TW202144396A - 抑制性嵌合受體架構 - Google Patents

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威爾遜 王
康熙
李勝熙
羅素 莫里森 高德利
阿雅拉 馬塞拉 古茲曼
嘉亮 李
尼古拉斯 弗蘭克爾
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美商聖堤生物科技股份有限公司
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Abstract

本文提供抑制性嵌合抗原受體組成物及包含此類組成物之細胞。亦提供使用抑制性嵌合抗原受體及細胞的方法。

Description

抑制性嵌合受體架構
嵌合抗原受體(CAR)實現免疫調節細胞(諸如T細胞)之靶向體內活化。這些重組膜受體具有抗原結合域及一或多個傳訊域(例如，T細胞活化域)。這些特殊的受體使T細胞識別腫瘤細胞上的特定蛋白抗原，並誘導T細胞活化及傳訊途徑。以表現嵌合受體之T細胞的臨床試驗之最近結果為其作為癌症免疫療法之劑的實用性提供了令人信服的支持。然而，儘管取得了這些有前景的結果，但仍發現了許多與CAR T細胞療法有關的副作用，產生顯著的安全問題。一種副作用為來自TCR及CAR經工程改造之T細胞的「在靶但脫組織(on-target but off-tissue)」不良事件，在該等不良事件中CAR T細胞與其靶腫瘤組織之外的配體結合並誘導免疫反應。因此，鑑定適當的CAR靶標的能力對於有效地靶向及治療腫瘤而不損害表現相同靶抗原的正常細胞來說是重要的。
抑制性嵌合抗原受體(亦稱為iCAR)為在結合靶細胞上之其同族配體之後抑制或減少免疫調節細胞活性的蛋白構造。當前的iCAR設計利用PD-1細胞內域進行抑制，但已證明難以再現。因此，需要用於iCAR的替代抑制域。
本文提供了嵌合抑制性受體，其包含：細胞外蛋白結合域；跨膜域，其中該跨膜域可操作地連接至該細胞外蛋白結合域；及細胞內傳訊域，其中該細胞內傳訊域可操作地連接至該跨膜域，且其中該細胞內傳訊域能夠防止、減弱或抑制在免疫調節細胞上表現之靶向腫瘤的嵌合受體之活化。
在一些態樣中，細胞內傳訊域衍生自選自由以下組成之群的蛋白：BTLA、PD-1、CTLA4、TIM3、KIR3DL1、LIR1、NKG2A、TIGIT及LAG3。
在一些態樣中，跨膜域及細胞內傳訊域衍生自相同蛋白。
在一些態樣中，跨膜域進一步包含蛋白細胞外域之至少一部分。
在一些態樣中，跨膜域衍生自第一蛋白，且細胞內傳訊域衍生自與第一蛋白不同的第二蛋白。
在一些態樣中，細胞內傳訊域衍生自BTLA。在一些態樣中，細胞內傳訊域包含與RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS (SEQ ID NO: 3)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，細胞內傳訊域包含胺基酸序列RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS (SEQ ID NO: 3)。
在一些態樣中，細胞內傳訊域衍生自LIR1。在一些態樣中，細胞內傳訊域包含與LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 50)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，細胞內傳訊域包含胺基酸序列LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 50)。
在一些態樣中，細胞內傳訊域衍生自PD-1。在一些態樣中，細胞內傳訊域包含與CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL (SEQ ID NO: 1)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，細胞內傳訊域包含胺基酸序列CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL (SEQ ID NO: 1)。
在一些態樣中，細胞內傳訊域衍生自KIR3DL1。在一些態樣中，細胞內傳訊域包含與有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與HLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP (SEQ ID NO: 66)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含胺基酸序列HLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP (SEQ ID NO: 66)。
在一些態樣中，細胞內傳訊域衍生自CTLA4。在一些態樣中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與AVSLSKMLKKRSPLTTGVGVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN (SEQ ID NO: 67)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含胺基酸序列AVSLSKMLKKRSPLTTGVGVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN (SEQ ID NO: 67)。
在一些態樣中，跨膜域衍生自選自由以下組成之群的蛋白：BTLA、CD8、CD28、CD3ζ、CD4、4-IBB、OX40、ICOS、2B4、CD25、CD7、LAX、LAT、PD-1、CTLA4、TIM3、KIR3DL1、LIR1、NKG2A、TIGIT及LAG3。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體包含衍生自BTLA的跨膜域。在一些態樣中，跨膜域包含與LLPLGGLPLLITTCFCLFCCL (SEQ ID NO: 12)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，跨膜域包含胺基酸序列LLPLGGLPLLITTCFCLFCCL (SEQ ID NO: 12)。在一些態樣中，跨膜域進一步包含BTLA細胞外域之至少一部分。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體包含衍生自LIR1的跨膜域。在一些態樣中，跨膜域包含與VIGILVAVILLLLLLLLLFLI (SEQ ID NO: 59)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，跨膜域包含胺基酸序列VIGILVAVILLLLLLLLLFLI (SEQ ID NO: 59)。在一些態樣中，跨膜域進一步包含LIR1細胞外域之至少一部分。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體包含衍生自PD-1的跨膜域。在一些態樣中，跨膜域包含與VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI (SEQ ID NO: 60)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，跨膜域包含胺基酸序列VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI (SEQ ID NO: 60)。在一些態樣中，跨膜域進一步包含PD1細胞外域之至少一部分。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體包含衍生自CTLA4的跨膜域。在一些態樣中，跨膜域包含與DFLLWILAAVSSGLFFYSFLLT (SEQ ID NO: 68)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，跨膜域包含胺基酸序列DFLLWILAAVSSGLFFYSFLLT (SEQ ID NO: 68)。在一些態樣中，跨膜域進一步包含CTLA4細胞外域之至少一部分。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體包含衍生自KIR3DL1的跨膜域。在一些態樣中，跨膜域包含與ILIGTSVVIILFILLLFFLL (SEQ ID NO: 69)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，跨膜域包含胺基酸序列ILIGTSVVIILFILLLFFLL (SEQ ID NO: 69)。在一些態樣中，跨膜域進一步包含KIR3DL1細胞外域之至少一部分。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體包含衍生自CD28的跨膜域。在一些態樣中，跨膜域包含與FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 11)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，跨膜域包含胺基酸序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 11)。在一些態樣中，跨膜域進一步包含CD28細胞外域之至少一部分。
在一些態樣中，蛋白不在靶腫瘤上表現。
在一些態樣中，蛋白在非腫瘤細胞上表現。
在一些態樣中，蛋白在衍生自選自由以下組成之群的組織的非腫瘤細胞上表現：腦、神經元組織、內分泌、內皮、骨、骨髓、免疫系統、肌肉、肺、肝、膽囊、胰臟、胃腸道、腎臟、膀胱、雄性生殖器、雌性生殖器、脂肪、軟組織及皮膚。
在一些態樣中，細胞外蛋白結合域包含配體結合域。
在一些態樣中，細胞外蛋白結合域包含受體結合域。
在一些態樣中，細胞外蛋白結合域包含抗原結合域。
在一些態樣中，抗原結合域包含抗體、抗體之抗原結合片段、F(ab)片段、F(ab')片段、單鏈可變片段(scFv)或單域抗體(sdAb)。
在一些態樣中，抗原結合域包含單鏈可變片段(scFv)。
在一些態樣中，各scFv包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。
在一些態樣中，VH及VL藉由肽連接子分開。
在一些態樣中，肽連接子包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：GGS (SEQ ID NO: 15)、GGSGGS (SEQ ID NO: 16)、GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 17)、GGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 18)、GGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 22)、GGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 23)、GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 24)、GGGGS (SEQ ID NO: 25)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 26)、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 27)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 28)及GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 29)。
在一些態樣中，scFv包含結構VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH為重鏈可變域，L為肽連接子，且VL為輕鏈可變域。
在一些態樣中，跨膜域物理連接至細胞外蛋白結合域。
在一些態樣中，細胞內傳訊域物理連接至跨膜域。
在一些態樣中，跨膜域物理連接至細胞外蛋白結合域，且細胞內傳訊域物理連接至跨膜域。
在一些態樣中，蛋白結合域具有高結合親和力。
在一些態樣中，蛋白結合域具有低結合親和力。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體能夠壓制經活化之免疫調節細胞產生細胞介素。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體能夠壓制對靶細胞的細胞介導之免疫反應，其中免疫反應藉由免疫調節細胞之活化來誘導。
在一些態樣中，靶細胞為腫瘤細胞。
在一些態樣中，細胞內傳訊域包含一或多個修飾。
在一些態樣中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾調節嵌合抑制性受體之敏感性。
在一些態樣中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾增加嵌合抑制性受體之敏感性。
在一些態樣中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾降低嵌合抑制性受體之敏感性。
在一些態樣中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾調節嵌合抑制性受體之效力。
在一些態樣中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾增加嵌合抑制性受體之效力。
在一些態樣中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾降低嵌合抑制性受體之效力。
在一些態樣中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，當在免疫調節細胞上表現時，該一或多個修飾調節靶向腫瘤的嵌合受體之活化之基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾降低基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾增加基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體進一步包含位於蛋白結合域與跨膜域之間且可操作地連接至蛋白結合域及跨膜域中之各者的間隔區。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體進一步包含位於蛋白結合域與跨膜域之間且物理連接至蛋白結合域及跨膜域中之各者的間隔區。
在一些態樣中，間隔區衍生自選自由以下組成之群的蛋白：CD8α、CD4、CD7、CD28、IgG1、IgG4、FcγRIIIα、LNGFR及PDGFR。
在一些態樣中，間隔區包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：AAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (SEQ ID NO: 31)、ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 32)、ESKYGPPAPSAP (SEQ ID NO: 33)、ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 34)、EPKSCDKTHTCP (SEQ ID NO: 35)、AAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN (SEQ ID NO: 36)、TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 37)、 ACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEADAEC (SEQ ID NO: 38)、ACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVC (SEQ ID NO: 39)、AVGQDTQEVIVVPHSLPFKV (SEQ ID NO: 40)及TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLP (SEQ ID NO: 70)。
在一些態樣中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區調節嵌合抑制性受體之敏感性。
在一些態樣中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區增加嵌合抑制性受體之敏感性。
在一些態樣中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區降低嵌合抑制性受體之敏感性。
在一些態樣中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區調節嵌合抑制性受體之效力。
在一些態樣中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區增加嵌合抑制性受體之效力。
在一些態樣中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區降低嵌合抑制性受體之效力。
在一些態樣中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，當在免疫調節細胞上表現時，間隔區調節靶向腫瘤的嵌合受體之活化之基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區降低基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區增加基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體進一步包含位於跨膜域與細胞內傳訊域之間且可操作地連接至跨膜域及細胞內傳訊域中之各者的細胞內間隔區。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體進一步包含位於跨膜域與細胞內傳訊域之間且物理連接至跨膜域及細胞內傳訊域中之各者的細胞內間隔區。
在一些態樣中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區調節嵌合抑制性受體之敏感性。
在一些態樣中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區增加嵌合抑制性受體之敏感性。
在一些態樣中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區降低嵌合抑制性受體之敏感性。
在一些態樣中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區調節嵌合抑制性受體之效力。
在一些態樣中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區增加嵌合抑制性受體之效力。
在一些態樣中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區降低嵌合抑制性受體之效力。
在一些態樣中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，當在免疫調節細胞上表現時，細胞內間隔區調節靶向腫瘤的嵌合受體之活化之基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區降低基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區增加基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，抑制性嵌合受體進一步包含酶抑制性域。
在一些態樣中，相對於缺乏酶抑制性域的其他方面相同的嵌合抑制性受體，當在免疫調節細胞上表現時，酶抑制性域能夠防止、減弱或抑制靶向腫瘤的嵌合受體之活化。
在一些態樣中，酶抑制性域包含酶催化域。
在一些態樣中，酶催化域衍生自選自由以下組成之群的酶：CSK、SHP-1、PTEN、CD45、CD148、PTP-MEG1、PTP-PEST、c-CBL、CBL-b、PTPN22、LAR、PTPH1、SHIP-1及RasGAP。
在一些態樣中，酶抑制性域包含一或多個修飾，相對於缺乏該一或多個修飾的其他方面相同的酶抑制性域，該一或多個修飾調節基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，相對於缺乏酶抑制性域的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該一或多個修飾降低嵌合抑制性受體之基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，相對於缺乏酶抑制性域的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該一或多個修飾增加嵌合抑制性受體之基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，靶向腫瘤的嵌合受體為靶向腫瘤的嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體(TCR)。
在一些態樣中，免疫調節細胞選自由以下組成之群：T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、γδ細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、調節性T細胞、病毒特異性T細胞、自然殺手T (NKT)細胞、自然殺手(NK)細胞、B細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、先天性淋巴樣細胞、肥胖細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、嗜中性球、髓樣細胞、巨噬細胞、單核球、樹突狀細胞、ESC衍生細胞及iPSC衍生細胞。
本文亦提供嵌合抑制性受體，其包含：細胞外蛋白結合域；跨膜域，其中跨膜域可操作地連接至細胞外蛋白結合域；及二或更多個細胞內傳訊域，其中該二或更多個細胞內傳訊域可操作地連接至跨膜域；且其中該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者能夠防止、減弱或抑制在免疫調節細胞上表現之靶向腫瘤的嵌合受體之活化。
在一些態樣中，該二或更多個細胞內傳訊域各自衍生自選自由以下組成之群的蛋白：BTLA、PD-1、CTLA4、TIM3、KIR3DL1、LIR1、NKG2A、TIGIT及LAG3。
在一些態樣中，跨膜域衍生自與該二或更多個細胞內傳訊域中之一者相同的蛋白。
在一些態樣中，跨膜域進一步包含相同蛋白之細胞外域之至少一部分。
在一些態樣中，跨膜域衍生自第一蛋白，且該二或更多個細胞內傳訊域衍生自與該第一蛋白不同的蛋白。
在一些態樣中，該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者衍生自BTLA。在一些態樣中，該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者包含與RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS (SEQ ID NO: 3)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者包含胺基酸序列RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS (SEQ ID NO: 3)。
在一些態樣中，該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者衍生自LIR1。在一些態樣中，該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者包含與LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 50)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者包含胺基酸序列LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 50)。
在一些態樣中，該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者衍生自PD-1。在一些態樣中，該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者包含與CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL (SEQ ID NO: 1)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者包含胺基酸序列CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL (SEQ ID NO: 1)。
在一些態樣中，該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者衍生自KIR3DL1。在一些態樣中，該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者包含與HLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP (SEQ ID NO: 66)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者包含胺基酸序列HLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP (SEQ ID NO: 66)。
在一些態樣中，該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者衍生自CTLA4。在一些態樣中，該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者包含與AVSLSKMLKKRSPLTTGVGVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN (SEQ ID NO: 67)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者包含胺基酸序列AVSLSKMLKKRSPLTTGVGVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN (SEQ ID NO: 67)。
在一些態樣中，跨膜域衍生自選自由以下組成之群的蛋白：BTLA、CD8、CD28、CD3ζ、CD4、4-IBB、OX40、ICOS、2B4、CD25、CD7、LAX、LAT、PD-1、CTLA4、TIM3、KIR3DL1、LIR1、NKG2A、TIGIT及LAG3。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體包含衍生自BTLA的跨膜域。在一些態樣中，跨膜域包含與LLPLGGLPLLITTCFCLFCCL (SEQ ID NO: 12)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，跨膜域包含胺基酸序列LLPLGGLPLLITTCFCLFCCL (SEQ ID NO: 12)。在一些態樣中，跨膜域進一步包含BTLA細胞外域之至少一部分。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體包含衍生自LIR1的跨膜域。在一些態樣中，跨膜域包含與VIGILVAVILLLLLLLLLFLI (SEQ ID NO: 59)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，跨膜域包含胺基酸序列VIGILVAVILLLLLLLLLFLI (SEQ ID NO: 59)。在一些態樣中，跨膜域進一步包含LIR1細胞外域之至少一部分。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體包含衍生自PD-1的跨膜域。在一些態樣中，跨膜域包含與VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI (SEQ ID NO: 60)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，跨膜域包含胺基酸序列VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI (SEQ ID NO: 60)。在一些態樣中，跨膜域進一步包含PD-1細胞外域之至少一部分。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體包含衍生自CTLA4的跨膜域。在一些態樣中，跨膜域包含與DFLLWILAAVSSGLFFYSFLLT (SEQ ID NO: 68)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，跨膜域包含胺基酸序列DFLLWILAAVSSGLFFYSFLLT (SEQ ID NO: 68)。在一些態樣中，跨膜域進一步包含CTLA4細胞外域之至少一部分。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體包含衍生自KIR3DL1的跨膜域。在一些態樣中，跨膜域包含與ILIGTSVVIILFILLLFFLL (SEQ ID NO: 69)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，跨膜域包含胺基酸序列ILIGTSVVIILFILLLFFLL (SEQ ID NO: 69)。在一些態樣中，跨膜域進一步包含KIR3DL1細胞外域之至少一部分。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體包含衍生自CD28的跨膜域。在一些態樣中，跨膜域包含與FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 11)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，跨膜域包含胺基酸序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 11)。在一些態樣中，跨膜域進一步包含CD28細胞外域之至少一部分。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體包含衍生自LIR1的第一細胞內傳訊域及衍生自BTLA的第二細胞內傳訊域。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體包含衍生自LIR1的第一細胞內傳訊域及衍生自PD-1的第二細胞內傳訊域。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體包含衍生自LIR1的第一細胞內傳訊域及衍生自KIR3DL1的第二細胞內傳訊域。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體包含衍生自LIR1的第一細胞內傳訊域及衍生自LIR1的第二細胞內傳訊域。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體包含衍生自LIR1的第一細胞內傳訊域及衍生自KIR3DL1的第二細胞內傳訊域。
在一些態樣中，該第一細胞內傳訊域進一步包含衍生自LIR1的跨膜域。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體包含衍生自BTLA的第一細胞內傳訊域及衍生自LIR1的第二細胞內傳訊域。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體包含衍生自BTLA的第一細胞內傳訊域及衍生自PD-1的第二細胞內傳訊域。
在一些態樣中，該第一細胞內傳訊域進一步包含衍生自BTLA的跨膜域。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體包含衍生自PD-1的第一細胞內傳訊域及衍生自LIR1的第二細胞內傳訊域。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體包含衍生自PD-1的第一細胞內傳訊域及衍生自BTLA的第二細胞內傳訊域。
在一些態樣中，該第一細胞內傳訊域進一步包含衍生自PD-1的跨膜域。
在一些態樣中，蛋白不在靶腫瘤上表現。
在一些態樣中，蛋白在非腫瘤細胞上表現。
在一些態樣中，蛋白在衍生自選自由以下組成之群的組織的非腫瘤細胞上表現：腦、神經元組織、內分泌、內皮、骨、骨髓、免疫系統、肌肉、肺、肝、膽囊、胰臟、胃腸道、腎臟、膀胱、雄性生殖器、雌性生殖器、脂肪、軟組織及皮膚。
在一些態樣中，細胞外蛋白結合域包含配體結合域。
在一些態樣中，細胞外蛋白結合域包含受體結合域。
在一些態樣中，細胞外蛋白結合域包含抗原結合域。
在一些態樣中，抗原結合域包含抗體、抗體之抗原結合片段、F(ab)片段、F(ab')片段、單鏈可變片段(scFv)或單域抗體(sdAb)。
在一些態樣中，抗原結合域包含單鏈可變片段(scFv)。
在一些態樣中，各scFv包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。
在一些態樣中，VH及VL藉由肽連接子分開。
在一些態樣中，肽連接子包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：GGS (SEQ ID NO: 15)、GGSGGS (SEQ ID NO: 16)、GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 17)、GGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 18)、GGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 22)、GGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 23)、GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 24)、GGGGS (SEQ ID NO: 25)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 26)、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 27)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 28)及GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 29)。
在一些態樣中，scFv包含結構VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH為重鏈可變域，L為肽連接子，且VL為輕鏈可變域。
在一些態樣中，跨膜域物理連接至細胞外蛋白結合域。
在一些態樣中，該二或更多個細胞內傳訊域中之一者物理連接至跨膜域。
在一些態樣中，跨膜域物理連接至細胞外蛋白結合域，且該二或更多個細胞內傳訊域中之一者物理連接至跨膜域。
在一些態樣中，蛋白結合域具有高結合親和力。
在一些態樣中，蛋白結合域具有低結合親和力。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體能夠壓制經活化之免疫調節細胞產生細胞介素。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體能夠壓制對靶細胞的細胞介導之免疫反應，其中免疫反應藉由免疫調節細胞之活化來誘導。
在一些態樣中，靶細胞為腫瘤細胞。
在一些態樣中，該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者包含一或多個修飾。
在一些態樣中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾調節嵌合抑制性受體之敏感性。
在一些態樣中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾增加嵌合抑制性受體之敏感性。
在一些態樣中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾降低嵌合抑制性受體之敏感性。
在一些態樣中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾調節嵌合抑制性受體之效力。
在一些態樣中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾增加嵌合抑制性受體之效力。
在一些態樣中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾降低嵌合抑制性受體之效力。
在一些態樣中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，當在免疫調節細胞上表現時，該一或多個修飾調節靶向腫瘤的嵌合受體之活化之基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾降低基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾增加基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體進一步包含位於蛋白結合域與跨膜域之間且可操作地連接至蛋白結合域及跨膜域中之各者的間隔區。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體進一步包含位於蛋白結合域與跨膜域之間且物理連接至蛋白結合域及跨膜域中之各者的間隔區。
在一些態樣中，間隔區衍生自選自由以下組成之群的蛋白：CD8α、CD4、CD7、CD28、IgG1、IgG4、FcγRIIIα、LNGFR及PDGFR。
在一些態樣中，間隔區包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：AAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (SEQ ID NO: 31)、ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 32)、ESKYGPPAPSAP (SEQ ID NO: 33)、ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 34)、EPKSCDKTHTCP (SEQ ID NO: 35)、AAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN (SEQ ID NO: 36)、TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 37)、 ACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEADAEC (SEQ ID NO: 38)、ACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVC (SEQ ID NO: 39)、AVGQDTQEVIVVPHSLPFKV (SEQ ID NO: 40)及TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLP (SEQ ID NO: 70)。
在一些態樣中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區調節嵌合抑制性受體之敏感性。
在一些態樣中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區增加嵌合抑制性受體之敏感性。
在一些態樣中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區降低嵌合抑制性受體之敏感性。
在一些態樣中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區調節嵌合抑制性受體之效力。
在一些態樣中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區增加嵌合抑制性受體之效力。
在一些態樣中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區降低嵌合抑制性受體之效力。
在一些態樣中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，當在免疫調節細胞上表現時，間隔區調節靶向腫瘤的嵌合受體之活化之基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區降低基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區增加基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體進一步包含位於跨膜域與該二或更多個細胞內傳訊域中之一者之間且可操作地連接至跨膜域及細胞內傳訊域中之各者的細胞內間隔區。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體進一步包含位於跨膜域與該二或更多個細胞內傳訊域中之一者之間且物理連接至跨膜域及細胞內傳訊域中之各者的細胞內間隔區。
在一些態樣中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區調節嵌合抑制性受體之敏感性。
在一些態樣中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區增加嵌合抑制性受體之敏感性。
在一些態樣中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區降低嵌合抑制性受體之敏感性。
在一些態樣中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區調節嵌合抑制性受體之效力。
在一些態樣中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區增加嵌合抑制性受體之效力。
在一些態樣中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區降低嵌合抑制性受體之效力。
在一些態樣中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，當在免疫調節細胞上表現時，細胞內間隔區調節靶向腫瘤的嵌合受體之活化之基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區降低基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區增加基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，抑制性嵌合受體進一步包含酶抑制性域。
在一些態樣中，相對於缺乏酶抑制性域的其他方面相同的嵌合抑制性受體，當在免疫調節細胞上表現時，酶抑制性域能夠防止、減弱或抑制靶向腫瘤的嵌合受體之活化。
在一些態樣中，酶抑制性域包含酶催化域。
在一些態樣中，酶催化域衍生自選自由以下組成之群的酶：CSK、SHP-1、PTEN、CD45、CD148、PTP-MEG1、PTP-PEST、c-CBL、CBL-b、PTPN22、LAR、PTPH1、SHIP-1及RasGAP。
在一些態樣中，酶抑制性域包含一或多個修飾，相對於缺乏該一或多個修飾的其他方面相同的酶抑制性域，該一或多個修飾調節基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，相對於缺乏酶抑制性域的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該一或多個修飾降低嵌合抑制性受體之基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，相對於缺乏酶抑制性域的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該一或多個修飾增加嵌合抑制性受體之基礎防止、減弱或抑制。
在一些態樣中，靶向腫瘤的嵌合受體為靶向腫瘤的嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體(TCR)。
在一些態樣中，免疫調節細胞選自由以下組成之群：T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、γδ細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、調節性T細胞、病毒特異性T細胞、自然殺手T (NKT)細胞、自然殺手(NK)細胞、B細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、先天性淋巴樣細胞、肥胖細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、嗜中性球、髓樣細胞、巨噬細胞、單核球、樹突狀細胞、ESC衍生細胞及iPSC衍生細胞。在一些態樣中，免疫調節細胞為自然殺手(NK)細胞。
本文亦提供包含如本文所述之嵌合抑制性受體及醫藥學上可接受之載劑的組成物。
本文亦提供編碼如本文所述之嵌合抑制性受體的經工程改造之核酸。
本文亦提供包含本文所述之經工程改造之核酸的表現載體。
本文亦提供包含編碼如本文所述之嵌合抑制性受體之經工程改造之核酸或如本文所述之表現載體的經分離之免疫抑制細胞。
本文亦提供包含如本文所述之經工程改造之核酸或如本文所述之表現載體及醫藥學上可接受之載劑的組成物。
本文亦提供包含如本文所述之嵌合抑制性受體的經分離之免疫調節細胞。
在一些態樣中，細胞進一步包含在細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體。
在一些態樣中，相對於缺乏嵌合抑制性受體的其他方面相同的細胞，在蛋白與嵌合抑制性受體結合之後，嵌合抑制性受體防止、減弱或抑制靶向腫瘤的嵌合受體之活化。
本文亦提供包含嵌合抑制性受體的經分離之免疫調節細胞，其中該嵌合抑制性受體包含：細胞外蛋白結合域；跨膜域，其中跨膜域可操作地連接至細胞外蛋白結合域；及細胞內傳訊域，其中細胞內傳訊域可操作地連接至跨膜域，且其中相對於缺乏嵌合抑制性受體的其他方面相同的細胞，在蛋白與嵌合抑制性受體結合之後，嵌合抑制性受體防止、減弱或抑制在細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體之活化。
在一些態樣中，細胞進一步包含在細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體。
本文亦提供經分離之免疫調節細胞，其包含：嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含：細胞外蛋白結合域；跨膜域，其中跨膜域可操作地連接至細胞外蛋白結合域；及細胞內傳訊域，其中細胞內傳訊域可操作地連接至跨膜域；以及在細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合抗體，其中相對於缺乏嵌合抑制性受體的其他方面相同的細胞，在蛋白與嵌合抑制性受體結合之後，嵌合抑制性受體防止、減弱或抑制靶向腫瘤的嵌合受體之活化。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體經重組表現。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體自載體或細胞基因體之選定基因座表現。
在一些態樣中，靶向腫瘤的嵌合受體為嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體。
在一些態樣中，在蛋白與嵌合抑制性受體結合之前，靶向腫瘤的嵌合受體能夠活化細胞。
在一些態樣中，在蛋白與嵌合抑制性受體結合之後，嵌合抑制性受體壓制經活化之細胞產生細胞介素。
在一些態樣中，在蛋白與嵌合抑制性受體結合之後，嵌合抑制性受體壓制對靶細胞的細胞介導之免疫反應，其中免疫反應藉由免疫調節細胞之活化來誘導。
在一些態樣中，跨膜域物理連接至細胞外蛋白結合域。
在一些態樣中，細胞內傳訊域物理連接至跨膜域。
在一些態樣中，跨膜域物理連接至細胞外蛋白結合域，且細胞內傳訊域物理連接至跨膜域。
本文亦提供包含嵌合抑制性受體的經分離之免疫調節細胞，其中該嵌合抑制性受體包含：細胞外蛋白結合域；跨膜域，其中跨膜域可操作地連接至細胞外蛋白結合域；及二或更多個細胞內傳訊域，其中該二或更多個細胞內傳訊域可操作地連接至跨膜域；且其中相對於缺乏嵌合抑制性受體的其他方面相同的細胞，在蛋白與嵌合抑制性受體結合之後，嵌合抑制性受體防止、減弱或抑制在細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體之活化。
在一些態樣中，細胞進一步包含在細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體。
本文亦提供經分離之免疫調節細胞，其包含：(a)嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含：細胞外蛋白結合域；跨膜域，其中跨膜域可操作地連接至細胞外蛋白結合域；及二或更多個細胞內傳訊域，其中該二或更多個細胞內傳訊域可操作地連接至跨膜域；以及(b)在細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體，其中相對於缺乏嵌合抑制性受體的其他方面相同的細胞，在蛋白與嵌合抑制性受體結合之後，嵌合抑制性受體防止、減弱或抑制靶向腫瘤的嵌合受體之活化。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體經重組表現。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體自載體或細胞基因體之選定基因座表現。
在一些態樣中，靶向腫瘤的嵌合受體為嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體。
在一些態樣中，在蛋白與嵌合抑制性受體結合之前，靶向腫瘤的嵌合受體能夠活化細胞。
在一些態樣中，在蛋白與嵌合抑制性受體結合之後，嵌合抑制性受體壓制經活化之細胞產生細胞介素。
在一些態樣中，在蛋白與嵌合抑制性受體結合之後，嵌合抑制性受體壓制對靶細胞的細胞介導之免疫反應，其中免疫反應藉由免疫調節細胞之活化來誘導。
在一些態樣中，跨膜域物理連接至細胞外蛋白結合域。
在一些態樣中，該二或更多個細胞內傳訊域中之一者物理連接至跨膜域。
在一些態樣中，跨膜域物理連接至細胞外蛋白結合域，且該二或更多個細胞內傳訊域中之一者物理連接至跨膜域。
在一些態樣中，靶細胞為腫瘤細胞。
在一些態樣中，細胞選自由以下組成之群：T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、γδ細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、調節性T細胞、病毒特異性T細胞、自然殺手T (NKT)細胞、自然殺手(NK)細胞、B細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、先天性淋巴樣細胞、肥胖細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、嗜中性球、髓樣細胞、巨噬細胞、單核球、樹突狀細胞、ESC衍生細胞及iPSC衍生細胞。在一些態樣中，免疫調節細胞為自然殺手(NK)細胞。
在一些態樣中，細胞為自體的。
在一些態樣中，細胞為同種異體的。
本文亦提供包含如本文所述之經分離之細胞及醫藥學上可接受之載劑的組成物。
本文亦提供防止、減弱或抑制藉由在免疫調節細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體誘導之細胞介導之免疫反應的方法，其包含：對免疫調節細胞進行工程改造，以在免疫調節細胞之表面上表現如本文所述之嵌合受體，其中在同族蛋白與嵌合抑制性受體結合之後，細胞內傳訊域防止、減弱或抑制靶向腫瘤的嵌合受體之活化。
本文亦提供防止、減弱或抑制在免疫調節細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體之活化的方法，其包含：在合適於嵌合抑制性受體結合嵌合抑制性受體之同族蛋白的條件下，將如本文所述之經分離之細胞或如本文所述之組成物與該同族蛋白接觸，其中在該蛋白與該嵌合抑制性受體結合之後，細胞內傳訊域防止、減弱或抑制靶向腫瘤的嵌合受體之活化。
在一些態樣中，靶向腫瘤的嵌合受體為嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體(TCR)。
在一些態樣中，CAR結合一或多種在腫瘤細胞之表面上表現之抗原。
在一些態樣中，相對於缺乏嵌合抑制性受體的其他方面相同的細胞，在蛋白與嵌合抑制性受體結合之後，嵌合抑制性受體防止、減弱或抑制靶向腫瘤的嵌合受體之活化。
本文亦提供包含嵌合抑制性受體的經分離之免疫調節細胞，其中該嵌合抑制性受體包含：細胞外蛋白結合域；跨膜域，其中跨膜域可操作地連接至細胞外蛋白結合域；及細胞內傳訊域，其中細胞內傳訊域可操作地連接至跨膜域；且其中相對於缺乏嵌合抑制性受體的其他方面相同的細胞，在蛋白與嵌合抑制性受體結合之後，嵌合抑制性受體防止、減弱或抑制在細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體之活化。
在一些態樣中，細胞進一步包含在細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體。
本文亦提供經分離之免疫調節細胞，其包含：(a)嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含：細胞外蛋白結合域；跨膜域，其中跨膜域可操作地連接至細胞外蛋白結合域；及細胞內傳訊域，其中細胞內傳訊域可操作地連接至跨膜域；以及(b)在細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合抗體，其中相對於缺乏嵌合抑制性受體的其他方面相同的細胞，在蛋白與嵌合抑制性受體結合之後，嵌合抑制性受體防止、減弱或抑制靶向腫瘤的嵌合受體之活化。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體經重組表現。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體自載體或細胞基因體之選定基因座表現。
在一些態樣中，靶向腫瘤的嵌合受體為嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體。
在一些態樣中，在蛋白與嵌合抑制性受體結合之前，靶向腫瘤的嵌合受體能夠活化細胞。
在一些態樣中，在蛋白與嵌合抑制性受體結合之後，嵌合抑制性受體壓制經活化之細胞產生細胞介素。
在一些態樣中，在蛋白與嵌合抑制性受體結合之後，嵌合抑制性受體壓制對靶細胞的細胞介導之免疫反應，其中免疫反應藉由免疫調節細胞之活化來誘導。
在一些態樣中，跨膜域物理連接至細胞外蛋白結合域。
在一些態樣中，細胞內傳訊域物理連接至跨膜域。
在一些態樣中，跨膜域物理連接至細胞外蛋白結合域，且細胞內傳訊域物理連接至跨膜域。
本文亦提供包含嵌合抑制性受體的經分離之免疫調節細胞，其中該嵌合抑制性受體包含：-細胞外蛋白結合域；跨膜域，其中跨膜域可操作地連接至細胞外蛋白結合域；及-二或更多個細胞內傳訊域，其中該二或更多個細胞內傳訊域可操作地連接至跨膜域；且其中相對於缺乏嵌合抑制性受體的其他方面相同的細胞，在蛋白與嵌合抑制性受體結合之後，嵌合抑制性受體防止、減弱或抑制在細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體之活化。
在一些態樣中，細胞進一步包含在細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體。
本文亦提供經分離之免疫調節細胞，其包含：(a)嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含：-細胞外蛋白結合域；-跨膜域，其中跨膜域可操作地連接至細胞外蛋白結合域；及-二或更多個細胞內傳訊域，其中該二或更多個細胞內傳訊域可操作地連接至跨膜域；以及(b)在細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體，其中相對於缺乏嵌合抑制性受體的其他方面相同的細胞，在蛋白與嵌合抑制性受體結合之後，嵌合抑制性受體防止、減弱或抑制靶向腫瘤的嵌合受體之活化。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體經重組表現。
在一些態樣中，嵌合抑制性受體自載體或細胞基因體之選定基因座表現。
在一些態樣中，靶向腫瘤的嵌合受體為嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體。
在一些態樣中，在蛋白與嵌合抑制性受體結合之前，靶向腫瘤的嵌合受體能夠活化細胞。
在一些態樣中，在蛋白與嵌合抑制性受體結合之後，嵌合抑制性受體壓制經活化之細胞產生細胞介素。
在一些態樣中，在蛋白與嵌合抑制性受體結合之後，嵌合抑制性受體壓制對靶細胞的細胞介導之免疫反應，其中免疫反應藉由免疫調節細胞之活化來誘導。
在一些態樣中，跨膜域物理連接至細胞外蛋白結合域。
在一些態樣中，該二或更多個細胞內傳訊域中之一者物理連接至跨膜域。
在一些態樣中，跨膜域物理連接至細胞外蛋白結合域，且該二或更多個細胞內傳訊域中之一者物理連接至跨膜域。
在一些態樣中，靶細胞為腫瘤細胞。
在一些態樣中，細胞選自由以下組成之群：T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、γδ細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、調節性T細胞、病毒特異性T細胞、自然殺手T (NKT)細胞、自然殺手(NK)細胞、B細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、先天性淋巴樣細胞、肥胖細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、嗜中性球、髓樣細胞、巨噬細胞、單核球、樹突狀細胞、ESC衍生細胞及iPSC衍生細胞。在一些態樣中，免疫調節細胞為自然殺手(NK)細胞。
在一些態樣中，細胞為自體的。
如本文所述之經分離之細胞，其中細胞為同種異體的。
本文亦提供包含如本文所述之經分離之細胞及醫藥學上可接受之載劑的組成物。
本文亦提供防止、減弱或抑制藉由在免疫調節細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體誘導之細胞介導之免疫反應的方法，其包含：對免疫調節細胞進行工程改造，以在免疫調節細胞之表面上表現如本文所述之嵌合受體，其中在同族蛋白與嵌合抑制性受體結合之後，細胞內傳訊域防止、減弱或抑制靶向腫瘤的嵌合受體之活化。
本文亦提供防止、減弱或抑制在免疫調節細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體之活化的方法，其包含：在合適於嵌合抑制性受體結合嵌合抑制性受體之同族蛋白的條件下，將如本文所述之經分離之細胞或如本文所述之組成物與該同族蛋白接觸，其中在該蛋白與該嵌合抑制性受體結合之後，細胞內傳訊域防止、減弱或抑制靶向腫瘤的嵌合受體之活化。
在一些態樣中，靶向腫瘤的嵌合受體為嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體(TCR)。
在一些態樣中，CAR結合一或多種在腫瘤細胞之表面上表現之抗原。
相關申請案之交互參照
本申請案主張2020年2月20日提交之美國臨時申請案第62/979,309號、2020年6月26日提交之美國臨時申請案第63/044,597號及2021年1月11日提交之美國臨時申請案第63/136,134號之權益，該等案出於所有目的均以引用之方式整體併入本文。 序列表
本申請案含有序列表，其已經由EFS-Web提交並據此以引用之方式整體併入本文。該ASCII複本創建於2021年4月2日，名稱為STB-020WO_SL.txt且大小為82,443位元組。定義
除非另外指定，否則申請專利範圍及說明書中所用之術語均如下文所示進行定義。
如本文所用之術語「抑制性嵌合受體 」或「嵌合抑制性受體 」係指以下多肽或多肽集合，當在免疫效應細胞中表現時，其為細胞提供針對靶細胞的特異性以及抑制性細胞內訊息生成。抑制性嵌合受體通常包括細胞外蛋白結合域(例如，配體結合域、受體結合域、抗原結合域、呈抗原結合域的抗體片段)、間隔域、跨膜域及一或多個細胞內傳訊/共傳訊域。抑制性嵌合受體亦可稱為「iCAR 」 。
如本文所用之術語「抑制性嵌合抗原受體 」或「iCAR 」係指以下多肽或多肽集合，當在免疫效應細胞中表現時，其為細胞提供針對靶細胞的特異性以及抑制性細胞內訊息生成。抑制性嵌合抗原受體通常包括細胞外抗原結合域(例如，抗體或其抗原結合域或片段)、間隔域、跨膜域及一或多個細胞內傳訊/共傳訊域。
術語「靶向腫瘤的嵌合受體 」係指活化嵌合受體、靶向腫瘤的嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體。靶向腫瘤的嵌合受體亦可稱為「aCAR 」或「活化 CAR 」。
如本文所用之術語「嵌合抗原受體 」或替代地「CAR 」係指以下多肽或多肽集合，當在免疫效應細胞中表現時，其為細胞提供針對靶細胞的特異性以及細胞內訊息生成。CAR通常包括細胞外抗原結合域(例如，呈抗原結合域的抗體片段)、間隔域、跨膜域及一或多個細胞內傳訊/共傳訊域。在一些實施例中，CAR至少包含細胞外抗原結合域、跨膜域及細胞質傳訊域(本文亦稱為「細胞內傳訊域」)，其包含衍生自抑制性分子或刺激性分子及/或共刺激性分子的功能性傳訊域。在一些態樣中，包含抑制性嵌合受體或靶向腫瘤的嵌合受體的一組多肽彼此鄰接。在一些實施例中，抑制性嵌合受體或靶向腫瘤的嵌合受體進一步包含在細胞外抗原結合域與跨膜域之間的間隔域。在一些實施例中，一組多肽包括募集域，諸如二聚化或多聚化域，其可以使多肽彼此偶聯。在一些實施例中，抑制性嵌合受體包含有包含細胞外抗原結合域、跨膜域及細胞內傳訊域的嵌合融合蛋白，細胞內傳訊域包含衍生自抑制性分子或刺激性分子的功能性傳訊域。在一個態樣中，抑制性嵌合受體包含有包含細胞外抗原結合域、跨膜域及細胞內傳訊域的嵌合融合蛋白，細胞內傳訊域包含衍生自抑制性分子的功能性抑制性域。在一個態樣中，靶向腫瘤的嵌合受體包含有包含細胞外抗原結合域、跨膜域及細胞內傳訊域的嵌合融合蛋白，細胞內傳訊域包含衍生自共刺激性分子的功能性傳訊域及衍生自刺激性分子的功能性傳訊域。
如本文所用之術語「細胞內傳訊域 」係指定位於細胞內部的抑制性嵌合受體或靶向腫瘤的嵌合受體之功能性域。在一些實施例中，細胞內傳訊域為抑制性傳訊域。在分子結合域與蛋白(諸如抗原或配體)結合之後，例如，抑制性傳訊域抑制受體傳訊，而活化傳訊域將訊號(例如，增殖/存活訊息)傳遞至細胞。
如本文所用之術語「跨膜域 」係指跨越細胞膜的域。在一些實施例中，跨膜域包含疏水性α螺旋。
如本文所用之術語「細胞外蛋白結合域 」係指以下分子結合域，其通常為配體或配體結合域、細胞受體之胞外域或抗體之抗原結合域且定位於細胞外部，暴露於細胞外空間。細胞外抗原結合域可包括能夠與蛋白或肽結合的任何分子(例如，蛋白或肽)，包括配體、配體結合域、受體結合域或者抗原結合域或呈抗原結合域的抗體片段。在一些實施例中，細胞外蛋白或抗原結合域包含配體、配體結合域或受體結合域。在一些實施例中，細胞外蛋白或抗原結合域包含抗體、其抗原結合片段、F(ab)、F(ab')、單鏈可變片段(scFv)或單域抗體(sdAb)。在一些實施例中，細胞外蛋白或抗原結合域與細胞表面配體(例如，抗原，諸如癌症抗原，或在細胞之表面上表現之蛋白)結合。
如本文所用之術語「細胞外抗原結合域 」係指以下分子抗原結合域，其通常為抗體之抗原結合域且定位於細胞外部，暴露於細胞外空間。細胞外抗原結合域可包括能夠與抗原蛋白或肽結合的任何分子(例如，蛋白或肽)。在一些實施例中，細胞外蛋白或抗原結合域包含抗體、其抗原結合片段、F(ab)、F(ab')、單鏈可變片段(scFv)或單域抗體(sdAb)。在一些實施例中，細胞外抗原結合域與細胞表面配體(例如，抗原，諸如癌症抗原或在細胞之表面上表現之蛋白)結合。
術語「腫瘤 」係指腫瘤細胞及有關的腫瘤微環境(TME)。在一些實施例中，腫瘤係指腫瘤細胞或腫瘤腫塊。在一些實施例中，腫瘤係指腫瘤微環境。
術語「未經表現之 」係指與非腫瘤細胞中導致靶向腫瘤的嵌合抗原受體之活化的表現水準相比低至少2倍的表現。在一些實施例中，與非腫瘤細胞中導致靶向腫瘤的嵌合抗原受體之活化的表現水準相比，表現低至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍或更多。
術語「改善 」係指在疾病狀態(例如，癌症疾病狀態)之治療中之任何治療有益的結果，包括其預防、嚴重性或進展減輕、緩解或治癒。
術語「原位 」係指在與活機體分開生長(例如在組織培養物中生長)的活細胞中發生的過程。
術語「體內 」係指在活機體中發生的過程。
本文所用之術語「哺乳動物 」包括人類及非人類，且包括但不限於人類、非人類靈長類、犬、貓、鼠、牛、馬及豬。
在二或更多個核酸或多肽序列之情境中，術語百分比「一致性 」係指如使用下文所述之序列比較算法之一(例如，BLASTP及BLASTN或技術人員可用的其他算法)或藉由目視檢查所量測，當針對最大對應進行比較及比對時，具有指定百分比的相同核酸或胺基酸殘基的二或更多個序列或子序列。根據應用，百分比「一致性」可以存在於正比較的序列之區上，例如功能域，或替代地存在於欲比較的兩個序列之全長上。
對於序列比較，通常一個序列充當與測試序列相比較的參考序列。當使用序列比較算法時，將測試序列及參考序列輸入至電腦中，必要時指定子序列坐標，且指定序列算法程式參數。隨後，序列比較算法基於所指定之程式參數，計算一或多個測試序列相對於參考序列的百分比序列一致性。
用於比較的最佳算法可例如藉由以下進行：Smith及Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)之局部同源性算法；Needleman及Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)之同源性比對算法；Pearson及Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)之相似性搜尋方法；這些算法之電腦化實施(Wisconsin Genetics套裝軟體Genetics Computer Group中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，575 Science Dr., Madison, Wis.)；或目視檢查(大體上參見Ausubel等人, 見下文)。
適於確定百分比序列一致性及序列相似性的算法之一個實例為BLAST算法，其描述於Altschul等人, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)。用於進行BLAST分析的軟體可通過美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。
術語「足夠量」係指足以產生所需效果的量，例如足以調節細胞中蛋白聚集的量。
術語「治療有效量」係指有效改善疾病症狀的量。治療有效量可為「預防有效量」，因為可以將預防視為治療。
必須注意，除非上下文另外明確指出，否則如說明書及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一個」、「一種」及「該」包括複數個提及物。嵌合抑制性受體
在一個態樣中，本文提供嵌合抑制性受體，其包含：(i)細胞外蛋白結合域(例如，抗原結合域、配體結合域、受體結合域等)；(ii)跨膜域，其中跨膜域可操作地連接至細胞外蛋白結合域；及(iii)一或多個細胞內傳訊域，其中該一或多個細胞內傳訊域可操作地連接至跨膜域；且其中該一或多個細胞內傳訊域中之至少一者能夠防止、減弱或抑制在免疫調節細胞上表現之靶向腫瘤的嵌合受體之活化。在一些實施例中，本揭露之嵌合抑制性受體包含二或更多個、三或更多個、四或更多個或五或更多個細胞內傳訊域。在一些實施例中，本揭露之嵌合抑制性受體包含一個細胞內傳訊域。在一些實施例中，本揭露之嵌合抑制性受體包含兩個細胞內傳訊域。在一些實施例中，本揭露之嵌合抑制性受體包含三個細胞內傳訊域。在一些實施例中，本揭露之嵌合抑制性受體包含四個細胞內傳訊域。在一些實施例中，本揭露之嵌合抑制性受體包含五個細胞內傳訊域。
該兩個、三個、四個、五個或更多個細胞內傳訊域可為相同細胞內域或不同細胞內域。例如，一個細胞內域可衍生自一種蛋白(例如，BTLA)，且第二個細胞內域可衍生自不同的蛋白(例如，LIR1)。在具有三或更多個細胞內域之情況下，三個細胞內域中之各者可衍生自相同蛋白、三種不同蛋白或兩種蛋白。例如，在細胞內域衍生自兩種蛋白之情況下，嵌合抑制性受體可具有兩個來自BTLA之域及一個來自LIR1之域，或本文所揭示之細胞內域之任一其他組合。在另一實例中，在細胞內域衍生自三種蛋白之情況下，嵌合抑制性受體可為一個來自BTLA之域、一個來自LIR1之域及一個來自PD-1之域。
一般而言，抑制性或靶向腫瘤的嵌合受體係針對T細胞或NK細胞進行設計，且為細胞內傳訊域及蛋白識別域(例如，受體結合域、配體結合域或抗原結合域，諸如抗體之單鏈片段(scFv))之嵌合體(Enblad等人, Human Gene Therapy. 2015; 26(8):498-505)。表現嵌合抗原受體(CAR)的T細胞在此項技術中稱為CAR T細胞。活化或靶向腫瘤的CAR通常在經由細胞內傳訊域與其同族配體結合之後誘導T細胞傳訊途徑，導致T細胞活化及免疫反應。活化CAR (activation CAR及activating CAR)及靶向腫瘤的CAR為可互換的術語。
一般而言，抑制性嵌合受體為經工程改造以識別蛋白(諸如抗原、配體或細胞表現之受體)並與其結合的人工免疫細胞受體。抑制性嵌合受體一般識別在腫瘤細胞上不表現的蛋白(例如，抗原、配體、受體等)，而活化或靶向腫瘤的嵌合受體(例如，aCAR)一般識別在腫瘤細胞上表現的抗原。嵌合受體一般通常包括呈抗原結合域的抗體片段、間隔或鉸鏈域、疏水性α螺旋跨膜域及一或多個細胞內傳訊/共傳訊域。
抑制性嵌合受體一般遵循活化CAR (aCAR)結構，但使用針對細胞內傳訊域的抑制性域，而不是衍生自T細胞受體(TCR)的活化傳訊域。細胞內傳訊/共傳訊域為減少或抑制同一細胞中其他受體蛋白傳訊的抑制性域。抑制性嵌合受體細胞可含有蛋白特異性抑制性受體(例如，抗原特異性抑制性受體、配體特異性抑制性受體、受體特異性抑制性受體等)例如以阻斷可能由腫瘤外靶標表現所致的非特異性免疫活化。在一些實施例中，抑制性嵌合受體阻斷T細胞中由其內源性T細胞受體或活化或靶向腫瘤的CAR所活化之T細胞反應。例如，免疫調節細胞可表現識別非腫瘤抗原靶標的抑制性嵌合受體及識別腫瘤抗原的靶向腫瘤的嵌合受體。當這種免疫調節細胞接觸腫瘤細胞時，僅靶向腫瘤的受體識別並結合其同族配體且被活化，得到細胞傳訊途徑之誘導及免疫細胞活化。相比之下，當免疫調節細胞接觸非腫瘤靶標時，抑制性嵌合受體與其同族蛋白(例如，同族配體、受體、抗原等)結合且壓制或抑制藉由靶向腫瘤的嵌合受體之活化誘導之任何傳訊。因此，可構築免疫調節細胞，使得僅當細胞接觸腫瘤細胞時發生免疫傳訊。
在一些實施例中，抑制性嵌合受體所結合之蛋白(例如，配體、受體、抗原等)不在靶腫瘤上表現。在一些實施例中，與非腫瘤細胞中導致靶向腫瘤的嵌合抗原受體之活化的表現水準相比，表現低至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍或更多。
在一些實施例中，抑制性嵌合受體所結合之蛋白(例如，配體、受體、抗原等)在非腫瘤細胞上表現。
在一些實施例中，抑制性嵌合受體所結合之蛋白(例如，配體、受體、抗原等)在衍生自選自由以下組成之群的組織的非腫瘤細胞上表現：腦、神經元組織、內分泌、內皮、骨、骨髓、免疫系統、肌肉、肺、肝、膽囊、胰臟、胃腸道、腎臟、膀胱、雄性生殖器、雌性生殖器、脂肪、軟組織及皮膚。
在一些實施例中，抑制性嵌合受體包含SEQ ID NO: 56中所示之序列。細胞內傳訊域
本揭露之抑制性嵌合受體包含一或多個能夠防止、減弱或抑制在免疫調節細胞上表現之靶向腫瘤的嵌合受體之活化的細胞內傳訊域。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域包含一或多個修飾。在一些實施例中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾調節嵌合抑制性受體之敏感性。在一些實施例中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾增加嵌合抑制性受體之敏感性。在一些實施例中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾降低嵌合抑制性受體之敏感性。在一些實施例中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾調節嵌合抑制性受體之效力。在一些實施例中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾增加嵌合抑制性受體之效力。在一些實施例中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾降低嵌合抑制性受體之效力。
在一些實施例中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾調節在免疫調節細胞上表現之靶向腫瘤的嵌合受體之活化之基礎防止、減弱或抑制。在一些實施例中，相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾降低基礎防止、減弱或抑制。在一些實施例中，相對於其他相同的未經修飾之受體，一或多個修飾增加了基礎防止、減弱或抑制。抑制性域
在一些實施例中，本文所述之CAR包含一或多個抑制性細胞內域。在一些實施例中，本文所述之CAR包含二或更多個抑制性細胞內域。在一些實施例中，本文所述之CAR包含三或更多個抑制性細胞內域。在一些實施例中，本文所述之CAR包含四或更多個抑制性細胞內域。在一些實施例中，本文所述之CAR包含五或更多個抑制性細胞內域。在一些實施例中，本文所述之CAR包含一個抑制性細胞內域。在一些實施例中，本文所述之CAR包含兩個抑制性細胞內域。在一些實施例中，本文所述之CAR包含三個抑制性細胞內域。在一些實施例中，本文所述之CAR包含四個抑制性細胞內域。在一些實施例中，本文所述之CAR包含五個抑制性細胞內域。
在一些實施例中，對於具有二或更多個抑制性細胞內域的CAR，抑制性細胞內域中之二或更多者為不同的域。在一些實施例中，對於具有二或更多個抑制性細胞內域的CAR，抑制性細胞內域中之各者為不同的域。作為說明性非限制性實例，CAR可具有連接至LIR1抑制性細胞內域的KIR3DL1抑制性細胞內域。在一些實施例中，對於具有二或更多個抑制性細胞內域的CAR，抑制性細胞內域中之二或更多者為相同域(亦即，相同域之連環(concatemer))。在一些實施例中，對於具有二或更多個抑制性細胞內域的CAR，抑制性細胞內域中之各者均為相同的域。作為說明性非限制性實例，CAR可具有第一KIR3DL1抑制性細胞內域，其連接至第二KIR3DL1抑制性細胞內域，或具有第一LIR1抑制性細胞內域，其連接至第二LIR1抑制性細胞內域。
在一些實施例中，該一或多個抑制性細胞內域中之一者為B及T淋巴球弱化子(BTLA)域。在一些實施例中，該一或多個抑制性細胞內域中之一者為BTLA細胞內域。BTLA (UNIPROT Q7Z6A9)為在B細胞、樹突狀細胞及初始T細胞以及活化的CD4+ T細胞上表現的跨膜蛋白。BTLA受體之細胞內域含有可與SHP-1及SHP-2結合的基於免疫受體酪胺酸之抑制性模體(ITIM)序列。當BTLA之細胞外域結合其配體HVEM時，SHP-1及SHP-2磷酸酶抑制通過TCR的傳訊且亦可阻斷共活化蛋白諸如CD28。
在一些實施例中，該一或多個抑制性細胞內域中之一者為LIR1域。在一些實施例中，該一或多個抑制性細胞內域中之一者為LIR1細胞內域。LIR1亦稱為白血球免疫球蛋白樣受體亞家族B成員1 (LILRB1，UNIPROT Q8NHL6)。LIR1為在免疫細胞上表現的跨膜蛋白且與抗原呈現細胞上之MHC I類分子結合。LIR1與其同族MHC I配體之結合誘導壓制免疫反應之刺激的抑制性傳訊。LIR家族受體含有二至四個細胞外免疫球蛋白域、一個跨膜域及二至四個具有ITIM序列之細胞內域。
在一些實施例中，該一或多個抑制性細胞內域中之一者為PD-1域。在一些實施例中，該一或多個抑制性細胞內域中之一者為PD-1細胞內域。PD-1 (計畫性細胞死亡蛋白1，UNIPROT Q15116)在T細胞、B細胞及巨噬細胞上表現，且為T細胞調節蛋白之CD28/CTLA-4家族及免疫球蛋白超家族之成員。PD-1為具有細胞外IgV配體結合域及細胞內域之跨膜蛋白，細胞內域具有ITIM序列及基於免疫受體酪胺酸之開關模體序列。在PD-1之兩種配體中之一者PD-L1或PD-L2結合之後，SHP-1及SHP-2與PD-1之細胞內域結合且負面調節TCR傳訊。
在一些實施例中，該一或多個抑制性細胞內傳訊域中之各者均衍生自選自由以下組成之群的蛋白：BTLA、PD-1、CTLA4、TIM3、KIR3DL1、LIR1、NKG2A、TIGIT及LAG3。在一些實施例中，本文所述之抑制性嵌合受體包含一或多個抑制性細胞內傳訊域。在一些實施例中，該一或多個抑制性細胞內傳訊域中之一者為BTLA域。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者衍生自BTLA。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者為CTLA4域。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者衍生自CTLA4。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者為PD-1域。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者衍生自PD-1。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者為TIM3域。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者衍生自TIM3。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者為KIR3DL1域。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者衍生自KIR3DL1。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者為LIR1域。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者衍生自LIR1。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者為NKG2A域。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者衍生自NKG2A。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者為TIGIT域。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者衍生自TIGIT。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者為LAG3域。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者衍生自LAG3。
示範性抑制性細胞內傳訊域胺基酸序列示於表 1 。示範性抑制性細胞內傳訊域核酸序列示於表 2 。
表1- 示範性抑制性細胞內傳訊域胺基酸序列
胺基酸序列 SEQ ID NO: 描述
CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL 1 PD-1細胞內傳訊域
AVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN 2 CTLA4細胞內傳訊域
RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS 3 BTLA細胞內傳訊域
LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH 50 LIR1細胞內傳訊域
HLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP 66 KIR3DL1細胞內傳訊域
AVSLSKMLKKRSPLTTGVGVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN 67 CTLA4細胞內傳訊域
KEPASPLDKCHYTKDNGQFDQSAKQLNLEAYTIEQETALISNKNGKPKRQQRKPNPPLNLDSYIVGQNDM 93 NKG2A (反向)細胞內傳訊域
LTRKKKALRIHSVEGDLRRKSAGQEEWSPSAPSPPGSCVQAEAAPAGLCGEQRGEDCAELHDYFNVLSYRSLGNCSFFTETG 95 TIGIT細胞內傳訊域
MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKNSILATEQEITYAELNLQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAPEK 105 NKG2A細胞內傳訊域
表2- 示範性抑制性細胞內傳訊域核酸序列
核酸序列 SEQ ID NO: 描述
TGTAGCAGAGCCGCCAGAGGAACAATCGGCGCCAGAAGAACAGGCCAGCCTCTGAAAGAGGACCCCTCTGCCGTTCCTGTGTTCAGCGTGGACTATGGCGAGCTGGATTTCCAGTGGCGGGAAAAGACACCCGAGCCTCCAGTGCCTTGTGTGCCTGAGCAGACAGAGTACGCCACCATCGTGTTCCCTAGCGGCATGGGCACATCTAGCCCTGCCAGAAGAGGATCTGCCGACGGACCTAGATCTGCCCAGCCTCTTAGACCTGAGGACGGCCACTGTTCTTGGCCTCTT 4 PD-1細胞內傳訊域
TGTAGCCGAGCGGCCAGAGGCACAATCGGGGCAAGACGAACAGGACAGCCGCTCAAAGAGGACCCCAGTGCGGTCCCCGTTTTCTCCGTGGATTACGGAGAACTGGATTTCCAGTGGCGGGAGAAGACACCAGAGCCCCCGGTGCCCTGCGTGCCGGAGCAGACTGAGTACGCCACGATTGTGTTTCCCTCTGGAATGGGGACTTCATCCCCCGCTAGGCGCGGCTCAGCTGATGGCCCAAGATCCGCTCAACCGTTGCGGCCAGAGGACGGGCATTGCAGTTGGCCTCTG 51 PD-1細胞內傳訊域
GCCGTGTCTCTGAGCAAGATGCTGAAGAAGCGGAGCCCTCTGACCACCGGCGTGTACGTGAAAATGCCTCCTACCGAGCCTGAGTGCGAGAAGCAGTTCCAGCCTTACTTCATCCCCATCAAC 5 CTLA4細胞內傳訊域
AGGAGACATCAGGGGAAGCAGAATGAACTCAGCGATACAGCAGGGCGAGAAATTAATTTGGTAGACGCGCATCTGAAGTCCGAACAGACAGAGGCTTCTACTAGACAGAACTCCCAAGTTTTGTTGAGTGAGACGGGGATCTATGATAATGATCCCGATCTGTGTTTTAGAATGCAGGAGGGTAGTGAAGTCTACTCAAACCCGTGCCTGGAAGAAAATAAGCCCGGCATTGTTTACGCTAGTTTGAATCATTCTGTAATAGGCCCGAACTCCAGACTGGCTCGCAATGTGAAGGAGGCCCCAACTGAGTATGCGTCCATTTGCGTGCGGTCT 6 BTLA細胞內傳訊域
AGAAGACATCAGGGGAAGCAGAATGAACTCAGCGATACAGCAGGGCGAGAAATTAATTTGGTAGACGCGCATCTGAAGTCCGAACAGACAGAGGCTTCTACTAGACAGAACTCCCAAGTTTTGTTGAGTGAGACGGGGATCTATGATAATGATCCCGATCTGTGTTTTAGAATGCAGGAGGGTAGTGAAGTCTACTCAAACCCGTGCCTGGAAGAAAATAAGCCCGGCATTGTTTACGCTAGTTTGAATCATTCTGTAATAGGCCCGAACTCCAGACTGGCTCGCAATGTGAAGGAGGCCCCAACTGAGTATGCGTCCATTTGCGTGCGGTCT 52 BTLA細胞內傳訊域
AGAAGGCACCAGGGAAAGCAGAACGAGCTGAGCGATACCGCCGGCAGAGAAATCAACCTGGTGGACGCCCACCTGAAAAGCGAGCAGACAGAGGCCAGCACCAGACAGAATAGCCAGGTGCTGCTGAGCGAGACAGGCATCTACGACAACGACCCCGACCTGTGCTTCCGGATGCAAGAGGGAAGCGAGGTGTACAGCAACCCCTGCCTGGAAGAGAACAAGCCCGGCATCGTGTACGCTAGCCTGAACCACTCTGTGATCGGCCCCAATTCCAGACTGGCCCGGAACGTGAAAGAGGCCCCTACAGAGTACGCCAGCATCTGCGTCAGAAGC 53 BTLA細胞內傳訊域
TTGCGCCACAGACGGCAGGGAAAGCACTGGACTAGTACGCAGAGGAAAGCGGACTTCCAGCATCCCGCAGGAGCCGTGGGGCCTGAACCCACTGATCGCGGCCTTCAATGGAGGTCTAGCCCGGCGGCAGACGCACAAGAGGAAAACTTGTACGCAGCCGTTAAGCACACCCAACCGGAGGACGGCGTTGAGATGGATACCCGCTCCCCTCACGATGAAGACCCTCAAGCAGTCACTTACGCGGAAGTAAAGCATAGCCGCCCCAGACGGGAAATGGCTAGCCCGCCGTCCCCCCTTAGCGGGGAATTTCTGGACACTAAAGATAGGCAGGCGGAAGAGGACCGCCAAATGGATACAGAGGCGGCGGCAAGTGAAGCACCTCAAGACGTTACTTACGCTCAACTTCACAGCCTTACCCTCAGGCGAGAAGCGACTGAACCACCCCCTTCCCAAGAAGGGCCAAGCCCAGCGGTTCCTTCTATCTATGCTACTCTTGCTATTCAC 54 LIR1細胞內傳訊域
CTGCGGCACAGACGGCAGGGCAAGCACTGGACAAGCACACAGAGAAAGGCCGACTTTCAGCACCCTGCTGGTGCCGTTGGACCTGAGCCTACAGATAGAGGACTGCAGTGGCGGTCTAGCCCTGCCGCTGATGCTCAAGAGGAAAACCTGTACGCCGCCGTGAAGCACACCCAACCTGAAGATGGCGTGGAAATGGACACCAGATCTCCCCACGATGAGGACCCTCAGGCCGTGACATATGCCGAAGTGAAGCACTCCCGGCCTCGGAGAGAAATGGCTAGCCCTCCAAGTCCTCTGAGCGGCGAGTTCCTGGACACCAAGGATAGACAGGCCGAAGAGGACCGGCAGATGGATACAGAAGCTGCCGCATCTGAGGCCCCACAGGATGTGACTTATGCCCAGCTGCACAGCCTGACACTGCGGAGAGAAGCCACAGAGCCTCCACCTTCTCAAGAGGGCCCATCTCCAGCCGTGCCTAGCATCTATGCCACACTGGCCATCCAC 55 LIR1細胞內傳訊域
GCCGTGTCACTTAGTAAGATGCTGAAGAAGAGGTCACCACTGACGACAGGGGTTGGAGTGAAGATGCCACCCACAGAACCCGAATGTGAGAAGCAATTCCAGCCTTATTTCATTCCAATAAAT 84 CTLA4細胞內傳訊域
CATCTGTGGTGTTCTAATAAGAAGAATGCTGCTGTGATGGATCAAGAGCCCGCTGGTAACAGAACGGCCAACAGTGAAGATAGCGATGAGCAGGACCCAGAAGAAGTGACCTACGCCCAACTCGACCACTGTGTTTTTACGCAGCGGAAAATCACTCGACCCTCTCAACGACCCAAAACGCCGCCTACGGACACCATACTCTACACCGAACTGCCGAACGCCAAACCACGGTCCAAGGTGGTATCATGTCCG 85 KIR3DL1細胞內傳訊域
CTGCGGCACAGAAGGCAGGGCAAGCACTGGACAAGCACCCAGAGAAAGGCCGATTTTCAGCACCCTGCTGGCGCCGTTGGACCTGAGCCTACAGATAGAGGACTGCAGTGGCGGTCTAGCCCTGCTGCCGATGCTCAAGAGGAAAACCTGTACGCCGCCGTGAAGCACACCCAACCTGAAGATGGCGTGGAAATGGACACCAGATCTCCCCACGATGAGGACCCTCAGGCCGTGACATACGCTGAAGTGAAGCACTCCCGGCCTCGGAGAGAAATGGCTAGCCCTCCAAGTCCTCTGAGCGGCGAGTTCCTGGACACCAAGGATAGACAGGCCGAAGAGGACCGGCAGATGGATACAGAAGCTGCCGCCTCTGAAGCCCCACAGGATGTGACATATGCCCAGCTGCATAGCCTGACACTGCGGAGAGAAGCCACAGAGCCTCCACCTTCTCAAGAGGGCCCATCTCCAGCCGTGCCTAGCATCTATGCCACACTGGCCATTCAC 86 LIR1細胞內傳訊域
AAGGAGCCTGCGTCCCCGTTGGATAAATGCCACTATACTAAGGATAACGGTCAGTTCGATCAGAGTGCAAAGCAACTTAACTTGGAGGCTTACACTATAGAGCAAGAAACAGCGCTGATAAGTAATAAGAACGGTAAGCCAAAGCGACAGCAGAGGAAACCCAATCCTCCGCTTAACTTGGATAGCTACATCGTCGGGCAAAATGACATG 94 NKG2A (反向)細胞內傳訊域
CTGACCAGAAAGAAGAAGGCCCTGAGAATCCACAGCGTGGAAGGCGACCTGCGGAGAAAGTCTGCCGGACAAGAAGAGTGGTCCCCTAGCGCTCCATCTCCACCTGGATCTTGTGTGCAGGCCGAAGCAGCTCCTGCTGGACTGTGTGGCGAACAGAGAGGCGAAGATTGCGCCGAGCTGCACGACTACTTCAACGTGCTGAGCTACAGAAGCCTGGGCAACTGCAGCTTCTTCACCGAGACAGGA 96 TIGIT細胞內傳訊域
ATGGACAACCAGGGCGTGATCTACAGCGACCTGAACCTGCCTCCTAATCCTAAGCGGCAGCAGAGAAAGCCCAAGGGCAACAAGAACAGCATCCTGGCCACCGAGCAAGAGATCACCTACGCCGAGCTGAATCTGCAGAAGGCCAGCCAGGACTTCCAGGGCAACGACAAGACCTACCACTGCAAGGACCTGCCTAGCGCTCCCGAGAAG 106 NKG2A細胞內傳訊域
ATGGACAACCAGGGCGTCATCTACAGCGACCTGAACCTGCCTCCTAATCCAAAGCGGCAGCAGCGGAAGCCCAAGGGCAACAAGAATAGCATCCTGGCCACCGAGCAAGAGATCACCTACGCCGAGCTGAATCTGCAGAAGGCCAGCCAGGATTTCCAGGGCAACGACAAGACCTACCACTGCAAGGACCTGCCTAGCGCTCCTGAGAAA 130 NKG2A細胞內傳訊域(密碼子最佳化)
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS (SEQ ID NO: 3)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含胺基酸序列RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS (SEQ ID NO: 3)。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與SEQ ID NO: 1有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與SEQ ID NO: 2有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含胺基酸序列SEQ ID NO: 2。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 50)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含胺基酸序列LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 50)。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與HLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP (SEQ ID NO: 66)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含胺基酸序列HLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP (SEQ ID NO: 66)。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與AVSLSKMLKKRSPLTTGVGVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN (SEQ ID NO: 67)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含胺基酸序列AVSLSKMLKKRSPLTTGVGVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN (SEQ ID NO: 67)。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與SEQ ID NO: 93有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含胺基酸序列SEQ ID NO: 93。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與SEQ ID NO: 95有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含胺基酸序列SEQ ID NO: 95。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與SEQ ID NO: 105有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含胺基酸序列SEQ ID NO: 105。
在一些實施例中，跨膜域及該一或多個細胞內傳訊域中之至少一者衍生自相同蛋白。在一些實施例中，跨膜域衍生自第一蛋白，且該一或多個細胞內傳訊域中之各者均衍生自與第一蛋白不同的蛋白。
在一些實施例中，本揭露之抑制性嵌合受體包含兩個細胞內傳訊域。在一些實施例中，第一細胞內傳訊域衍生自LIR1，且第二細胞內傳訊域衍生自BTLA。在一些實施例中，第一細胞內傳訊域衍生自LIR1，且第二細胞內傳訊域衍生自PD-1。在一些實施例中，第一細胞內傳訊域進一步包含衍生自LIR1的跨膜域。
在一些實施例中，本揭露之抑制性嵌合受體包含兩個細胞內傳訊域。在一些實施例中，第一細胞內傳訊域衍生自BTLA，且第二細胞內傳訊域衍生自LIR1。在一些實施例中，第一細胞內傳訊域衍生自BTLA，且第二細胞內傳訊域衍生自PD-1。在一些實施例中，第一細胞內傳訊域進一步包含衍生自BTLA的跨膜域。
在一些實施例中，本揭露之抑制性嵌合受體包含兩個細胞內傳訊域。在一些實施例中，該兩個細胞內傳訊域選自由以下組成之群：BTLA、PD-1、CTLA4、TIM3、KIR3DL1、LIR1、NKG2A、TIGIT及LAG3。在一些實施例中，第一細胞內傳訊域衍生自PD-1，且第二細胞內傳訊域衍生自LIR1。在一些實施例中，第一細胞內傳訊域衍生自PD-1，且第二細胞內傳訊域衍生自BTLA。在一些實施例中，第一細胞內傳訊域進一步包含衍生自PD-1的跨膜域。第一及第二細胞內傳訊域可為任何順序。
在一些實施例中，本揭露之抑制性嵌合受體包含三個細胞內傳訊域。在一些實施例中，該三個細胞內傳訊域選自由以下組成之群：BTLA、PD-1、CTLA4、TIM3、KIR3DL1、LIR1、NKG2A、TIGIT及LAG3。在一些實施例中，第一細胞內傳訊域衍生自PD-1，第二細胞內傳訊域衍生自LIR1，且第三細胞內傳訊域衍生自BTLA。在一些實施例中，第一細胞內傳訊域進一步包含衍生自PD-1的跨膜域。在一些實施例中，第一細胞內傳訊域進一步包含衍生自LIR1的跨膜域。在一些實施例中，第一細胞內傳訊域進一步包含衍生自BTLA的跨膜域。第一、第二及第三細胞內傳訊域可為任何順序。例如，在包含三個來自PD-1、LIR1及BTLA之傳訊域的抑制性嵌合受體中，細胞內傳訊域之順序可為PD-1—LIR1—BTLA、或PD-1—BTLA—LIR1、或LIR1—PD-1—BTLA、或LIR1—BTLA—PD-1、或BTLA—PD-1—LIR1、或BTLA—LIR1—PD-1。
在一些實施例中，本揭露之抑制性嵌合受體包含四個細胞內傳訊域。在一些實施例中，該四個細胞內傳訊域選自由以下組成之群：BTLA、PD-1、CTLA4、TIM3、KIR3DL1、LIR1、NKG2A、TIGIT及LAG3。第一、第二、第三及第四細胞內傳訊域可為任何順序。
在一些實施例中，本揭露之抑制性嵌合受體包含五個細胞內傳訊域。在一些實施例中，該五個細胞內傳訊域選自由以下組成之群：BTLA、PD-1、CTLA4、TIM3、KIR3DL1、LIR1、NKG2A、TIGIT及LAG3。第一、第二、第三、第四及第五細胞內傳訊域可為任何順序。在一些實施例中，本揭露之抑制性嵌合受體包含多於五個細胞內傳訊域。在一些實施例中，該多於五個細胞內傳訊域選自由以下組成之群：BTLA、PD-1、CTLA4、TIM3、KIR3DL1、LIR1、NKG2A、TIGIT及LAG3。第一、第二、第三、第四、第五及額外細胞內傳訊域可為任何順序。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含有包含SEQ ID NO: 4之核酸。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域多肽中之一者包含與SEQ ID NO: 4有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含有包含SEQ ID NO: 5之核酸。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與SEQ ID NO: 5有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含有包含SEQ ID NO: 6之核酸。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與SEQ ID NO: 6有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含有包含SEQ ID NO: 51之核酸。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與SEQ ID NO: 51有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含有包含SEQ ID NO: 52之核酸。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與SEQ ID NO: 52有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含有包含SEQ ID NO: 53之核酸。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與SEQ ID NO: 53有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含有包含SEQ ID NO: 54之核酸。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與SEQ ID NO: 54有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含有包含SEQ ID NO: 55之核酸。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與SEQ ID NO: 55有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含有包含SEQ ID NO: 84之核酸。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與SEQ ID NO: 84有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含有包含SEQ ID NO: 85之核酸。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與SEQ ID NO: 85有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含有包含SEQ ID NO: 86之核酸。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與SEQ ID NO: 86有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含有包含SEQ ID NO: 94之核酸。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與SEQ ID NO: 94有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含有包含SEQ ID NO: 96之核酸。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與SEQ ID NO: 96有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含有包含SEQ ID NO: 106之核酸。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與SEQ ID NO: 106有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。
在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含有包含SEQ ID NO: 130之核酸。在一些實施例中，該一或多個細胞內傳訊域中之一者包含與SEQ ID NO: 130有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。酶抑制性域
在一些實施例中，抑制性嵌合受體包含酶抑制性域。在一些實施例中，相對於缺乏酶抑制性域的其他方面相同的嵌合抑制性受體，當在免疫調節細胞上表現時，酶抑制性域能夠防止、減弱或抑制嵌合受體之活化。
在一些實施例中，酶抑制性域包含酶催化域。在一些實施例中，酶催化域衍生自選自由以下組成之群的酶：CSK、SHP-1、PTEN、CD45、CD148、PTP-MEG1、PTP-PEST、c-CBL、CBL-b、PTPN22、LAR、PTPH1、SHIP-1及RasGAP。
在一些實施例中，酶抑制性域包含一或多個修飾，相對於缺乏該一或多個修飾的其他方面相同的酶抑制性域，該一或多個修飾調節基礎防止、減弱或抑制。在一些實施例中，相對於缺乏該一或多個修飾的其他方面相同的酶抑制性域，該一或多個修飾降低基礎防止、減弱或抑制。在一些實施例中，相對於缺乏該一或多個修飾的其他方面相同的酶抑制性域，該一或多個修飾增加基礎防止、減弱或抑制。活化及共刺激性域
在一些實施例中，本文所揭示之細胞可進一步包含至少一種靶向腫瘤的嵌合受體或T細胞受體，其包含活化細胞內域或共刺激性細胞內域。在一些實施例中，細胞包含至少一種抑制性嵌合受體及至少一種靶向腫瘤的嵌合受體。細胞可包含至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種或至少10種或更多種靶向腫瘤的CAR及至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種或至少10種或更多種抑制性嵌合受體。
在一些實施例中，活化傳訊域為CD3-ζ蛋白，其包括三個基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)。活化傳訊域之其他實例包括CD28、4-1BB及OX40。在一些實施例中，細胞受體包含多於一個活化傳訊域，其各自被稱為共刺激性域。
在一些實施例中，靶向腫瘤的嵌合受體為嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體。在一些實施例中，CAR結合一或多種在腫瘤細胞之表面上表現之抗原。
在一些實施例中，在抗原與嵌合抑制性受體結合之前，靶向腫瘤的嵌合受體能夠活化細胞。
在一些實施例中，靶向腫瘤的嵌合抗體包含SEQ ID NO: 51中所示之序列。在一些實施例中，靶向腫瘤的嵌合抗體包含SEQ ID NO: 52中所示之序列。跨膜域
抑制性嵌合受體可含有跨膜域，其將蛋白結合域連接至細胞內域。不同的跨膜域得到不同的受體穩定性。合適的跨膜域包括但不限於BTLA、CD8、CD28、CD3ζ、CD4、4-IBB、OX40、ICOS、2B4、CD25、CD7、LAX、LAT、PD-1、CTLA4、TIM3、KIR3DL1、LIR1、NKG2A、TIGIT及LAG3。
在一些實施例中，跨膜域衍生自選自由以下組成之群的蛋白：BTLA、CD8、CD28、CD3ζ、CD4、4-IBB、OX40、ICOS、2B4、CD25、CD7、LAX、LAT、PD-1、CTLA4、TIM3、KIR3DL1、LIR1、NKG2A、TIGIT及LAG3。在一些實施例中，細胞受體之跨膜域為BTLA跨膜域。在一些實施例中，細胞受體之跨膜域為CD8跨膜域。在一些實施例中，細胞受體之跨膜域為CD28跨膜域。在一些實施例中，細胞受體之跨膜域為CD3ζ跨膜域。在一些實施例中，細胞受體之跨膜域為CD4跨膜域。在一些實施例中，細胞受體之跨膜域為4-1BB跨膜域。在一些實施例中，細胞受體之跨膜域為OX40跨膜域。在一些實施例中，細胞受體之跨膜域為ICOS跨膜域。在一些實施例中，細胞受體之跨膜域為2B4跨膜域。在一些實施例中，細胞受體之跨膜域為CD25跨膜域。在一些實施例中，細胞受體之跨膜域為CD7跨膜域。在一些實施例中，細胞受體之跨膜域為LAX跨膜域。在一些實施例中，細胞受體之跨膜域為LAT跨膜域。在一些實施例中，細胞受體之跨膜域為PD-1跨膜域。在一些實施例中，細胞受體之跨膜域為CLTA4跨膜域。在一些實施例中，細胞受體之跨膜域為TIM3跨膜域。在一些實施例中，細胞受體之跨膜域為KIR3DL跨膜域。在一些實施例中，細胞受體之跨膜域為LIR1跨膜域。在一些實施例中，細胞受體之跨膜域為NKG2A跨膜域。在一些實施例中，細胞受體之跨膜域為TIGIT跨膜域。在一些實施例中，細胞受體之跨膜域為LAG3跨膜域。
在一些實施例中，跨膜域進一步包含相同蛋白之細胞外域之至少一部分。在一些實施例中，跨膜域進一步包含BTLA之細胞外域之至少一部分。在一些實施例中，跨膜域進一步包含PD-1之細胞外域之至少一部分。在一些實施例中，跨膜域進一步包含CTLA4之細胞外域之至少一部分。在一些實施例中，跨膜域進一步包含TIM3之細胞外域之至少一部分。在一些實施例中，跨膜域進一步包含KIR3DL1之細胞外域之至少一部分。在一些實施例中，跨膜域進一步包含LIR1之細胞外域之至少一部分。在一些實施例中，跨膜域進一步包含NKG2A之細胞外域之至少一部分。在一些實施例中，跨膜域進一步包含TIGIT之細胞外域之至少一部分。在一些實施例中，跨膜域進一步包含LAG3之細胞外域之至少一部分。
在一些實施例中，跨膜域進一步包含BTLA細胞外域之至少一部分。在一些實施例中，跨膜域包含BTLA細胞外域之至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100或更多個胺基酸。在一些實施例中，跨膜域包含與BTLA細胞外域中之一者部分有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，跨膜域進一步包含LIR1細胞外域之至少一部分。在一些實施例中，跨膜域包含LIR1細胞外域之至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100或更多個胺基酸。在一些實施例中，跨膜域包含與LIR1細胞外域之一部分有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，跨膜域進一步包含PD-1細胞外域之至少一部分。在一些實施例中，跨膜域包含PD-1細胞外域之至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100或更多個胺基酸。在一些實施例中，跨膜域包含與PD-1細胞外域之一部分有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，跨膜域進一步包含CTLA4細胞外域之至少一部分。在一些實施例中，跨膜域包含CTLA4細胞外域之至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100或更多個胺基酸。在一些實施例中，跨膜域包含與CTLA4細胞外域之一部分有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，跨膜域進一步包含KIR3DL1細胞外域之至少一部分。在一些實施例中，跨膜域包含KIR3DL1細胞外域之至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100或更多個胺基酸。在一些實施例中，跨膜域包含與KIR3DL1細胞外域之一部分有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，跨膜域進一步包含CD28細胞外域之至少一部分。在一些實施例中，跨膜域包含CD28細胞外域之至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100或更多個胺基酸。在一些實施例中，跨膜域包含與CD28細胞外域之一部分有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 7有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含胺基酸序列SEQ ID NO: 7。在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 8有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含胺基酸序列SEQ ID NO: 8。在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 9有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含胺基酸序列SEQ ID NO: 9。在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 10有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含胺基酸序列SEQ ID NO: 10。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 11有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含胺基酸序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 12有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含胺基酸序列LLPLGGLPLLITTCFCLFCCL (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 59有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含胺基酸序列VIGILVAVILLLLLLLLLFLI (SEQ ID NO: 59)。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 60有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含胺基酸序列VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI (SEQ ID NO: 60)。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 68有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含胺基酸序列DFLLWILAAVSSGLFFYSFLLT (SEQ ID NO: 68)。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 69有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含胺基酸序列ILIGTSVVIILFILLLFFLL (SEQ ID NO: 69)。
示範性跨膜域胺基酸序列展示於表 3 。示範性跨膜域核酸序列展示於表 4 。
表3- 示範性跨膜域胺基酸序列
胺基酸序列 SEQ ID NO: 描述
IFSGFAGLLAILLVVAVFCIL 7 LAX跨膜域
VAVAGCVFLLISVLLLSGL 8 CD25跨膜域
AALAVISFLLGLGLGVACVLA 9 CD7跨膜域
MEADALSPVGLGLLLLPFLVTLLAALAVRARELPVS 10 LAT跨膜域
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV 11 CD28跨膜域
LLPLGGLPLLITTCFCLFCCL 12 BTLA跨膜域
VIGILVAVILLLLLLLLLFLI 59 LIR1跨膜域
VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI 60 PD-1跨膜域
DFLLWILAAVSSGLFFYSFLLT 68 CTLA4跨膜域
ILIGTSVVIILFILLLFFLL 69 KIR3DL1跨膜域
IVVITVVSAMLILCIIGLIGVIL 89 NKG2A (反向)跨膜域
LLGAMAATLVVICTAVIVVVA 91 TIGIT跨膜域
LIVGILGIICLILMASVVTIVVI 107 NKG2A跨膜域
表4- 示範性跨膜域核酸序列
核酸序列 SEQ ID NO: 描述
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG 13 CD28跨膜域
CTCTTGCCGTTGGGGGGTCTGCCACTTCTCATAACAACTTGCTTCTGCCTTTTTTGCTGTTTG 14 BTLA跨膜域
CTGCTGCCTCTTGGAGGACTGCCCCTCCTGATCACCACATGCTTTTGCCTGTTCTGCTGTCTG 61 BTLA跨膜域
GTTATAGGGATCCTGGTGGCTGTCATACTCCTCTTGCTCCTCTTGTTGCTGCTTTTTTTGATA 62 LIR1跨膜域
GTGATCGGAATTCTGGTGGCCGTGATTCTGCTGCTGCTCCTTCTGCTCCTGCTGTTTCTGATT 63 LIR1跨膜域
GTTGGGGTTGTAGGTGGTCTGCTCGGCAGCCTGGTCTTGTTGGTGTGGGTCTTGGCTGTGATC 64 PD-1跨膜域
GTGGGAGTTGTTGGCGGCCTGCTGGGATCTCTGGTGCTGCTTGTTTGGGTGCTCGCCGTGATC 65 PD-1跨膜域
GATTTTCTGCTGTGGATTCTGGCAGCTGTGAGCTCTGGCTTGTTTTTCTACAGCTTCCTCCTGACC 80 CTLA-4跨膜域
ATCCTGATCGGGACAAGTGTAGTAATCATACTTTTCATACTCCTGCTCTTTTTTCTCTTG 81 KIR3DL1跨膜域
GTGATCGGAATTCTGGTGGCCGTGATCCTGCTGCTCCTGCTTCTCCTCCTGCTGTTTCTGATC 82 LIR1跨膜域(密碼子最佳化#1)
GTGATCGGCATTCTGGTGGCCGTGATTCTGCTGCTCCTGCTGTTGCTGCTGCTGTTCCTGATC 131 LIR1跨膜域(密碼子最佳化#2)
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV 11 CD28跨膜域
ATAGTGGTCATCACTGTAGTTAGTGCAATGCTTATTCTTTGTATCATAGGGCTCATAGGGGTAATCCTG 90 NKG2A跨膜域
CTGCTGGGCGCCATGGCCGCCACACTGGTTGTTATCTGTACCGCCGTGATCGTGGTGGTGGCC 92 TIGIT跨膜域
CTGATCGTGGGAATCCTGGGCATCATCTGCCTGATCCTGATGGCCAGCGTGGTCACCATCGTGGTCATC 108 NKG2A跨膜域
CTGATCGTGGGCATCCTGGGCATCATCTGTCTGATCCTGATGGCCAGCGTGGTCACCATCGTGGTCATC 132 NKG2A跨膜域(密碼子最佳化)
在一些實施例中，跨膜域物理連接至細胞外蛋白結合域。在一些實施例中，該一或更多個細胞內傳訊域中之一者物理連接至跨膜域。在一些實施例中，跨膜域物理連接至細胞外蛋白結合域，且該一或更多個細胞內傳訊域中之一者物理連接至跨膜域。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 7有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含胺基酸序列SEQ ID NO: 7。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 13有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含核酸序列SEQ ID NO: 13。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 14有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含核酸序列SEQ ID NO: 14。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 61有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含核酸序列SEQ ID NO: 61。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 62有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含核酸序列SEQ ID NO: 62。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 63有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含核酸序列SEQ ID NO: 63。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 64有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含核酸序列SEQ ID NO: 64。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 65有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含核酸序列SEQ ID NO: 65。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 80有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含核酸序列SEQ ID NO: 80。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 81有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含核酸序列SEQ ID NO: 81。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 82有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含核酸序列SEQ ID NO: 82。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 83有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含核酸序列SEQ ID NO: 83。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 90有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含核酸序列SEQ ID NO: 90。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 92有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含核酸序列SEQ ID NO: 92。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 108有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含核酸序列SEQ ID NO: 108。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 131有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含核酸序列SEQ ID NO: 131。
在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 132有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的核酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含核酸序列SEQ ID NO: 132。細胞外蛋白結合域
本文所述之抑制性嵌合受體進一步包含細胞外蛋白結合域，諸如配體結合域、受體結合域、抗原結合域等。
在一些實施例中，表現抑制性嵌合受體的免疫細胞經基因修飾以識別多種靶標或蛋白(例如，配體、受體、抗原等)，其允許識別腫瘤細胞上之獨特靶標或蛋白(例如，配體、受體、抗原等)表現模式。
在一些實施例中，蛋白(例如，配體、受體、抗原等)不在靶腫瘤上表現。在一些實施例中，與導致靶向腫瘤的嵌合抗原受體之活化的表現水準相比，非腫瘤細胞中之表現低至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍或更多。
在一些實施例中，蛋白(例如，配體、受體、抗原等)在非腫瘤細胞上表現。
在一些實施例中，蛋白(例如，配體、受體、抗原等)在衍生自選自由以下組成之群的組織的非腫瘤細胞上表現：腦、神經元組織、內分泌、內皮、骨、骨髓、免疫系統、肌肉、肺、肝、膽囊、胰臟、胃腸道、腎臟、膀胱、雄性生殖器、雌性生殖器、脂肪、軟組織及皮膚。
在一些實施例中，本揭露之抑制性嵌合受體之細胞外蛋白結合域包含抗原結合域，諸如特異於腫瘤抗原的單鏈Fv (scFv)。在一些實施例中，細胞外蛋白結合域包含抗體、其抗原結合片段、F(ab)、F(ab')、單鏈可變片段(scFv)或單域抗體(sdAb)。
術語「單鏈」係指包含藉由肽鍵線性連接的胺基酸單體的分子。在一特定此類實施例中，在單鏈Fab分子中，Fab輕鏈之C末端連接至Fab重鏈之N末端。如本文更詳細描述，scFv之輕鏈(VL)可變域藉由多肽鏈自其C末端連接至重鏈(VH)可變域之N末端。替代地，scFv包含其中VH之C末端藉由多肽鏈連接至VL之N末端的多肽鏈。
「Fab片段」(亦稱為抗原結合片段)含有輕鏈恆定域(CL)及重鏈第一恆定域(CH1)以及分別在輕鏈及重鏈上的可變域VL及VH。可變域包含參與抗原結合的互補決定環(CDR，亦稱為高變區)。Fab'片段與Fab片段之區別在於在重鏈CH1域之羧基末端添加了一些殘基，包括來自抗體鉸鏈區的一或多個半胱胺酸。
「F(ab')2」片段含有兩個Fab'片段，其在鉸鏈區域附近藉由雙硫鍵接合。F(ab')2片段可例如藉由重組方法或藉由完整抗體之胃蛋白酶消化而生成。F(ab')片段可例如藉由用β-巰基乙醇處理來解離。
「Fv」片段包含一個重鏈可變域與一個輕鏈可變域之非共價連接之二聚體。
「單鏈Fv」或「sFv」或「scFv」包括抗體之VH及VL域，其中這些域存在於單一多肽鏈中。在一個實施例中，Fv多肽進一步包含在VH與VL域之間的多肽連接子，其使scFv能夠形成抗原結合所需結構。
術語「單域抗體」或「sdAb」係指以下分子，在該分子中抗體之一個可變域在不存在另一可變域之情況下與抗原特異性結合。單域抗體及其片段描述於Arabi Ghahroudi等人, FEBS Letters, 1998, 414:521-526及Muyldermans等人, Trends in Biochem. Sci., 2001, 26:230-245，其各自以引用之方式整體併入。單域抗體亦稱為sdAb或奈米抗體。sdab相當穩定且易於呈與抗體之Fc鏈融合搭配物來表現(Harmsen MM, De Haard HJ (2007). "Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments". Appl. Microbiol Biotechnol. 77(1): 13-22)。
「抗體片段」包含完整抗體之一部分，諸如完整抗體之抗原結合區或可變區。抗體片段包括例如Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、scFv(sFv)片段及scFv-Fc片段。
在一些實施例中，蛋白結合域為包含抗體、抗體之抗原結合片段、F(ab)片段、F(ab')片段、單鏈可變片段(scFv)或單域抗體(sdAb)的抗原結合域。在一些實施例中，抗原結合域包含單鏈可變片段(scFv)。在一些實施例中，各scFv包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。在一些實施例中，VH及VL藉由肽連接子分開。
在一些實施例中，細胞外蛋白結合域包含配體結合域。配體結合域可為來自受體的域，其中受體選自由以下組成之群：TCR、BCR、細胞介素受體、RTK受體、絲胺酸/蘇胺酸激酶受體、激素受體、免疫球蛋白超家族受體及TNFR受體超家族。
結合域之選擇取決於限定靶細胞之表面的配體之類型及數量。例如，蛋白結合域可經選擇以識別充當靶細胞上與非疾病狀態(諸如「自身」正常組織)有關的細胞表面標誌物的配體。或者蛋白結合域可經選擇以識別充當靶標上與特定疾病狀態(諸如癌症或自體免疫疾病)有關的細胞表面寶植物的配體。一般而言，抑制性嵌合受體結合域可選自非疾病狀態細胞表面標誌物，而靶向腫瘤的嵌合受體結合域可選自疾病狀態細胞表面標誌物。因此，可充當本揭露之抑制性嵌合受體中之蛋白結合域之配體的細胞表面標誌物之實例包括與正常組織有關者，且可充當靶向腫瘤的嵌合受體中之蛋白結合域之配體的細胞表面標誌物之實例包括與癌細胞及/或其他形式患病細胞有關者。在一些實施例中，藉助於工程改造與非腫瘤細胞上經工程改造之核酸所編碼之抗原或蛋白特異性結合的所需抗原或蛋白結合域，將抑制性嵌合受體工程改造成靶向感興趣的非腫瘤抗原或蛋白。
在一些實施例中，細胞外蛋白結合域包含受體結合域。在一些實施例中，細胞外蛋白結合域包含抗原結合域。
與靶標或抗原決定區特異性結合的蛋白結合域(例如，配體結合域、受體結合域或抗原結合域，諸如scFv)為此項技術中所理解之術語，且確定此類特異性結合的方法亦為此項技術中已知的。若分子與特定靶抗原反應或締合與其與替代靶標反應或締合相比頻率更大、速度更快、持續時間更長及/或親和力更大，則稱該分子表現出特異性結合。與第一靶抗原特異性結合的蛋白結合域(例如，配體結合域、受體結合域或抗原結合域，諸如scFv)可與或不與第二靶抗原特異性結合。因此，特異性結合不一定需要(但是其可以包括)排他性結合。
在一些實施例中，蛋白結合域具有高結合親和力。
在一些實施例中，蛋白結合域具有低結合親和力。連接子
在一些實施例中，抑制性嵌合受體包含肽連接子。連接子一般用於連接蛋白結合域(例如，抗原結合域、配體結合域、受體結合域等)之兩種肽，諸如肽scFv或sdAb。可以使用此項技術已知的任何適當連接子，包括基於甘油-絲胺酸之連接子。在一些實施例中，scFv之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)由肽連接子分開。在一些實施例中，scFv包含結構VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH為重鏈可變域，L為肽連接子，且VL為輕鏈可變域。
在一些實施例中，抑制性嵌合受體包含肽連接子。連接子一般用於連接蛋白結合域(例如，抗原結合域、配體結合域、受體結合域等)之兩種肽，諸如肽scFv或sdAb。可以使用此項技術已知的任何適當連接子，包括基於甘油-絲胺酸之連接子。在一些實施例中，scFv之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)由肽連接子分開。在一些實施例中，scFv包含結構VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH為重鏈可變域，L為肽連接子，且VL為輕鏈可變域。在一些實施例中，肽連接子包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：GGS (SEQ ID NO: 15)、GGSGGS (SEQ ID NO: 16)、GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 17)、GGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 18)、GGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 22)、GGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 23)、GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 24)、GGGGS (SEQ ID NO: 25)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 26)、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 27)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 28)及GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 29)。在一些實施例中，肽連接子包含有包含SEQ ID NO: 30中所示之序列的核酸序列。
示範性連接子胺基酸序列展示於表 5 。示範性連接子核酸序列展示於表 6 。
表5- 示範性連接子胺基酸序列
胺基酸序列 SEQ ID NO: 描述
GGS 15 (G2 S)1 scFv連接子
GGSGGS 16 (G2 S)2 scFv連接子
GGSGGSGGS 17 (G2 S)3 scFv連接子
GGSGGSGGSGGS 18 (G2 S)4 scFv連接子
GGSGGSGGSGGSGGS 19 (G2 S)5 scFv連接子
GGGS 20 (G3 S)1 scFv連接子
GGGSGGGS 21 (G3 S)2 scFv連接子
GGGSGGGSGGGS 22 (G3 S)3 scFv連接子
GGGSGGGSGGGSGGGS 23 (G3 S)4 scFv連接子
GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS 24 (G3 S)5 scFv連接子
GGGGS 25 (G4 S)1 scFv連接子
GGGGSGGGGS 26 (G4 S)2 scFv連接子
GGGGSGGGGSGGGGS 27 (G4 S)3 scFv連接子
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 28 (G4 S)4 scFv連接子
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 29 (G4 S)5 scFv連接子
表6- 示範性連接子核酸序列
核酸序列 SEQ ID NO: 描述
GGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCT 30 (G4 S)3 scFv連接子(SEQ ID NO: 27)
間隔 / 鉸鏈
嵌合受體亦可在多肽中含有間隔或鉸鏈域。在一些實施例中，間隔域或鉸鏈域定位於抑制性嵌合受體或靶向腫瘤的嵌合受體之細胞外域(例如，包含蛋白結合域)與跨膜域之間，或定位於抑制性嵌合受體或靶向腫瘤的嵌合受體之細胞內傳訊域與跨膜域之間。間隔或鉸鏈域為起到在多肽鏈中將跨膜域連接至細胞外域及/或細胞內域的作用的任何寡肽或多肽。間隔或鉸鏈域為抑制性嵌合受體或靶向腫瘤的嵌合受體或其各域提供可撓性，或防止抑制性嵌合受體或靶向腫瘤的嵌合受體或其各域之立體阻礙。在一些實施例中，間隔域或鉸鏈域可包含至多300個胺基酸(例如，10至100個胺基酸，或5至20個胺基酸)。在一些實施例中，該一或多個間隔域可包括在抑制性嵌合受體或靶向腫瘤的嵌合受體之其他區中。
示範性間隔或鉸鏈域胺基酸序列展示於表 7 。示範性間隔或鉸鏈域核酸序列展示於表 8 。
表7- 示範性間隔或鉸鏈域胺基酸序列
胺基酸序列 SEQ ID NO: 描述
AAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP 31 CD28鉸鏈
ESKYGPPCPSCP 32 IgG4最小鉸鏈
ESKYGPPAPSAP 33 IgG4最小鉸鏈，無雙硫
ESKYGPPCPPCP 34 IgG4 S228P最小鉸鏈，雙硫形成增強
EPKSCDKTHTCP 35 IgG1最小鉸鏈
AAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN 36 延伸之CD8a鉸鏈
TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD 37 CD8a鉸鏈
ACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEADAEC 38 LNGFR鉸鏈
ACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVC 39 截短之LNGFR鉸鏈(TNFR-Cys1)
AVGQDTQEVIVVPHSLPFKV 40 PDGFR-β細胞外連接子
TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLP 70 CD8a-DAP10e鉸鏈
表8- 示範性間隔或鉸鏈域核酸序列
核酸序列 SEQ ID NO: 描述
GCAGCAGCTATCGAGGTGATGTATCCTCCGCCCTACCTGGATAATGAAAAGAGTAATGGGACTATCATTCATGTAAAAGGGAAGCATCTTTGTCCTTCTCCCCTTTTCCCCGGTCCGTCTAAACCT 41 CD28鉸鏈
GAAAGCAAGTACGGTCCACCTTGCCCTAGCTGTCCG 42 IgG4最小鉸鏈
GAATCCAAGTACGGCCCCCCAGCGCCTAGTGCCCCA 43 IgG4最小鉸鏈，無雙硫
GAATCTAAATATGGCCCGCCATGCCCGCCTTGCCCA 44 IgG4 S228P最小鉸鏈，雙硫形成增強
GAACCGAAGTCTTGTGATAAAACTCATACGTGCCCG 45 IgG1最小鉸鏈
GCTGCTGCTTTCGTACCCGTGTTCCTCCCTGCTAAGCCTACGACTACCCCCGCACCGAGACCACCCACGCCAGCACCCACGATTGCTAGCCAGCCCCTTAGTTTGCGACCAGAAGCTTGTCGGCCTGCTGCTGGTGGCGCGGTACATACCCGCGGCCTTGATTTTGCTTGCGATATATATATCTGGGCGCCTCTGGCCGGAACATGCGGGGTCCTCCTCCTTTCTCTGGTTATTACTCTCTACTGTAATCACAGGAAT 46 延伸之CD8a鉸鏈
GCCTGCCCGACCGGGCTCTACACTCATAGCGGGGAATGTTGTAAGGCATGTAACTTGGGTGAGGGCGTCGCACAGCCCTGCGGAGCTAACCAAACAGTGTGCGAACCCTGCCTCGATAGTGTGACGTTCTCTGATGTTGTATCAGCTACAGAGCCTTGCAAACCATGTACTGAGTGCGTTGGACTTCAGTCAATGAGCGCTCCATGTGTGGAGGCAGATGATGCGGTCTGTCGATGTGCTTACGGATACTACCAAGACGAGACAACAGGGCGGTGCGAGGCCTGTAGAGTTTGTGAGGCGGGCTCCGGGCTGGTGTTTTCATGTCAAGACAAGCAAAATACGGTCTGTGAAGAGTGCCCTGATGGCACCTACTCAGACGAAGCAGATGCAGAATGC 47 LNGFR鉸鏈
GCCTGCCCTACAGGACTCTACACGCATAGCGGTGAGTGTTGTAAAGCATGCAACCTCGGGGAAGGTGTAGCCCAGCCATGCGGGGCTAACCAAACCGTTTGC 48 截短之LNGFR鉸鏈(TNFR-Cys1)
GCTGTGGGCCAGGACACGCAGGAGGTCATCGTGGTGCCACACTCCTTGCCCTTTAAGGTG 49 PDGFR-β細胞外連接子
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTTGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT 79 CD8鉸鏈
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTTGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATCAGACCACACCTGGCGAGAGATCTTCCCTGCCTGCCTTCTATCCTGGCACCAGCGGCTCTTGTTCTGGCTGTGGATCACTGAGCCTGCCT 87 CD8a-DAP10e鉸鏈
GCCGCTGCTATCGAAGTGATGTACCCTCCTCCTTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGTCCTTCTCCACTGTTCCCCGGACCTAGCAAGCCT 88 CD28鉸鏈
在一些實施例中，嵌合抑制性受體進一步包含位於蛋白結合域與跨膜域之間且可操作地連接至蛋白結合域及跨膜域中之各者的間隔區。在一些實施例中，嵌合抑制性受體進一步包含位於蛋白結合域與跨膜域之間且物理連接至蛋白結合域及跨膜域中之各者的間隔區。
在一些實施例中，嵌合抑制性受體進一步包含在蛋白結合域與跨膜域之間的間隔區。
在一些實施例中，間隔區衍生自選自由以下組成之群的蛋白：CD8α、CD4、CD7、CD28、IgG1、IgG4、FcγRIIIα、LNGFR及PDGFR。在一些實施例中，間隔區包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：AAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (SEQ ID NO: 31)、ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 32)、ESKYGPPAPSAP (SEQ ID NO: 33)、ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 34)、EPKSCDKTHTCP (SEQ ID NO: 35)、AAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN (SEQ ID NO: 36)、TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 37)、ACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEADAEC (SEQ ID NO: 38)、ACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVC (SEQ ID NO: 39)、AVGQDTQEVIVVPHSLPFKV (SEQ ID NO: 40)及TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLP (SEQ ID NO: 70)。
在一些實施例中，間隔區包含與SEQ ID NO: 31有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，間隔區包含與SEQ ID NO: 32有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，間隔區包含與SEQ ID NO: 33有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，間隔區包含與SEQ ID NO: 34有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，間隔區包含與SEQ ID NO: 35有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，間隔區包含與SEQ ID NO: 36有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，間隔區包含與SEQ ID NO: 37有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，間隔區包含與SEQ ID NO: 38有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，間隔區包含與SEQ ID NO: 39有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，間隔區包含與SEQ ID NO: 40有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，間隔區包含與SEQ ID NO: 70有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，間隔區調節嵌合抑制性受體之敏感性。在一些實施例中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區增加嵌合抑制性受體之敏感性。在一些實施例中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區降低嵌合抑制性受體之敏感性。在一些實施例中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區調節嵌合抑制性受體之效力。在一些實施例中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區增加嵌合抑制性受體之效力。在一些實施例中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區降低嵌合抑制性受體之效力。在一些實施例中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區調節在免疫調節細胞上表現之靶向腫瘤的嵌合受體之活化之基礎防止、減弱或抑制。在一些實施例中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區降低基礎防止、減弱或抑制。在一些實施例中，相對於缺乏間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，間隔區增加基礎防止、減弱或抑制。
在一些實施例中，其中嵌合抑制性受體進一步包含位於跨膜域與該一或多個細胞內傳訊域中之一者之間且可操作地連接至跨膜域及細胞內傳訊域中之各者的細胞內間隔區。在一些實施例中，嵌合抑制性受體進一步包含位於跨膜域與該一或更多個細胞內傳訊域中之一者之間且物理連接至跨膜域及細胞內傳訊域中之各者的細胞內間隔區。
在一些實施例中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區調節嵌合抑制性受體之敏感性。在一些實施例中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區增加嵌合抑制性受體之敏感性。在一些實施例中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區降低嵌合抑制性受體之敏感性。在一些實施例中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區調節嵌合抑制性受體之效力。
在一些實施例中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區增加嵌合抑制性受體之效力。在一些實施例中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區降低嵌合抑制性受體的效力。在一些實施例中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，當在免疫調節細胞上表現時，細胞內間隔區調節在免疫調節細胞上表現之靶向腫瘤的嵌合受體之活化之基礎防止、減弱或抑制。在一些實施例中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區降低基礎防止、減弱或抑制。在一些實施例中，相對於缺乏細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，細胞內間隔區增加基礎防止、減弱或抑制。編碼抑制性嵌合受體的多核苷酸
本文亦呈現了編碼抑制性嵌合受體的多核苷酸或多核苷酸集合，以及包含此類多核苷酸的載體。當抑制性嵌合受體為多鏈受體時，使用多核苷酸集合。在這種情況下，可將多核苷酸集合選殖至單一載體或複數個載體中。在一些實施例中，多核苷酸包含編碼抑制性嵌合受體的序列，其中編碼細胞外蛋白結合域的序列與編碼細胞內傳訊域及跨膜域的序列鄰接並在相同的閱讀框中。
可對多核苷酸進行密碼子最佳化以在哺乳動物細胞中表現。在一些實施例中，對多核苷酸之整個序列進行密碼子最佳化以在哺乳動物細胞中表現。密碼子最佳化係指發現編碼DNA中同義密碼子(亦即，編碼相同胺基酸的密碼子)之出現頻率在不同物種中有偏差。此類密碼子簡併性使相同多肽由多種核酸序列編碼。多種密碼子最佳化方法為此項技術中已知的，且包括例如至少在美國專利第5,786,464號及第6,114,148號中所揭示之方法。
編碼抑制性嵌合受體的多核苷酸可使用此項技術中已知的重組方法(諸如像藉由篩選表現多核苷酸之細胞之文庫，藉由將其自已知包括其的載體衍生出，或藉由直接自含有其的細胞及組織分離出)來使用標準技術獲得。替代地，多核苷酸可合成產生，而不是選殖。
可將多核苷酸選殖至載體中。在一些實施例中，使用此項技術中已知的表現載體。據此，本揭露包括表現抑制性嵌合受體的反轉錄病毒及慢病毒載體，其可直接轉導至細胞中。
本揭露亦包括可直接轉導至細胞中的RNA構築體。用於生成在轉染中使用之mRNA之方法涉及用專門設計的引子體外轉錄(IVT)模板，接著添加polyA，以產生含有3'及5'未轉譯序列(「UTR」)(例如，本文所述之3'及/或5' UTR)、5'帽(例如，本文所述之5'帽)及/或內部核糖體進入位點(IRES)(例如，本文所述之IRES)、欲表現之核酸及polyA尾的構築體。如此產生之RNA可有效轉染不同種類的細胞。在一些實施例中，藉由電穿孔將RNA抑制性嵌合受體轉導至細胞(例如，T細胞或NK細胞)中。細胞
在一個態樣中，本揭露提供抑制性嵌合受體修飾之細胞。細胞可為經修飾以表現本文所述之抑制性嵌合受體的幹細胞、先驅細胞及/或免疫細胞。在一些實施例中，使用衍生自免疫細胞的細胞株。如本文所提供，細胞之非限制性實例包括間葉幹細胞(MSC)、自然殺手(NK)細胞、NKT細胞、先天性淋巴樣細胞、肥胖細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、巨噬細胞、嗜中性球、間葉幹細胞、樹突狀細胞、T細胞(例如，CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、γδ T細胞及調節性T細胞(CD4+、FOXP3+、CD25+))及B細胞。在一些實施例中，細胞為乾細胞，例如富潛能幹細胞、胚胎幹細胞、成體幹細胞、骨髓幹細胞、臍帶乾細胞或其他幹細胞。
細胞可經修飾以表現本文所提供之抑制性嵌合受體。據此，本揭露提供一種經工程改造以表現抑制性嵌合受體的細胞(例如，細胞群)，其中抑制性嵌合受體包含蛋白結合域(例如，抗原結合域、配體結合域、受體結合域等)、跨膜域及一或多個抑制性細胞內傳訊域。在一些實施例中，抑制性嵌合受體包含二或更多個細胞內傳訊域。在一些實施例中，抑制性嵌合受體包含三或更多個細胞內傳訊域。在一些實施例中，抑制性嵌合受體包含四或更多個細胞內傳訊域。在一些實施例中，抑制性嵌合受體包含五或更多個細胞內傳訊域。在一些實施例中，抑制性嵌合受體包含一個細胞內傳訊域。在一些實施例中，抑制性嵌合受體包含兩個細胞內傳訊域。在一些實施例中，抑制性嵌合受體包含三個細胞內傳訊域。在一些實施例中，抑制性嵌合受體包含四個細胞內傳訊域。在一些實施例中，抑制性嵌合受體包含五個細胞內傳訊域。
在一些實施例中，免疫調節細胞選自由以下組成之群：T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、γδ細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、調節性T細胞、病毒特異性T細胞、自然殺手T (NKT)細胞、自然殺手(NK)細胞、B細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、先天性淋巴樣細胞、肥胖細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、嗜中性球、髓樣細胞、巨噬細胞、單核球、樹突狀細胞、ESC衍生細胞及iPSC衍生細胞。在一些實施例中，免疫調節細胞為自然殺手(NK)細胞。
在一些實施例中，細胞為自體的。在一些實施例中，細胞為同種異體的。
在一些實施例中，免疫調節細胞包含嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含：細胞外蛋白結合域(例如，細胞外抗原結合域、細胞外配體結合域、細胞外受體結合域等)；跨膜域，其中跨膜域可操作地連接至細胞外蛋白結合域；及一或多個細胞內傳訊域，其中該一或多個細胞內傳訊域可操作地連接至跨膜域，且其中在蛋白(例如，配體、受體、抗原等)與嵌合抑制性受體結合之後，嵌合抑制性受體防止、減弱或抑制在細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體之活化。在一些實施例中，抑制性嵌合受體包含二或更多個細胞內傳訊域。在一些實施例中，抑制性嵌合受體包含三或更多個細胞內傳訊域。在一些實施例中，抑制性嵌合受體包含四或更多個細胞內傳訊域。在一些實施例中，抑制性嵌合受體包含五或更多個細胞內傳訊域。在一些實施例中，抑制性嵌合受體包含一個細胞內傳訊域。在一些實施例中，抑制性嵌合受體包含兩個細胞內傳訊域。在一些實施例中，抑制性嵌合受體包含三個細胞內傳訊域。在一些實施例中，抑制性嵌合受體包含四個細胞內傳訊域。在一些實施例中，抑制性嵌合受體包含五個細胞內傳訊域。
在一些實施例中，細胞進一步包含在細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體。在一些實施例中，嵌合抑制性受體經重組表現。
在一些實施例中，在蛋白(例如，配體、受體、抗原等)與嵌合抑制性受體結合之前，靶向腫瘤的嵌合受體能夠活化細胞。在一些實施例中，在蛋白(例如，配體、受體、抗原等)與嵌合抑制性受體結合之後，嵌合抑制性受體壓制經活化之細胞產生細胞介素。在一些實施例中，在蛋白(例如，配體、受體、抗原等)與嵌合抑制性受體結合之後，嵌合抑制性受體壓制對靶細胞的細胞介導之免疫反應，其中免疫反應藉由免疫調節細胞之活化來誘導。在一些實施例中，靶細胞為腫瘤細胞。在一些實施例中，靶細胞為非腫瘤細胞。表現多種嵌合受體的細胞
細胞可經修飾以表現本文所提供之抑制性嵌合受體。細胞亦可經修飾以表現抑制性嵌合受體(例如，iCAR)及靶向腫瘤的CAR (例如，aCAR)。若細胞經修飾以表現至少一種抑制性嵌合受體及至少一種靶向腫瘤的CAR，則細胞可表現多種抑制性及/或靶向腫瘤的嵌合受體蛋白及/或多核苷酸。在一些實施例中，細胞表現至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種或至少10種或更多種抑制性嵌合受體多核苷酸及/或多肽。在一些實施例中，細胞含有至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種或至少10種或更多種靶向腫瘤的嵌合受體多核苷酸及/或多肽。製備抑制性嵌合受體修飾之細胞的方法
在一個態樣中，本揭露提供一種製備包含抑制性嵌合受體之經修飾之細胞以用於實驗或治療用途的方法。
用於製備治療抑制性嵌合受體修飾之細胞的離體程序為此項技術中已知的。例如，將細胞自哺乳動物(例如，人類)分離且用表現本文所揭示之抑制性嵌合受體之載體進行基因修飾(亦即，體外轉導或轉染)。可向哺乳動物接受者投與抑制性嵌合受體修飾之細胞以提供治療益處。哺乳動物接受者可為人類，且抑制性嵌合受體修飾之細胞可關於接受者為自體的。替代地，細胞可關於接受者為同種異體、同系或異種的。用於離體擴增造血幹細胞及前驅細胞之程序描述於美國專利第5,199,942號(其以引用之方式併入本文)中且可應用於本揭露之細胞。其他合適方法為此項技術中已知的，因此本揭露不限於任何特定的離體擴增細胞的方法。簡言之，離體培養及擴增免疫效應細胞(例如，T細胞、NK細胞)包含：(1)自周邊血液收穫物或骨髓外植體收集哺乳動物之CD34+造血幹細胞及前驅細胞；及(2)離體擴增此類細胞。除美國專利第5,199,942號中所述之細胞生長因子之外，其他因子，諸如flt3-L、IL-1、IL-3及c-kit配體，亦可用於培養及擴增細胞。
在一些實施例中，方法包含將細胞群(例如，在細胞培養基中)培養至所需細胞密度(例如，對於特定基於細胞之療法來說足夠的細胞密度)。在一些實施例中，在不存在抑制可抑制蛋白酶活性的劑之情況下或在存在抑制可抑制蛋白酶活性的劑之情況下培養細胞群。
在一些實施例中，將細胞群體培養一段時間，使得產生包含至少2倍起始群體細胞數的擴增細胞群。在一些實施例中，將細胞群體培養一段時間，使得產生包含至少4倍起始群體細胞數的擴增細胞群。在一些實施例中，將細胞群體培養一段時間，使得產生包含至少16倍起始群體細胞數的擴增細胞群。使用方法
亦涵蓋用於治療免疫相關疾病諸如癌症的方法。該等方法包括投與如本文所述之抑制性嵌合受體或免疫反應性抑制性嵌合受體修飾之細胞。在一些實施例中，可向個體全身或直接提供包含嵌合受體或經基因修飾之表現此類嵌合受體的免疫反應性細胞之組成物以用於治療增生性病症，諸如癌症。
在一個態樣中，本揭露提供一種製備包含至少一種抑制性嵌合受體之經修飾之細胞(例如，抑制性嵌合受體(iCAR)修飾之細胞)以用於實驗或治療用途的方法。在一些實施例中，經修飾之免疫細胞進一步包含至少一種靶向腫瘤的嵌合受體(例如，iCAR及aCAR修飾之細胞)。
在一些態樣中，使用方法涵蓋防止、減弱或抑制藉由在免疫調節細胞之表面上表現之嵌合受體誘導之細胞介導之反應的方法，其包含：對免疫調節細胞進行工程改造，以在免疫調節細胞之表面上表現本文所述之嵌合受體，其中在同族蛋白(例如，配體、受體、抗原等)與嵌合抑制性受體結合之後，細胞內傳訊域防止、減弱或抑制嵌合受體之活化。在其他態樣中，使用方法涵蓋防止、減弱或抑制在免疫調節細胞之表面上表現之嵌合受體之活化的方法，其包含：在合適於嵌合抑制性受體結合同族蛋白(例如，配體、受體、抗原等)的條件下，將如本文所述之經分離之細胞或組成物與嵌合抑制性受體之同族蛋白(例如，配體、受體、抗原等)接觸，其中在蛋白(例如，配體、受體、抗原等)與嵌合抑制性受體結合之後，細胞內傳訊域防止、減弱或抑制嵌合受體之活化。
一般而言，抑制性嵌合受體用於防止、減弱、抑制或壓制藉由靶向腫瘤的嵌合受體(例如，活化CAR)引發之免疫反應。例如，免疫調節細胞表現識別蛋白靶標1 (例如，非腫瘤靶配體、受體、抗原等)的抑制性嵌合受體及識別蛋白靶標2 (例如，腫瘤靶抗原)的靶向腫瘤的嵌合受體。當示範性免疫調節細胞接觸靶細胞時，抑制性嵌合受體及靶向腫瘤的嵌合受體可或可不與其同族蛋白結合。在靶細胞為表現蛋白靶標1及蛋白靶標2的非腫瘤細胞的示範性情況下，抑制性嵌合受體及靶向腫瘤的受體可被活化。在此類情況下，抑制性嵌合受體之活化導致防止、減弱或抑制靶向腫瘤的嵌合受體傳訊，且免疫調節細胞未被活化。類似地，在靶細胞為僅表現蛋白靶標1的非腫瘤細胞的示範性情況下，僅抑制性嵌合受體可被活化。相比之下，在靶細胞為僅表現蛋白靶標2的腫瘤細胞的示範性情況下，抑制性嵌合受體可被活化，同時靶向腫瘤的嵌合受體可被活化，得到導致免疫調節細胞之活化的訊息轉導。
藉由靶向腫瘤的嵌合受體引發之免疫反應之減弱可為靶向腫瘤的嵌合受體之活化之降低或減少、靶向腫瘤的嵌合受體之訊息轉導之降低或減少或者免疫調節細胞之活化之降低或減少。與靶向腫瘤的嵌合受體之活化、訊號轉導或者與缺乏抑制性嵌合受體之免疫調節細胞相比的免疫調節細胞之活化相比，抑制性嵌合受體可使靶向腫瘤的嵌合受體之活化、藉由靶向腫瘤的嵌合受體之訊息轉導或藉由靶向腫瘤的受體之免疫調節細胞之活化減弱1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多。在一些實施例中，減弱係指在活化之後靶向腫瘤的嵌合受體之活性之降低或減少。
藉由靶向腫瘤的嵌合受體引發之免疫反應之防止可為靶向腫瘤的嵌合受體之活化之抑制或降低、靶向腫瘤的嵌合受體之訊息轉導之抑制或降低或者免疫調節細胞之活化之抑制或降低。與靶向腫瘤的嵌合受體之活化、訊號轉導或者與缺乏抑制性嵌合受體之免疫調節細胞相比的免疫調節細胞之活化相比，抑制性嵌合受體可使靶向腫瘤的嵌合受體之活化、藉由靶向腫瘤的嵌合受體之訊息轉導或藉由靶向腫瘤的受體之免疫調節細胞之活化防止約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多。在一些實施例中，防止係指在活化之前阻斷靶向腫瘤的嵌合受體之活性。
藉由靶向腫瘤的嵌合受體引發之免疫反應之抑制可為靶向腫瘤的嵌合受體之活化之抑制或降低、靶向腫瘤的嵌合受體之訊息轉導之抑制或降低或者免疫調節細胞之活化之抑制或降低。與靶向腫瘤的嵌合受體之活化、訊號轉導或者與缺乏抑制性嵌合受體之免疫調節細胞相比的免疫調節細胞之活化相比，抑制性嵌合受體可使靶向腫瘤的嵌合受體之活化、藉由靶向腫瘤的嵌合受體之訊息轉導或藉由靶向腫瘤的受體之免疫調節細胞之活化抑制約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多。在一些實施例中，抑制係指在活化之前或之後，靶向腫瘤的嵌合受體之活性之降低或減少。
藉由靶向腫瘤的嵌合受體引發之免疫反應之壓制可為靶向腫瘤的嵌合受體之活化之抑制或降低、靶向腫瘤的嵌合受體之訊息轉導之抑制或降低或者免疫調節細胞之活化之抑制或降低。與靶向腫瘤的嵌合受體之活化、訊號轉導或者與缺乏抑制性嵌合受體之免疫調節細胞相比的免疫調節細胞之活化相比，抑制性嵌合受體可使靶向腫瘤的嵌合受體之活化、藉由靶向腫瘤的嵌合受體之訊息轉導或藉由靶向腫瘤的受體之免疫調節細胞之活化壓制約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多。在一些實施例中，壓制係指在活化之前或之後，靶向腫瘤的嵌合受體之活性之降低或減少。
免疫反應可為經活化之免疫調節細胞產生及分泌細胞介素或趨化介素。免疫反應可為對靶細胞的細胞介導之免疫反應。
在一些實施例中，嵌合抑制性受體能夠壓制經活化之免疫調節細胞產生細胞介素。在一些實施例中，嵌合抑制性受體能夠壓制對靶細胞的細胞介導之免疫反應，其中免疫反應藉由免疫調節細胞之活化來誘導。
在一個態樣中，本揭露提供一種類型的細胞療法，在該細胞療法中，免疫細胞經基因修飾以表現本文所提供之抑制性嵌合受體，且向有需要之個體投與經修飾之免疫細胞。
因此，在一些實施例中，該等方法包含向需要基於細胞之療法的個體遞送擴增細胞群之細胞以治療疾患或病症。在一些實施例中，個體為人類個體。在一些實施例中，疾患或病症為自體免疫疾患。在一些實施例中，疾患或病症為免疫相關疾患。在一些實施例中，疾患或病症為癌症(例如，原發性癌症或轉移性癌症)。在一些實施例中，癌症為固態癌症。在一些實施例中，癌症為液態癌症，諸如骨髓性病症。醫藥組成物
可將抑制性嵌合受體或免疫反應性細胞調配於醫藥組成物中。本揭露之醫藥組成物可包含如本文所述之抑制性嵌合受體(例如，iCAR)或免疫反應性細胞(例如，複數個抑制性嵌合受體表現細胞)以及一或多種醫藥學上或生理學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。此類材料應為無毒的且應不干擾活化成分之功效。載劑或其他材料之精確性質可取決於投與途徑，例如，經口、靜脈內、皮膚或皮下、經鼻、肌內、腹膜內途徑。在某些實施例中，將組成物直接注射至感興趣的器官(例如，受病症影響之器官)中。替代地，可例如藉由向循環系統(例如，腫瘤脈管系統)中投與來將組成物間接地提供至感興趣的器官。可以在投與組成物之前、期間或之後提供擴增及分化劑以增加體外或體內T細胞、NK細胞或CTL細胞產生。
在某些實施例中，組成物為包含經基因修飾之細胞(諸如免疫反應性細胞或其前驅細胞)及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組成物。投與可為自體或異體的。例如，可自一名個體獲得免疫反應性細胞或前驅細胞，且向同一個體或不同的相容個體投與。在一些實施例中，本揭露之免疫反應性細胞或其後代可衍生自周邊血細胞(例如，體內、離體或體外衍生)且經由局部注射來投與，包括導管投與、全身注射、局部注射、靜脈內注射或腸胃外投與。當投與本揭露之治療組成物(例如，含有本揭露之經基因修飾之細胞的醫藥組成物)時，其一般以單位劑量可注射形式(溶液、懸浮液、乳液)進行調配。
本揭露之某些態樣係關於包含本揭露之嵌合受體或表現此類嵌合受體之經基因修飾之細胞(例如，本揭露之免疫反應細胞)的組成物之調配物。在一些實施例中，包含經基因修飾之細胞的本揭露之組成物可提供為無菌液體製劑，包括但不限於等滲水溶液、懸浮液、乳液、分散液及黏性組成物，其可經緩衝至選定pH。液體製劑通常比凝膠、其他黏性組成物及固體組成物更易於製備。此外，液體組成物可更便於投與，尤其藉由注射來投與。在一些實施例中，黏性組成物可經調配在適當黏度範圍內以提供與特定組織的較長接觸時間。液體或黏性組成物可包含載劑，其可為含有例如水、鹽水、磷酸緩衝鹽水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)及其合適混合物的溶劑或分散介質。
用於經口投與之醫藥組成物可為錠劑、膠囊、散劑或液體形式。錠劑可包括固體載劑諸如明膠或佐劑。液體醫藥組成物一般包括液體載劑，諸如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油。可包括生理鹽水溶液、右旋糖或其他醣溶液或二醇諸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
對於靜脈內、皮膚或皮下注射或者在患處注射，活性成分將為腸胃外可接受之水溶液之形式，其無熱原且具有合適pH、等滲性及穩定性。此項技術相關技術人員能夠使用例如等滲媒介物諸如氯化鈉注射液、林格式注射液、乳酸林格氏注射液來製備合適的溶液。需要時，可包括防腐劑、穩定劑、緩衝液、抗氧化劑及/或其他添加劑。在一些實施例中，本揭露之組成物可為等滲的，亦即，滲透壓與血液及淚液相同。在一些實施例中，所需等滲性可使用例如氯化鈉、右旋糖、硼酸、酒石酸鈉、丙二醇或其他無機或有機溶質來達成。
在一些實施例中，本揭露之組成物可進一步包括各種可增強組成物之穩定性及無菌性的添加劑。此類添加劑之實例包括但不限於抗微生物防腐劑、抗氧化劑、螯合劑及緩衝液。在一些實施例中，可藉由包括各種抗細菌及抗真菌劑(包括但不限於對羥苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸及其類似者)中任一者來防止微生物污染。可藉由使用合適的延遲吸收的劑(諸如單硬脂酸鋁及明膠)來實現本揭露之可注射醫藥調配物之延長吸收。在一些實施例中，可藉由將本揭露之經基因修飾之細胞併入按需要具有各種量任何其他成分的足夠量的適當溶劑來製備無菌可注射溶液。此類組成物可與合適載劑、稀釋劑或賦形劑諸如無菌水、生理鹽水、葡萄糖、右旋糖或其類似者混合。在一些實施例中，組成物亦可經凍乾。根據投與途徑及所需製劑，組成物可含有輔助物質，諸如潤濕劑、分散劑、pH緩衝劑及抗微生物劑。
在一些實施例中，本揭露之調配物之組分經選擇為化學惰性的且不影響本揭露之經基因修飾之細胞之生存力或功效。
關於揭露之經基因修飾之細胞之治療用途的一個考量為達成最佳功效所需的細胞之量。在一些實施例中，欲投與之細胞之量將因治療之個體而不同。在某些實施例中，向有需要之個體投與之經基因修飾之細胞之量之範圍可為1 × 104 個細胞至1 × 1010 個細胞。在一些實施例中，視為有效劑量的細胞之精確量可基於各個體之個別因素，包括其體型、年齡、性別、體重及特定個體之狀況。熟習此項技術者可基於本揭露及此項技術之知識而容易地確定劑量。
無論是多肽、抗體、核酸、小分子還是向個體給予的其他根據本發明的醫藥學上可用的化合物，投與較佳以「治療有效量」或「預防有效量」(正如可能出現的情況那樣，但是可將預防視為治療)，這足以展示對個體有益。所投與之準確量及投與速率及時程將取決於正治療之蛋白聚集疾病之性質及嚴重性。治療處方，例如劑量決定等，為全科醫生及其他醫學醫師責任，且通常考慮到欲治療之病症、個別患者之狀況、遞送部位、投與方法及從業人員已知的其他因素。上文提及之技術及方案之實例可見於Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版, Osol, A. (編), 1980。
組成物可單獨投與或與其他治療劑組合根據欲治療之疾患同時或依序投與。套組
本揭露之某些態樣係關於用於治療及/或預防癌症或其他疾病(例如，免疫相關或自體免疫疾病)的套組。在某些實施例中，套組包括治療或預防組成物，其包含有效量的一或多種本揭露之嵌合受體、本揭露之經分離之核酸、本揭露之載體及/或本揭露之細胞(例如，免疫反應性細胞)。在一些實施例中，套組包含無菌容器。在一些實施例中，此類容器可為盒子、安瓿、瓶子、小瓶、管、袋、囊、泡鼓包裝或此項技術中已知的其他合適容器。容器可由塑膠、玻璃、層壓紙、金屬箔或合適於盛裝藥劑的其他材料製成。
在一些實施例中，提供了治療或預防組成物，以及用於將治療或預防組成物向患有癌症或免疫相關病症或處於其風險中的個體投與的說明書。在一些實施例中，說明書可包括關於組成物用於治療及/或預防疾病的用途的資訊。在一些實施例中，說明書包括但不限於治療或預防性組成物之描述、劑量排程、用於治療或預防病症或其症狀的投與排程、注意事項、警告、適應症、禁忌症、 劑量過量資訊、不良反應、動物藥理學、臨床研究及/或參考文獻。在一些實施例中，說明書可直接在容器(存在時)上、或者作為施加至容器的標籤、或者作為在容器中或與其一起供應的單獨片材、小冊子、卡片或摺頁來印刷。額外實施例
下文提供描述本發明之特定實施例的枚舉實施例：實施例 1 ： 一種嵌合抑制性受體，其包含： - 細胞外蛋白結合域， - 跨膜域，其中該跨膜域可操作地連接至該細胞外蛋白結合域，及 - 細胞內傳訊域，其中該細胞內傳訊域可操作地連接至該跨膜域；且 其中該細胞內傳訊域能夠防止、減弱或抑制在免疫調節細胞上表現之靶向腫瘤的嵌合受體之活化。實施例 2 ： 如實施例1之嵌合抑制性受體，其中該細胞內傳訊域衍生自選自由以下組成之群的蛋白：BTLA、PD-1、CTLA4、TIM3、KIR3DL1、LIR1、NKG2A、TIGIT及LAG3。實施例 3 ： 如實施例1或實施例2之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域及該細胞內傳訊域衍生自相同蛋白。實施例 4 ： 如實施例3之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域進一步包含相同蛋白之細胞外域之至少一部分。實施例 5 ： 如實施例1或實施例2之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域衍生自第一蛋白，且該細胞內傳訊域衍生自與該第一蛋白不同的第二蛋白。實施例 6 ： 如實施例1-5中任一項之嵌合抑制性受體，其中該細胞內傳訊域衍生自BTLA。實施例 7 ： 如實施例6之嵌合抑制性受體，其中該細胞內傳訊域包含與RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS (SEQ ID NO: 3)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。實施例 8 ： 如實施例6之嵌合抑制性受體，其中該細胞內傳訊域包含胺基酸序列RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS (SEQ ID NO: 3)。實施例 9 ： 如實施例1-5中任一項之嵌合抑制性受體，其中該細胞內傳訊域衍生自LIR1。實施例 10 ： 如實施例9之嵌合抑制性受體，其中該細胞內傳訊域包含與LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 50)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。實施例 11 ： 如實施例9之嵌合抑制性受體，其中該細胞內傳訊域包含胺基酸序列LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 50)。實施例 12 ： 如實施例1-5中任一項之嵌合抑制性受體，其中該細胞內傳訊域衍生自KIR3DL1。實施例 13 ： 如實施例12之嵌合抑制性受體，其中該細胞內傳訊域包含與HLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP (SEQ ID NO: 66)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。實施例 14 ： 如實施例12之嵌合抑制性受體，其中該細胞內傳訊域包含胺基酸序列HLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP (SEQ ID NO: 66)。實施例 15 ： 如實施例1-5中任一項之嵌合抑制性受體，其中該細胞內傳訊域衍生自PD-1。實施例 16 ： 如實施例15之嵌合抑制性受體，其中該細胞內傳訊域包含與CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL (SEQ ID NO: 1)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。實施例 17 ： 如實施例15之嵌合抑制性受體，其中該細胞內傳訊域包含胺基酸序列CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL (SEQ ID NO: 1)。實施例 18 ： 如實施例1-5中任一項之嵌合抑制性受體，其中該細胞內傳訊域衍生自CTLA4。實施例 19 ： 如實施例18之嵌合抑制性受體，其中該細胞內傳訊域包含與AVSLSKMLKKRSPLTTGVGVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN (SEQ ID NO: 67)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。實施例 20 ： 如實施例18之嵌合抑制性受體，其中該細胞內傳訊域包含胺基酸序列AVSLSKMLKKRSPLTTGVGVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN (SEQ ID NO: 67)。實施例 21 ： 如實施例1-20中任一項之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域衍生自選自由以下組成之群的蛋白：BTLA、CD8、CD28、CD3ζ、CD4、4-IBB、OX40、ICOS、2B4、CD25、CD7、LAX、LAT、PD-1、CTLA4、TIM3、KIR3DL1、LIR1、NKG2A、TIGIT及LAG3。實施例 22 ： 如實施例1-20中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含衍生自BTLA的跨膜域。實施例 23 ： 如實施例22之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含與LLPLGGLPLLITTCFCLFCCL (SEQ ID NO: 12)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。實施例 24 ： 如實施例22之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含胺基酸序列LLPLGGLPLLITTCFCLFCCL (SEQ ID NO: 12)。實施例 25 ： 如實施例22-24中任一項之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域進一步包含該BTLA細胞外域之至少一部分。實施例 26 ： 如實施例1-20中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含衍生自PD-1的跨膜域。實施例 27 ： 如實施例26之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含與VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI (SEQ ID NO: 60)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。實施例 28 ： 如實施例26之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含胺基酸序列VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI (SEQ ID NO: 60)。實施例 29 ： 如實施例26-28中任一項之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域進一步包含該PD-1細胞外域之至少一部分。實施例 30 ： 如實施例1-20中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含衍生自CTLA4的跨膜域。實施例 31 ： 如實施例30之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含與DFLLWILAAVSSGLFFYSFLLT (SEQ ID NO: 68)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。實施例 32 ： 如實施例30之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含胺基酸序列DFLLWILAAVSSGLFFYSFLLT (SEQ ID NO: 68)。實施例 33 ： 如實施例30-32中任一項之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域進一步包含該CTLA4細胞外域之至少一部分。實施例 34 ： 如實施例1-20中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含衍生自KIR3DL1的跨膜域。實施例 35 ： 如實施例34之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含與ILIGTSVVIILFILLLFFLL (SEQ ID NO: 69)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。實施例 36 ： 如實施例34之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含胺基酸序列ILIGTSVVIILFILLLFFLL (SEQ ID NO: 69)。實施例 37 ： 如實施例34-36中任一項之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域進一步包含該KIR3DL1細胞外域之至少一部分。實施例 38 ： 如實施例1-20中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含衍生自LIR1的跨膜域。實施例 39 ： 如實施例38之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含與VIGILVAVILLLLLLLLLFLI (SEQ ID NO: 59)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。實施例 40 ： 如實施例38之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含胺基酸序列VIGILVAVILLLLLLLLLFLI (SEQ ID NO: 59)。實施例 41 ： 如實施例38-40中任一項之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域進一步包含該LIR1細胞外域之至少一部分。實施例 42 ： 如實施例1-20中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含衍生自CD28的跨膜域。實施例 43 ： 如實施例42之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含與FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 11)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。實施例 44 ： 如實施例42之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含胺基酸序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 11)。實施例 45 ： 如實施例42-44中任一項之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域進一步包含該CD28細胞外域之至少一部分。實施例 46 ： 如實施例1-45中任一項之嵌合抑制性受體，其中該蛋白不在靶腫瘤上表現。實施例 47 ： 如實施例1-46中任一項之嵌合抑制性受體，其中該蛋白在非腫瘤細胞上表現。實施例 48 ： 如實施例47之嵌合抑制性受體，其中該蛋白在衍生自選自由以下組成之群的組織的非腫瘤細胞上表現：腦、神經元組織、內分泌、內皮、骨、骨髓、免疫系統、肌肉、肺、肝、膽囊、胰臟、胃腸道、腎臟、膀胱、雄性生殖器、雌性生殖器、脂肪、軟組織及皮膚。實施例 49 ： 如實施例1-48中任一項之嵌合抑制性受體，其中該細胞外蛋白結合域包含配體結合域。實施例 50 ： 如實施例1-48中任一項之嵌合抑制性受體，其中該細胞外蛋白結合域包含受體結合域。實施例 51 ： 如實施例1-48中任一項之嵌合抑制性受體，其中該細胞外蛋白結合域包含抗原結合域。實施例 52 ： 如實施例51之嵌合抑制性受體，其中該抗原結合域包含抗體、抗體之抗原結合片段、F(ab)片段、F(ab')片段、單鏈可變片段(scFv)或單域抗體(sdAb)。實施例 53 ： 如實施例51之嵌合抑制性受體，其中該抗原結合域包含單鏈可變片段(scFv)。實施例 54 ： 如實施例53之嵌合抑制性受體，其中各scFv包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。實施例 55 ： 如實施例54之嵌合抑制性受體，其中該VH及VL藉由肽連接子分開。實施例 56 ： 如實施例55之嵌合抑制性受體，其中該肽連接子包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：GGS (SEQ ID NO: 15)、GGSGGS (SEQ ID NO: 16)、GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 17)、GGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 18)、GGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 22)、GGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 23)、GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 24)、GGGGS (SEQ ID NO: 25)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 26)、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 27)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 28)及GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 29)。實施例 57 ： 如實施例54-56中任一項之嵌合抑制性受體，其中該scFv包含結構VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH為重鏈可變域，L為肽連接子，且VL為輕鏈可變域。實施例 58 ： 如實施例1-57中任一項之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域物理連接至該細胞外蛋白結合域。實施例 59 ： 如實施例1-58中任一項之嵌合抑制性受體，其中該細胞內傳訊域物理連接至該跨膜域。實施例 60 ： 如實施例1-57中任一項之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域物理連接至該細胞外蛋白結合域，且該細胞內傳訊域物理連接至該跨膜域。實施例 61 ： 如實施例1-60中任一項之嵌合抑制性受體，其中該細胞外蛋白結合域具有高結合親和力。實施例 62 ： 如實施例1-60中任一項之嵌合抑制性受體，其中該細胞外蛋白結合域具有低結合親和力。實施例 63 ： 如實施例1-62中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體能夠壓制經活化之免疫調節細胞產生細胞介素。實施例 64 ： 如實施例1-63中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體能夠壓制對靶細胞的細胞介導之免疫反應，其中該免疫反應藉由該免疫調節細胞之活化來誘導。實施例 65 ： 如實施例1-64中任一項之嵌合抑制性受體，其中該靶細胞為腫瘤細胞。實施例 66 ： 如實施例1-65中任一項之嵌合抑制性受體，其中該細胞內傳訊域包含一或多個修飾。實施例 67 ： 如實施例66之嵌合抑制性受體，其中相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾調節該嵌合抑制性受體之敏感性。實施例 68 ： 如實施例66之嵌合抑制性受體，其中相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾增加該嵌合抑制性受體之敏感性。實施例 69 ： 如實施例66之嵌合抑制性受體，其中相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾降低該嵌合抑制性受體之敏感性。實施例 70 ： 如實施例66-69中任一項之嵌合抑制性受體，其中相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾調節該嵌合抑制性受體之效力。實施例 71 ： 如實施例70之嵌合抑制性受體，其中相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾增加該嵌合抑制性受體之效力。實施例 72 ： 如實施例70之嵌合抑制性受體，其中相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾降低該嵌合抑制性受體之效力。實施例 73 ： 如實施例66-72中任一項之嵌合抑制性受體，其中相對於其他方面相同的未經修飾之受體，當在免疫調節細胞上表現時，該一或多個修飾調節該靶向腫瘤的嵌合受體之活化之基礎防止、減弱或抑制。實施例 74 ： 如實施例73之嵌合抑制性受體，其中相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾降低基礎防止、減弱或抑制。實施例 75 ： 如實施例73之嵌合抑制性受體，其中相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾增加基礎防止、減弱或抑制。實施例 76 ： 如實施例1-75中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體進一步包含位於該細胞外蛋白結合域與該跨膜域之間且可操作地連接至該細胞外蛋白結合域及該跨膜域中之各者的間隔區。實施例 77 ： 如實施例1-75中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體進一步包含位於該細胞外蛋白結合域與該跨膜域之間且物理連接至該細胞外蛋白結合域及該跨膜域中之各者的間隔區。實施例 78 ： 如實施例76或實施例77之嵌合抑制性受體，其中該間隔區衍生自選自由以下組成之群的蛋白：CD8α、CD4、CD7、CD28、IgG1、IgG4、FcγRIIIα、LNGFR及PDGFR。實施例 79 ： 如實施例76或實施例77之嵌合抑制性受體，其中該間隔區包含選自由以下組成之群的序列：AAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (SEQ ID NO: 31)、ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 32)、ESKYGPPAPSAP (SEQ ID NO: 33)、ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 34)、EPKSCDKTHTCP (SEQ ID NO: 35)、AAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN (SEQ ID NO: 36)、TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 37)、ACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEADAEC (SEQ ID NO: 38)、ACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVC (SEQ ID NO: 39)、AVGQDTQEVIVVPHSLPFKV (SEQ ID NO: 40)及TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLP (SEQ ID NO: 70)。實施例 80 ： 如實施例76-79中任一項之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該間隔區調節該嵌合抑制性受體之敏感性。實施例 81 ： 如實施例80之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該間隔區增加該嵌合抑制性受體之敏感性。實施例 82 ： 如實施例80之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該間隔區降低該嵌合抑制性受體之敏感性。實施例 83 ： 如實施例76-82中任一項之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該間隔區調節該嵌合抑制性受體之效力。實施例 84 ： 如實施例83之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該間隔區增加該嵌合抑制性受體之效力。實施例 85 ： 如實施例83之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該間隔區降低該嵌合抑制性受體之效力。實施例 86 ： 如實施例76-85中任一項之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，當在免疫調節細胞上表現時，該間隔區調節該靶向腫瘤的嵌合受體之活化之基礎防止、減弱或抑制。實施例 87 ： 如實施例86之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該間隔區降低基礎防止、減弱或抑制。實施例 88 ： 如實施例86之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該間隔區增加基礎防止、減弱或抑制。實施例 89 ： 如實施例1-88中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體進一步包含位於該跨膜域與該細胞內傳訊域之間且可操作地連接至該跨膜域及該細胞內傳訊域中之各者的細胞內間隔區。實施例 90 ： 如實施例1-88中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體進一步包含位於該跨膜域與該細胞內傳訊域之間且物理連接至該跨膜域及該細胞內傳訊域中之各者的細胞內間隔區。實施例 91 ： 如實施例89或實施例90之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該細胞內間隔區調節該嵌合抑制性受體之敏感性。實施例 92 ： 如實施例91之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該細胞內間隔區增加該嵌合抑制性受體之敏感性。實施例 93 ： 如實施例91之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該細胞內間隔區降低該嵌合抑制性受體之敏感性。實施例 94 ： 如實施例89-93中任一項之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該細胞內間隔區調節該嵌合抑制性受體之效力。實施例 95 ： 如實施例94之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該細胞內間隔區增加該嵌合抑制性受體之效力。實施例 96 ： 如實施例94之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該細胞內間隔區降低該嵌合抑制性受體之效力。實施例 97 ： 如實施例89-96中任一項之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，當在免疫調節細胞上表現時，該細胞內間隔區調節該靶向腫瘤的嵌合受體之活化之基礎防止、減弱或抑制。實施例 98 ： 如實施例97之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該細胞內間隔區降低基礎防止、減弱或抑制。實施例 99 ： 如實施例97之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該細胞內間隔區增加基礎防止、減弱或抑制。實施例 100 ： 如實施例1-99中任一項之嵌合抑制性受體，其中該抑制性嵌合受體進一步包含酶抑制性域。實施例 101 ： 如實施例100之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該酶抑制性域的其他方面相同的嵌合抑制性受體，當在免疫調節細胞上表現時，該酶抑制性域能夠防止、減弱或抑制靶向腫瘤的嵌合受體之活化。實施例 102 ： 如實施例100或實施例101之嵌合抑制性受體，其中該酶抑制性域包含酶催化域。實施例 103 ： 如實施例102之嵌合抑制性受體，其中該酶催化域衍生自選自由以下組成之群的酶：CSK、SHP-1、PTEN、CD45、CD148、PTP-MEG1、PTP-PEST、c-CBL、CBL-b、PTPN22、LAR、PTPH1、SHIP-1及RasGAP。實施例 104 ： 如實施例100-103中任一項之嵌合抑制性受體，其中該酶抑制性域包含一或多個修飾，相對於缺乏該一或多個修飾的其他方面相同的酶抑制性域，該一或多個修飾調節基礎防止、減弱或抑制。實施例 105 ： 如實施例104之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該酶抑制性域的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該一或多個修飾降低該嵌合抑制性受體之基礎防止、減弱或抑制。實施例 106 ： 如實施例104之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該酶抑制性域的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該一或多個修飾增加該嵌合抑制性受體之基礎防止、減弱或抑制。實施例 107 ： 如實施例1-106中任一項之嵌合抑制性受體，其中該靶向腫瘤的嵌合受體為靶向腫瘤的嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體(TCR)。實施例 108 ： 如實施例1-107中任一項之嵌合抑制性受體，其中該免疫調節細胞選自由以下組成之群：T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、γδ細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、調節性T細胞、病毒特異性T細胞、自然殺手T (NKT)細胞、自然殺手(NK)細胞、B細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、先天性淋巴樣細胞、肥胖細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、嗜中性球、髓樣細胞、巨噬細胞、單核球、樹突狀細胞、ESC衍生細胞及iPSC衍生細胞。實施例 109 ： 如實施例1-108中任一項之嵌合抑制性受體，其中該免疫調節細胞為自然殺手(NK)細胞。實施例 110 ： 一種嵌合抑制性受體，其包含： - 細胞外蛋白結合域， - 跨膜域，其中該跨膜域可操作地連接至該細胞外蛋白結合域，及 - 二或更多個細胞內傳訊域，其中該二或更多個細胞內傳訊域可操作地連接至該跨膜域；且 其中該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者能夠防止、減弱或抑制在免疫調節細胞上表現之靶向腫瘤的嵌合受體之活化。實施例 111 ： 如實施例110之嵌合抑制性受體，其中該二或更多個細胞內傳訊域各自衍生自選自由以下組成之群的蛋白：BTLA、PD-1、CTLA4、TIM3、KIR3DL1、LIR1、NKG2A、TIGIT及LAG3。實施例 112 ： 如實施例110或實施例111之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域衍生自與該二或更多個細胞內傳訊域中之一者相同的蛋白。實施例 113 ： 如實施例112之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域進一步包含相同蛋白之細胞外域之至少一部分。實施例 114 ： 如實施例110或實施例111之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域衍生自第一蛋白，且該二或更多個細胞內傳訊域衍生自與該第一蛋白不同的蛋白。實施例 115 ： 如實施例110-114中任一項之嵌合抑制性受體，其中該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者衍生自BTLA。實施例 116 ： 如實施例115之嵌合抑制性受體，其中該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者包含與RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS (SEQ ID NO: 3)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。實施例 117 ： 如實施例115之嵌合抑制性受體，其中該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者包含胺基酸序列RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS (SEQ ID NO: 3)。實施例 118 ： 如實施例110-114中任一項之嵌合抑制性受體，其中該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者衍生自LIR1。實施例 119 ： 如實施例118之嵌合抑制性受體，其中該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者包含與LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 50 )有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。實施例 120 ： 如實施例118之嵌合抑制性受體，其中該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者包含胺基酸序列LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 50 )。實施例 121 ： 如實施例110-114中任一項之嵌合抑制性受體，其中該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者衍生自PD-1。實施例 122 ： 如實施例121之嵌合抑制性受體，其中該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者包含與CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL (SEQ ID NO: 1)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。實施例 123 ： 如實施例121之嵌合抑制性受體，其中該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者包含胺基酸序列CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL (SEQ ID NO: 1)。實施例 124 ： 如實施例110-114中任一項之嵌合抑制性受體，其中該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者衍生自KIR3DL1。實施例 125 ： 如實施例124之嵌合抑制性受體，其中該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者包含與HLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP (SEQ ID NO: 66)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。實施例 126 ： 如實施例124之嵌合抑制性受體，其中該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者包含胺基酸序列HLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP (SEQ ID NO: 66)。實施例 127 ： 如實施例110-114中任一項之嵌合抑制性受體，其中該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者衍生自CTLA4。實施例 128 ： 如實施例127之嵌合抑制性受體，其中該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者包含與AVSLSKMLKKRSPLTTGVGVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN (SEQ ID NO: 67)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。實施例 129 ： 如實施例127之嵌合抑制性受體，其中該細胞內傳訊域包含胺基酸序列AVSLSKMLKKRSPLTTGVGVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN (SEQ ID NO: 67)。實施例 130 ： 如實施例110-129中任一項之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域衍生自選自由以下組成之群的蛋白：BTLA、CD8、CD28、CD3ζ、CD4、4-IBB、OX40、ICOS、2B4、CD25、CD7、LAX、LAT、PD-1、CTLA4、TIM3、KIR3DL1、LIR1、NKG2A、TIGIT及LAG3。實施例 131 ： 如實施例110-130中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含衍生自BTLA的跨膜域。實施例 132 ： 如實施例131之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含與LLPLGGLPLLITTCFCLFCCL (SEQ ID NO: 12)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。實施例 133 ： 如實施例131之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含胺基酸序列LLPLGGLPLLITTCFCLFCCL (SEQ ID NO: 12)。實施例 134 ： 如實施例131-133中任一項之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域進一步包含該BTLA細胞外域之至少一部分。實施例 135 ： 如實施例110-130中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含衍生自LIR1的跨膜域。實施例 136 ： 如實施例135之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含與VIGILVAVILLLLLLLLLFLI (SEQ ID NO: 59)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。實施例 137 ： 如實施例135之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含胺基酸序列VIGILVAVILLLLLLLLLFLI (SEQ ID NO: 59)。實施例 138 ： 如實施例135-137中任一項之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域進一步包含該LIR1細胞外域之至少一部分。實施例 139 ： 如實施例110-130中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含衍生自PD-1的跨膜域。實施例 140 ： 如實施例139之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含與VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI (SEQ ID NO: 60)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。實施例 141 ： 如實施例139之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含胺基酸序列VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI (SEQ ID NO: 60)。實施例 142 ： 如實施例139-141中任一項之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域進一步包含該PD-1細胞外域之至少一部分。實施例 143 ： 如實施例110-130中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含衍生自CTLA4的跨膜域。實施例 144 ： 如實施例143之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含與DFLLWILAAVSSGLFFYSFLLT (SEQ ID NO: 68)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。實施例 145 ： 如實施例143之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含胺基酸序列DFLLWILAAVSSGLFFYSFLLT (SEQ ID NO: 68)。實施例 146 ： 如實施例143-145中任一項之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域進一步包含該CTLA4細胞外域之至少一部分。實施例 147 ： 如實施例110-130中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含衍生自KIR3DL1的跨膜域。實施例 148 ： 如實施例147之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含與ILIGTSVVIILFILLLFFLL (SEQ ID NO: 69)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。實施例 149 ： 如實施例147之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含胺基酸序列ILIGTSVVIILFILLLFFLL (SEQ ID NO: 69)。實施例 150 ： 如實施例147-149中任一項之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域進一步包含該KIR3DL1細胞外域之至少一部分。實施例 151 ： 如實施例110-130中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含衍生自CD28的跨膜域。實施例 152 ： 如實施例151之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含與FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 11)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。實施例 153 ： 如實施例151之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域包含胺基酸序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 11)。實施例 154 ： 如實施例151-153中任一項之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域進一步包含該CD28細胞外域之至少一部分。實施例 155 ： 如實施例110-154中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含衍生自LIR1的第一細胞內傳訊域及衍生自BTLA的第二細胞內傳訊域。實施例 156 ： 如實施例110-154中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含衍生自LIR1的第一細胞內傳訊域及衍生自PD-1的第二細胞內傳訊域。實施例 157 ： 如實施例110-154中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含衍生自LIR1的第一細胞內傳訊域及衍生自KIR3DL1的第二細胞內傳訊域。實施例 158 ： 如實施例110-154中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含衍生自LIR1的第一細胞內傳訊域及衍生自LIR1的第二細胞內傳訊域。實施例 159 ： 如實施例155-158中任一項之嵌合抑制性受體，其中該第一細胞內傳訊域進一步包含衍生自LIR1的跨膜域。實施例 160 ： 如實施例110-154中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含衍生自BTLA的第一細胞內傳訊域及衍生自LIR1的第二細胞內傳訊域。實施例 161 ： 如實施例110-154中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含衍生自BTLA的第一細胞內傳訊域及衍生自PD-1的第二細胞內傳訊域。實施例 162 ： 如實施例160或實施例161之嵌合抑制性受體，其中該第一細胞內傳訊域進一步包含衍生自BTLA的跨膜域。實施例 163 ： 如實施例110-154中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含衍生自PD-1的第一細胞內傳訊域及衍生自LIR1的第二細胞內傳訊域。實施例 164 ： 如實施例110-154中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含衍生自PD-1的第一細胞內傳訊域及衍生自BTLA的第二細胞內傳訊域。實施例 165 ： 如實施例163或實施例164之嵌合抑制性受體，其中該第一細胞內傳訊域進一步包含衍生自PD-1的跨膜域。實施例 166 ： 如實施例110-154中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含衍生自KIR3DL1的第一細胞內傳訊域及衍生自LIR1的第二細胞內傳訊域。實施例 167 ： 如實施例110-154中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含衍生自KIR3DL1的第一細胞內傳訊域及衍生自KIR3DL1的第二細胞內傳訊域。實施例 168 ： 如實施例166或實施例167之嵌合抑制性受體，其中該第一細胞內傳訊域進一步包含衍生自KIR3DL1的跨膜域。實施例 169 ： 如實施例110-168中任一項之嵌合抑制性受體，其中該蛋白不在靶腫瘤上表現。實施例 170 ： 如實施例110-169中任一項之嵌合抑制性受體，其中該蛋白在非腫瘤細胞上表現。實施例 171 ： 如實施例170之嵌合抑制性受體，其中該蛋白在衍生自選自由以下組成之群的組織的非腫瘤細胞上表現：腦、神經元組織、內分泌、內皮、骨、骨髓、免疫系統、肌肉、肺、肝、膽囊、胰臟、胃腸道、腎臟、膀胱、雄性生殖器、雌性生殖器、脂肪、軟組織及皮膚。實施例 172 ： 如實施例110-171中任一項之嵌合抑制性受體，其中該細胞外蛋白結合域包含配體結合域。實施例 173 ： 如實施例110-171中任一項之嵌合抑制性受體，其中該細胞外蛋白結合域包含受體結合域。實施例 174 ： 如實施例110-171中任一項之嵌合抑制性受體，其中該細胞外蛋白結合域包含抗原結合域。實施例 175 ： 如實施例174之嵌合抑制性受體，其中該抗原結合域包含抗體、抗體之抗原結合片段、F(ab)片段、F(ab')片段、單鏈可變片段(scFv)或單域抗體(sdAb)。實施例 176 ： 如實施例174之嵌合抑制性受體，其中該抗原結合域包含單鏈可變片段(scFv)。實施例 177 ： 如實施例176之嵌合抑制性受體，其中各scFv包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。實施例 178 ： 如實施例177之嵌合抑制性受體，中該VH及VL藉由肽連接子分開。實施例 179 ： 如實施例178之嵌合抑制性受體，其中該肽連接子包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：GGS (SEQ ID NO: 15)、GGSGGS (SEQ ID NO: 16)、GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 17)、GGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 18)、GGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 22)、GGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 23)、GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 24)、GGGGS (SEQ ID NO: 25)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 26)、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 27)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 28)及GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 29)。實施例 180 ： 如實施例177-179中任一項之嵌合抑制性受體，其中該scFv包含結構VH-L-VL或VL-L-VH，其中VH為重鏈可變域，L為肽連接子，且VL為輕鏈可變域。實施例 181 ： 如實施例110-180中任一項之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域物理連接至該細胞外蛋白結合域。實施例 182 ： 如實施例110-181中任一項之嵌合抑制性受體，其中該二或更多個細胞內傳訊域中之一者物理連接至該跨膜域。實施例 183 ： 如實施例110-171中任一項之嵌合抑制性受體，其中該跨膜域物理連接至該細胞外蛋白結合域，且該二或更多個細胞內傳訊域中之一者物理連接至該跨膜域。實施例 184 ： 如實施例110-183中任一項之嵌合抑制性受體，其中該細胞外蛋白結合域具有高結合親和力。實施例 185 ： 如實施例110-183中任一項之嵌合抑制性受體，其中該細胞外蛋白結合域具有低結合親和力。實施例 186 ： 如實施例110-185中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體能夠壓制經活化之免疫調節細胞產生細胞介素。實施例 187 ： 如實施例110-186中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體能夠壓制對靶細胞的細胞介導之免疫反應，其中該免疫反應藉由該免疫調節細胞之活化來誘導。實施例 188 ： 如實施例110-187中任一項之嵌合抑制性受體，其中該靶細胞為腫瘤細胞。實施例 189 ： 如實施例110-188中任一項之嵌合抑制性受體，其中該二或更多個細胞內傳訊域中之至少一者包含一或多個修飾。實施例 190 ： 如實施例189之嵌合抑制性受體，其中相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾調節該嵌合抑制性受體之敏感性。實施例 191 ： 如實施例189之嵌合抑制性受體，其中相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾增加該嵌合抑制性受體之敏感性。實施例 192 ： 如實施例189之嵌合抑制性受體，其中相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾降低該嵌合抑制性受體之敏感性。實施例 193 ： 如實施例189-192中任一項之嵌合抑制性受體，其中相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾調節該嵌合抑制性受體之效力。實施例 194 ： 如實施例193之嵌合抑制性受體，其中相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾增加該嵌合抑制性受體之效力。實施例 195 ： 如實施例193之嵌合抑制性受體，其中相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾降低該嵌合抑制性受體之效力。實施例 196 ： 如實施例189-195中任一項之嵌合抑制性受體，其中相對於其他方面相同的未經修飾之受體，當在免疫調節細胞上表現時，該一或多個修飾調節該靶向腫瘤的嵌合受體之活化之基礎防止、減弱或抑制。實施例 197 ： 如實施例196之嵌合抑制性受體，其中相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾降低基礎防止、減弱或抑制。實施例 198 ： 如實施例196之嵌合抑制性受體，其中相對於其他方面相同的未經修飾之受體，該一或多個修飾增加基礎防止、減弱或抑制。實施例 199 ： 如實施例110-198中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體進一步包含位於該細胞外蛋白結合域與該跨膜域之間且可操作地連接至該細胞外蛋白結合域及該跨膜域中之各者的間隔區。實施例 200 ： 如實施例110-198中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體進一步包含位於該細胞外蛋白結合域與該跨膜域之間且物理連接至該細胞外蛋白結合域及該跨膜域中之各者的間隔區。實施例 201 ： 如實施例199或實施例200之嵌合抑制性受體，其中該間隔區衍生自選自由以下組成之群的蛋白：CD8α、CD4、CD7、CD28、IgG1、IgG4、FcγRIIIα、LNGFR及PDGFR。實施例 202 ： 如實施例199或實施例200之嵌合抑制性受體，其中該間隔區包含選自由以下組成之群的序列：AAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (SEQ ID NO: 31)、ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 32)、ESKYGPPAPSAP (SEQ ID NO: 33)、ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 34)、EPKSCDKTHTCP (SEQ ID NO: 35)、AAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN (SEQ ID NO: 36)、TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 37)、ACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEADAEC (SEQ ID NO: 38)、ACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVC (SEQ ID NO: 39)、AVGQDTQEVIVVPHSLPFKV (SEQ ID NO: 40)及TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLP (SEQ ID NO: 70)。實施例 203 ： 如實施例199-202中任一項之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該間隔區調節該嵌合抑制性受體之敏感性。實施例 204 ： 如實施例203之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該間隔區增加該嵌合抑制性受體之敏感性。實施例 205 ： 如實施例203之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該間隔區降低該嵌合抑制性受體之敏感性。實施例 206 ： 如實施例199-205中任一項之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該間隔區調節該嵌合抑制性受體之效力。實施例 207 ： 如實施例206之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該間隔區增加該嵌合抑制性受體之效力。實施例 208 ： 如實施例206之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該間隔區降低該嵌合抑制性受體之效力。實施例 209 ： 如實施例199-208中任一項之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，當在免疫調節細胞上表現時，該間隔區調節該靶向腫瘤的嵌合受體之活化之基礎防止、減弱或抑制。實施例 210 ： 如實施例209之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該間隔區降低基礎防止、減弱或抑制。實施例 211 ： 如實施例209之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該間隔區增加基礎防止、減弱或抑制。實施例 212 ： 如實施例110-211中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體進一步包含位於該跨膜域與該二或更多個細胞內傳訊域中之一者之間且可操作地連接至該跨膜域及該細胞內傳訊域中之各者的細胞內間隔區。實施例 213 ： 如實施例110-211中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體進一步包含位於該跨膜域與該二或更多個細胞內傳訊域中之一者之間且物理連接至該跨膜域及該細胞內傳訊域中之各者的細胞內間隔區。實施例 214 ： 如實施例212或實施例213之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該細胞內間隔區調節該嵌合抑制性受體之敏感性。實施例 215 ： 如實施例214之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該細胞內間隔區增加該嵌合抑制性受體之敏感性。實施例 216 ： 如實施例214之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該細胞內間隔區降低該嵌合抑制性受體之敏感性。實施例 217 ： 如實施例212-216中任一項之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該細胞內間隔區調節該嵌合抑制性受體之效力。實施例 218 ： 如實施例217之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該細胞內間隔區增加該嵌合抑制性受體之效力。實施例 219 ： 如實施例217之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該細胞內間隔區降低該嵌合抑制性受體之效力。實施例 220 ： 如實施例212-219中任一項之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，當在免疫調節細胞上表現時，該細胞內間隔區調節該靶向腫瘤的嵌合受體之活化之基礎防止、減弱或抑制。實施例 221 ： 如實施例220之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該細胞內間隔區降低基礎防止、減弱或抑制。實施例 222 ： 如實施例220之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該細胞內間隔區的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該細胞內間隔區增加基礎防止、減弱或抑制。實施例 223 ： 如實施例110-222中任一項之嵌合抑制性受體，其中該抑制性嵌合受體進一步包含酶抑制性域。實施例 224 ： 如實施例223之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該酶抑制性域的其他方面相同的嵌合抑制性受體，當在免疫調節細胞上表現時，該酶抑制性域能夠防止、減弱或抑制靶向腫瘤的嵌合受體之活化。實施例 225 ： 如實施例223或實施例224之嵌合抑制性受體，其中該酶抑制性域包含酶催化域。實施例 226 ： 如實施例225之嵌合抑制性受體，其中該酶催化域衍生自選自由以下組成之群的酶：CSK、SHP-1、PTEN、CD45、CD148、PTP-MEG1、PTP-PEST、c-CBL、CBL-b、PTPN22、LAR、PTPH1、SHIP-1及RasGAP。實施例 227 ： 如實施例223-226中任一項之嵌合抑制性受體，其中該酶抑制性域包含一或多個修飾，相對於缺乏該一或多個修飾的其他方面相同的酶抑制性域，該一或多個修飾調節基礎防止、減弱或抑制。實施例 228 ： 如實施例227之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該酶抑制性域的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該一或多個修飾降低該嵌合抑制性受體之基礎防止、減弱或抑制。實施例 229 ： 如實施例227之嵌合抑制性受體，其中相對於缺乏該酶抑制性域的其他方面相同的嵌合抑制性受體，該一或多個修飾增加該嵌合抑制性受體之基礎防止、減弱或抑制。實施例 230 ： 如實施例110-229中任一項之嵌合抑制性受體，其中該靶向腫瘤的嵌合受體為靶向腫瘤的嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體(TCR)。實施例 231 ： 如實施例110-230中任一項之嵌合抑制性受體，其中該免疫調節細胞選自由以下組成之群：T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、γδ細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、調節性T細胞、病毒特異性T細胞、自然殺手T (NKT)細胞、自然殺手(NK)細胞、B細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、先天性淋巴樣細胞、肥胖細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、嗜中性球、髓樣細胞、巨噬細胞、單核球、樹突狀細胞、ESC衍生細胞及iPSC衍生細胞。實施例 232 ： 如實施例110-230中任一項之嵌合抑制性受體，其中該免疫調節細胞為自然殺手(NK)細胞。實施例 233 ： 一種組成物，其包含如實施例1-232中任一項之嵌合抑制性受體及醫藥學上可接受之載劑。實施例 234 ： 一種經工程改造之核酸，其編碼如實施例1-232中任一項之嵌合抑制性受體。實施例 235 ： 一種表現載體，其包含如實施例234之經工程改造之核酸。實施例 236 ： 一種經分離之免疫調節細胞，其包含如實施例234之經工程改造之核酸或如實施例235之表現載體。實施例 237 ： 一種組成物，其包含如實施例234之經工程改造之核酸或如實施例235之表現載體及醫藥學上可接受之載劑。實施例 238 ： 一種經分離之免疫調節細胞，其包含如實施例1-232中任一項之嵌合抑制性受體。實施例 239 ： 如實施例238之經分離之細胞，其中該細胞進一步包含在該細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體。實施例 240 ： 如實施例239之經分離之細胞，其中相對於缺乏該嵌合抑制性受體的其他方面相同的細胞，在蛋白與該嵌合抑制性受體結合之後，該嵌合抑制性受體防止、減弱或抑制該靶向腫瘤的嵌合受體之活化。實施例 241 ： 一種經分離之免疫調節細胞，其包含嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含： - 細胞外蛋白結合域； - 跨膜域，其中該跨膜域可操作地連接至該細胞外蛋白結合域，及 - 細胞內傳訊域，其中該細胞內傳訊域可操作地連接至該跨膜域；且 其中相對於缺乏該嵌合抑制性受體的其他方面相同的細胞，在蛋白與該嵌合抑制性受體結合之後，該嵌合抑制性受體防止、減弱或抑制在該細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體之活化。實施例 242 ： 如實施例241之經分離之細胞，其中該細胞進一步包含在該細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體。實施例 243 ： 一種經分離之免疫調節細胞，其包含： (a) 嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含： - 細胞外蛋白結合域， - 跨膜域，其中該跨膜域可操作地連接至該細胞外蛋白結合域，及 - 細胞內傳訊域，其中該細胞內傳訊域可操作地連接至該跨膜域；且 (b) 在該細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體， 其中相對於缺乏該嵌合抑制性受體的其他方面相同的細胞，在蛋白與該嵌合抑制性受體結合之後，該嵌合抑制性受體防止、減弱或抑制該靶向腫瘤的嵌合受體之活化。實施例 244 ： 如實施例241-243中任一項之經分離之細胞，其中該細胞內傳訊域衍生自選自由以下組成之群的蛋白：BTLA、PD-1、CTLA4、TIM3、KIR3DL1、LIR1、NKG2A、TIGIT及LAG3。實施例 245 ： 如實施例238-244中任一項之經分離之細胞，其中該嵌合抑制性受體經重組表現。實施例 246 ： 如實施例238-245中任一項之經分離之細胞，其中該嵌合抑制性受體自載體或該細胞之基因體之選定基因座表現。實施例 247 ： 如實施例238-246中任一項之經分離之細胞，其中該靶向腫瘤的嵌合受體為嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體。實施例 248 ： 如實施例238-247中任一項之細胞，其中在蛋白與該嵌合抑制性受體結合之前，該靶向腫瘤的嵌合受體能夠活化該細胞。實施例 249 ： 如實施例238-248中任一項之細胞，其中在蛋白與該嵌合抑制性受體結合之後，該嵌合抑制性受體壓制該經活化之細胞產生細胞介素。實施例 250 ： 如實施例238-249中任一項之細胞，其中在蛋白與該嵌合抑制性受體結合之後，該嵌合抑制性受體壓制對靶細胞的細胞介導之免疫反應，其中該免疫反應藉由該免疫調節細胞之活化來誘導。實施例 251 ： 如實施例241-250中任一項之細胞，其中該跨膜域物理連接至該細胞外蛋白結合域。實施例 252 ： 如實施例241-251中任一項之細胞，其中該細胞內傳訊域物理連接至該跨膜域。實施例 253 ： 如實施例241-250中任一項之細胞，其中該跨膜域物理連接至該細胞外蛋白結合域，且該細胞內傳訊域物理連接至該跨膜域。實施例 254 ： 一種經分離之免疫調節細胞，其包含嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含： - 細胞外蛋白結合域； - 跨膜域，其中該跨膜域可操作地連接至該細胞外蛋白結合域，及 - 二或更多個細胞內傳訊域，其中該二或更多個細胞內傳訊域可操作地連接至該跨膜域；且 其中相對於缺乏該嵌合抑制性受體的其他方面相同的細胞，在蛋白與該嵌合抑制性受體結合之後，該嵌合抑制性受體防止、減弱或抑制在該細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體之活化。實施例 255 ： 如實施例252之經分離之細胞，其中該細胞進一步包含在該細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體。實施例 256 ： 一種經分離之免疫調節細胞，其包含： (a) 嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體包含： - 細胞外蛋白結合域， - 跨膜域，其中該跨膜域可操作地連接至該細胞外蛋白結合域，及 - 二或更多個細胞內傳訊域，其中該二或更多個細胞內傳訊域可操作地連接至該跨膜域；且 (b) 在該細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體， 其中相對於缺乏該嵌合抑制性受體的其他方面相同的細胞，在蛋白與該嵌合抑制性受體結合之後，該嵌合抑制性受體防止、減弱或抑制該靶向腫瘤的嵌合受體之活化。實施例 257 ： 如實施例254-256中任一項之經分離之細胞，其中該二或更多個細胞內傳訊域中之各者衍生自選自由以下組成之群的蛋白：BTLA、PD-1、CTLA4、TIM3、KIR3DL1、LIR1、NKG2A、TIGIT及LAG3。實施例 258 ： 如實施例254-257中任一項之經分離之細胞，其中該嵌合抑制性受體經重組表現。實施例 259 ： 如實施例254-258中任一項之經分離之細胞，其中該嵌合抑制性受體自載體或該細胞之基因體之選定基因座表現。實施例 260 ： 如實施例254-259中任一項之經分離之細胞，其中該靶向腫瘤的嵌合受體為嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體。實施例 261 ： 如實施例254-260中任一項之細胞，其中在蛋白與該嵌合抑制性受體結合之前，該靶向腫瘤的嵌合受體能夠活化該細胞。實施例 262 ： 如實施例254-261中任一項之經分離之細胞，其中在蛋白與該嵌合抑制性受體結合之後，該嵌合抑制性受體壓制該經活化之細胞產生細胞介素。實施例 263 ： 如實施例254-262中任一項之經分離之細胞，其中在蛋白與該嵌合抑制性受體結合之後，該嵌合抑制性受體壓制對靶細胞的細胞介導之免疫反應，其中該免疫反應藉由該免疫調節細胞之活化來誘導。實施例 264 ： 如實施例254-263中任一項之經分離之細胞，其中該跨膜域物理連接至該細胞外蛋白結合域。實施例 265 ： 如實施例254-264中任一項之經分離之細胞，其中該二或更多個細胞內傳訊域中之一者物理連接至該跨膜域。實施例 266 ： 如實施例254-263中任一項之經分離之細胞，其中該跨膜域物理連接至該細胞外蛋白結合域，且該二或更多個細胞內傳訊域中之一者物理連接至該跨膜域。實施例 267 ： 如實施例238-266中任一項之經分離之細胞，其中該靶細胞為腫瘤細胞。實施例 268 ： 如實施例238-267中任一項之經分離之細胞，其中該細胞選自由以下組成之群：T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、γδ細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、調節性T細胞、病毒特異性T細胞、自然殺手T (NKT)細胞、自然殺手(NK)細胞、B細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、先天性淋巴樣細胞、肥胖細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、嗜中性球、髓樣細胞、巨噬細胞、單核球、樹突狀細胞、ESC衍生細胞及iPSC衍生細胞。實施例 269 ： 如實施例238-267中任一項之經分離之細胞，其中該細胞為自然殺手(NK)細胞。實施例 270 ： 如實施例238-269中任一項之經分離之細胞，其中該細胞為自體的。實施例 271 ： 如實施例238-269中任一項之經分離之細胞，其中該細胞為同種異體的。實施例 272 ： 一種組成物，其包含如實施例238-271中任一項之經分離之細胞及醫藥學上可接受之載劑。實施例 273 ： 一種防止、減弱或抑制藉由在免疫調節細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體誘導之細胞介導之免疫反應的方法，其包含： 對該免疫調節細胞進行工程改造，以在該免疫調節細胞之表面上表現如實施例1-231中任一項之嵌合抑制性受體， 其中在同族蛋白與該嵌合抑制性受體結合之後，該細胞內傳訊域防止、減弱或抑制該靶向腫瘤的嵌合受體之活化。實施例 274 ： 一種防止、減弱或抑制在免疫調節細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體之方法，其包含： 在合適於該嵌合抑制性受體結合該嵌合抑制性受體之同族蛋白的條件下，將如實施例238-271中任一項之經分離之細胞或如實施例272之組成物與該同族蛋白接觸， 其中在該蛋白與該嵌合抑制性受體結合之後，該細胞內傳訊域防止、減弱或抑制該靶向腫瘤的嵌合受體之活化。實施例 275 ： 如實施例273或實施例274之方法，其中該靶向腫瘤的嵌合受體為嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體(TCR)。實施例 276 ： 如實施例275之方法，其中該CAR結合一或多種在腫瘤細胞之表面上表現之抗原。 實例
以下為用於實施本發明的特定實施例之實例。實例僅出於說明性目的提供，且不意欲以任何方式限制本發明之範圍。已經努力確保所用之數字(例如，量、溫度等)之準確性，但仍應允許一些實驗誤差及偏差。
除非另外指示，否則本發明之實踐將採用此項技術內的蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術及藥理學的習知方法。文獻中充分解釋了此類技術。參見例如T.E. Creighton,Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993)；A.L. Lehninger,Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition)；Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)；Methods In Enzymology (S. Colowick及N. Kaplan編, Academic Press, Inc.)；Remington's Pharmaceutical Sciences , 第18版(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)；Carey及SundbergAdvanced Organic Chemistry 第 3 版 (Plenum Press) A卷及B卷(1992)。實例 1 ：具有各種傳訊域之抑制性 CAR 減少 T 細胞活化 方法及材料 抑制性嵌合受體及靶向腫瘤的嵌合受體構築體
合成了具有BTLA細胞內傳訊域之抑制性嵌合受體(iCAR)。iCAR包含IgGκ分泌訊息、具有FLAG標籤之抗CD19 scFv、CD8鉸鏈域、BTLA跨膜域及BTLA細胞內傳訊域。將FLAG標籤融合在iCAR中scFv (在訊息序列之後)之N末端。亦構築了兩種活化CAR (aCAR)。一種aCAR具有CD8分泌訊息、具有Myc標籤之抗CD19 scFv、CD8鉸鏈域、CD28跨膜域及CD28與CD3ζ細胞內傳訊域。另一aCAR具有CD8分泌訊息、具有Myc標籤之抗CD20 scFv、CD8鉸鏈域、CD28跨膜域及CD28與CD3ζ細胞內傳訊域。將MYC標籤融合在aCAR中scFv (在鉸鏈之前)之C末端。在兩種情況下，在scFv及將scFv連接至跨膜域的CD8鉸鏈中使用3x(G4S)連接子(SEQ ID NO: 27)。
共表現抗CD19-BTLA iCAR及抗CD19-CD28/CD3ζ aCAR之T細胞接觸表現CD19之靶細胞之示範性圖展示於圖 1A 中。
共表現抗CD19-BTLA iCAR及抗CD20-CD28/CD3ζ aCAR之T細胞接觸表現CD19及CD20之靶細胞之示範性圖展示於圖 4A 中。
亦合成了具有與BTLA、PD1、CTLA4、KIR3DL1、NKG2A或LIR1細胞內傳訊域及GFP融合之抗Her2 scFv之額外抑制性嵌合受體。如上文所述，這些抑制性嵌合受體具有FLAG標籤及GFP螢光蛋白。亦合成了包含與CD3ζ細胞內傳訊域及mCherry融合之抗Axl scFv之額外aCAR。表現Axl、Her2、Axl與Her2或Axl及Her2之靶細胞以及共表現具有一般細胞內抑制性域之抗Her2 iCAR及抗Axl-CD3ζ aCAR之T細胞之示範性圖展示於圖 7A 中。
表 9 提供所合成之抑制性及靶向腫瘤的嵌合受體之序列。
表9- 抑制性及靶向腫瘤的嵌合受體
胺基酸序列 SEQ ID NO: 描述
METDTLLLWVLLLWVPGSTGAGGSDYKDDDDKGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITTTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDLLPLGGLPLLITTCFCLFCCLRRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS 56 抗CD19 BTLA抑制性嵌合受體
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITEQKLISEEDLNGAATTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 57 抗CD19-CD28 /CD3ζ靶向腫瘤的CAR
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGFITPTTGYPEYNQKFKDRVTMTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRKVGKGVYYALDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIHNYLAWYQQKPGKVPKLLIYNTKTLADGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQHFWSSPWTFGGGTKVEIKEQKLISEEDLNGAATTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 58 抗CD20-CD28/CD3ζ靶向腫瘤的CAR
具有BTLA細胞內傳訊域之抗CD19 BTLA抑制性嵌合受體之序列展示為SEQ ID NO: 56。抗CD19-CD28/CD3ζ靶向腫瘤的CAR之序列展示為SEQ ID NO: 57。抗CD20-CD28/CD3ζ靶向腫瘤的CAR之序列展示為SEQ ID NO: 58。用抗 CD19 或抗 CD20 活化 CAR (aCAR) 及 / 或抗 CD19 抑制性 CAR (iCAR) 之 T 細胞轉導及擴增
在第1天，將1×106 個純化之CD4+/CD8+ T細胞解凍並用3×106 個Dynabead刺激，然後培養於具有0.2 ug/mL IL-2之1 mL Optimizer CTS T細胞擴增培養基(Gibco)中。在第2天，用編碼抗CD19或抗CD20活化CAR (aCAR)及/或抗CD19抑制性CAR (iCAR)之組成型表現之慢病毒(各100K，如GoStix (Tekara)所定量)單一或共同轉導T細胞。
在第3天，藉由磁鐵移除Dynabead。對T細胞進行計數並繼代(0.5×106 個細胞/mL)。用PE綴合之抗MYC及BV421綴合之抗FLAG抗體(對應於aCAR及iCAR)對這些細胞之等分試樣進行染色，且使用LX CytoFlex流式細胞儀定量其基因轉殖表現。在後續擴增中，使細胞每兩天繼代(0.5×106 個細胞/mL)。抗 CD19/CD20 iCAR 及 aCAR 之 T 細胞共培養物檢定
在第8天，對T細胞進行計數並分配至96孔盤中以供共培養物檢定。各孔含有5×105 個用cell trace violet染料(Invitrogen)染色之Nalm6靶細胞及5×105 個aCAR加或減iCAR T細胞。將共培養物在37℃與5% CO2 下孵育18 h。
在第9天，用NIR生存力染料(Biolegend)對共培養物中之細胞進行染色，且使用LX CytoFlex流式細胞儀定量靶細胞之死亡百分比。將殺傷百分比正規化至僅靶細胞。使用人類磁性Luminex檢定(Human magnetic Luminex assay，R&D systems)及MAGPIX分析儀(Millipore Sigma)量測相同共培養物之培養基中之細胞介素。用抗 Axl-CD3ζ 活化 CAR (aCAR) 及 / 或抗 Her2 抑制性 CAR (iCAR) 之 T 細胞轉導及擴增
在第1天，將1×106 個純化之CD4+ T細胞解凍並用3×106 個Dynabead刺激，然後培養於具有0.2 ug/mL IL-2之1 mL Optimizer CTS T細胞擴增培養基(Gibco)中。在第2天，用編碼抗Axl-CD3ζ-mCherry活化CAR (aCAR)及/或個別地各種抗Her2抑制性CAR (iCAR)之組成型表現之慢病毒(各100K，如GoStix (Tekara)所定量)單一或共同轉導T細胞。iCAR表現質體包括嘌黴素抗性基因。
在第4天，將T細胞與含有嘌黴素之培養基一起孵育以針對所指示之iCAR之表現進行選擇。未用嘌黴素選擇僅用抗Axl-CD3ζ-mCherry活化CAR轉導之對照細胞。
藉由磁鐵移除Dynabead。對T細胞進行計數並繼代(0.5×106 個細胞/mL)。藉由針對mCherry表現的流式細胞分析技術檢查抗Axl-CD3ζ-mCherry aCAR之表現。在後續擴增中，使細胞每兩天繼代(0.5×106 個細胞/mL)。抗 Her2 iCAR 及抗 Axl aCAR 之 T 細胞共培養物檢定
在第7天，對T細胞進行計數並分配至具有補充有人類抗體的X-VIVO15培養基(Lonza)之96孔盤中以供共培養物檢定。各孔含有1×105 個表現Alx、Her2、Axl與Her2或Axl或Her2 (wt)之Nalm6靶細胞以及1×105 個表現抗Axl活化CAR及所指示之抗Her2抑制性CAR之CD4+ T細胞。將僅表現抗Axl活化CAR之CD4+ T細胞用作對照。將共培養物在37℃與5% CO2 下孵育18 h。
在第8天，收集上清液並經由ELISA分析細胞介素。結果 抑制性嵌合受體及靶向腫瘤的嵌合受體結合相同抗原
評估了在表現結合相同抗原的iCAR及aCAR之細胞中iCAR減少或抑制T細胞活化的能力。共表現抗CD19-BTLA iCAR及抗CD19 aCAR之T細胞接觸表現CD19之靶細胞之示範性圖展示於圖 1A 中。用抗CD19-BTLA-iCAR及抗CD19 aCAR轉導之細胞在初代T細胞中展示高水準的表面表現。僅用aCAR轉導之T細胞展示高aCAR表現且無iCAR表現(圖 1C )，而用aCAR及iCAR共轉導之T細胞展示高水準的兩種CAR蛋白表現(圖 1D )。陰性對照細胞未展示任一構築體表現(圖 1B )。
在與表現CD19之Nalm6細胞共培養之後，抗CD19-BTLA iCAR壓制藉由抗CD19 aCAR (aCD19-28z)誘導之T細胞細胞介素產生。表現CD19之Nalm6細胞與抗CD19 aCAR T細胞之共培養誘導TNF-α、IFN-γ及IL-2產生(分別地，圖 2A 、圖 2B 及圖 2C )。然而，在與Nalm6靶細胞共培養之後，表現抗CD19 aCAR及抗CD19 BTLA-iCAR之T細胞顯著減少TNF-α、IFN-γ及IL-2產生(*p＞0.05，** p＞0.01)。因此，iCAR與其在靶細胞上的同族配體之結合成功減少aCAR誘導之細胞介素產生。
此外，在與表現CD19之Nalm6細胞共培養之後，抗CD19-BTLA iCAR壓制藉由抗CD19 aCAR誘導之T細胞細胞毒性。如圖 3 中所示，表現CD19之靶Nalm6細胞與僅表現抗CD19 aCAR之T細胞之共培養導致靶細胞之顯著殺傷。然而，當與Nalm6靶細胞共培養時，表現抗CD19 aCAR及抗CD19 BTLA iCAR之T細胞之細胞毒性統計學上顯著降低。因此，iCAR與其在靶細胞上的同族配體之結合成功減少T細胞之aCAR誘導之細胞毒性活性。抑制性嵌合受體及靶向腫瘤的嵌合受體結合不同抗原
接下來，評估了在表現各自結合不同抗原的iCAR及aCAR之T細胞中iCAR減少或抑制T細胞活化的能力。共表現抗CD20-BTLA iCAR及抗CD19 aCAR之T細胞接觸表現CD19及CD20之靶細胞之示範性圖展示於圖 4A 中。用抗CD19-BTLA iCAR及抗CD20 aCAR轉導之細胞在初代T細胞中展示高水準的表面表現。僅用aCAR轉導之T細胞展示高aCAR表現且無iCAR表現(圖 4C )，而用aCAR及iCAR共轉導之T細胞展示高水準的兩種CAR蛋白表現(圖 4D )。陰性對照細胞未展示任一構築體表現(圖 4B )。
在與表現CD19及CD20之Raji氏細胞共培養之後，抗CD19-BTLA iCAR壓制藉由抗CD20 aCAR (aCD20-28z)誘導之T細胞細胞介素產生。Raji氏細胞與抗CD20 aCAR T細胞之共培養誘導TNF-α、IFN-γ及IL-2產生(分別地，圖 5A 、圖 5B 及圖 5C )。然而，在與Raji氏靶細胞共培養之後，表現抗CD20 aCAR及抗CD19 BTLA iCAR之T細胞顯著減少TNF-α、IFN-γ及IL-2產生(**p＞0.01，**** p＞0.0001)。因此，iCAR與其在靶細胞上的同族配體之結合成功減少aCAR誘導之細胞介素產生。
因此，抗CD19-BTLA融合物(iCAR)在慢病毒轉導之CD4+及CD8+細胞中以高水準表現而無隨後的富集。重要的是，在共轉導之後觀察到高水準的iCAR及aCAR之共表現。此外，在兩種情況下，CD19-BTLA iCAR壓制多種T細胞活化反應(細胞毒性及細胞介素TNF-α、IFN-γ及IL-2產生)：i)當iCAR共享與aCAR (CD19受體)相同的細胞表面配體時；及ii)當iCAR及aCAR靶向不同的細胞表面配體(分別地，CD19及CD20)時。額外 iCAR 域之功能
圖 6 展示如藉由mCherry之流式細胞分析技術定量所確定之CD4+ T細胞中抗Axl-CD3ζ-mCherry aCAR之表現。在抗性選擇之T細胞之mCherry流式細胞分析技術定量之前，經由嘌黴素抗性選擇確定了所指示之抗Her2抑制性CAR之表現。不將僅表現抗Axl-CD3ζ aCAR之對照細胞與嘌黴素一起孵育。因此，圖 6 中所有經雙重轉導之T細胞表現抗Axl-CD3ζ aCAR及所指示之抗Her2抑制性CAR。
在與表現單獨Axl、單獨Her2或Axl與Her2 (HAML細胞)之靶Naml6細胞一起孵育之後，評估了雙重表現T細胞之IL-2 (圖 7B )及IFN-γ (圖 7C )分泌。將表現Axl或Her2之WT Nalm6細胞用作對照。
如圖 7B 中所示，表現抗Axl-CD3ζ aCAR及抗Her2-PD-1 iCAR或抗Her2-BTLA iCAR之細胞在IL-2分泌檢定中具有最高特異性。在那些樣品中，表現Axl之Nalm6細胞誘導T細胞之IL-2分泌，而表現Axl及Her2之Nalm6細胞HAML不誘導IL-2分泌，指示抗Her2-PD-1 iCAR或抗Her2-BTLA iCAR對T細胞中抗Axl-CD3ζ aCAR之活化及傳訊的成功的抑制性活性。在接觸HAML雙重表現靶細胞之後，抗Her2-NKG2A iCAR亦成功減少T細胞中抗Axl-CD3ζ aCAR誘導之IL-2分泌。
如圖 7C 中所示，表現抗Axl-CD3ζ aCAR及抗Her2-PD-1 iCAR、抗Her2-KIR3DL1 iCAR或抗Her2-LIR1 iCAR之細胞在IFN-γ分泌檢定中具有最高特異性。在那些樣品中，表現Axl之Nalm6細胞誘導T細胞之IFN-γ分泌，而表現Axl及Her2之Nalm6細胞HAML不誘導IFN-γ分泌，指示抗Her2-PD-1 iCAR、抗Her2-KIR3DL1 iCAR或抗Her2-LIR1 iCAR對T細胞中抗Axl-CD3ζ aCAR之活化及傳訊的成功的抑制性活性。在接觸HAML雙重表現靶細胞之後，抗Her2-BTLA iCAR及抗Her2-NKG2A iCAR亦成功減少T細胞中抗Axl-CD3ζ aCAR誘導之IFN-γ分泌。實例 2 ：具有 BTLA 傳訊域之抑制性嵌合受體降低 NK 細胞活化 材料及方法 轉導及擴增
在第1天，將NK細胞以1:1比率與照射aAPC(K562 mIL-15/4-1BBL/CD86)一起共培養以驅動擴增。在第7天，藉由在4°下用RetroNectin (Tekara，7 ug/孔)塗佈24孔盤之各孔隔夜來製備檢定盤。
在第8天，根據製造商之方案，使用RetroNectin (MOI：5-10)，用編碼活化CAR (aCAR)及/或抑制性CAR (iCAR)之組成型表現之慢病毒共轉導NK細胞。aCAR為與CD3ζ細胞內傳訊域及mCherry融合之抗Axl scFv。iCAR為與BTLA細胞內傳訊域及GFP融合之抗Her2 scFv。在第9天，重複轉導。藉由螢光顯微鏡檢查術及流式細胞分析技術檢查aCAR及iCAR轉基因之表現。共培養物檢定
在遞增的效應子與靶細胞之比率(E:T)下，將表現aCAR及/或iCAR之NK細胞與經工程改造之Nalm6靶細胞(Her2+, Axl+)一起孵育。根據製造商之說明書，使用LDH-Glo™細胞毒性檢定(Promega)進行Nalm6靶細胞之NK細胞殺傷。結果
與抗Axl CD3ζ-aCAR共轉導，抗Her2 BTLA-iCAR展示在初代NK細胞中高水準的表面表現。圖 8A 展示非轉導之NK細胞(陰性對照，上圖)及僅用抗Her2-BTLA iCAR表現構築體轉導之NK細胞(下圖)之流式細胞分析技術點圖。圖 8B 展示非轉導之細胞、用抗Her2-BTLA iCAR轉導之細胞、用抗Axl-CD3ζ aCAR轉導之細胞及用iCAR與aCAR轉導之細胞之免疫螢光顯微鏡術之GFP、mCherry及合併通道。如藉由融合之mCherry或GFP報告蛋白之表現所示，單及雙重轉導之細胞均展示CAR之良好表現。非轉導之細胞展示在GFP、mCherry或合併通道中無訊息。Her2-BTLA-GFP細胞展示在GFP通道中之訊息。Axl- CD3ζ-mCherry細胞展示在mCherry通道中之訊息。Her2-BTLA-GFP及Axl- CD3ζ-mCherry細胞展示在合併通道中重疊的對應通道中之GFP及mCherry表現，指示雙重轉導之細胞成功表現Her2-BTLA-GFP iCAR及Axl- CD3ζ-mCherry aCAR構築體。
抗Her2-BTLA iCAR在初代NK細胞中壓制抗Axl-CD3ζ aCAR細胞毒性。圖 9A 展示在與單表現或共表現抗Her2-BTLA iCAR及抗Axl-CD3ζ aCAR之NK細胞一起孵育4 h之後，靶Her2+ Axl+ Nalm6細胞之細胞溶解百分比。與未經轉導之NK細胞相比，僅表現抗Her2-BTLA iCAR之NK細胞不誘導細胞溶解，而與未經轉導之NK細胞相比，僅表現抗Axl-CD3ζ aCAR之NK細胞誘導顯著量的細胞溶解。重要的是，與表現單獨aCAR之NK細胞相比，共表現iCAR及aCAR之NK細胞誘導較低水準的靶細胞溶解。這指示，iCAR藉由靶細胞上其同族配體之活化抑制aCAR之傳訊，且因此抑制NK細胞之活化。在孵育8 h之後看到類似的結果(圖 9B )，在共轉導之NK細胞中iCAR對aCAR傳訊之抑制性活性較大。
因此，抗Her2-BTLA融合物(iCAR)在慢病毒轉導之NK細胞中以高水準表現而無隨後的富集。重要的是，在共轉導之後看到iCAR及aCAR之共表現。此外，scFv-BTLA iCAR壓制靶細胞之aCAR介導之細胞毒性。實例 3 ： LIR1 及 KIR3DL1 抑制性嵌合受體在減少 NK 細胞活化方面之評估 材料及方法 轉導及擴增
用絲裂黴素C處理之K562餵養細胞(feeder cell)將NK細胞擴增10天，接著用7.5e5 pg單獨aCAR病毒(SFFV FLAGtag aAxl CD28-CD3z)或用7.5e5 pg iCAR1或iCAR2病毒(分別地，SFFV aHer2 V5tag LIR1 P2A PuroR或SFFV aHer2 V5tag KIR3DL1 P2A PuroR)進行轉導。所評估之iCAR構築體之序列展示於表 10A 中。所評估之aCAR構築體之序列展示於圖 10B 中。各iCAR構築體形式自N末端之C末端為：訊息序列1-訊息序列2-scFv-標籤-鉸鏈-TM-抑制性細胞溶質域1-抑制性細胞溶質域2 (若存在)。aAxl CD28-CD3z形式自N末端至C末端為：訊息序列-標籤-scFv-鉸鏈-TM-細胞內傳訊域1-細胞內傳訊域2。4天之後，將嘌黴素添加至細胞中以供選擇。
再3天之後，藉由將經工程改造之NK細胞及親代NALM6靶標(WT)或經工程改造以過表現Axl或Axl與Her2抗原之NALM6靶標共孵育來進行細胞毒性檢定。對各經工程改造之NK細胞進行孵育，其中：(1)各靶細胞型單獨地以25,000個NK細胞與50,000個NALM6細胞之比率，一式三份；或(2)呈25,000個單抗原僅Axl+及25,000個雙抗原Axl+Her2+ NALM6細胞與25,000個具有所指示之類型的NK細胞以1:1:1比率之混合物(用不同膜染料將雙抗原靶標染色，使其能夠藉由流動來區分)。孵育隔夜之後，將細胞用生存力染料染色並經由流式細胞分析技術進行計數。將靶細胞減少定量為100% × (1-靶標數/靶標數(NV))。亦自細胞毒性檢定收集上清液並藉由ELISA (Luminex)分析NK細胞分泌之細胞毒性因子(包括TNFa、顆粒酶B及IFNg)之存在。表 10A- 抗 Her2 iCAR 形式及域
構築體(藉由ICD) 域 序列
KIR3DL1 LIR1 訊息序列1 (CD8) 胺基酸 MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 71)
KIR3DL1 LIR1 訊息序列1 (CD8) 核酸 ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG (SEQ ID NO: 72)
KIR3DL1 LIR1 訊息序列2 (pelB) 胺基酸 KYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA (SEQ ID NO: 73)
KIR3DL1 LIR1 訊息序列2 (pelB) 核酸 AAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC (SEQ ID NO: 74)
KIR3DL1 LIR1 scFv (具有(G4S)3連接子(SEQ ID NO: 27)之aHer2 H3B1) 胺基酸 QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIAWVRQMPGKGLEYMGLIYPGDSDTKYSPSFQGQVTISVDKSVSTAYLQWSSLKPSDSAVYFCARHDVGYCTDRTCAKWPEYFQHWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDHTNRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGFRSEDEADYYCASWDYTLSGWVFGGGTKLTVLG (SEQ ID NO: 75)
KIR3DL1 LIR1 scFv (具有(G4S)3連接子(SEQ ID NO: 27)之aHer2 H3B1) 核酸 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGCTACTGGATCGCCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTACATGGGGCTCATCTATCCTGGTGACTCTGACACCAAATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGTCGACAAGTCCGTCAGCACTGCCTACTTGCAATGGAGCAGTCTGAAGCCCTCGGACAGCGCCGTGTATTTTTGTGCGAGACATGACGTGGGATATTGCACCGACCGGACTTGCGCAAAGTGGCCTGAATACTTCCAGCATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGATCACACCAATCGGCCCGCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGTTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCCTCCTGGGACTACACCCTCTCGGGCTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT (SEQ ID NO: 76)
KIR3DL1 LIR1 標籤 (V5 + NGAA連接子(SEQ ID NO: 133)) 胺基酸 GKPIPNPLLGLDSTNGAA (SEQ ID NO: 77)
KIR3DL1 LIR1 標籤 (V5 + NGAA連接子(SEQ ID NO: 133)) 核酸 GGGAAGCCTATCCCGAACCCTCTGTTGGGTCTCGATAGTACCAATGGGGCCGCA (SEQ ID NO: 78)
KIR3DL1 LIR1 鉸鏈 (CD8) 胺基酸 TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 37)
KIR3DL1 LIR1 鉸鏈 (CD8) 核酸 ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTTGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT (SEQ ID NO: 79)
KIR3DL1 TM (KIR3DL1) 胺基酸 ILIGTSVVIILFILLLFFLL (SEQ ID NO: 69)
KIR3DL1 TM (KIR3DL1) 核酸 ATCCTGATCGGGACAAGTGTAGTAATCATACTTTTCATACTCCTGCTCTTTTTTCTCTTG (SEQ ID NO: 81)
LIR1 TM (LIR1) 胺基酸 VIGILVAVILLLLLLLLLFLI (SEQ ID NO: 59)
LIR1 TM (LIR1) 核酸 GTTATAGGGATCCTGGTGGCTGTCATACTCCTCTTGCTCCTCTTGTTGCTGCTTTTTTTGATA (SEQ ID NO: 62)
KIR3DL1    抑制性細胞溶質域1 (KIR3DL1) 胺基酸 HLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP (SEQ ID NO: 66)
KIR3DL1 抑制性細胞溶質域1 (KIR3DL1) 核酸 CATCTGTGGTGTTCTAATAAGAAGAATGCTGCTGTGATGGATCAAGAGCCCGCTGGTAACAGAACGGCCAACAGTGAAGATAGCGATGAGCAGGACCCAGAAGAAGTGACCTACGCCCAACTCGACCACTGTGTTTTTACGCAGCGGAAAATCACTCGACCCTCTCAACGACCCAAAACGCCGCCTACGGACACCATACTCTACACCGAACTGCCGAACGCCAAACCACGGTCCAAGGTGGTATCATGTCCG (SEQ ID NO: 85)
LIR1 抑制性細胞溶質域1 (LIR1) 胺基酸 LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 50)
LIR1 抑制性細胞溶質域1 (LIR1) 核酸 TTGCGCCACAGACGGCAGGGAAAGCACTGGACTAGTACGCAGAGGAAAGCGGACTTCCAGCATCCCGCAGGAGCCGTGGGGCCTGAACCCACTGATCGCGGCCTTCAATGGAGGTCTAGCCCGGCGGCAGACGCACAAGAGGAAAACTTGTACGCAGCCGTTAAGCACACCCAACCGGAGGACGGCGTTGAGATGGATACCCGCTCCCCTCACGATGAAGACCCTCAAGCAGTCACTTACGCGGAAGTAAAGCATAGCCGCCCCAGACGGGAAATGGCTAGCCCGCCGTCCCCCCTTAGCGGGGAATTTCTGGACACTAAAGATAGGCAGGCGGAAGAGGACCGCCAAATGGATACAGAGGCGGCGGCAAGTGAAGCACCTCAAGACGTTACTTACGCTCAACTTCACAGCCTTACCCTCAGGCGAGAAGCGACTGAACCACCCCCTTCCCAAGAAGGGCCAAGCCCAGCGGTTCCTTCTATCTATGCTACTCTTGCTATTCAC (SEQ ID NO: 54)
表 10B-aAxl CD28-CD3z aCAR 域
構築體 域 序列
aAxl CD28-CD3z 訊息序列(IgK) 胺基酸 METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 113)
aAxl CD28-CD3z 訊息序列(IgK) 核酸 ATGGAAACCGACACACTGCTGCTGTGGGTGCTGCTTCTTTGGGTGCCCGGATCTACAGGT (SEQ ID NO: 114)
aAxl CD28-CD3z scFv (具有(G4S)3連接子(SEQ ID NO: 27)之aAxl 1448) 胺基酸 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSNYWGWIRQPPGKGLEWMGYITYSGSTSYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAITTFYYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGNYLRWFQQKPGKAPKLLISGATNLAAGVPSRFSGSGSGSDFTLTISSLQPEDFATYYCLQSKESPWTFGQGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 115)
aAxl CD28-CD3z scFv (具有(G4S)3連接子(SEQ ID NO: 27)之aAxl 1448) 核酸 CAGGTCCAGCTGCAAGAATCTGGACCAGGCCTCGTGAAGCCCAGCGAGACACTGTCTCTGACCTGTACCGTGTCCGGCTACAGCATCACCAGCAACTACTGGGGCTGGATCAGACAGCCTCCTGGCAAAGGCCTTGAGTGGATGGGCTACATCACCTACAGCGGCAGCACCAGCTACAACCCCAGCCTGAAGTCCCGGATCACCATCAGCAGAGACACCAGCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCCGATACAGCCGTGTACTACTGTGCCATCACCACCTTCTACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTTTCTAGCGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCTGATATCCAGATGACACAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACCATCACCTGTAGGGCCAGCCAGGACATCGGCAACTACCTGAGATGGTTCCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATTAGCGGCGCCACAAATCTGGCTGCTGGCGTGCCAAGCAGATTTTCCGGCTCTGGCAGCGGCTCCGATTTCACCCTGACCATATCTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGAGCAAAGAGAGCCCCTGGACATTTGGACAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGGACC (SEQ ID NO: 116)
aAxl CD28-CD3z 標籤 (AGGS (SEQ ID NO: 134) FLAGtag GGS (SEQ ID NO: 15)) 胺基酸 AGGSDYKDDDDKGGS (SEQ ID NO: 117)
aAxl CD28-CD3z 標籤 (AGGS (SEQ ID NO: 134) FLAGtag GGS (SEQ ID NO: 15)) 核酸 GCCGGCGGAAGCGACTACAAGGACGACGATGACAAAGGCGGCAGC (SEQ ID NO: 118)
aAxl CD28-CD3z 鉸鏈 (CD8) 胺基酸 TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 37)
aAxl CD28-CD3z 鉸鏈 (CD8) 核酸 ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTTGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT (SEQ ID NO: 79)
aAxl CD28-CD3z TM (CD28) 胺基酸 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 11)
aAxl CD28-CD3z TM (CD28) 核酸 TTCTGGGTGCTCGTTGTTGTTGGCGGCGTGCTGGCCTGTTATTCCCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTC (SEQ ID NO: 83)
aAxl CD28-CD3z 細胞內傳訊域1 (CD28) 胺基酸 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 119)
aAxl CD28-CD3z 細胞內傳訊域1 (CD28) 核酸 CGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGATTACATGAACATGACCCCTCGGAGGCCCGGACCTACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGATTTCGCCGCCTACCGGTCC (SEQ ID NO: 120)
aAxl CD28-CD3z 細胞內傳訊域2 (CD3ζ) 胺基酸 RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 121)
aAxl CD28-CD3z 細胞內傳訊域2 (CD3ζ) 核酸 AGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGATGCTCCCGCCTATAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAAATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA (SEQ ID NO: 122)
結果
NK細胞經工程改造以表現活化嵌合受體(aCAR)及具有LIR1與KIR3DL1抑制性域之抑制性嵌合受體(iCAR)。然後針對iCAR減少NK細胞之aCAR介導之活化來對經工程改造之NK細胞進行評估。
用僅aCAR (抗Axl-CD28/CD3ζ；「αAxl 28ζ」)或其與抗Her2 iCAR1 (LIR1抑制性域；「αHer2 LIR1」)或iCAR2 (KIR3DL1抑制性域；「αHer2 KIR3DL1」)之組合對NK細胞進行病毒轉導。如圖 10 中所示，對於單獨aCAR，CAR在約50%的NK細胞中表現(右上圖)。用iCAR共工程改造之NK細胞展示在約50%的細胞中共表現(aCAR+iCAR+)(各下圖之右上象限)。應注意，經共工程改造之NK細胞僅展示約5-6%的細胞表現僅aCAR (aCAR+iCAR-；各下圖之右下象限)。表現結果展示NK細胞可成功地經工程改造以共表現aCAR及iCAR。
然後針對iCAR減少aCAR誘導之NK細胞介導之靶細胞殺傷來對經工程改造之NK細胞進行評估。如圖 11 中所示，相對於不表現aCAR抗原之親代靶細胞(NALM6 WT；各工程改造條件，柱1)之殺傷，經工程改造以共表現aCAR及iCAR之NK細胞殺傷僅表現aCAR抗原之靶細胞(NALM6 Axl+；各工程改造條件，柱2)，不遜色於僅用aCAR轉導之NK細胞，表明aCAR抗原依賴性抗原特異性殺傷。當與表現aCAR及iCAR抗原之靶細胞(NALM6 Axl+Her2+；各工程改造條件，柱3)共孵育時，相對於僅表現aCAR抗原之靶細胞之殺傷，經工程改造以共表現aCAR及iCAR之NK細胞展現出顯著降低的殺傷(分別地，aCAR/iCAR1及aCAR/iCAR2比較柱3與2)。相比之下，經工程改造以僅表現aCAR之NK細胞未展示出殺傷之顯著減少(分別地，僅aCAR比較柱3與2)。結果表明，經工程改造以共表現aCAR及iCAR之NK細胞在不存在iCAR配體之情況下成功殺傷靶細胞且在存在iCAR配體之情況下成功減少NK介導之殺傷。
然後針對在混合靶標群之情況下iCAR減少aCAR誘導之NK細胞介導之殺傷對經工程改造之NK細胞進行評估。如圖 12 中所示，與經工程改造以僅表現aCAR之NK細胞(分別地，僅aCAR比較柱2與1)相比，在混合群體(分別地，aCAR/iCAR1及aCAR/iCAR2比較柱2與1)內，相對於僅表現aCAR配體之靶細胞之殺傷，經工程改造以共表現aCAR及iCAR之NK細胞展現出顯著減少的表現aCAR及iCAR抗原之靶細胞之殺傷。結果表明，在混合細胞群中，經工程改造以共表現aCAR及iCAR之NK細胞成功地選擇性殺傷不表現iCAR配體之靶細胞。
然後如藉由細胞介素產生所評估，針對iCAR減少NK細胞之aCAR介導之活化來對經工程改造之NK細胞進行評估。如圖 13 中所示，當與僅表現aCAR配體之靶細胞aCAR (aCAR/iCAR1及aCAR/iCAR柱2)或一半僅表現aCAR配體之混合靶細胞群(aCAR/iCAR1及aCAR/iCAR2比較柱4)一起共孵育時，經工程改造以共表現aCAR及iCAR之NK細胞分泌細胞介素TNFα、顆粒酶B及IFNγ，而在與表現aCAR及iCAR抗原之靶細胞(aCAR/iCAR1及aCAR/iCAR2比較柱3)共孵育之後，細胞介素分泌減少。
結果表明，NK細胞可成功地經工程改造以共表現aCAR及iCAR，經工程改造以共表現aCAR及iCAR之NK細胞在不存在iCAR配體之情況下成功地殺傷靶細胞及促發炎細胞介素產生，且經工程改造以共表現aCAR及iCAR之NK細胞成功地以iCAR配體依賴性方式減少NK介導之殺傷及促發炎細胞介素產生。實例 4 ：各種抑制性嵌合受體在減少 NK 細胞活化方面之評估 材料及方法 轉導及擴增
用絲裂黴素C處理之K562餵養細胞將NK細胞擴增10天，接著用7.5e5 pg針對aCAR及iCAR構築體之各慢病毒進行轉導。所評估之iCAR構築體之序列展示於表 11 中。所評估之aCAR構築體之序列展示於圖 10B 中。各iCAR構築體形式自N末端之C末端為：訊息序列1-訊息序列2-scFv-標籤-鉸鏈-TM-抑制性細胞溶質域1-抑制性細胞溶質域2 (若存在)。aAxl CD28-CD3z形式自N末端至C末端為：訊息序列-標籤-scFv-鉸鏈-TM-細胞內傳訊域1-細胞內傳訊域2。4天之後，將嘌黴素添加至細胞中以供選擇。
再3天之後，藉由將經工程改造之NK細胞及親代SEM靶細胞(WT)或經工程改造以過表現Axl或Axl與Her2抗原之SEM靶標共孵育來進行細胞毒性檢定。對各經工程改造之NK細胞進行孵育，其中：(1)各靶細胞型單獨地以25,000個NK細胞與50,000個SEM細胞之比率，一式三份；或(2)呈25,000個單抗原僅Axl+及25,000個雙抗原Axl+Her2+ SEM細胞與25,000個具有所指示之類型的NK細胞以1:1:1比率之混合物(用不同膜染料將雙抗原靶標染色，使其能夠藉由流動來區分)。孵育隔夜之後，將細胞用生存力染料染色並經由流式細胞分析技術進行計數。將靶細胞減少定量為100% × (1-靶標數/靶標數(NV))。表 11- 抗 Her2 iCAR 形式及域
構築體(藉由ICD) 域 序列
PD-1 CTLA-4 KIR3DL1 LIR1 BTLA NKG2A 訊息序列1 (CD8) 胺基酸 MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 71)
PD-1 CTLA-4 KIR3DL1 LIR1 BTLA NKG2A 訊息序列1 (CD8) 核酸 ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG (SEQ ID NO: 72)
PD-1 CTLA-4 KIR3DL1 LIR1 BTLA NKG2A 訊息序列2 (pelB) 胺基酸 KYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA (SEQ ID NO: 73)
PD-1 CTLA-4 KIR3DL1 LIR1 BTLA NKG2A 訊息序列2 (pelB) 核酸 AAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC (SEQ ID NO: 74)
PD-1 CTLA-4 KIR3DL1 LIR1 BTLA NKG2A scFv (具有(G4S)3連接子(SEQ ID NO: 27)之aHer2 H3B1) 胺基酸 SEQ ID NO: 75
PD-1 CTLA-4 KIR3DL1 LIR1 BTLA NKG2A scFv (具有(G4S)3連接子(SEQ ID NO: 27)之aHer2 H3B1) 核酸 SEQ ID NO: 76
PD-1 CTLA-4 KIR3DL1 LIR1 BTLA NKG2A 標籤 (V5 + NGAA連接子(SEQ ID NO: 133)) 胺基酸 GKPIPNPLLGLDSTNGAA (SEQ ID NO: 77)
PD-1 CTLA-4 KIR3DL1 LIR1 BTLA NKG2A 標籤 (V5 + NGAA連接子(SEQ ID NO: 133)) 核酸 GGGAAGCCTATCCCGAACCCTCTGTTGGGTCTCGATAGTACCAATGGGGCCGCA (SEQ ID NO: 78)
PD-1 CTLA-4 KIR3DL1 LIR1 BTLA NKG2A 鉸鏈 (CD8) 胺基酸 TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 37)
PD-1 CTLA-4 KIR3DL1 LIR1 BTLA NKG2A 鉸鏈 (CD8) 核酸 ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTTGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT (SEQ ID NO: 79)
PD-1 TM (PD-1) 胺基酸 VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI (SEQ ID NO: 60)
PD-1 TM (PD-1) 核酸 GTTGGGGTTGTAGGTGGTCTGCTCGGCAGCCTGGTCTTGTTGGTGTGGGTCTTGGCTGTGATC (SEQ ID NO: 64)
CTLA-4 TM (CTLA-4) 胺基酸 DFLLWILAAVSSGLFFYSFLLT (SEQ ID NO: 68)
CTLA-4 TM (CTLA-4) 核酸 GATTTTCTGCTGTGGATTCTGGCAGCTGTGAGCTCTGGCTTGTTTTTCTACAGCTTCCTCCTGACC (SEQ ID NO: 80)
KIR3DL1 TM (KIR3DL1) 胺基酸 ILIGTSVVIILFILLLFFLL (SEQ ID NO: 69)
KIR3DL1 TM (KIR3DL1) 核酸 ATCCTGATCGGGACAAGTGTAGTAATCATACTTTTCATACTCCTGCTCTTTTTTCTCTTG (SEQ ID NO: 81)
LIR1 TM (LIR1) 胺基酸 VIGILVAVILLLLLLLLLFLI (SEQ ID NO: 59)
LIR1 TM (LIR1) 核酸 GTTATAGGGATCCTGGTGGCTGTCATACTCCTCTTGCTCCTCTTGTTGCTGCTTTTTTTGATA (SEQ ID NO: 62)
BTLA TM (BTLA) 核酸 LLPLGGLPLLITTCFCLFCCL (SEQ ID NO: 12)
BTLA TM (BTLA) 核酸 CTCTTGCCGTTGGGGGGTCTGCCACTTCTCATAACAACTTGCTTCTGCCTTTTTTGCTGTTTG (SEQ ID NO: 14)
CD28 TM (CD28) 胺基酸 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 11)
CD28 TM (CD28) 核酸 TTCTGGGTGCTCGTTGTTGTTGGCGGCGTGCTGGCCTGTTATTCCCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTC (SEQ ID NO: 83)
NKG2A TM (NKG2A-反向) 胺基酸 IVVITVVSAMLILCIIGLIGVIL (SEQ ID NO: 89)
NKG2A TM (NKG2A-反向) 胺基酸 ATAGTGGTCATCACTGTAGTTAGTGCAATGCTTATTCTTTGTATCATAGGGCTCATAGGGGTAATCCTG (SEQ ID NO: 90)
PD-1 抑制性細胞溶質域1 (PD-1) 胺基酸 CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL (SEQ ID NO: 1)
PD-1 抑制性細胞溶質域1 (PD-1) 核酸 TGTAGCCGAGCGGCCAGAGGCACAATCGGGGCAAGACGAACAGGACAGCCGCTCAAAGAGGACCCCAGTGCGGTCCCCGTTTTCTCCGTGGATTACGGAGAACTGGATTTCCAGTGGCGGGAGAAGACACCAGAGCCCCCGGTGCCCTGCGTGCCGGAGCAGACTGAGTACGCCACGATTGTGTTTCCCTCTGGAATGGGGACTTCATCCCCCGCTAGGCGCGGCTCAGCTGATGGCCCAAGATCCGCTCAACCGTTGCGGCCAGAGGACGGGCATTGCAGTTGGCCTCTG (SEQ ID NO: 51)
CTLA-4 抑制性細胞溶質域1 (CTLA-4) 胺基酸 AVSLSKMLKKRSPLTTGVGVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN (SEQ ID NO: 67)
CTLA-4 抑制性細胞溶質域1 (CTLA-4) 核酸 GCCGTGTCACTTAGTAAGATGCTGAAGAAGAGGTCACCACTGACGACAGGGGTTGGAGTGAAGATGCCACCCACAGAACCCGAATGTGAGAAGCAATTCCAGCCTTATTTCATTCCAATAAAT (SEQ ID NO: 84)
KIR3DL1 抑制性細胞溶質域1 (KIR3DL1) 胺基酸 HLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP (SEQ ID NO: 66)
KIR3DL1 抑制性細胞溶質域1 (KIR3DL1) 核酸 CATCTGTGGTGTTCTAATAAGAAGAATGCTGCTGTGATGGATCAAGAGCCCGCTGGTAACAGAACGGCCAACAGTGAAGATAGCGATGAGCAGGACCCAGAAGAAGTGACCTACGCCCAACTCGACCACTGTGTTTTTACGCAGCGGAAAATCACTCGACCCTCTCAACGACCCAAAACGCCGCCTACGGACACCATACTCTACACCGAACTGCCGAACGCCAAACCACGGTCCAAGGTGGTATCATGTCCG (SEQ ID NO: 85)
LIR1 抑制性細胞溶質域1 (LIR1) 胺基酸 LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 50)
LIR1 抑制性細胞溶質域1 (LIR1) 核酸 TTGCGCCACAGACGGCAGGGAAAGCACTGGACTAGTACGCAGAGGAAAGCGGACTTCCAGCATCCCGCAGGAGCCGTGGGGCCTGAACCCACTGATCGCGGCCTTCAATGGAGGTCTAGCCCGGCGGCAGACGCACAAGAGGAAAACTTGTACGCAGCCGTTAAGCACACCCAACCGGAGGACGGCGTTGAGATGGATACCCGCTCCCCTCACGATGAAGACCCTCAAGCAGTCACTTACGCGGAAGTAAAGCATAGCCGCCCCAGACGGGAAATGGCTAGCCCGCCGTCCCCCCTTAGCGGGGAATTTCTGGACACTAAAGATAGGCAGGCGGAAGAGGACCGCCAAATGGATACAGAGGCGGCGGCAAGTGAAGCACCTCAAGACGTTACTTACGCTCAACTTCACAGCCTTACCCTCAGGCGAGAAGCGACTGAACCACCCCCTTCCCAAGAAGGGCCAAGCCCAGCGGTTCCTTCTATCTATGCTACTCTTGCTATTCAC (SEQ ID NO: 54)
BTLA 抑制性細胞溶質域1 (BTLA) 胺基酸 RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS (SEQ ID NO: 3)
BTLA 抑制性細胞溶質域1 (BTLA) 核酸 AGAAGACATCAGGGGAAGCAGAATGAACTCAGCGATACAGCAGGGCGAGAAATTAATTTGGTAGACGCGCATCTGAAGTCCGAACAGACAGAGGCTTCTACTAGACAGAACTCCCAAGTTTTGTTGAGTGAGACGGGGATCTATGATAATGATCCCGATCTGTGTTTTAGAATGCAGGAGGGTAGTGAAGTCTACTCAAACCCGTGCCTGGAAGAAAATAAGCCCGGCATTGTTTACGCTAGTTTGAATCATTCTGTAATAGGCCCGAACTCCAGACTGGCTCGCAATGTGAAGGAGGCCCCAACTGAGTATGCGTCCATTTGCGTGCGGTCT (SEQ ID NO: 52)
NKG2A 抑制性細胞溶質域1 (NKG2A-反向) 胺基酸 KEPASPLDKCHYTKDNGQFDQSAKQLNLEAYTIEQETALISNKNGKPKRQQRKPNPPLNLDSYIVGQNDM (SEQ ID NO: 93)
NKG2A 抑制性細胞溶質域1 (NKG2A-反向) 核酸 AAGGAGCCTGCGTCCCCGTTGGATAAATGCCACTATACTAAGGATAACGGTCAGTTCGATCAGAGTGCAAAGCAACTTAACTTGGAGGCTTACACTATAGAGCAAGAAACAGCGCTGATAAGTAATAAGAACGGTAAGCCAAAGCGACAGCAGAGGAAACCCAATCCTCCGCTTAACTTGGATAGCTACATCGTCGGGCAAAATGACATG (SEQ ID NO: 94)
結果
NK細胞經工程改造以表現活化嵌合受體(aCAR)及具有各種抑制性域之抑制性嵌合受體(iCAR)。用僅aCAR (抗Axl-CD28 /CD3ζ；「αAxl28ζ」)或其與具有各種所指示之抑制性域之抗Her2 iCAR之組合對NK細胞進行病毒轉導。然後針對iCAR減少aCAR誘導之NK細胞介導之靶細胞殺傷來對經工程改造之NK細胞進行評估。如圖 14 中所示，相對於不表現aCAR抗原之親代靶細胞(各工程改造條件，柱1)之殺傷，經工程改造以共表現aCAR及iCAR之NK細胞殺傷呈單獨的靶標群(各工程改造條件，柱2)或以混合靶標群(各工程改造條件，柱4)的僅表現aCAR抗原(「Axl+」)之靶細胞，不遜色於僅用aCAR轉導之NK細胞，表明抗原特異性殺傷。應注意，相對於僅表現aCAR抗原之靶細胞，經工程改造以表現具有LIR1及KIR3DL1抑制性域之抗Her2 iCAR的NK細胞展示出減少的呈單獨的靶標群(各工程改造條件，柱3)或以混合靶標群(各工程改造條件，柱5)的表現aCAR抗原及iCAR抗原(「Axl+Her+」)之靶細胞之殺傷，而在經工程改造以表現具有NKG2A、CTLA4、PD-1或BTLA抑制性域之抗Her2 iCAR之NK細胞中未觀察到差異。結果表明，經工程改造以共表現aCAR及選擇iCAR之NK細胞在不存在iCAR配體之情況下成功地殺傷靶細胞且以iCAR配體依賴性方式成功地減少NK介導之殺傷，同時亦指示，在NK細胞活化之iCAR抗原依賴性壓制方面，具有衍生自不同天然抑制性共受體的抑制性域之iCAR可能相對於彼此有所不同。實例 5 ：串聯抑制性嵌合受體在減少 NK 細胞活化方面之評估 材料及方法 轉導及擴增
用絲裂黴素C處理之K562餵養細胞將NK細胞擴增10天，接著用7.5e5 pg針對具有串聯抑制性域之aCAR及iCAR構築體的各慢病毒進行轉導。所評估之iCAR構築體之序列展示於表 12 中。所評估之aCAR構築體之序列展示於圖 10B 中。各iCAR構築體形式自N末端之C末端為：訊息序列1-訊息序列2-scFv-標籤-鉸鏈-TM-抑制性細胞溶質域1-抑制性細胞溶質域2 (若存在)。aAxl CD28-CD3z形式自N末端至C末端為：訊息序列-標籤-scFv-鉸鏈-TM-細胞內傳訊域1-細胞內傳訊域2。4天之後，將嘌黴素添加至細胞中以供選擇。
再3天之後，藉由將經工程改造之NK細胞及親代SEM靶細胞(WT)或經工程改造以過表現Axl或Axl與Her2抗原之SEM靶標共孵育來進行細胞毒性檢定。對各經工程改造之NK細胞進行孵育，其中：(1)各靶細胞型單獨地以25,000個NK細胞與50,000個SEM細胞之比率，一式三份；或(2)呈25,000個單抗原僅Axl+及25,000個雙抗原Axl+Her2+ SEM細胞與25,000個具有所指示之類型的NK細胞以1:1:1比率之混合物(用不同膜染料將雙抗原靶標染色，使其能夠藉由流動來區分)。孵育隔夜之後，將細胞用生存力染料染色並經由流式細胞分析技術進行計數。將靶細胞減少定量為100% × (1-靶標數/靶標數(NV))。表 12- 抗 Her2 iCAR 形式及域
構築體(藉由ICD) 域 序列
LIR1-BTLA LIR1-PD1 訊息序列1 (CD8) 胺基酸 MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 71)
LIR1-BTLA LIR1-PD1 訊息序列1 (CD8) 核酸 ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG (SEQ ID NO: 72)
LIR1-BTLA LIR1-PD1 訊息序列2 (pelB) 胺基酸 KYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA (SEQ ID NO: 73)
LIR1-BTLA LIR1-PD1 訊息序列2 (pelB) 核酸 AAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC (SEQ ID NO: 74)
LIR1-BTLA LIR1-PD1 scFv (具有(G4S)3連接子(SEQ ID NO: 27)之aHer2 H3B1) 胺基酸 SEQ ID NO: 75
LIR1-BTLA LIR1-PD1 scFv (具有(G4S)3連接子(SEQ ID NO: 27)之aHer2 H3B1) 核酸 SEQ ID NO: 76
LIR1-BTLA LIR1-PD1 標籤 (V5 + NGAA連接子(SEQ ID NO: 133)) 胺基酸 GKPIPNPLLGLDSTNGAA (SEQ ID NO: 77)
LIR1-BTLA LIR1-PD1 標籤 (V5 + NGAA連接子(SEQ ID NO: 133)) 核酸 GGGAAGCCTATCCCGAACCCTCTGTTGGGTCTCGATAGTACCAATGGGGCCGCA (SEQ ID NO: 78)
LIR1-BTLA LIR1-PD1 鉸鏈 (CD8) 胺基酸 TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 37)
LIR1-BTLA LIR1-PD1 鉸鏈 (CD8) 核酸 ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTTGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT (SEQ ID NO: 79)
LIR1-BTLA LIR1-PD1 TM (LIR1) 胺基酸 VIGILVAVILLLLLLLLLFLI (SEQ ID NO: 59)
LIR1-BTLA LIR1-PD1 TM (LIR1) 核酸 GTTATAGGGATCCTGGTGGCTGTCATACTCCTCTTGCTCCTCTTGTTGCTGCTTTTTTTGATA (SEQ ID NO: 62)
LIR1-BTLA LIR1-PD1 抑制性細胞溶質域1 (LIR1) 胺基酸 SEQ ID NO: 50
LIR1-BTLA LIR1-PD1 抑制性細胞溶質域1 (LIR1) 核酸 SEQ ID NO: 54
LIR1-BTLA 抑制性細胞溶質域2 (BTLA) 胺基酸 RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS (SEQ ID NO: 3)
LIR1-BTLA 抑制性細胞溶質域2 (BTLA) 核酸 AGAAGACATCAGGGGAAGCAGAATGAACTCAGCGATACAGCAGGGCGAGAAATTAATTTGGTAGACGCGCATCTGAAGTCCGAACAGACAGAGGCTTCTACTAGACAGAACTCCCAAGTTTTGTTGAGTGAGACGGGGATCTATGATAATGATCCCGATCTGTGTTTTAGAATGCAGGAGGGTAGTGAAGTCTACTCAAACCCGTGCCTGGAAGAAAATAAGCCCGGCATTGTTTACGCTAGTTTGAATCATTCTGTAATAGGCCCGAACTCCAGACTGGCTCGCAATGTGAAGGAGGCCCCAACTGAGTATGCGTCCATTTGCGTGCGGTCT (SEQ ID NO: 52)
LIR1-PD1 抑制性細胞溶質域2 (PD-1) 胺基酸 CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL (SEQ ID NO: 1)
LIR1-PD1 抑制性細胞溶質域2 (PD-1) 核酸 TGTAGCCGAGCGGCCAGAGGCACAATCGGGGCAAGACGAACAGGACAGCCGCTCAAAGAGGACCCCAGTGCGGTCCCCGTTTTCTCCGTGGATTACGGAGAACTGGATTTCCAGTGGCGGGAGAAGACACCAGAGCCCCCGGTGCCCTGCGTGCCGGAGCAGACTGAGTACGCCACGATTGTGTTTCCCTCTGGAATGGGGACTTCATCCCCCGCTAGGCGCGGCTCAGCTGATGGCCCAAGATCCGCTCAACCGTTGCGGCCAGAGGACGGGCATTGCAGTTGGCCTCTG (SEQ ID NO: 51)
結果
NK細胞經工程改造以表現活化嵌合受體(aCAR)及細胞內域具有串聯的抑制性域的抑制性嵌合受體(iCAR)。用僅aCAR (抗Axl-CD28 /CD3ζ；「αAxl28ζ」)或其與具有各種所指示之串聯抑制性域之抗Her2 iCAR之組合對NK細胞進行病毒轉導。如圖 15 中所示，對於單獨aCAR，CAR在約40%的NK細胞中表現(右上圖)。用iCAR共工程改造之NK細胞展示在約40-45%的細胞中共表現(aCAR+iCAR+)(各下圖之右上象限)。應注意，經共工程改造之NK細胞僅展示少於5%的細胞表現僅aCAR (aCAR+iCAR-；各下圖之右下象限)。表現結果表明，NK細胞可成功地經工程改造以共表現aCAR及具有串聯細胞內抑制性域之iCAR。
然後針對iCAR減少aCAR誘導之NK細胞介導之靶細胞殺傷來對經工程改造之NK細胞進行評估。如圖 16 中所示，相對於不表現aCAR抗原之親代細胞(WT SEM)(各工程改造條件，柱1)之殺傷，經工程改造以共表現aCAR及iCAR之NK細胞殺傷Axl+靶細胞(各工程改造條件，柱2)，但遜色於僅用aCAR轉導之NK細胞(GFP-PuroR)，表明aCAR抗原依賴性抗原特異性殺傷。當與表現aCAR及iCAR抗原之靶細胞(Axl+Her2+ SEM細胞；各工程改造條件，柱3)共孵育時，相對於僅表現aCAR抗原之靶細胞之殺傷(比較柱3與2)，經工程改造以共表現aCAR及具有串聯LIR1/PD-1組織的iCAR之NK細胞展現出顯著減少的殺傷，且具有串聯LIR1/BTLA組織的iCAR展現出明顯(p=.055)減少的殺傷。相比之下，經工程改造以僅表現aCAR之NK細胞未展示出殺傷之可觀察的減少(分別地，GFP-PuroR比較柱3與2)。結果表明，經工程改造以共表現aCAR及iCAR之NK細胞在不存在iCAR配體之情況下成功殺傷靶細胞且以iCAR配體依賴性方式成功減少NK介導之殺傷。實例 6 ：具有或不具有抑制性域之細胞外域之抑制性嵌合受體在減少 T 細胞活化方面之評估 材料及方法 轉導及擴增
自人類供體PBMC分離出初代T細胞並冷凍。在第1天，將1×106 個純化之CD4+/CD8+ T細胞解凍並用3×106 個Dynabead刺激，然後培養於具有0.2 ug/mL IL-2之1 mL Optimizer CTS T細胞擴增培養基(Gibco)中。在第2天，用慢病毒(各100K，如藉由GoStix (Tekara)所定量)單轉導或共轉導T細胞。所評估之iCAR構築體之序列展示於表 13A 中。各iCAR構築體形式自N末端之C末端(除了指定為「全」者)為：訊息序列1-訊息序列2-scFv-標籤-鉸鏈-TM-抑制性細胞溶質域1-抑制性細胞溶質域2 (若存在)。具有ECD (指定為「全」)之各iCAR構築體自N末端至N末端(除了NKG2A「全」)為：訊息序列1-訊息序列2-scFv-標籤-鉸鏈-ECD-TM-抑制性細胞溶質域1。NKG2A「全」iCAR形式自N末端至C末端為：抑制性細胞溶質域1-TM-ECD-鉸鏈-標籤-訊息序列1-scFv。aCAR構築體aAxl CD3z之序列展示於圖 13B 中。aAxl CD3z形式自N末端至C末端為：訊息序列- scFv -標籤-鉸鏈- TM -細胞內傳訊域。
藉由磁鐵移除Dynabead。擴增細胞並用嘌黴素處理10天。用PE綴合之抗MYC及BV421綴合之抗FLAG抗體(對應於aCAR及iCAR)對各條件之等分試樣進行染色，且使用LX CytoFlex流式細胞儀定量其基因轉殖表現。T 細胞共培養物殺傷檢定
對T細胞進行計數並分配至96孔盤中以供共培養物檢定。藉由將經工程改造之T細胞及親代NALM6靶標(WT)或經工程改造以過表現Axl、Her2或Axl與Her2抗原之NALM6靶標共孵育來進行細胞毒性檢定。各孔含有1×105 個用cell trace violet染料(Invitrogen)預染色之Nalm6靶細胞及1×105 個經工程改造之T細胞。將共培養物在37℃與5% CO2 下孵育24 h。用7-AAD生存力染料將細胞染色，並藉由流式細胞分析技術定量靶細胞之死亡百分比。將殺傷百分比正規化至僅靶細胞。使用人類磁性Luminex檢定(Human magnetic Luminex assay，R&D systems)及MAGPIX分析儀(Millipore Sigma)量測相同共培養物之培養基中之細胞介素。表 13A- 抗 Her2 iCAR 形式及域
構築體(藉由ICD) 域 序列
LIR1 PD-1 (全) CTLA-4 (全) KIR3DL1 (全) NKG2A TIGIT TIGIT (全) 訊息序列1 (CD8) 胺基酸 MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 71)
LIR1 PD-1 (全) CTLA-4 (全) KIR3DL1 (全) NKG2A TIGIT TIGIT (全) 訊息序列1 (CD8) 核酸 ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG (SEQ ID NO: 72)
LIR1 PD-1 (全) CTLA-4 (全) KIR3DL1 (全) NKG2A TIGIT TIGIT (全) NKG2A全，無ss1 訊息序列2 (pelB) 胺基酸 KYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA (SEQ ID NO: 73)
LIR1 PD-1 (全) CTLA-4 (全) KIR3DL1 (全) NKG2A TIGIT TIGIT (全) NKG2A全，無ss1 訊息序列2 (pelB) 核酸 AAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC (SEQ ID NO: 74)
LIR1 PD-1 (全) CTLA-4 (全) KIR3DL1 (全) NKG2A NKG2A (全) TIGIT TIGIT (全) scFv (具有(G4S)3連接子(SEQ ID NO: 27)之aHer2 H3B1) 胺基酸 SEQ ID NO: 75
LIR1 PD-1 (全) CTLA-4 (全) KIR3DL1 (全) NKG2A NKG2A (全) TIGIT TIGIT (全) scFv (具有(G4S)3連接子(SEQ ID NO: 27)之aHer2 H3B1) 核酸 SEQ ID NO: 76
LIR1 PD-1 (全) CTLA-4 (全) KIR3DL1 (全) NKG2A NKG2A (全) TIGIT TIGIT (全) 標籤 (V5 + NGAA連接子(SEQ ID NO: 133)) 胺基酸 GKPIPNPLLGLDSTNGAA (SEQ ID NO: 77)
LIR1 PD-1 (全) CTLA-4 (全) KIR3DL1 (全) NKG2A TIGIT TIGIT (全) 標籤 (V5 + NGAA連接子(SEQ ID NO: 133)) 核酸 GGGAAGCCTATCCCGAACCCTCTGTTGGGTCTCGATAGTACCAATGGGGCCGCA (SEQ ID NO: 78)
LIR1 PD-1 (全) CTLA-4 (全) KIR3DL1 (全) NKG2A NKG2A (全) TIGIT TIGIT (全) 鉸鏈 (CD8) 胺基酸 TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 37)
LIR1 PD-1 (全) CTLA-4 (全) KIR3DL1 (全) NKG2A NKG2A (全) TIGIT TIGIT (全) 鉸鏈 (CD8) 核酸 ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTTGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT (SEQ ID NO: 79)
PD-1 (全) TM (PD-1) 胺基酸 VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI (SEQ ID NO: 60)
PD-1 (全) TM (PD-1) 核酸 GTTGGGGTTGTAGGTGGTCTGCTCGGCAGCCTGGTCTTGTTGGTGTGGGTCTTGGCTGTGATC (SEQ ID NO: 64)
CTLA-4 (全) TM (CTLA-4) 胺基酸 DFLLWILAAVSSGLFFYSFLLT (SEQ ID NO: 68)
CTLA-4 (全) TM (CTLA-4) 核酸 GATTTTCTGCTGTGGATTCTGGCAGCTGTGAGCTCTGGCTTGTTTTTCTACAGCTTCCTCCTGACC (SEQ ID NO: 80)
KIR3DL1 (全) TM (KIR3DL1) 胺基酸 ILIGTSVVIILFILLLFFLL (SEQ ID NO: 69)
KIR3DL1 (全) TM (KIR3DL1) 核酸 ATCCTGATCGGGACAAGTGTAGTAATCATACTTTTCATACTCCTGCTCTTTTTTCTCTTG (SEQ ID NO: 81)
LIR1 TM (LIR1) 胺基酸 VIGILVAVILLLLLLLLLFLI (SEQ ID NO: 59)
LIR1 TM (LIR1) 核酸 GTTATAGGGATCCTGGTGGCTGTCATACTCCTCTTGCTCCTCTTGTTGCTGCTTTTTTTGATA (SEQ ID NO: 62)
NKG2A TM (NKG2A-反向) 胺基酸 IVVITVVSAMLILCIIGLIGVIL (SEQ ID NO: 89)
NKG2A TM (NKG2A-反向) 胺基酸 ATAGTGGTCATCACTGTAGTTAGTGCAATGCTTATTCTTTGTATCATAGGGCTCATAGGGGTAATCCTG (SEQ ID NO: 90)
TIGIT TIGIT (全) TM (TIGIT) 胺基酸 LLGAMAATLVVICTAVIVVVA (SEQ ID NO: 91)
TIGIT TIGIT (全) TM (TIGIT) 核酸 CTGCTGGGCGCCATGGCCGCCACACTGGTTGTTATCTGTACCGCCGTGATCGTGGTGGTGGCC (SEQ ID NO: 92)
PD-1 (全) 抑制性細胞溶質域1 (PD-1) 胺基酸 CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL (SEQ ID NO: 1)
PD-1 (全) 抑制性細胞溶質域1 (PD-1) 核酸 TGTAGCCGAGCGGCCAGAGGCACAATCGGGGCAAGACGAACAGGACAGCCGCTCAAAGAGGACCCCAGTGCGGTCCCCGTTTTCTCCGTGGATTACGGAGAACTGGATTTCCAGTGGCGGGAGAAGACACCAGAGCCCCCGGTGCCCTGCGTGCCGGAGCAGACTGAGTACGCCACGATTGTGTTTCCCTCTGGAATGGGGACTTCATCCCCCGCTAGGCGCGGCTCAGCTGATGGCCCAAGATCCGCTCAACCGTTGCGGCCAGAGGACGGGCATTGCAGTTGGCCTCTG (SEQ ID NO: 51)
CTLA-4 (全) 抑制性細胞溶質域1 (CTLA-4) 胺基酸 AVSLSKMLKKRSPLTTGVGVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN (SEQ ID NO: 67)
CTLA-4 (全) 抑制性細胞溶質域1 (CTLA-4) 核酸 GCCGTGTCACTTAGTAAGATGCTGAAGAAGAGGTCACCACTGACGACAGGGGTTGGAGTGAAGATGCCACCCACAGAACCCGAATGTGAGAAGCAATTCCAGCCTTATTTCATTCCAATAAAT (SEQ ID NO: 84)
KIR3DL1 (全) 抑制性細胞溶質域1 (KIR3DL1) 胺基酸 HLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP (SEQ ID NO: 66)
KIR3DL1 (全) 抑制性細胞溶質域1 (KIR3DL1) 核酸 CATCTGTGGTGTTCTAATAAGAAGAATGCTGCTGTGATGGATCAAGAGCCCGCTGGTAACAGAACGGCCAACAGTGAAGATAGCGATGAGCAGGACCCAGAAGAAGTGACCTACGCCCAACTCGACCACTGTGTTTTTACGCAGCGGAAAATCACTCGACCCTCTCAACGACCCAAAACGCCGCCTACGGACACCATACTCTACACCGAACTGCCGAACGCCAAACCACGGTCCAAGGTGGTATCATGTCCG (SEQ ID NO: 85)
LIR1 抑制性細胞溶質域1 (LIR1) 胺基酸 LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 50)
LIR1 抑制性細胞溶質域1 (LIR1) 核酸 TTGCGCCACAGACGGCAGGGAAAGCACTGGACTAGTACGCAGAGGAAAGCGGACTTCCAGCATCCCGCAGGAGCCGTGGGGCCTGAACCCACTGATCGCGGCCTTCAATGGAGGTCTAGCCCGGCGGCAGACGCACAAGAGGAAAACTTGTACGCAGCCGTTAAGCACACCCAACCGGAGGACGGCGTTGAGATGGATACCCGCTCCCCTCACGATGAAGACCCTCAAGCAGTCACTTACGCGGAAGTAAAGCATAGCCGCCCCAGACGGGAAATGGCTAGCCCGCCGTCCCCCCTTAGCGGGGAATTTCTGGACACTAAAGATAGGCAGGCGGAAGAGGACCGCCAAATGGATACAGAGGCGGCGGCAAGTGAAGCACCTCAAGACGTTACTTACGCTCAACTTCACAGCCTTACCCTCAGGCGAGAAGCGACTGAACCACCCCCTTCCCAAGAAGGGCCAAGCCCAGCGGTTCCTTCTATCTATGCTACTCTTGCTATTCAC (SEQ ID NO: 54)
NKG2A 抑制性細胞溶質域1 (NKG2A-反向) 胺基酸 KEPASPLDKCHYTKDNGQFDQSAKQLNLEAYTIEQETALISNKNGKPKRQQRKPNPPLNLDSYIVGQNDM (SEQ ID NO: 93)
NKG2A 抑制性細胞溶質域1 (NKG2A-反向) 核酸 AAGGAGCCTGCGTCCCCGTTGGATAAATGCCACTATACTAAGGATAACGGTCAGTTCGATCAGAGTGCAAAGCAACTTAACTTGGAGGCTTACACTATAGAGCAAGAAACAGCGCTGATAAGTAATAAGAACGGTAAGCCAAAGCGACAGCAGAGGAAACCCAATCCTCCGCTTAACTTGGATAGCTACATCGTCGGGCAAAATGACATG (SEQ ID NO: 94)
TIGIT TIGIT (全) 抑制性細胞溶質域1 (TIGIT) 胺基酸 LTRKKKALRIHSVEGDLRRKSAGQEEWSPSAPSPPGSCVQAEAAPAGLCGEQRGEDCAELHDYFNVLSYRSLGNCSFFTETG (SEQ ID NO: 95)
TIGIT TIGIT (全) 抑制性細胞溶質域1 (TIGIT) 核酸 CTGACCAGAAAGAAGAAGGCCCTGAGAATCCACAGCGTGGAAGGCGACCTGCGGAGAAAGTCTGCCGGACAAGAAGAGTGGTCCCCTAGCGCTCCATCTCCACCTGGATCTTGTGTGCAGGCCGAAGCAGCTCCTGCTGGACTGTGTGGCGAACAGAGAGGCGAAGATTGCGCCGAGCTGCACGACTACTTCAACGTGCTGAGCTACAGAAGCCTGGGCAACTGCAGCTTCTTCACCGAGACAGGA (SEQ ID NO: 96)
PD-1 (全) ECD (PD-1)胺基酸 FLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLV (SEQ ID NO: 97)
PD-1 (全) ECD (PD-1)核酸 TTCCTGGACAGCCCCGACAGACCTTGGAACCCTCCTACATTCAGCCCCGCTCTGCTGGTGGTTACCGAGGGCGATAATGCCACCTTCACCTGTAGCTTCAGCAACACCAGCGAGAGCTTCGTGCTGAACTGGTACAGAATGAGCCCCAGCAACCAGACCGACAAGCTGGCCGCCTTTCCTGAGGATAGATCTCAGCCCGGCCAGGACTGCCGGTTCAGAGTTACACAGCTGCCCAACGGCCGGGACTTCCACATGTCTGTCGTCCGGGCCAGAAGAAACGACAGCGGCACATATCTGTGCGGCGCCATTTCTCTGGCCCCTAAGGCTCAGATCAAAGAGAGCCTGAGAGCCGAGCTGAGAGTGACAGAAAGACGGGCCGAAGTGCCCACAGCTCACCCTTCACCTTCTCCAAGACCTGCCGGCCAGTTTCAGACACTGGTT (SEQ ID NO: 98)
CTLA-4 (全) ECD (CTLA-4)胺基酸 KAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLT (SEQ ID NO: 99)
CTLA-4 (全) ECD (CTLA-4)核酸 AAGGCCATGCATGTGGCTCAGCCTGCTGTGGTGCTGGCCTCTTCTAGAGGAATCGCCAGCTTCGTGTGCGAGTACGCCTCTCCTGGAAAGGCCACTGAAGTGCGCGTGACCGTTCTGAGACAGGCCGATAGCCAAGTGACCGAAGTGTGCGCCGCCACCTACATGATGGGCAACGAGCTGACCTTCCTGGACGACAGCATCTGTACCGGCACCAGCAGCGGCAATCAAGTGAACCTGACCATCCAGGGCCTGAGAGCCATGGATACCGGCCTGTACATCTGCAAGGTGGAACTGATGTACCCTCCTCCTTACTACCTCGGCATCGGCAACGGCACCCAGATCTACGTGATCGACCCTGAGCCTTGTCCTGACAGCGACTTTCTGCTGTGGATCCTGGCTGCCGTGTCCAGCGGCCTGTTCTTCTACTCTTTTCTGCTGACC (SEQ ID NO: 100)
KIR3DL1 (全) ECD (KIR3DL1)胺基酸 HMGGQDKPFLSAWPSAVVPRGGHVTLRCHYRHRFNNFMLYKEDRIHIPIFHGRIFQESFNMSPVTTAHAGNYTCRGSHPHSPTGWSAPSNPVVIMVTGNHRKPSLLAHPGPLVKSGERVILQCWSDIMFEHFFLHKEGISKDPSRLVGQIHDGVSKANFSIGPMMLALAGTYRCYGSVTHTPYQLSAPSDPLDIVVTGPYEKPSLSAQPGPKVQAGESVTLSCSSRSSYDMYHLSREGGAHERRLPAVRKVNRTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFRHSPYEWSDPSDPLLVSVTGNPSSSWPSPTEPSSKSGNPRHLH (SEQ ID NO: 101)
KIR3DL1 (全) ECD (KIR3DL1)核酸 CACATGGGCGGACAGGATAAGCCTTTCCTGAGCGCCTGGCCTTCTGCCGTTGTTCCTAGAGGCGGACACGTGACCCTGCGGTGTCACTACAGACACCGGTTCAACAACTTCATGCTGTACAAAGAGGACCGGATTCACATCCCCATCTTCCACGGCCGGATCTTCCAAGAGTCCTTCAACATGAGCCCCGTGACCACAGCTCACGCCGGCAACTACACATGCAGAGGCTCTCACCCTCACAGCCCTACAGGCTGGAGTGCCCCTTCTAACCCCGTGGTCATCATGGTCACCGGCAACCACAGAAAGCCCAGCCTGCTTGCTCATCCCGGACCTCTGGTTAAGTCTGGCGAGCGAGTGATCCTGCAGTGTTGGAGCGATATTATGTTCGAGCACTTCTTTCTGCACAAAGAGGGCATCAGCAAGGACCCCTCTAGACTCGTGGGCCAGATCCATGATGGCGTGTCCAAGGCCAACTTCAGCATCGGCCCTATGATGCTGGCCCTGGCCGGCACCTATAGATGTTACGGCAGCGTGACCCACACACCTTACCAGCTGAGCGCCCCTAGCGACCCTCTGGATATCGTGGTCACAGGCCCCTACGAGAAGCCTAGCCTGTCTGCACAGCCTGGACCTAAAGTGCAGGCCGGCGAAAGCGTGACACTGAGCTGTAGCAGCAGATCCAGCTACGACATGTACCACCTGAGCAGAGAAGGCGGAGCCCACGAGAGAAGGCTGCCTGCCGTCAGAAAAGTGAACCGGACCTTCCAGGCCGACTTTCCTCTGGGACCTGCTACACACGGCGGCACCTACCGGTGTTTCGGCAGCTTTAGACACAGCCCTTACGAGTGGAGCGACCCCTCTGATCCTCTGCTGGTGTCTGTGACCGGCAATCCTAGCAGCAGCTGGCCCTCTCCAACAGAGCCTTCTAGCAAGAGCGGCAACCCCAGACATCTGCAC (SEQ ID NO: 102)
TIGIT (全) ECD (TIGIT)胺基酸 MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIP (SEQ ID NO: 103)
TIGIT (全) ECD (TIGIT)核酸 ATGATGACCGGCACCATCGAGACAACCGGCAACATCTCTGCCGAGAAAGGCGGCAGCATCATCCTGCAGTGTCACCTGTCTAGCACCACCGCTCAAGTGACCCAAGTGAACTGGGAGCAGCAGGATCAGCTGCTGGCCATCTGCAATGCCGATCTCGGCTGGCACATCAGCCCCAGCTTCAAGGATAGAGTGGCCCCTGGACCTGGCCTGGGACTGACACTTCAGAGCCTGACCGTGAACGATACCGGCGAGTACTTCTGCATCTACCACACATACCCCGACGGCACCTATACCGGCCGGATCTTTCTGGAAGTGCTGGAAAGCTCTGTGGCCGAGCACGGCGCCAGATTTCAGATTCCT (SEQ ID NO: 104)
NKG2A (全) 抑制性細胞溶質域1 (NKG2A) 胺基酸 MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKNSILATEQEITYAELNLQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAPEK (SEQ ID NO: 105)
NKG2A (全) 抑制性細胞溶質域1 (NKG2A) 核酸 ATGGACAACCAGGGCGTGATCTACAGCGACCTGAACCTGCCTCCTAATCCTAAGCGGCAGCAGAGAAAGCCCAAGGGCAACAAGAACAGCATCCTGGCCACCGAGCAAGAGATCACCTACGCCGAGCTGAATCTGCAGAAGGCCAGCCAGGACTTCCAGGGCAACGACAAGACCTACCACTGCAAGGACCTGCCTAGCGCTCCCGAGAAG (SEQ ID NO: 106)
NKG2A (全) TM (NKG2A)胺基酸 LIVGILGIICLILMASVVTIVVI (SEQ ID NO: 107)
NKG2A (全) TM (NKG2A)核酸 CTGATCGTGGGAATCCTGGGCATCATCTGCCTGATCCTGATGGCCAGCGTGGTCACCATCGTGGTCATC (SEQ ID NO: 108)
NKG2A (全) ECD (NKG2A)胺基酸 PSTLIQRHNNSSLNTRTQKARHCGHCPEEWITYSNSCYYIGKERRTWEESLLACTSKNSSLLSIDNEEEMKFLSIISPSSWIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKDSDNAELNCAVLQVNRLKSAQCGSSIIYHCKHKL (SEQ ID NO: 109)
NKG2A (全) ECD (NKG2A)核酸 CCCAGCACACTGATCCAGCGGCACAACAACAGCAGCCTGAACACCAGAACACAGAAGGCCCGGCACTGCGGCCACTGTCCTGAAGAGTGGATCACATACAGCAACAGCTGCTACTACATCGGCAAAGAGCGGCGGACCTGGGAAGAATCTCTGCTGGCCTGCACCAGCAAGAACTCCAGCCTGCTGAGCATCGACAACGAGGAAGAGATGAAGTTCCTGTCCATCATCAGCCCCAGCAGCTGGATCGGCGTGTTCAGAAACAGCTCCCACCATCCTTGGGTCACCATGAACGGCCTGGCCTTCAAGCACGAGATCAAGGACAGCGACAACGCCGAACTGAACTGTGCCGTGCTGCAAGTGAACCGGCTGAAGTCTGCCCAGTGTGGCAGCAGCATCATCTATCACTGCAAGCACAAGCTG (SEQ ID NO: 110)
NKG2A (全) 標籤 (NGAA (SEQ ID NO: 133) + Myctag)胺基酸 NGAAEQKLISEEDL (SEQ ID NO: 111)
NKG2A (全) 標籤 (NGAA (SEQ ID NO: 133) + Myctag)核酸 AATGGGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAAGATCTG (SEQ ID NO: 112)
表 13B - aAxl CD3z aCAR 域
構築體 域 序列
aAxl CD3z 訊息序列(CD8) 胺基酸 MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 71)
aAxl CD3z 訊息序列(CD8) 核酸 ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCATGCTGCTAGACCT (SEQ ID NO: 123)
aAxl CD3z scFv (具有(G4S)3連接子(SEQ ID NO: 27)之aAxl 1448) 胺基酸 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSNYWGWIRQPPGKGLEWMGYITYSGSTSYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAITTFYYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGNYLRWFQQKPGKAPKLLISGATNLAAGVPSRFSGSGSGSDFTLTISSLQPEDFATYYCLQSKESPWTFGQGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 115)
aAxl CD3z scFv (具有(G4S)3連接子(SEQ ID NO: 27)之aAxl 1448) 核酸 CAGGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGCCCTGGCCTCGTGAAGCCTAGCGAGACACTGAGCCTGACCTGCACCGTGTCCGGCTACAGCATCACCAGCAACTACTGGGGCTGGATCAGACAGCCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGGCTACATCACCTACAGCGGCAGCACCAGCTACAACCCCAGCCTGAAGTCCCGGATCACCATCAGCCGGGACACCAGCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACAGCCGCCGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCATCACCACCTTCTACTATTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACCGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGATCTGGCGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGGGGCTCTGATATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGACATCGGCAACTACCTGCGGTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTCCGGCGCCACAAATCTGGCCGCTGGCGTGCCAAGCAGATTCAGCGGCTCTGGCAGCGGCTCCGACTTCACCCTGACCATCTCTAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGAGCAAAGAGAGCCCCTGGACCTTCGGACAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGGACA (SEQ ID NO: 124)
aAxl CD3z 標籤 (Myc + NGAA連接子(SEQ ID NO: 133)) 胺基酸 EQKLISEEDLNGAA (SEQ ID NO: 125)
aAxl CD3z 標籤 (Myc + NGAA連接子(SEQ ID NO: 133)) 核酸 GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAAGATCTGAATGGGGCCGCA (SEQ ID NO: 126)
aAxl CD3z 鉸鏈 (CD8) 胺基酸 TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 37)
aAxl CD3z 鉸鏈 (CD8) 核酸 ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTTGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT (SEQ ID NO: 79)
aAxl CD3z TM (CD8) 胺基酸 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (SEQ ID NO: 127)
aAxl CD3z TM (CD8) 核酸 ATATACATCTGGGCTCCTCTGGCTGGCACTTGCGGAGTGCTTCTGCTGAGTCTGGTTATTACC (SEQ ID NO: 128)
aAxl CD3z 細胞內傳訊域(CD3ζ) 胺基酸 RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 121)
aAxl CD3z 細胞內傳訊域(CD3ζ) 核酸 AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 129)
結果
T細胞經工程改造以表現活化嵌合受體(aCAR)及具有各種抑制性域之抑制性嵌合受體(iCAR)，尤其包括特徵為僅抑制性受體之細胞溶質域(CD)或亦相應抑制性受體之細胞外域(ECD；「全」)之形式。
用僅aCAR (aAxl-CD3z-mCherry)或其與具有各種所指示之抑制性域之抗Her2 iCAR之組合對NK細胞進行病毒轉導。如圖 17 中所示，在iCAR僅具有LIR1之細胞溶質域或全(CD+ECD) KIR3DL1序列之情況下觀察到較高百分比的細胞展示出共表現(aCAR+iCAR+)，在具有全(CD+ECD) PD-1或TIGIT序列之iCAR之情況下可觀察到但較低百分比的細胞共表現，且在具有全CTLA-4序列、全NKG2A序列或TIGIT之細胞溶質域之iCAR之情況下可觀察到最小程度的共表現。
然後針對iCAR減aCAR誘導之T細胞活化來對經工程改造之T細胞進行評估。如圖 18 中所示，相對於不表現aCAR抗原之親代靶細胞(WT NALM6；各工程改造條件，柱1)或僅表現iCAR抗原之靶細胞(Her2 NALM6；各工程改造條件，柱1)之殺傷，經工程改造以僅表現aCAR (「aAxal-CD3z」)或共表現aCAR及各種iCAR形式之T細胞全部展現出對僅表現aCAR抗原之靶細胞(Axl NALM6；各工程改造條件，柱3)之殺傷，表明aCAR抗原依賴性抗原特異性殺傷。當與表現aCAR及iCAR抗原之靶細胞(Her2 Axl NALM6；各工程改造條件，柱4)共孵育時，相對於僅表現僅具有LIR1之細胞溶質域(「aCAR+LIR1 icd iCAR」)或全(CD+ECD) KIR3DL1序列(「aCAR+ KIR3DL1全iCAR」)之iCAR之靶細胞(分別地，比較柱4與3)之殺傷，經工程改造以共表現aCAR及iCAR之T細胞展現出明顯減少的殺傷，而其他iCAR形式展現出更適中的減少，大體上與僅aCAR條件一致。如圖 19 中所示，亦評估了T細胞IL-2分泌之iCAR依賴性減少，且其與T細胞殺傷相關。應注意，T細胞殺傷之iCAR依賴性減少及與iCAR表現(亦即，展現出較大表現的僅具有LIR1之細胞溶質域或全(CD+ECD) KIR3DL1序列之iCAR)相關之細胞介素產生亦展現出aCAR介導之T細胞活化之最大調控。
結果表明，可針對選擇的形式成功地將T細胞工程改造成共表現aCAR及選擇iCAR。此外，iCAR以iCAR配體依賴性方式展現出T細胞介導之殺傷及細胞介素產生之減少，這與T細胞中之共表現對應。實例 7 ：各種抑制性嵌合受體在減少 NK 細胞活化方面之評估 材料及方法 轉導及擴增
用絲裂黴素C處理之K562餵養細胞將NK細胞擴增10天，接著用7.5e5 pg針對aCAR及iCAR構築體之各慢病毒進行轉導。所評估之iCAR構築體之序列展示於表 14 中。各iCAR構築體形式自N末端之C末端(除了指定為「全」者)為：訊息序列1-訊息序列2-scFv-標籤-鉸鏈-TM-抑制性細胞溶質域1-抑制性細胞溶質域2 (若存在)。具有ECD (指定為「全」)之各iCAR構築體自N末端至N末端(除了NKG2A「全」)為：訊息序列1-訊息序列2-scFv-標籤-鉸鏈-ECD-TM-抑制性細胞溶質域1。NKG2A「全」iCAR形式自N末端至C末端為：抑制性細胞溶質域1-TM-ECD-鉸鏈-標籤-訊息序列1-scFv。使用抗Axl aCAR形式aAxl CD28-CD3z或aAxl CD3z。aAxl-CD28/CD3z aCAR構築體之序列展示於表 10B 中。aAxl CD28-CD3z形式自N末端至C末端為：訊息序列-標籤-scFv-鉸鏈-TM-細胞內傳訊域1-細胞內傳訊域2。aAxl CD3z aCAR構築體之序列展示於表 13B 。aAxl CD3z形式自N末端至C末端為：訊息序列- scFv -標籤-鉸鏈- TM -細胞內傳訊域。4天之後，將嘌黴素添加至細胞中以供選擇。
再3天之後，藉由將經工程改造之NK細胞及親代靶細胞(WT)或者經工程改造以過表現aCAR抗原(例如，Axl)或aCAR抗原與iCAR抗原(例如，Axl與Her2)之靶標共孵育來進行細胞毒性檢定。對各經工程改造之NK細胞進行孵育，其中：(1)各靶細胞型單獨地以25,000個NK細胞與50,000個靶細胞之比率，一式三份；或(2)呈25,000個僅aCAR抗原及25,000個雙抗原靶細胞與25,000個具有所指示之類型的NK細胞以1:1:1比率之混合物(用不同膜染料將雙抗原靶標染色，使其能夠藉由流動來區分)。孵育隔夜之後，將細胞用生存力染料染色並經由流式細胞分析技術進行計數。將靶細胞減少定量為100% × (1-靶標數/靶標數(NV))。表 14- 抗 Her2 iCAR 形式及域
構築體(藉由ICD) 域 序列
PD-1 CTLA-4 KIR3DL1 LIR1 BTLA NKG2A LIR1-BTLA LIR1-PD1 LIR1-KIR3DL1 KIR3DL1-LIR1 LIR1 2x KIR3DL1 2x DAP10e KIR3DL1 28-28 KIR3DL1 LIR1 (密碼子最佳化) PD-1 (全) CTLA-4 (全) KIR3DL1 (全) TIGIT TIGIT (全) LIR1-BTLA LIR1-PD-1 訊息序列1 (CD8) 胺基酸 MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 71)
PD-1 CTLA-4 KIR3DL1 LIR1 BTLA NKG2A LIR1-BTLA LIR1-PD1 LIR1-KIR3DL1 KIR3DL1-LIR1 LIR1 2x KIR3DL1 2x DAP10e KIR3DL1 28-28 KIR3DL1 LIR1 (密碼子最佳化) PD-1 (全) CTLA-4 (全) KIR3DL1 (全) TIGIT TIGIT (全) LIR1-BTLA LIR1-PD-1 訊息序列1 (CD8) 核酸 ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG (SEQ ID NO: 72)
PD-1 CTLA-4 KIR3DL1 LIR1 BTLA NKG2A LIR1-BTLA LIR1-PD1 LIR1-KIR3DL1 KIR3DL1-LIR1 LIR1 2x KIR3DL1 2x DAP10e KIR3DL1 28-28 KIR3DL1 LIR1 (密碼子最佳化) PD-1 (全) CTLA-4 (全) KIR3DL1 (全) TIGIT TIGIT (全) LIR1-BTLA LIR1-PD-1 NKG2A全，無ss1 訊息序列2 (pelB) 胺基酸 KYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA (SEQ ID NO: 73)
PD-1 CTLA-4 KIR3DL1 LIR1 BTLA NKG2A LIR1-BTLA LIR1-PD1 LIR1-KIR3DL1 KIR3DL1-LIR1 LIR1 2x KIR3DL1 2x DAP10e KIR3DL1 28-28 KIR3DL1 LIR1 (密碼子最佳化) PD-1 (全) CTLA-4 (全) KIR3DL1 (全) TIGIT TIGIT (全) LIR1-BTLA LIR1-PD-1 NKG2A全，無ss1 訊息序列2 (pelB) 核酸 AAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC (SEQ ID NO: 74)
PD-1 CTLA-4 KIR3DL1 LIR1 BTLA NKG2A TIGIT LIR1-BTLA LIR1-PD1 LIR1-KIR3DL1 KIR3DL1-LIR1 LIR1 2x KIR3DL1 2x DAP10e KIR3DL1 28-28 KIR3DL1 LIR1 (密碼子最佳化) PD-1 (全) CTLA-4 (全) KIR3DL1 (全) NKG2A (全) TIGIT (全) LIR1-BTLA LIR1-PD-1 scFv (具有(G4S)3連接子(SEQ ID NO: 27)之aHer2 H3B1) 胺基酸 QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIAWVRQMPGKGLEYMGLIYPGDSDTKYSPSFQGQVTISVDKSVSTAYLQWSSLKPSDSAVYFCARHDVGYCTDRTCAKWPEYFQHWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDHTNRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGFRSEDEADYYCASWDYTLSGWVFGGGTKLTVLG (SEQ ID NO: 75)
PD-1 CTLA-4 KIR3DL1 LIR1 BTLA NKG2A TIGIT LIR1-BTLA LIR1-PD1 LIR1-KIR3DL1 KIR3DL1-LIR1 LIR1 2x KIR3DL1 2x DAP10e KIR3DL1 28-28 KIR3DL1 LIR1 (密碼子最佳化) PD-1 (全) CTLA-4 (全) KIR3DL1 (全) NKG2A (全) TIGIT (全) LIR1-BTLA LIR1-PD-1 scFv (具有(G4S)3連接子(SEQ ID NO: 27)之aHer2 H3B1) 核酸 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGCTACTGGATCGCCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTACATGGGGCTCATCTATCCTGGTGACTCTGACACCAAATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGTCGACAAGTCCGTCAGCACTGCCTACTTGCAATGGAGCAGTCTGAAGCCCTCGGACAGCGCCGTGTATTTTTGTGCGAGACATGACGTGGGATATTGCACCGACCGGACTTGCGCAAAGTGGCCTGAATACTTCCAGCATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGATCACACCAATCGGCCCGCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGTTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCCTCCTGGGACTACACCCTCTCGGGCTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT (SEQ ID NO: 76)
PD-1 CTLA-4 KIR3DL1 LIR1 BTLA NKG2A TIGIT LIR1-BTLA LIR1-PD1 LIR1-KIR3DL1 KIR3DL1-LIR1 LIR1 2x KIR3DL1 2x DAP10e KIR3DL1 28-28 KIR3DL1 LIR1 (密碼子最佳化) PD-1 (全) CTLA-4 (全) KIR3DL1 (全) TIGIT (全) LIR1-BTLA LIR1-PD-1 標籤 (V5 + NGAA連接子(SEQ ID NO: 133)) 胺基酸 GKPIPNPLLGLDSTNGAA (SEQ ID NO: 77)
PD-1 CTLA-4 KIR3DL1 LIR1 BTLA NKG2A TIGIT LIR1-BTLA LIR1-PD1 LIR1-KIR3DL1 KIR3DL1-LIR1 LIR1 2x KIR3DL1 2x DAP10e KIR3DL1 28-28 KIR3DL1 LIR1 (密碼子最佳化) PD-1 (全) CTLA-4 (全) KIR3DL1 (全) TIGIT (全) LIR1-BTLA LIR1-PD-1 標籤 (V5 + NGAA連接子(SEQ ID NO: 133)) 核酸 GGGAAGCCTATCCCGAACCCTCTGTTGGGTCTCGATAGTACCAATGGGGCCGCA (SEQ ID NO: 78)
PD-1 CTLA-4 KIR3DL1 LIR1 BTLA NKG2A TIGIT LIR1-BTLA LIR1-PD1 LIR1-KIR3DL1 KIR3DL1-LIR1 LIR1 2x KIR3DL1 2x DAP10e KIR3DL1 28-28 KIR3DL1 LIR1 (密碼子最佳化) PD-1 (全) CTLA-4 (全) KIR3DL1 (全) NKG2A (全) TIGIT (全) LIR1-BTLA LIR1-PD-1 鉸鏈 (CD8) 胺基酸 TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 37)
PD-1 CTLA-4 KIR3DL1 LIR1 BTLA NKG2A TIGIT LIR1-BTLA LIR1-PD1 LIR1-KIR3DL1 KIR3DL1-LIR1 LIR1 2x KIR3DL1 2x DAP10e KIR3DL1 28-28 KIR3DL1 LIR1 (密碼子最佳化) PD-1 (全) CTLA-4 (全) KIR3DL1 (全) NKG2A (全) TIGIT (全) LIR1-BTLA LIR1-PD-1 鉸鏈 (CD8) 核酸 ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTTGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT (SEQ ID NO: 79)
PD-1 PD-1 (全) TM (PD-1) 胺基酸 VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI (SEQ ID NO: 60)
PD-1 PD-1 (全) TM (PD-1) 核酸 GTTGGGGTTGTAGGTGGTCTGCTCGGCAGCCTGGTCTTGTTGGTGTGGGTCTTGGCTGTGATC (SEQ ID NO: 64)
CTLA-4 CTLA-4 (全) TM (CTLA-4) 胺基酸 DFLLWILAAVSSGLFFYSFLLT (SEQ ID NO: 68)
CTLA-4 CTLA-4 (全) TM (CTLA-4) 核酸 GATTTTCTGCTGTGGATTCTGGCAGCTGTGAGCTCTGGCTTGTTTTTCTACAGCTTCCTCCTGACC (SEQ ID NO: 80)
KIR3DL1 KIR3DL1-LIR1 KIR3DL1 2x DAP10e KIR3DL1 KIR3DL1 (全) TM (KIR3DL1) 胺基酸 ILIGTSVVIILFILLLFFLL (SEQ ID NO: 69)
KIR3DL1 KIR3DL1-LIR1 KIR3DL1 2x DAP10e KIR3DL1 KIR3DL1 (全) TM (KIR3DL1) 核酸 ATCCTGATCGGGACAAGTGTAGTAATCATACTTTTCATACTCCTGCTCTTTTTTCTCTTG (SEQ ID NO: 81)
LIR1 LIR1-KIR3DL1 LIR1 2x LIR1 (密碼子最佳化) LIR1-BTLA LIR1-PD1    TM (LIR1) 胺基酸 VIGILVAVILLLLLLLLLFLI (SEQ ID NO: 59)
LIR1 LIR1-KIR3DL1 LIR1 2x LIR1-BTLA LIR1-PD1 TM (LIR1) 核酸 GTTATAGGGATCCTGGTGGCTGTCATACTCCTCTTGCTCCTCTTGTTGCTGCTTTTTTTGATA (SEQ ID NO: 62)
LIR1 (密碼子最佳化) TM (LIR1) 核酸 GTGATCGGAATTCTGGTGGCCGTGATCCTGCTGCTCCTGCTTCTCCTCCTGCTGTTTCTGATC (SEQ ID NO: 82)
BTLA TM (BTLA) 核酸 LLPLGGLPLLITTCFCLFCCL (SEQ ID NO: 12)
BTLA TM (BTLA) 核酸 CTCTTGCCGTTGGGGGGTCTGCCACTTCTCATAACAACTTGCTTCTGCCTTTTTTGCTGTTTG (SEQ ID NO: 14)
CD28 TM (CD28) 胺基酸 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 11)
CD28 TM (CD28) 核酸 TTCTGGGTGCTCGTTGTTGTTGGCGGCGTGCTGGCCTGTTATTCCCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTC (SEQ ID NO: 83)
NKG2A TM (NKG2A-反向) 胺基酸 IVVITVVSAMLILCIIGLIGVIL (SEQ ID NO: 89)
NKG2A TM (NKG2A-反向) 胺基酸 ATAGTGGTCATCACTGTAGTTAGTGCAATGCTTATTCTTTGTATCATAGGGCTCATAGGGGTAATCCTG (SEQ ID NO: 90)
TIGIT TIGIT (全) TM (TIGIT) 胺基酸 LLGAMAATLVVICTAVIVVVA (SEQ ID NO: 91)
TIGIT TIGIT (全) TM (TIGIT) 核酸 CTGCTGGGCGCCATGGCCGCCACACTGGTTGTTATCTGTACCGCCGTGATCGTGGTGGTGGCC (SEQ ID NO: 92)
PD-1 PD-1 (全) 抑制性細胞溶質域1 (PD-1) 胺基酸 CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL (SEQ ID NO: 1)
PD-1 PD-1 (全) 抑制性細胞溶質域1 (PD-1) 核酸 TGTAGCCGAGCGGCCAGAGGCACAATCGGGGCAAGACGAACAGGACAGCCGCTCAAAGAGGACCCCAGTGCGGTCCCCGTTTTCTCCGTGGATTACGGAGAACTGGATTTCCAGTGGCGGGAGAAGACACCAGAGCCCCCGGTGCCCTGCGTGCCGGAGCAGACTGAGTACGCCACGATTGTGTTTCCCTCTGGAATGGGGACTTCATCCCCCGCTAGGCGCGGCTCAGCTGATGGCCCAAGATCCGCTCAACCGTTGCGGCCAGAGGACGGGCATTGCAGTTGGCCTCTG (SEQ ID NO: 51)
CTLA-4 CTLA-4 (全) 抑制性細胞溶質域1 (CTLA-4) 胺基酸 AVSLSKMLKKRSPLTTGVGVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN (SEQ ID NO: 67)
CTLA-4 CTLA-4 (全) 抑制性細胞溶質域1 (CTLA-4) 核酸 GCCGTGTCACTTAGTAAGATGCTGAAGAAGAGGTCACCACTGACGACAGGGGTTGGAGTGAAGATGCCACCCACAGAACCCGAATGTGAGAAGCAATTCCAGCCTTATTTCATTCCAATAAAT (SEQ ID NO: 84)
KIR3DL1 KIR3DL1-LIR1 KIR3DL1 2x DAP10e KIR3DL1 28-28 KIR3DL1 KIR3DL1 (全) 抑制性細胞溶質域1 (KIR3DL1) 胺基酸 HLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP (SEQ ID NO: 66)
KIR3DL1 KIR3DL1-LIR1 KIR3DL1 2x DAP10e KIR3DL1 28-28 KIR3DL1 KIR3DL1 (全) 抑制性細胞溶質域1 (KIR3DL1) 核酸 CATCTGTGGTGTTCTAATAAGAAGAATGCTGCTGTGATGGATCAAGAGCCCGCTGGTAACAGAACGGCCAACAGTGAAGATAGCGATGAGCAGGACCCAGAAGAAGTGACCTACGCCCAACTCGACCACTGTGTTTTTACGCAGCGGAAAATCACTCGACCCTCTCAACGACCCAAAACGCCGCCTACGGACACCATACTCTACACCGAACTGCCGAACGCCAAACCACGGTCCAAGGTGGTATCATGTCCG (SEQ ID NO: 85)
LIR1 LIR1-KIR3DL1 LIR1 2x LIR1 (密碼子最佳化) LIR1-BTLA LIR1-PD1 抑制性細胞溶質域1 (LIR1) 胺基酸 LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 50)
LIR1 LIR1-KIR3DL1 LIR1 2x LIR1-BTLA LIR1-PD1 抑制性細胞溶質域1 (LIR1) 核酸 TTGCGCCACAGACGGCAGGGAAAGCACTGGACTAGTACGCAGAGGAAAGCGGACTTCCAGCATCCCGCAGGAGCCGTGGGGCCTGAACCCACTGATCGCGGCCTTCAATGGAGGTCTAGCCCGGCGGCAGACGCACAAGAGGAAAACTTGTACGCAGCCGTTAAGCACACCCAACCGGAGGACGGCGTTGAGATGGATACCCGCTCCCCTCACGATGAAGACCCTCAAGCAGTCACTTACGCGGAAGTAAAGCATAGCCGCCCCAGACGGGAAATGGCTAGCCCGCCGTCCCCCCTTAGCGGGGAATTTCTGGACACTAAAGATAGGCAGGCGGAAGAGGACCGCCAAATGGATACAGAGGCGGCGGCAAGTGAAGCACCTCAAGACGTTACTTACGCTCAACTTCACAGCCTTACCCTCAGGCGAGAAGCGACTGAACCACCCCCTTCCCAAGAAGGGCCAAGCCCAGCGGTTCCTTCTATCTATGCTACTCTTGCTATTCAC (SEQ ID NO: 54)
LIR1 (密碼子最佳化) 抑制性細胞溶質域1 (LIR1) 核酸 密碼子最佳化 CTGCGGCACAGAAGGCAGGGCAAGCACTGGACAAGCACCCAGAGAAAGGCCGATTTTCAGCACCCTGCTGGCGCCGTTGGACCTGAGCCTACAGATAGAGGACTGCAGTGGCGGTCTAGCCCTGCTGCCGATGCTCAAGAGGAAAACCTGTACGCCGCCGTGAAGCACACCCAACCTGAAGATGGCGTGGAAATGGACACCAGATCTCCCCACGATGAGGACCCTCAGGCCGTGACATACGCTGAAGTGAAGCACTCCCGGCCTCGGAGAGAAATGGCTAGCCCTCCAAGTCCTCTGAGCGGCGAGTTCCTGGACACCAAGGATAGACAGGCCGAAGAGGACCGGCAGATGGATACAGAAGCTGCCGCCTCTGAAGCCCCACAGGATGTGACATATGCCCAGCTGCATAGCCTGACACTGCGGAGAGAAGCCACAGAGCCTCCACCTTCTCAAGAGGGCCCATCTCCAGCCGTGCCTAGCATCTATGCCACACTGGCCATTCAC (SEQ ID NO: 86)
BTLA 抑制性細胞溶質域1 (BTLA) 胺基酸 RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS (SEQ ID NO: 3)
BTLA 抑制性細胞溶質域1 (BTLA) 核酸 AGAAGACATCAGGGGAAGCAGAATGAACTCAGCGATACAGCAGGGCGAGAAATTAATTTGGTAGACGCGCATCTGAAGTCCGAACAGACAGAGGCTTCTACTAGACAGAACTCCCAAGTTTTGTTGAGTGAGACGGGGATCTATGATAATGATCCCGATCTGTGTTTTAGAATGCAGGAGGGTAGTGAAGTCTACTCAAACCCGTGCCTGGAAGAAAATAAGCCCGGCATTGTTTACGCTAGTTTGAATCATTCTGTAATAGGCCCGAACTCCAGACTGGCTCGCAATGTGAAGGAGGCCCCAACTGAGTATGCGTCCATTTGCGTGCGGTCT (SEQ ID NO: 52)
NKG2A 抑制性細胞溶質域1 (NKG2A-反向) 胺基酸 KEPASPLDKCHYTKDNGQFDQSAKQLNLEAYTIEQETALISNKNGKPKRQQRKPNPPLNLDSYIVGQNDM (SEQ ID NO: 93)
NKG2A 抑制性細胞溶質域1 (NKG2A-反向) 核酸 AAGGAGCCTGCGTCCCCGTTGGATAAATGCCACTATACTAAGGATAACGGTCAGTTCGATCAGAGTGCAAAGCAACTTAACTTGGAGGCTTACACTATAGAGCAAGAAACAGCGCTGATAAGTAATAAGAACGGTAAGCCAAAGCGACAGCAGAGGAAACCCAATCCTCCGCTTAACTTGGATAGCTACATCGTCGGGCAAAATGACATG (SEQ ID NO: 94)
LIR1-KIR3DL1 KIR3DL1 2x 抑制性細胞溶質域2 (KIR3DL1) 胺基酸 SEQ ID NO: 66
LIR1-KIR3DL1 KIR3DL1 2x 抑制性細胞溶質域2 (KIR3DL1) 核酸 SEQ ID NO: 85
KIR3DL1-LIR1 LIR1 2x 抑制性細胞溶質域2 (LIR1) 胺基酸 SEQ ID NO: 50
KIR3DL1-LIR1 LIR1 2x 抑制性細胞溶質域2 (LIR1) 核酸 SEQ ID NO: 54
LIR1-BTLA 抑制性細胞溶質域2 (BTLA) 胺基酸 RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS (SEQ ID NO: 3)
LIR1-BTLA 抑制性細胞溶質域2 (BTLA) 核酸 AGAAGACATCAGGGGAAGCAGAATGAACTCAGCGATACAGCAGGGCGAGAAATTAATTTGGTAGACGCGCATCTGAAGTCCGAACAGACAGAGGCTTCTACTAGACAGAACTCCCAAGTTTTGTTGAGTGAGACGGGGATCTATGATAATGATCCCGATCTGTGTTTTAGAATGCAGGAGGGTAGTGAAGTCTACTCAAACCCGTGCCTGGAAGAAAATAAGCCCGGCATTGTTTACGCTAGTTTGAATCATTCTGTAATAGGCCCGAACTCCAGACTGGCTCGCAATGTGAAGGAGGCCCCAACTGAGTATGCGTCCATTTGCGTGCGGTCT (SEQ ID NO: 52)
LIR1-PD1 抑制性細胞溶質域2 (PD-1) 胺基酸 CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL (SEQ ID NO: 1)
LIR1-PD1 抑制性細胞溶質域2 (PD-1) 核酸 TGTAGCCGAGCGGCCAGAGGCACAATCGGGGCAAGACGAACAGGACAGCCGCTCAAAGAGGACCCCAGTGCGGTCCCCGTTTTCTCCGTGGATTACGGAGAACTGGATTTCCAGTGGCGGGAGAAGACACCAGAGCCCCCGGTGCCCTGCGTGCCGGAGCAGACTGAGTACGCCACGATTGTGTTTCCCTCTGGAATGGGGACTTCATCCCCCGCTAGGCGCGGCTCAGCTGATGGCCCAAGATCCGCTCAACCGTTGCGGCCAGAGGACGGGCATTGCAGTTGGCCTCTG (SEQ ID NO: 51)
DAP10e KIR3DL1 鉸鏈 (CD8-DAP10e) 胺基酸 TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLP (SEQ ID NO: 70)
DAP10e KIR3DL1 鉸鏈 (CD8-DAP10e) 核酸 ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTTGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATCAGACCACACCTGGCGAGAGATCTTCCCTGCCTGCCTTCTATCCTGGCACCAGCGGCTCTTGTTCTGGCTGTGGATCACTGAGCCTGCCT (SEQ ID NO: 87)
28-28 KIR3DL1 鉸鏈 (CD28) 胺基酸 AAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (SEQ ID NO: 31)
28-28 KIR3DL1 鉸鏈 (CD28) 核酸 GCCGCTGCTATCGAAGTGATGTACCCTCCTCCTTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGTCCTTCTCCACTGTTCCCCGGACCTAGCAAGCCT (SEQ ID NO: 88)
TIGIT TIGIT (全) 抑制性細胞溶質域1 (TIGIT) 胺基酸 LTRKKKALRIHSVEGDLRRKSAGQEEWSPSAPSPPGSCVQAEAAPAGLCGEQRGEDCAELHDYFNVLSYRSLGNCSFFTETG (SEQ ID NO: 95)
TIGIT TIGIT (全) 抑制性細胞溶質域1 (TIGIT) 核酸 CTGACCAGAAAGAAGAAGGCCCTGAGAATCCACAGCGTGGAAGGCGACCTGCGGAGAAAGTCTGCCGGACAAGAAGAGTGGTCCCCTAGCGCTCCATCTCCACCTGGATCTTGTGTGCAGGCCGAAGCAGCTCCTGCTGGACTGTGTGGCGAACAGAGAGGCGAAGATTGCGCCGAGCTGCACGACTACTTCAACGTGCTGAGCTACAGAAGCCTGGGCAACTGCAGCTTCTTCACCGAGACAGGA (SEQ ID NO: 96)
PD-1 (全) ECD (PD-1)胺基酸 FLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLV (SEQ ID NO: 97)
PD-1 (全) ECD (PD-1)核酸 TTCCTGGACAGCCCCGACAGACCTTGGAACCCTCCTACATTCAGCCCCGCTCTGCTGGTGGTTACCGAGGGCGATAATGCCACCTTCACCTGTAGCTTCAGCAACACCAGCGAGAGCTTCGTGCTGAACTGGTACAGAATGAGCCCCAGCAACCAGACCGACAAGCTGGCCGCCTTTCCTGAGGATAGATCTCAGCCCGGCCAGGACTGCCGGTTCAGAGTTACACAGCTGCCCAACGGCCGGGACTTCCACATGTCTGTCGTCCGGGCCAGAAGAAACGACAGCGGCACATATCTGTGCGGCGCCATTTCTCTGGCCCCTAAGGCTCAGATCAAAGAGAGCCTGAGAGCCGAGCTGAGAGTGACAGAAAGACGGGCCGAAGTGCCCACAGCTCACCCTTCACCTTCTCCAAGACCTGCCGGCCAGTTTCAGACACTGGTT (SEQ ID NO: 98)
CTLA-4 (全) ECD (CTLA-4)胺基酸 KAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLT (SEQ ID NO: 99)
CTLA-4 (全) ECD (CTLA-4)核酸 AAGGCCATGCATGTGGCTCAGCCTGCTGTGGTGCTGGCCTCTTCTAGAGGAATCGCCAGCTTCGTGTGCGAGTACGCCTCTCCTGGAAAGGCCACTGAAGTGCGCGTGACCGTTCTGAGACAGGCCGATAGCCAAGTGACCGAAGTGTGCGCCGCCACCTACATGATGGGCAACGAGCTGACCTTCCTGGACGACAGCATCTGTACCGGCACCAGCAGCGGCAATCAAGTGAACCTGACCATCCAGGGCCTGAGAGCCATGGATACCGGCCTGTACATCTGCAAGGTGGAACTGATGTACCCTCCTCCTTACTACCTCGGCATCGGCAACGGCACCCAGATCTACGTGATCGACCCTGAGCCTTGTCCTGACAGCGACTTTCTGCTGTGGATCCTGGCTGCCGTGTCCAGCGGCCTGTTCTTCTACTCTTTTCTGCTGACC (SEQ ID NO: 100)
KIR3DL1 (全) ECD (KIR3DL1)胺基酸 HMGGQDKPFLSAWPSAVVPRGGHVTLRCHYRHRFNNFMLYKEDRIHIPIFHGRIFQESFNMSPVTTAHAGNYTCRGSHPHSPTGWSAPSNPVVIMVTGNHRKPSLLAHPGPLVKSGERVILQCWSDIMFEHFFLHKEGISKDPSRLVGQIHDGVSKANFSIGPMMLALAGTYRCYGSVTHTPYQLSAPSDPLDIVVTGPYEKPSLSAQPGPKVQAGESVTLSCSSRSSYDMYHLSREGGAHERRLPAVRKVNRTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFRHSPYEWSDPSDPLLVSVTGNPSSSWPSPTEPSSKSGNPRHLH (SEQ ID NO: 101)
KIR3DL1 (全) ECD (KIR3DL1)核酸 CACATGGGCGGACAGGATAAGCCTTTCCTGAGCGCCTGGCCTTCTGCCGTTGTTCCTAGAGGCGGACACGTGACCCTGCGGTGTCACTACAGACACCGGTTCAACAACTTCATGCTGTACAAAGAGGACCGGATTCACATCCCCATCTTCCACGGCCGGATCTTCCAAGAGTCCTTCAACATGAGCCCCGTGACCACAGCTCACGCCGGCAACTACACATGCAGAGGCTCTCACCCTCACAGCCCTACAGGCTGGAGTGCCCCTTCTAACCCCGTGGTCATCATGGTCACCGGCAACCACAGAAAGCCCAGCCTGCTTGCTCATCCCGGACCTCTGGTTAAGTCTGGCGAGCGAGTGATCCTGCAGTGTTGGAGCGATATTATGTTCGAGCACTTCTTTCTGCACAAAGAGGGCATCAGCAAGGACCCCTCTAGACTCGTGGGCCAGATCCATGATGGCGTGTCCAAGGCCAACTTCAGCATCGGCCCTATGATGCTGGCCCTGGCCGGCACCTATAGATGTTACGGCAGCGTGACCCACACACCTTACCAGCTGAGCGCCCCTAGCGACCCTCTGGATATCGTGGTCACAGGCCCCTACGAGAAGCCTAGCCTGTCTGCACAGCCTGGACCTAAAGTGCAGGCCGGCGAAAGCGTGACACTGAGCTGTAGCAGCAGATCCAGCTACGACATGTACCACCTGAGCAGAGAAGGCGGAGCCCACGAGAGAAGGCTGCCTGCCGTCAGAAAAGTGAACCGGACCTTCCAGGCCGACTTTCCTCTGGGACCTGCTACACACGGCGGCACCTACCGGTGTTTCGGCAGCTTTAGACACAGCCCTTACGAGTGGAGCGACCCCTCTGATCCTCTGCTGGTGTCTGTGACCGGCAATCCTAGCAGCAGCTGGCCCTCTCCAACAGAGCCTTCTAGCAAGAGCGGCAACCCCAGACATCTGCAC (SEQ ID NO: 102)
TIGIT (全) ECD (TIGIT)胺基酸 MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIP (SEQ ID NO: 103)
TIGIT (全) ECD (TIGIT)核酸 ATGATGACCGGCACCATCGAGACAACCGGCAACATCTCTGCCGAGAAAGGCGGCAGCATCATCCTGCAGTGTCACCTGTCTAGCACCACCGCTCAAGTGACCCAAGTGAACTGGGAGCAGCAGGATCAGCTGCTGGCCATCTGCAATGCCGATCTCGGCTGGCACATCAGCCCCAGCTTCAAGGATAGAGTGGCCCCTGGACCTGGCCTGGGACTGACACTTCAGAGCCTGACCGTGAACGATACCGGCGAGTACTTCTGCATCTACCACACATACCCCGACGGCACCTATACCGGCCGGATCTTTCTGGAAGTGCTGGAAAGCTCTGTGGCCGAGCACGGCGCCAGATTTCAGATTCCT (SEQ ID NO: 104)
NKG2A (全) 抑制性細胞溶質域1 (NKG2A) 胺基酸 MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKNSILATEQEITYAELNLQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAPEK (SEQ ID NO: 105)
NKG2A (全) 抑制性細胞溶質域1 (NKG2A) 核酸 ATGGACAACCAGGGCGTGATCTACAGCGACCTGAACCTGCCTCCTAATCCTAAGCGGCAGCAGAGAAAGCCCAAGGGCAACAAGAACAGCATCCTGGCCACCGAGCAAGAGATCACCTACGCCGAGCTGAATCTGCAGAAGGCCAGCCAGGACTTCCAGGGCAACGACAAGACCTACCACTGCAAGGACCTGCCTAGCGCTCCCGAGAAG (SEQ ID NO: 106)
NKG2A (全) TM (NKG2A)胺基酸 LIVGILGIICLILMASVVTIVVI (SEQ ID NO: 107)
NKG2A (全) TM (NKG2A)核酸 CTGATCGTGGGAATCCTGGGCATCATCTGCCTGATCCTGATGGCCAGCGTGGTCACCATCGTGGTCATC (SEQ ID NO: 108)
NKG2A (全) ECD (NKG2A)胺基酸 PSTLIQRHNNSSLNTRTQKARHCGHCPEEWITYSNSCYYIGKERRTWEESLLACTSKNSSLLSIDNEEEMKFLSIISPSSWIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKDSDNAELNCAVLQVNRLKSAQCGSSIIYHCKHKL (SEQ ID NO: 109)
NKG2A (全) ECD (NKG2A)核酸 CCCAGCACACTGATCCAGCGGCACAACAACAGCAGCCTGAACACCAGAACACAGAAGGCCCGGCACTGCGGCCACTGTCCTGAAGAGTGGATCACATACAGCAACAGCTGCTACTACATCGGCAAAGAGCGGCGGACCTGGGAAGAATCTCTGCTGGCCTGCACCAGCAAGAACTCCAGCCTGCTGAGCATCGACAACGAGGAAGAGATGAAGTTCCTGTCCATCATCAGCCCCAGCAGCTGGATCGGCGTGTTCAGAAACAGCTCCCACCATCCTTGGGTCACCATGAACGGCCTGGCCTTCAAGCACGAGATCAAGGACAGCGACAACGCCGAACTGAACTGTGCCGTGCTGCAAGTGAACCGGCTGAAGTCTGCCCAGTGTGGCAGCAGCATCATCTATCACTGCAAGCACAAGCTG (SEQ ID NO: 110)
NKG2A (全) 標籤 (NGAA (SEQ ID NO: 133) + Myctag)胺基酸 NGAAEQKLISEEDL (SEQ ID NO: 111)
NKG2A (全) 標籤 (NGAA (SEQ ID NO: 133) + Myctag)核酸 AATGGGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAAGATCTG (SEQ ID NO: 112)
結果
NK細胞經過工程改造以表現活化嵌合受體(aCAR)及具有各種抑制性域形式之抑制性嵌合受體(iCAR)，諸如衍生自不同抑制性受體之各種抑制性域、各種CAR序列(例如，各種跨膜或鉸鏈序列)及/或抑制性域之各種串聯組織。所評估之形式描述於表 14 中。用僅aCAR或其與具有各種所指示之抑制性域之iCAR之組合對NK細胞進行病毒轉導。然後針對iCAR減少aCAR誘導之NK細胞介導之靶細胞殺傷及NK細胞細胞介素產生來對經工程改造之NK細胞進行評估。結果表明，NK成功地經工程改造以共表現aCAR及iCAR，在不存在iCAR配體之情況下以aCAR配體依賴性方式成功地殺傷靶細胞並產生細胞介素，且以iCAR配體依賴性方式成功地減少NK介導之殺傷及細胞介素產生。實例 8 ：各種抑制性嵌合受體在減少 NK 細胞活化方面之進一步評估 材料及方法
將個別iCAR及aCAR構築體包裝至慢病毒粒子中並用於在用K562餵養細胞與500 U/mL IL-2及20 ng/uL IL-15擴增10天之後轉導初代NK細胞。藉由p24力價設定病毒量(每次轉導750,000 pg)。iCAR構築體含有puroR匣且在轉導之後第4天至第7天，將嘌黴素添加至NK細胞培養物中，此時藉由流式細胞分析技術評估擴增且將NK細胞轉移至微孔盤中以供用12,500個NK細胞及50,000個總腫瘤細胞之殺傷檢定。將NK細胞與以下一起培養：(1)僅表現aCAR抗原之腫瘤細胞(SEM細胞)；(2)表現aCAR抗原及iCAR抗原之腫瘤細胞；或(3)混合之兩種腫瘤細胞型。16-18 h之後，藉由流式細胞分析技術分析培養物並對各類型之剩餘活靶細胞進行計數。藉由首先計算總殺傷(與僅靶標條件相比的靶標減少)，然後扣除藉由對照(僅iCAR) NK細胞之總殺傷來定量aCAR介導之給定NK細胞型殺傷(扣除基底)。將iCAR介導之保護定量為具有或不具有iCAR抗原之靶標之間的aCAR介導之殺傷之變化。分析殺傷檢定上清液之TNFα分泌，且與殺傷類似地計算aCAR及iCAR性能度量。對於表現分析，用aV5-Alexafluor 647染色iCAR且用aFLAG-BV-421染色aCAR。基於iCAR+/-及aCAR+/-表現狀態，將細胞指派至4個象限，使吾等能夠評估「%aCAR+iCAR+」 及「%非 aCAR+iCAR-」(aCAR+iCAR-未經閘控且欲避免潛在毒性的CAR-NK細胞)。為了進一步分析表現水準，吾等量測了aCAR+iCAR+亞群體之aCAR及iCAR之中位數螢光強度(MFI)，其藉由相應螢光通道中之未經轉導之NK細胞之MFI經正規化。對於各iCAR，進行1-3次生物性重複(展示為具有相同標誌物類型的不同點)。X及Y誤差線(適用時)：+/-平均值之標準誤差。
所評估之iCAR構築體之序列展示於表 15 中。各iCAR構築體形式自N末端之C末端為：訊息序列1-訊息序列2-scFv-標籤-鉸鏈-TM-抑制性細胞溶質域1-抑制性細胞溶質域2 (若存在)。所評估之NKG2A形式不包括訊息序列2。aCAR形式使用CD28-CD3z形式，其自N末端至C末端為：訊息序列-標籤-scFv-鉸鏈-TM-細胞內傳訊域1-細胞內傳訊域2(參見表 10B 中所示之序列)。表 15-NK 細胞之 iCAR 形式及域
構築體(藉由ICD) 域 序列
BTLA LIR1 LIR1 2x LIR1-KIR3DL1 KIR3DL1 KIR3DL1 2x NKG2A NKG2A (LIR1 TM) 訊息序列1 (CD8) 胺基酸 MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 71)
BTLA LIR1 LIR1 2x LIR1-KIR3DL1 KIR3DL1 KIR3DL1 2x NKG2A NKG2A (LIR1 TM) 訊息序列1 (CD8) 核酸 ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG (SEQ ID NO: 72)
BTLA LIR1 LIR1 2x LIR1-KIR3DL1 KIR3DL1 KIR3DL1 2x 訊息序列2 (pelB) 胺基酸 KYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA (SEQ ID NO: 73)
BTLA LIR1 LIR1 2x LIR1-KIR3DL1 KIR3DL1 KIR3DL1 2x 訊息序列2 (pelB) 核酸 AAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC (SEQ ID NO: 74)
BTLA LIR1 LIR1 2x LIR1-KIR3DL1 KIR3DL1 KIR3DL1 2x NKG2A NKG2A (LIR1 TM) scFv (具有(G4S)3連接子(SEQ ID NO: 27)之iCAR特異性scFv)    具有(G4S)3連接子(SEQ ID NO: 27)之iCAR抗原特異性scFv
BTLA LIR1 LIR1 2x LIR1-KIR3DL1 KIR3DL1 KIR3DL1 2x NKG2A NKG2A (LIR1 TM) 標籤 (V5 + NGAA連接子(SEQ ID NO: 133)) 胺基酸 GKPIPNPLLGLDSTNGAA (SEQ ID NO: 77)
BTLA LIR1 LIR1 2x LIR1-KIR3DL1 KIR3DL1 KIR3DL1 2x NKG2A NKG2A (LIR1 TM) 標籤 (V5 + NGAA連接子(SEQ ID NO: 133)) 核酸 GGGAAGCCTATCCCGAACCCTCTGTTGGGTCTCGATAGTACCAATGGGGCCGCA (SEQ ID NO: 78)
BTLA LIR1 LIR1 2x LIR1-KIR3DL1 KIR3DL1 KIR3DL1 2x NKG2A NKG2A (LIR1 TM) 鉸鏈 (CD8) 胺基酸 TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 37)
BTLA LIR1 LIR1 2x LIR1-KIR3DL1 KIR3DL1 KIR3DL1 2x NKG2A NKG2A (LIR1 TM) 鉸鏈 (CD8) 核酸 ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTTGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT (SEQ ID NO: 79)
KIR3DL1 KIR3DL1 2x TM (KIR3DL1) 胺基酸 ILIGTSVVIILFILLLFFLL (SEQ ID NO: 69)
KIR3DL1 KIR3DL1 2x TM (KIR3DL1) 核酸 ATCCTGATCGGGACAAGTGTAGTAATCATACTTTTCATACTCCTGCTCTTTTTTCTCTTG (SEQ ID NO: 81)
LIR1 LIR1-KIR3DL1 LIR1 2x NKG2A (LIR1 TM) TM (LIR1) 胺基酸 VIGILVAVILLLLLLLLLFLI (SEQ ID NO: 59)
LIR1 LIR1-KIR3DL1 LIR1 2x TM (LIR1) 核酸 GTTATAGGGATCCTGGTGGCTGTCATACTCCTCTTGCTCCTCTTGTTGCTGCTTTTTTTGATA (SEQ ID NO: 62)
NKG2A (LIR1 TM) TM (LIR1) 核酸 GTGATCGGCATTCTGGTGGCCGTGATTCTGCTGCTCCTGCTGTTGCTGCTGCTGTTCCTGATC (SEQ ID NO: 131)
BTLA TM (BTLA) 核酸 LLPLGGLPLLITTCFCLFCCL (SEQ ID NO: 12)
BTLA TM (BTLA) 核酸 CTCTTGCCGTTGGGGGGTCTGCCACTTCTCATAACAACTTGCTTCTGCCTTTTTTGCTGTTTG (SEQ ID NO: 14)
NKG2A TM (NKG2A) 胺基酸 LIVGILGIICLILMASVVTIVVI (SEQ ID NO: 107)
NKG2A TM (NKG2A) 胺基酸 CTGATCGTGGGCATCCTGGGCATCATCTGTCTGATCCTGATGGCCAGCGTGGTCACCATCGTGGTCATC (SEQ ID NO: 132)
KIR3DL1 KIR3DL1 2x 抑制性細胞溶質域1 (KIR3DL1) 胺基酸 HLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP (SEQ ID NO: 66)
KIR3DL1 KIR3DL1 2x 抑制性細胞溶質域1 (KIR3DL1) 核酸 CATCTGTGGTGTTCTAATAAGAAGAATGCTGCTGTGATGGATCAAGAGCCCGCTGGTAACAGAACGGCCAACAGTGAAGATAGCGATGAGCAGGACCCAGAAGAAGTGACCTACGCCCAACTCGACCACTGTGTTTTTACGCAGCGGAAAATCACTCGACCCTCTCAACGACCCAAAACGCCGCCTACGGACACCATACTCTACACCGAACTGCCGAACGCCAAACCACGGTCCAAGGTGGTATCATGTCCG (SEQ ID NO: 85)
LIR1 LIR1-KIR3DL1 LIR1 2x 抑制性細胞溶質域1 (LIR1) 胺基酸 LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 50)
LIR1 LIR1-KIR3DL1 LIR1 2x 抑制性細胞溶質域1 (LIR1) 核酸 TTGCGCCACAGACGGCAGGGAAAGCACTGGACTAGTACGCAGAGGAAAGCGGACTTCCAGCATCCCGCAGGAGCCGTGGGGCCTGAACCCACTGATCGCGGCCTTCAATGGAGGTCTAGCCCGGCGGCAGACGCACAAGAGGAAAACTTGTACGCAGCCGTTAAGCACACCCAACCGGAGGACGGCGTTGAGATGGATACCCGCTCCCCTCACGATGAAGACCCTCAAGCAGTCACTTACGCGGAAGTAAAGCATAGCCGCCCCAGACGGGAAATGGCTAGCCCGCCGTCCCCCCTTAGCGGGGAATTTCTGGACACTAAAGATAGGCAGGCGGAAGAGGACCGCCAAATGGATACAGAGGCGGCGGCAAGTGAAGCACCTCAAGACGTTACTTACGCTCAACTTCACAGCCTTACCCTCAGGCGAGAAGCGACTGAACCACCCCCTTCCCAAGAAGGGCCAAGCCCAGCGGTTCCTTCTATCTATGCTACTCTTGCTATTCAC (SEQ ID NO: 54)
BTLA 抑制性細胞溶質域1 (BTLA) 胺基酸 RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS (SEQ ID NO: 3)
BTLA 抑制性細胞溶質域1 (BTLA) 核酸 AGAAGACATCAGGGGAAGCAGAATGAACTCAGCGATACAGCAGGGCGAGAAATTAATTTGGTAGACGCGCATCTGAAGTCCGAACAGACAGAGGCTTCTACTAGACAGAACTCCCAAGTTTTGTTGAGTGAGACGGGGATCTATGATAATGATCCCGATCTGTGTTTTAGAATGCAGGAGGGTAGTGAAGTCTACTCAAACCCGTGCCTGGAAGAAAATAAGCCCGGCATTGTTTACGCTAGTTTGAATCATTCTGTAATAGGCCCGAACTCCAGACTGGCTCGCAATGTGAAGGAGGCCCCAACTGAGTATGCGTCCATTTGCGTGCGGTCT (SEQ ID NO: 52)
NKG2A NKG2A (LIR1 TM) 抑制性細胞溶質域1 (NKG2A) 胺基酸 MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKNSILATEQEITYAELNLQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAPEK (SEQ ID NO: 105)
NKG2A NKG2A (LIR1 TM) 抑制性細胞溶質域1 (NKG2A) 核酸 ATGGACAACCAGGGCGTCATCTACAGCGACCTGAACCTGCCTCCTAATCCAAAGCGGCAGCAGCGGAAGCCCAAGGGCAACAAGAATAGCATCCTGGCCACCGAGCAAGAGATCACCTACGCCGAGCTGAATCTGCAGAAGGCCAGCCAGGATTTCCAGGGCAACGACAAGACCTACCACTGCAAGGACCTGCCTAGCGCTCCTGAGAAA (SEQ ID NO: 130)
LIR1-KIR3DL1 KIR3DL1 2x 抑制性細胞溶質域2 (KIR3DL1) 胺基酸 SEQ ID NO: 66
LIR1-KIR3DL1 KIR3DL1 2x 抑制性細胞溶質域2 (KIR3DL1) 核酸 SEQ ID NO: 85
LIR1 2x 抑制性細胞溶質域2 (LIR1) 胺基酸 SEQ ID NO: 50
LIR1 2x 抑制性細胞溶質域2 (LIR1) 核酸 SEQ ID NO: 54
結果
NK細胞經過工程改造以表現活化嵌合受體(aCAR)及具有各種抑制性域形式之抑制性嵌合受體(iCAR)，諸如衍生自不同抑制性受體之各種抑制性域、各種CAR序列(例如，各種跨膜或鉸鏈序列)及/或抑制性域之各種串聯組織。所評估之形式描述於表 15 中。用僅aCAR或其與具有各種所指示之抑制性域之iCAR之組合對NK細胞進行病毒轉導。
評估經工程改造之NK細胞之CAR表現。如圖 20 中所示，在aCAR+iCAR+ NK細胞(上圖)中，aCAR表現通常高於背景大於10倍，且iCAR通常大於100倍。LIR1構築體展示出相對於其他構築體明顯高的表現。亦評估了CAR表現群體之概況(下圖)且表明總群體含有少於5% aCAR+iCAR-細胞且對於各種iCAR形式具有不同百分比的aCAR+iCAR+群體。再次，相對於其他構築體，含有LIR1之iCAR通常明顯展示出較大比例的aCAR+iCAR+細胞。
接下來，評估了aCAR誘導之NK細胞介導之靶細胞殺傷及NK細胞細胞介素產生之iCAR減少。評估靶SEM細胞中之各者單獨地(「單獨」：僅aCAR抗原SEM細胞及共表現aCAR/iCAR抗原之SEM細胞單獨地)或在混合的靶細胞及非靶細胞之群體之情況下(「混合的」：僅aCAR抗原SEM細胞及共表現aCAR/iCAR抗原之SEM細胞一起在同一培養物中)之減少。如圖 21 中所示，表現LIR1、LIR1 (2x)、KIR3DL1、KIR3DL1 (2x) iCAR形式之NK細胞展現出一致的aCAR介導之殺傷性能(上圖)及iCAR介導之殺傷(上圖)及細胞介素產生(下圖)之保護，BTLA及NKG2A構築體之性能改變較大。
結果表明，NK成功地經工程改造以共表現aCAR及iCAR，在不存在iCAR配體之情況下以aCAR配體依賴性方式成功地殺傷靶細胞並產生細胞介素，且以iCAR配體依賴性方式成功地減少NK介導之殺傷及細胞介素產生。 以引用的方式併入
本申請案中所引用的所有公開案、專利、專利申請案和其他文件出於所有目的據此以用的方式整體併入，其程度如同各個別公開案、專利、專利申請案或其他文件出於所有目的個別地以引用的方式併入。 等效物
儘管已經說明並描述了各種特定實施例，但是上文說明書不具有限制性。應當理解，可在不背離本揭露的精神及範圍之情況下進行各種改變。許多變化在回顧本說明書之後對於熟習此項技術者而言為顯而易見的。
本發明之這些及其他特徵、態樣及優勢將關於以下描述及隨附圖式得到更好的理解，在隨附圖式中：
圖 1A 展示共表現抗CD19-BTLA iCAR及抗CD19-CD28/CD3ζ aCAR之T細胞接觸表現CD19之靶細胞的示範性圖。圖 1B 展示無任一CAR構築體表現的陰性對照細胞。圖 1C 展示經轉導之T細胞中之抗CD19-CD28/CD3ζ aCAR表現。圖 1D 展示經轉導之T細胞中之抗CD19-CD28/CD3ζ aCAR及抗CD19-BTLA iCAR表現。圖 2A 展示與單獨抗CD19 aCAR相比，抗CD19 aCAR及抗CD19 iCAR之共表現減少T細胞之TNF-α產生。圖 2B 展示與單獨抗CD19 aCAR相比，抗CD19 aCAR及抗CD19 iCAR之共表現減少T細胞之IFN-γ產生。圖 2C 展示與單獨CD19 aCAR相比，抗CD19 aCAR及抗CD19 iCAR之共表現減少T細胞之IL-2產生。圖 3 展示與單獨抗CD19 aCAR相比，抗CD19 aCAR及抗CD19 iCAR之共表現減少T細胞細胞毒性。圖 4A 展示共表現抗CD19-BTLA iCAR及抗CD20-CD28/CD3ζ aCAR之T細胞接觸表現CD19及CD20之靶細胞的示範性圖。圖 4B 展示無任一CAR構築體表現的陰性對照細胞。圖 4C 展示經轉導之T細胞中之抗CD20-CD28/CD3ζ aCAR表現。圖 4D 展示經轉導之T細胞中之抗CD20-CD28/CD3ζ aCAR及抗CD19-BTLA iCAR表現。圖 5A 展示與單獨抗CD20 aCAR相比，抗CD20 aCAR及抗CD19 iCAR之共表現減少T細胞之TNF-α產生。圖 5B 展示與單獨抗CD20 aCAR相比，抗CD20 aCAR及抗CD19 iCAR之共表現減少T細胞之IFN-γ產生。圖 5C 展示與單獨CD20 aCAR相比，抗CD20 aCAR及抗CD19 iCAR之共表現減少T細胞之IL-2產生。圖 6 展示共表現所指示之抗Her2抑制性域iCAR之嘌黴素選擇T細胞中之抗Axl-CD3ζ-mCherry aCAR表現。圖 7A 展示共表現抗Axl-CD3ζ aCAR及抗Her2抑制性域iCAR之T細胞接觸表現Axl、Her2、Axl與Her2蛋白或兩種蛋白均不表現之靶細胞的示範性圖。圖 7B 展示在接觸所指示之靶細胞之後，共表現抗Axl-CD3ζ aCAR及所指示之抗Her2抑制性域iCAR之T細胞之IL-2分泌。圖 7C 展示在接觸所指示之靶細胞之後，共表現抗Axl-CD3ζ aCAR及所指示之抗Her2抑制性域iCAR之T細胞之IFN-γ分泌。圖 8A 展示未經轉導之NK細胞以及經轉導之NK細胞中抗Her2-BTLA-GFP iCAR之表現。圖 8B 展示經單或雙重轉導之NK細胞中抗Her2-BTLA-GFP iCAR及抗Axl-CD3ζ-mCherry aCAR之表現之螢光顯微鏡影像。圖 9A 展示與表現抗Axl aCAR、抗Her2 iCAR或aCAR與iCAR之NK細胞一起孵育4小時之後靶細胞之溶解百分比。圖 9B 展示與表現抗Axl aCAR、抗Her2 iCAR或aCAR與iCAR之NK細胞一起孵育8小時之後靶細胞之溶解百分比。圖 10 展示如藉由流式細胞分析技術所評估，在NK細胞之轉導之後，aCAR及各種iCAR形式之表現，包括共表現。圖 11 展示親代靶細胞(柱1)、僅表現aCAR抗原之靶細胞(柱2)或表現aCAR抗原及iCAR抗原之靶細胞(柱3)之NK細胞介導之殺傷。展示了經工程改造以僅表現aCAR或經工程改造以表現aCAR及所指示之iCAR的各種NK細胞之殺傷。圖 12 展示混合群體中僅表現aCAR抗原之靶細胞(柱1)或混合群體中表現aCAR抗原及iCAR抗原之靶細胞(柱2)之NK細胞介導之殺傷。展示了經工程改造以僅表現aCAR或經工程改造以表現aCAR及所指示之iCAR的各種NK細胞之殺傷。圖 13 展示在與親代靶細胞(柱1)、僅表現aCAR抗原之靶細胞(柱2)、表現aCAR抗原及iCAR抗原之靶細胞(柱3)或僅表現aCAR抗原或表現aCAR抗原及iCAR抗原之靶細胞之混合群體共培養之後TNFα (左上)、顆粒酶B (左下)及IFNγ (右上)之NK細胞介導之產生。展示了經工程改造以僅表現aCAR或經工程改造以表現aCAR及所指示之iCAR的各種NK細胞之細胞介素產生。圖 14 展示親代靶細胞(柱1)、僅表現aCAR抗原之靶細胞(柱2)、表現aCAR抗原及iCAR抗原之靶細胞(柱3)、混合群體中僅表現aCAR之靶細胞(柱4)或混合群體中表現aCAR抗原及iCAR抗原之靶細胞(柱5)之NK細胞介導之殺傷。展示了經工程改造以僅表現aCAR或經工程改造以表現aCAR及所指示之iCAR的各種NK細胞之殺傷。圖 15 展示如藉由流式細胞分析技術所評估，在NK細胞之轉導之後，aCAR及各種iCAR形式之表現，包括共表現。圖 16 展示親代靶細胞(柱1)、僅表現aCAR抗原之靶細胞(柱2)或表現aCAR抗原及iCAR抗原之靶細胞(柱3)之NK細胞介導之殺傷。展示了經工程改造以僅表現aCAR或經工程改造以表現aCAR及所指示之iCAR的各種NK細胞之殺傷。圖 17 展示如藉由流式細胞分析技術所評估，在T細胞之轉導之後，aCAR及各種iCAR形式之表現，包括共表現。圖 18 展示親代靶細胞(柱1)、僅表現iCAR抗原之靶細胞(柱2)、僅表現aCAR抗原之靶細胞(柱3)或表現aCAR抗原及iCAR抗原之靶細胞(柱4)之T細胞介導之殺傷。展示了經工程改造以僅表現aCAR或經工程改造以表現aCAR及所指示之iCAR的各種T細胞之殺傷。圖 19 展示親代靶細胞(柱1)、僅表現iCAR抗原之靶細胞(柱2)、僅表現aCAR抗原之靶細胞(柱3)或表現aCAR抗原及iCAR抗原之靶細胞(柱4)之T細胞介導之IL-2分泌。展示了經工程改造以僅表現aCAR或經工程改造以表現aCAR及所指示之iCAR的各種T細胞之殺傷。圖 20 展示如藉由流式細胞分析技術所評估，在NK細胞之轉導之後，aCAR及各種iCAR形式之表現概況，包括共表現。每個條件有1與3之間次的生物性重複(指示為單獨的點)。圖 21 展示NK細胞介導之殺傷(上圖)及細胞介素分泌(下圖)。展示了經工程改造以共表現aCAR及所指示之iCAR之各種NK細胞。「單獨的」 =各類型的SEM細胞單獨呈現。「混合的」 =兩種類型的SEM細胞一起混合在同一培養物中。每個條件有1與3之間次的生物性重複(指示為單獨的點)。每次量測有3次技術重複，在相關處繪製X及Y SEM。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Claims (15)

  1. 一種嵌合抑制性受體，其包含：  (a) 細胞外蛋白結合域， (b) 跨膜域，其中該跨膜域可操作地連接至該細胞外蛋白結合域，及 (c) 一或多個細胞內傳訊域，其中該一或多個細胞內傳訊域可操作地連接至該跨膜域；且 其中該一或多個細胞內傳訊域中之各者衍生自選自由以下組成之群的蛋白：BTLA、PD-1、CTLA4、TIM3、KIR3DL1、LIR1、NKG2A、TIGIT及LAG3；且其中該一或多個細胞內傳訊域中之至少一者能夠防止、減弱或抑制在免疫調節細胞上表現之靶向腫瘤的嵌合受體之活化。
  2. 如請求項1之嵌合抑制性受體，其中：  (a) 該跨膜域及該一或多個細胞內傳訊域中之一者衍生自相同蛋白，視情況其中該跨膜域進一步包含相同蛋白之細胞外域之至少一部分；或 (b) 該跨膜域衍生自第一蛋白，且該一或多個細胞內傳訊域中之一者衍生自與該第一蛋白不同的第二蛋白。
  3. 如請求項1或請求項2之嵌合抑制性受體，其中：  (a) 該一或多個細胞內傳訊域中之一者衍生自BTLA，視情況其中該細胞內傳訊域包含與RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS (SEQ ID NO: 3)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列，或其中該細胞內傳訊域包含胺基酸序列RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS (SEQ ID NO: 3)；或 (b) 該一或多個細胞內傳訊域中之一者衍生自LIR1，視情況其中該細胞內傳訊域包含與LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 50)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列，或其中該細胞內傳訊域包含胺基酸序列LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 50)；或 (c) 該一或多個細胞內傳訊域中之一者衍生自KIR3DL1，視情況其中該細胞內傳訊域包含與HLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP (SEQ ID NO: 66)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列，或其中該細胞內傳訊域包含胺基酸序列HLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP (SEQ ID NO: 66)；或 (d) 該一或多個細胞內傳訊域中之一者衍生自PD-1，視情況其中該細胞內傳訊域包含與CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL (SEQ ID NO: 1)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列，或其中該細胞內傳訊域包含胺基酸序列CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL (SEQ ID NO: 1)；或 (e) 該一或多個細胞內傳訊域中之一者衍生自CTLA4，視情況其中該細胞內傳訊域包含與AVSLSKMLKKRSPLTTGVGVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN (SEQ ID NO: 67)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列，或其中該細胞內傳訊域包含胺基酸序列AVSLSKMLKKRSPLTTGVGVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN (SEQ ID NO: 67)；或 (f) 該一或多個細胞內傳訊域中之一者衍生自NKG2A，視情況其中該細胞內傳訊域包含與KEPASPLDKCHYTKDNGQFDQSAKQLNLEAYTIEQETALISNKNGKPKRQQRKPNPPLNLDSYIVGQNDM (SEQ ID NO: 93)或MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKNSILATEQEITYAELNLQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAPEK (SEQ ID NO: 105)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列，或其中該細胞內傳訊域包含胺基酸序列KEPASPLDKCHYTKDNGQFDQSAKQLNLEAYTIEQETALISNKNGKPKRQQRKPNPPLNLDSYIVGQNDM (SEQ ID NO: 93)或MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKNSILATEQEITYAELNLQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAPEK (SEQ ID NO: 105)。
  4. 如請求項1-3中任一項之嵌合抑制性受體，其中：  (a) 該跨膜域衍生自選自由以下組成之群的蛋白：BTLA、CD8、CD28、CD3ζ、CD4、4-IBB、OX40、ICOS、2B4、CD25、CD7、LAX、LAT、PD-1、CTLA4、TIM3、KIR3DL1、LIR1、NKG2A、TIGIT及LAG3；或 (b) 該跨膜域衍生自BTLA，視情況其中該跨膜域包含與LLPLGGLPLLITTCFCLFCCL (SEQ ID NO: 12)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列，或其中該跨膜域包含胺基酸序列LLPLGGLPLLITTCFCLFCCL (SEQ ID NO: 12)，且視情況其中該跨膜域進一步包含該BTLA細胞外域之至少一部分；或 (c) 該跨膜域衍生自PD-1，視情況其中該跨膜域包含與VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI (SEQ ID NO: 60)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列，或其中該跨膜域包含胺基酸序列VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI (SEQ ID NO: 60)，且視情況其中該跨膜域進一步包含該PD-1細胞外域之至少一部分；或 (d) 該跨膜域衍生自CTLA4，視情況其中該跨膜域包含與DFLLWILAAVSSGLFFYSFLLT (SEQ ID NO: 68)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列，或其中該跨膜域包含胺基酸序列DFLLWILAAVSSGLFFYSFLLT (SEQ ID NO: 68)，且視情況其中該跨膜域進一步包含該CTLA4細胞外域之至少一部分；或 (e) 該跨膜域衍生自KIR3DL1，視情況其中該跨膜域包含與 ILIGTSVVIILFILLLFFLL (SEQ ID NO: 69)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列，或其中該跨膜域包含胺基酸序列 ILIGTSVVIILFILLLFFLL (SEQ ID NO: 69)，且視情況其中該跨膜域進一步包含該KIR3DL1細胞外域之至少一部分；或 (f) 該跨膜域衍生自LIR1，視情況其中該跨膜域包含與VIGILVAVILLLLLLLLLFLI (SEQ ID NO: 59)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列，或其中該跨膜域包含胺基酸序列VIGILVAVILLLLLLLLLFLI (SEQ ID NO: 59)，且視情況其中該跨膜域進一步包含該LIR1細胞外域之至少一部分；或 (g) 該跨膜域衍生自CD28，視情況其中該跨膜域包含與FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 11)有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列，或其中該跨膜域包含胺基酸序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 11)，且視情況其中該跨膜域進一步包含該CD28細胞外域之至少一部分。
  5. 如請求項1-4中任一項之嵌合抑制性受體，其中：  (a) 該蛋白結合域結合不在靶腫瘤上表現之蛋白，或該蛋白結合域結合在非腫瘤細胞上表現之蛋白，視情況其中該非腫瘤細胞衍生自選自由以下組成之群的組織：腦、神經元組織、內分泌、內皮、骨、骨髓、免疫系統、肌肉、肺、肝、膽囊、胰臟、胃腸道、腎臟、膀胱、雄性生殖器、雌性生殖器、脂肪、軟組織及皮膚；且 (b) 該細胞外蛋白結合域包含配體結合域，或該細胞外蛋白結合域包含受體結合域，或該細胞外蛋白結合域包含抗原結合域，視情況其中當該細胞外蛋白結合域包含抗原結合域時，該抗原結合域包含抗體、抗體之抗原結合片段、F(ab)片段、F(ab')片段、單鏈可變片段(scFv)或單域抗體(sdAb)，且視情況其中當該抗原結合域包含scFv時，該scFv包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)，且該VH及VL藉由肽連接子分開，且視情況其中該肽連接子包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：GGS (SEQ ID NO: 15)、GGSGGS (SEQ ID NO: 16)、GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 17)、GGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 18)、GGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 22)、GGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 23)、GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 24)、GGGGS (SEQ ID NO: 25)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 26)、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 27)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 28)及GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 29)。
  6. 如請求項1-5中任一項之嵌合抑制性受體，其中該嵌合抑制性受體進一步包含位於該細胞外蛋白結合域與該跨膜域之間且可操作地連接或物理連接至該細胞外蛋白結合域及該跨膜域中之各者的間隔區，  視情況其中該嵌合抑制性受體進一步包含位於該跨膜域與該一或多個細胞內傳訊域中之一者之間且可操作地連接或物理連接至該跨膜域及該一或多個細胞內傳訊域中之一者中之各者的間隔區，且 視情況其中該間隔區衍生自選自由以下組成之群的蛋白：CD8α、CD4、CD7、CD28、IgG1、IgG4、FcγRIIIα、LNGFR及PDGFR，或其中該間隔區包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：AAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (SEQ ID NO: 31)、ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 32)、ESKYGPPAPSAP (SEQ ID NO: 33)、ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 34)、EPKSCDKTHTCP (SEQ ID NO: 35)、AAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN (SEQ ID NO: 36)、TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 37) 、ACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEADAEC (SEQ ID NO: 38)、ACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVC (SEQ ID NO: 39)、AVGQDTQEVIVVPHSLPFKV (SEQ ID NO: 40)及TTTPAPRPPTPAPTIALQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLP (SEQ ID NO: 70)。
  7. 如請求項1-6中任一項之嵌合抑制性受體，其中該靶向腫瘤的嵌合受體為靶向腫瘤的嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體(TCR)。
  8. 如請求項1-7中任一項之嵌合抑制性受體，其中該免疫調節細胞選自由以下組成之群：T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、γδ細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、調節性T細胞、病毒特異性T細胞、自然殺手T (NKT)細胞、自然殺手(NK)細胞、B細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、先天性淋巴樣細胞、肥胖細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、嗜中性球、髓樣細胞、巨噬細胞、單核球、樹突狀細胞、ESC衍生細胞及iPSC衍生細胞。
  9. 如請求項1-8中任一項之嵌合抑制性受體，其中：  (a) 該嵌合抑制性受體包含衍生自LIR1的第一細胞內傳訊域及衍生自BTLA的第二細胞內傳訊域；或 (b) 該嵌合抑制性受體包含衍生自LIR1的第一細胞內傳訊域及衍生自PD-1的第二細胞內傳訊域；或 (c) 該嵌合抑制性受體包含衍生自LIR1的第一細胞內傳訊域及衍生自KIR3DL1的第二細胞內傳訊域；或 (d) 該嵌合抑制性受體包含衍生自LIR1的第一細胞內傳訊域及衍生自LIR1的第二細胞內傳訊域；或 (e) 該嵌合抑制性受體包含衍生自BTLA的第一細胞內傳訊域及衍生自LIR1的第二細胞內傳訊域；或 (f) 該嵌合抑制性受體包含衍生自BTLA的第一細胞內傳訊域及衍生自PD-1的第二細胞內傳訊域；或 (g) 該抑制性受體包含衍生自PD-1的第一細胞內傳訊域及衍生自LIR1的第二細胞內傳訊域；或 (h) 該嵌合抑制性受體包含衍生自PD-1的第一細胞內傳訊域及衍生自BTLA的第二細胞內傳訊域；或 (i) 該嵌合抑制性受體包含衍生自KIR3DL1的第一細胞內傳訊域及衍生自LIR1的第二細胞內傳訊域；或 (j) 該嵌合抑制性受體包含衍生自KIR3DL1的第一細胞內傳訊域及衍生自KIR3DL1的第二細胞內傳訊域。
  10. 一種經工程改造之核酸，其編碼如請求項1-9中任一項之嵌合抑制性受體。
  11. 一種表現載體，其包含如請求項10之經工程改造之核酸。
  12. 一種經分離之免疫調節細胞，其包含如請求項1-9中任一項之嵌合抑制性受體、如請求項10之經工程改造之核酸或如請求項11之表現載體，視情況其中該細胞進一步包含在該細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體，且視情況其中相對於缺乏嵌合抑制性受體的其他方面相同的細胞，在該蛋白與該嵌合抑制性受體結合之後，該嵌合抑制性受體防止、減弱或抑制該靶向腫瘤的嵌合受體之活化。
  13. 一種組成物，其包含： (a) 如請求項1-9中任一項之嵌合抑制性受體、如請求項10之經工程改造之核酸、如請求項11之表現載體或如請求項12之經分離之細胞；及 (b) 醫藥學上可接受之載劑、醫藥學上可接受之賦形劑或其組合。
  14. 減弱或抑制藉由在免疫調節細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體誘導之細胞介導之免疫反應的方法，其包含：  對該免疫調節細胞進行工程改造，以在該免疫調節細胞之表面上表現如請求項1-9中任一項之嵌合抑制性受體， 其中在同族蛋白與該嵌合抑制性受體結合之後，該細胞內傳訊域防止、減弱或抑制該靶向腫瘤的嵌合受體之活化， 視情況其中該靶向腫瘤的嵌合受體為嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體(TCR)，且視情況其中該CAR結合一或多種在腫瘤細胞之表面上表現之抗原。
  15. 減弱或抑制在免疫調節細胞之表面上表現之靶向腫瘤的嵌合受體之方法，其包含： 在合適於該嵌合抑制性受體結合該嵌合抑制性受體之同族蛋白的條件下，將如請求項12之經分離之細胞或如請求項13之組成物與該同族蛋白接觸， 其中在該蛋白與該嵌合抑制性受體結合之後，該細胞內傳訊域防止、減弱或抑制該靶向腫瘤的嵌合受體之活化， 視情況其中該靶向腫瘤的嵌合受體為嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體(TCR)，且視情況其中該CAR結合一或多種在腫瘤細胞之表面上表現之抗原。
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