記操作されたＴ細胞の集団を含む前記薬学的組成物を投与される前に、前記異種キメラタンパク質を含む前記薬学的組成物を投与される、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記対象が、前記操作されたＴ細胞の集団を含む前記薬学的組成物を投与された後に、前記異種キメラタンパク質を含む前記薬学的組成物を投与される、請求項８２に記載の方法。
  85. 前記対象が、前記操作されたＴ細胞の集団を含む前記薬学的組成物を投与されるのと同時に、前記異種キメラタンパク質を含む前記薬学的組成物を投与される、請求項８２に記載の方法。
  86. 前記異種キメラタンパク質を含む前記薬学的組成物の投与量が、前記操作されたＴ細胞の集団を含む前記薬学的組成物を投与されていないか、または投与されない対象に投与される投与量よりも少ない、請求項８２～８５のいずれか１項に記載の方法。
  87. 治療有効量の免疫抑制薬を、前記対象に投与することをさらに含む、請求項７１～８６のいずれか１項に記載の方法。
  88. 前記免疫抑制薬が、サイトカイン放出症候群を低減または予防する、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記免疫抑制薬が、インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）に対する抗体である、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記抗体が、トシリズマブである、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記免疫抑制薬が、前記操作されたＴ細胞の集団を含む前記薬学的組成物の前に投与される、請求項８７～９０のいずれか１項に記載の方法。
  92. 前記免疫抑制薬が、前記操作されたＴ細胞の集団を含む前記薬学的組成物の後に投与される、請求項８７～９０のいずれか１項に記載の方法。
  93. 前記免疫抑制薬が、前記操作されたＴ細胞の集団を含む前記薬学的組成物と同時に投与される、請求項８７～９０のいずれか１項に記載の方法。
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