BR112017013956B1

BR112017013956B1 - Proteínas de fusão de citocinas

Info

Publication number: BR112017013956B1
Application number: BR112017013956-1A
Authority: BR
Inventors: Klaus Pfizenmaier; Sina Fellermaier; Dafne Müller; Ugur Sahin; Friederike Gieseke; Ronald Backer; Sebastian Kreiter; Roland Kontermann
Original assignee: Universität Stuttgart; Tron - Translationale Onkologie An Der Universitätsmedizin Der Johannes Gutenberg-Universität Mainz Ggmbh; BioNTech SE
Priority date: 2015-01-15
Filing date: 2016-01-15
Publication date: 2024-01-23
Also published as: MX2017009153A; CA2971950A1; JP2018503379A; BR112017013956B8; MX2021010668A; BR112017013956A2; BR112017013956A8; CN107428842A; EP3245223B1; HK1246316A1; CN113801241A; US10808019B2; NZ733266A; AU2016207955B2; CN107428842B; EP3245223A1; WO2016113395A1; US10301368B2; US20190276511A1; JP6813491B2

Abstract

PROTEÍNAS DE FUSÃO DE CITOCINAS. A presente invenção se refere a proteínas de fusão de citocinas e a moléculas de ácido nucleico que codificam essas proteínas de fusão de citoquinas. A presente invenção se refere ainda a células e organismos não humanos. Composições farmacêuticas e kits que compreendem as proteínas de fusão de citoquinas ou as moléculas de ácido nucleico que as codificam, bem como a sua utilização como medicamentos.

Description

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a proteínas de fusão de citocina e moléculas de ácidos nucleicos que codificam tais proteínas de fusão de citocinas. A presente invenção diz ainda respeito a células e organismos não humanos, composições farmacêuticas e kits compreendendo as proteínas de fusão de citocina ou as moléculas de ácido nucleico codificando-as, bem como à sua utilização como medicamentos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os ligantes da superfamília do fator de necrose tumoral (TNF) têm um papel importante em processos normais de desenvolvimento, incluindo a apoptose, regulação de funções imuno-celulares e outras respostas específicas do tipo celular. Eles também desempenham um papel importante em várias doenças adquiridas e genéticas, incluindo câncer e doenças autoimunes.

[003] A família de ligantes de TNF caracteriza-se por um domínio conservado C-terminal extracelular referido como domínio de homologia (THD) TNF (Bodmer, JL et al (2002), Trends in Biochemical Sciences, 27 (1):19 - 26). Os THDs, que compartilham uma dobra terciária praticamente idêntica e apresentam uma identidade de sequência entre os membros da família de aprox. 20 a 30%, são responsáveis pela ligação ao receptor e interagem não-covalentemente para formar (homo-) complexos triméricos, os quais são depois reconhecidos pelos seus receptores específicos. Embora a maioria dos ligantes sejam sintetizados como proteínas ligadas à membrana de proteínas transmembranares, tipo mais especificamente II (isto é, intracelular N-terminal e extracelular C-terminal), as citocinas solúveis podem ser geradas por clivagem proteolítica dos domínios extracelulares que constituem a THD (Bodmer, JL et al (2002), Trends in Biochemical Sciences, 27 (1):19 - 26).

[004] Foi um objetivo da presente invenção proporcionar proteína de fusão de citocina multifuncional, em particular, bifuncional ou de ação dupla que compreende pelo menos duas citocinas diferentes. Foi um outro objetivo da presente invenção proporcionar moléculas de ácido nucleico, em moléculas de RNA específicas que codificam para tais proteínas de fusão de citocina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] Em um aspecto, a presente invenção se refere a uma proteína de fusão de citocina que compreende (i) três domínios extracelulares ou seus fragmentos ou variantes de um primeiro ligante da superfamília do fator de necrose tumoral (TNF) formando um primeiro homotrímero capaz de se ligar a um receptor da primeiro ligante e (ii) três domínios extracelulares ou seus fragmentos ou variantes de um segundo ligante da superfamília TNF formando um segundo homotrímero capaz de se ligar a um receptor do segundo ligante, em que o primeiro ligante e o segundo ligante são diferentes, e em que o primeiro homotrímero e o segundo homotrímero são covalentemente ligados, preferencialmente, por meio de um ou mais ligantes peptídicos.

[006] Em uma concretização, os três domínios extracelulares ou seus fragmentos ou variantes do primeiro ligante e / ou os três domínios extracelulares ou seus fragmentos ou variantes do segundo ligante estão covalentemente ligados.

[007] Em uma concretização, a proteína de fusão de citocina compreende uma molécula / estrutura possuindo a fórmula geral em que A compreende o domínio extracelular ou um fragmento ou um seu variante do primeiro ligante, e B compreende o domínio extracelular ou um seu fragmento ou variante do segundo ligante, e em que L compreende um ligante peptídico, e LA e LB são, em cada ocorrência, independentemente, selecionados de uma ligação covalente e de um ligante peptídico.

[008] Em uma concretização, L compreende adicionalmente um domínio de multimerização, de preferência, um domínio de dimerização, permitindo que a multimerização, de preferência, a dimerização, da proteína de fusão de citocina.

[009] Em uma concretização, o domínio de dimerização é selecionado a partir do grupo que consiste de um domínio 2 de cadeia pesada de IgE (EHD2), um domínio 2 de cadeia pesada de IgM 2 (MHD2), um domínio 3 de cadeia pesada de IgG (GHD3), um domínio 3 de cadeia pesada de IgA (AHD2), um domínio 3 de cadeia pesada de IgD (DHD3), um domínio 4 de cadeia pesada de IgE (EHD4), um domínio 4 de cadeia pesada de IgM (MHD4), um domínio de Fc, um domínio de dimerização de uteroglobina e as variantes funcionais de qualquer um dos precedentes.

[0010] Em uma concretização, a proteína de fusão de citocina está presente como um complexo multimérico, de preferência, dimérico.

[0011] Em outra concretização, a proteína de fusão de citocina compreende, pelo menos, um, de preferência, três, subunidades com a fórmula geral: em que A compreende o domínio extracelular ou um seu fragmento ou variante do primeiro ligante, e B compreende o domínio extracelular ou um seu fragmento ou variante do segundo ligante, em que L compreende um ligante peptídico, e em que, de preferência, as três subunidades formam a proteína de fusão de citocina.

[0012] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma proteína de fusão de citocina que compreende um primeiro bloco compreendendo três domínios extracelulares ou seus fragmentos ou variantes de um primeiro ligante da superfamília do fator de necrose tumoral (TNF) que está ligado de forma covalente e de um segundo bloco que compreende três domínios extracelulares domínios ou seus fragmentos ou variantes de um segundo ligante da superfamia TNF que são covalentemente ligados, em que o primeiro ligante e o segundo ligante são diferentes, e em que o primeiro bloco e o segundo blocos estão ligados covalentemente.

[0013] Em uma concretização, os três domínios extracelulares ou seus fragmentos ou variantes do primeiro ligante formam um primeiro homotrímero capaz de se ligar a um receptor do primeiro ligante, e os três domínios extracelulares ou seus fragmentos ou variantes do segundo ligante formam um segundo homotrímero capaz de se ligar a um receptor do segundo ligante.

[0014] Em uma concretização, os três domínios extracelulares do primeiro ligante e / ou os três domínios extracelulares do segundo ligante e / ou o primeiro bloco e o segundo bloco estão covalentemente ligados através de ligantes peptídicos.

[0015] Em uma concretização, a proteína de fusão de citocina compreende uma molécula / estrutura possuindo a fórmula geral em que A compreende o domínio extracelular ou um seu fragmento ou variante do primeiro ligante, e B compreende o domínio extracelular ou um seu fragmento ou variante do segundo ligante, e em que G compreende um ligante peptídico, e LA e LB são, em cada ocorrência, independentemente, selecionados de uma ligação covalente e de um ligante peptídico.

[0016] Em uma concretização, L compreende adicionalmente um domínio de multimerização, de preferência, um domínio de dimerização, permitindo que a multimerização, de preferência, a dimerização da proteína de fusão de citocina.

[0017] Em uma concretização, o domínio de dimerização é selecionado a partir do grupo que consiste de um domínio 2 de cadeia pesada de IgE (EHD2), um domínio 2 de cadeia pesada de IgM 2 (MHD2), um domínio 3 de cadeia pesada de IgG (GHD3), um domínio 3 de cadeia pesada de IgA (AHD2), um domínio 3 de cadeia pesada de IgD (DHD3), um domínio 4 de cadeia pesada de IgE (EHD4), um domínio 4 de cadeia pesada de IgM (MHD4), um domínio de Fc, um domínio de dimerização de uteroglobina e as variantes funcionais de qualquer um dos precedentes.

[0018] Em uma concretização, a proteína de fusão de citocina está presente como um complexo multimérico, de preferência, dimérico.

[0019] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma proteína de fusão de citocina que compreende o domínio extracelular ou um seu fragmento ou variante de um primeiro ligante da superfamília do fator de necrose tumoral (TNF) e o domínio extracelular ou um seu fragmento ou variante de um segundo ligante da superfamia de TNF, em que o primeiro ligante e o segundo ligante são diferentes, e em que os domínios extracelulares ou seus fragmentos ou as suas variantes estão ligados covalentemente.

[0020] Em uma concretização, os domínios extracelulares são covalentemente ligados através de um ligante peptídico.

[0021] Em uma concretização, a proteína de fusão de citocina compreende uma molécula / estrutura possuindo a fórmula geral: em que A compreende o domínio extracelular ou um seu fragmento ou variante do primeiro ligante, e B compreende o domínio extracelular ou um seu fragmento ou variante do segundo ligante, e em que L compreende um ligante peptídico.

[0022] Em uma concretização, a proteína de fusão de citocina está presente como um complexo trimérico, onde os três domínios extracelulares ou seus fragmentos ou variantes do primeiro ligante formam um primeiro homotrímero capaz de se ligar a um receptor do primeiro ligante, e os três domínios extracelulares ou fragmentos ou variantes do segundo ligante formam um segundo homotrímero capaz de se ligar a um receptor do segundo ligante.

[0023] De acordo com a presente invenção, o primeiro ligante e o segundo ligante aqui referidos são preferencialmente selecionados de entre o grupo consistindo de CD40L, CD27L, 4-1BBL, OX40L, APRIL, CD30L, EDA-A1, A2-EDA, FasL, GITRL, LUZ, LT-alfa, TL1A, TNF-alfa, TRAIL, RANKL, TWEAK e, mais preferencialmente, a partir do grupo consistindo de CD40L, CD27L, 4-1BBL, OX40L e.

[0024] Em uma concretização, - o primeiro ligante é CD40L, e o segundo ligante é CD27L; - o primeiro ligante é CD27L, e o segundo ligante é CD40L; - o primeiro ligante, é CD40L, e o segundo ligante é 4-1BBL; - o primeiro ligante é 4-1BBL, e o segundo ligante é CD40L; - o primeiro ligante é CD27L, e o segundo ligante é 4-1BBL; - o primeiro ligante é um 4- BBL, e o segundo ligante é CD27L; - o primeiro ligante é CD40L, e o segundo ligante é OX40L; - o primeiro ligante é OX40L, e o segundo ligante é CD40L; - o primeiro ligante é CD27L, e o segundo ligante é OX40L; - o primeiro ligante é OX40L, e o segundo ligante é CD27L; - o primeiro ligante é OX40L, e o segundo ligante é 4-1 BBL; ou - o primeiro ligante é 4-1 BBL, e o segundo ligante é OX40L.

[0025] Em uma concretização, o domínio extracelular de CD40L compreende ou consiste nos resíduos de aminoácidos 51 a 261 ou 116 a 261 da SEQ ID NO: 1, o domínio extracelular de CD27L compreende ou consiste nos resíduos de aminoácidos 52 a 193 da SEQ ID NO: 2, o domínio extracelular de uma 4- BBL compreende ou consiste nos resíduos de aminoácidos 71 a 254 da SEQ ID nO: 3, e / ou o domínio extracelular de OX40L compreende ou consiste nos resíduos de aminoácidos 51 a 183 da SEQ ID nO: 4.

[0026] Em uma concretização, a proteína de fusão de citocina compreende ainda, pelo menos, um marcador ou etiqueta que permite a detecção e / ou isolamento da proteína de fusão de citocina.

[0027] Em uma concretização, a proteína de fusão de citocina compreende, ainda, uma ou mais modificações que aumentam a estabilidade da proteína de fusão de citocina.

[0028] Em um outro aspecto, o presente se refere a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão de citocina tal como definido acima ou uma sua subunidade.

[0029] Em uma concretização, a molécula de ácido nucleico está operacionalmente ligada a uma sequência de controlo de expressão.

[0030] Em uma concretização, a molécula de ácido nucleico está contida em um vetor.

[0031] Em uma concretização, a molécula de ácido nucleico é uma molécula de RNA, de um modo preferido uma molécula de RNA vitro-transcrita (IVT).

[0032] Em um outro aspecto, o presente se refere a uma célula transformada ou transfectada com uma molécula de ácido nucleico tal como definido acima.

[0033] Em uma concretização, a célula é uma célula procariótica.

[0034] Em uma concretização, a célula é uma célula eucariótica, de preferência, uma célula de mamífero, mais preferencialmente, uma célula humana.

[0035] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a um organismo não humano transformado ou transfectado com uma molécula de ácido nucleico, tal como definido acima.

[0036] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo, como agente ativo, uma proteína de fusão de citocina, tal como definido acima, uma molécula de ácido nucleico, tal como definido acima, ou de uma célula, tal como definido acima.

[0037] Em uma concretização, a composição farmacêutica compreende ainda um veículo e / ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0038] Em um outro aspecto, o presente se refere a um kit que compreende uma proteína de fusão de citocina tal como definido acima, uma molécula de ácido nucleico como acima definido, uma célula, tal como definido acima ou uma composição farmacêutica tal como definida acima.

[0039] Em um outro aspecto, o presente se refere a uma proteína de fusão de citocina tal como definido acima, uma molécula de ácido nucleico como acima definido, uma célula tal como definido acima, ou uma composição farmacêutica tal como definida acima para utilização como um medicamento.

[0040] Em um outro aspecto, o presente se refere a uma proteína de fusão de citocina tal como definido acima, uma molécula de ácido nucleico como acima definido, uma célula tal como definido acima, ou uma composição farmacêutica tal como definida acima para utilização no tratamento de uma doença seleccionada a partir do grupo que consiste de câncer, doenças infecciosas, doenças inflamatórias, doenças metabólicas, doenças autoimunes, doenças degenerativas, doenças associadas a apoptose e rejeições de transplantes.

[0041] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere à utilização de uma proteína de fusão de citocina, tal como definido acima, uma molécula de ácido nucleico como acima definido, uma célula, tal como definido acima, ou uma composição farmacêutica na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença selecionado a partir do grupo que consiste de câncer, doenças infecciosas, doenças inflamatórias, doenças metabólicas, doenças auto-imunes, doenças degenerativas, doenças associadas a apoptose e rejeições de transplantes.

[0042] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a um método de tratamento de uma doença seleccionada a partir do grupo que consiste de câncer, doenças infecciosas, doenças inflamatórias, doenças metabólicas, doenças auto- imunes, doenças degenerativas, doenças associadas a apoptose e rejeições de transplantes, o referido modo compreendendo administrar uma quantidade eficaz de uma proteína de fusão de citocina tal como definido acima, uma molécula de ácido nucleico como acima definido, uma célula tal como definido acima, ou uma composição farmacêutica como definido acima a um sujeito em necessidade do mesmo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0043] A Figura 1 mostra um esquema de montagem Duocinas, scDuocinas e EHD2-scDuocinas.

[0044] Figura 2 mostra a análise de SDS-PAGE das Duocinas purificadas sob condições redutoras e não redutoras utilizando um gel de poliacrilamida a 12% (1, CD40L-CD27L; 2, CD27L-CD40L; 3, CD40L 4-1BBL; 4, 4-1BBL -CD40L; 5, CD27L-4- 1BBL; 6, 4-1BBL-CD27L; 7, CD40L-OX40L; 8, OX40L-CD40L; 9, CD27L-OX40L; 10, OX40L-CD27L; 11, 4-1BBL-OX40L; 12, OX40L-4- 1BBL). As proteínas foram visualizadas por coloração com Azul Brilhante de Coomassie G250.

[0045] A Figura 3 mostra a análise por cromatografia de exclusão de tamanho B. (SEC) das Duocinas demonstrando a integridade das proteínas de fusão A e. cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) foi realizada com um Yarra SEC-2000 (Phenomenex) com um caudal de 0,5 mL / min. Tiroglobulina, álcool desidrogenase, albumina de soro bovino, anidrase carbônica e peptídeo FLAG foram usados como proteínas padrão.

[0046] A Figura 4 mostra a ligação de Duocinas (100 nM) para proteínas de fusão imobilizada CD40-, CD27-, 4-1BB- e OX40-Fc em ELISA. Todos as Duocinas ligadas às respectivas proteínas de fusão do receptor Fc, e qualquer reatividade cruzada foi detectada.

[0047] A Figura 5A e B. mostra a ligação de Duocinas para proteínas de fusão imobilizada CD40-, CD27-, 4- IBB- e OX40-Fc em ELISA (n = 3 ± DP). Duocinas foram tituladas em duplicata a partir de uma concentração de 316 nM. Todas as Duocinas ligadas às respectivas proteínas de fusão de Fc- receptor de uma maneira dependente da dose com valores EC50 na faixa nanomolar baixa. As concentrações de proteína de acordo com moléculas triméricas.

[0048] As Figuras 6A e B. mostra a ligação de Duocinas (100 nM) para CD40-, CD27-, 4-1 BB e OX40- expressando células HT1080 analisadas por citometria de fluxo. Duocinas ligados foram detectados com um anticorpo anti-FLAG marcado com PE (cinzento, células sozinhas; células de linhagem fina incubadas com anticorpo marcado com PE antiFLAG, linhagem a cheio, células incubadas com Duocinas).

[0049] As Figura 7A e B mostra a biespecificidade de Duocinas foi analisada por citometria de fluxo. Após a ligação de Duocinas (100 nM) para células CD40-, CD27-, 4- 1BB- e HT1080 que expressam OX40, as Duocinas foram detectadas usando as correspondentes proteínas de receptor-Fc de fus (10 nM) e um PE-anti-humano marcado anticorpo Fc. TNFRl-Fc foi incluído como controle negativo (cinzento, células incubadas com anticorpo anti-Fc humano marcado com PE; linha fina, as células incubadas com Duocinas e TNFRl-Fc; linha a negrito, as células incubadas com CD40-, CD27-, 4-1BB - ou OX40-Fc).

[0050] A Figura 8 mostra a análise de SDS-PAGE das Duocinas de cadeia simples purificados sob condições redutoras e não redutoras utilizando um gel de poliacrilamida a 10% (1, scCD40L-scCD27L; 2, scCD27L-scCD40L; 3, scCD40L- sc4-lBBL; 4, sc4-lBBL-scCD40L; 5, scCD27L-sc4-lBBL; 6, sc4- lBBL-scCD27L; 7, scCD40L-scOX40L; 8, scOX40L-scCD40L; 9, scCD27L-scOX40L; 10, scOX40L-scCD27L; 11, sc4- lBBL-scOX40L; 12, scOX40L-sc4-lBBL). As proteínas foram visualizadas por coloração com Azul Brilhante de Coomassie G250.

[0051] As Figuras 9A e B monstram a análise por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) das Duocinas de cadeia simples que demonstram a integridade das proteínas de fusão. A cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) foi realizada com um Yarra SEC-2000 (Phenomenex) com um caudal de 0,5 mL / min. Tiroglobulina, álcool desidrogenase, albumina de soro bovino, anidrase carbônica e peptídeo FLAG foram usadas como proteínas padrão.

[0052] A Figura 10 mostra a Ligação de uma única cadeia de Duocina (100 nM) para proteínas de fusão CD40-, CD27-, 4-1BB- e OX40-Fc imobilizada em ELISA (n = 3 ± DP). Todas as Duocinas de cadeia simples ligadas às respectivas proteínas de fusão do receptor Fc e qualquer reatividade cruzada foi detectada.

[0053] As Figura 11A e B mostram a ligação de Duocinas de cadeia simples para proteínas de fusão CD40-, CD27-, 4-1BB- e OX40-Fc imobilizadas em ELISA (n = 3 ± DP). Duocinas foram titulados em duplicado a partir de uma concentração de 316 nM. Todas as Duocinas de cadeia simples ligados às respectivas proteínas de fusão de Fc-receptor de uma maneira dependente da dose, com valores de EC50 na gama nanomolar baixa.

[0054] As Figura 12A e B mostram a ligação de uma única cadeia Duocinas (100 nM) para CD40-, CD27-, 4- IBB- e OX40-expressando células HT1080 analisadas por citometria de fluxo. Ligados Duocinas de cadeia simples foram detectados com um anticorpo anti-FLAG marcado com PE (cinzento, células sozinhas, as células finas linhagens incubadas com anticorpo anti-FLAG marcado com PE; linha em negrito, as células foram incubadas com uma única cadeia Duocinas).

[0055] As Figura 13A e B mostram a biespecificidade de uma única cadeia Duocinas foi analisada por citometria de fluxo. Após a ligação de uma única cadeia Duocinas (100 nM) para células CD40-, CD27-, 4-1BB- e HT1080 que expressam OX40, as Duocinas de cadeia simples foram detectadas usando as correspondentes proteínas de receptor-Fc de fus (10 nM) e um anticorpo anti-Fc humano marcado com PE. TNFRl-Fc foi incluído como controle negativo (cinzento, células incubadas com anticorpo anti-Fc humano marcado com PE; linhagem fina, as células incubadas com uma única cadeia Duocinas e TNFRl- Fc; linha a cheio, células incubadas com uma única cadeia Duocinas e CD40 -, CD27-, 4-1BB- ou OX40-Fc).

[0056] A Figura 14 mostra a análise SDS-PAGE dos Duocinas de cadeia simples purificadas sob condições redutoras e utilizando um gel de poliacrilamida a 4-15% (1, sc4-lBBL-EHD2-scCD40L não redutor; 2, sc4- lBBL-EHD2-scCD27L; 3, scCD40L-scCD27L). As proteínas foram visualizadas por coloração com Azul Brilhante de Coomassie G250.

[0057] A Figura 15 mostra a análise de tamanho de cromatografia de exclusão (SEC) das EHD2-scDuocinas demonstrando a integridade das proteínas de fusão. A cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) foi realizada com um Yarra SEC-2000 (Phenomenex) com um caudal de 0,5 mL / min. Tiroglobulina, álcool desidrogenase, albumina de soro bovino, anidrase carbónica e peptídeo FLAG foram usadas como proteínas padrão.

[0058] A Figura 16 mostra a ligação de EHD2- scDuocinas (100 nM) para CD40- imobilizada, CD27-, 4-1BB- e proteínas de fusão OX40-Fc em ELISA. Todas as EHD2-scDuocinas ligadas às respectivas proteínas de fusão do receptor Fc, e qualquer reatividade cruzada foi detectada.

[0059] A Figura 17 mostra a ligação de EHD2 ligados Duocinas de cadeia simples para imobilizada CD40-, CD27-, 4- 1BB- e proteínas de fusão OX40-Fc em ELISA (n = 3 ± DP). EHD2-scDuocinas foram tituladas em duplicatas a partir de uma concentração de 316 nM. Todas as EHD2-scDuocinas ligadas às respectivas proteínas de fusão de Fc-receptor de uma maneira dependente da dose, com valores de EC50 na faixa nanomolar baixa.

[0060] A Figura 18 mostra a Ligação de EHD2- scDuocinas (100 nm) para CD40-, CD27-, 4-LBB-expressando células HT1080 analisadas por citometria de fluxo. Ligados EHD2-scDuocinas foram detectados com um anticorpo anti-FLAG marcado com PE (cinzento, células sozinhas; células de linha fina incubadas com anticorpo marcado com PE anti-FLAG ;, linha a cheio, células incubadas com EHD2-scDuocinas).

[0061] A Figura 19 mostra a biespecificidade de EHD2- scDuocinas foi analisada por citometria de fluxo. Após a ligação de EHD2-scDuocinas (100 nM) para CD40-, CD27-, 4-1BB- e células HT1080 que expressam OX40, os EHD2-scDuocinas foram detectadas usando as correspondentes proteínas de receptor-Fc de fus (10 nM) e um PE- marcado anticorpo anti-Fc humano. TNFRl-Fc foi incluído como controle negativo (Gray, células incubadas com anticorpo anti-Fc humano marcado com PE; linha fina, as células incubadas com EHD2-scDuocinas e TNFRl-Fc; linha a cheio, células incubadas com EHD2-scDuocinas e CD40-, CD27-, 4-1BB- ou OX40-Fc).

[0062] A Figura 20 mostra a ativação do receptor de EHD2-scDuocinas analisados por IL-8 de liberação de CD40- e 4- LBB-expressando células HT1080 (n = 3 ± DP) ou a partir de células HT1080 que expressam CD27 (n = 1 ± SD). 2 x 104 células HT1080 foram incubadas com diluições em série do EHD2-scDuocinas e a quantidade de IL-8 no sobrenadante foi detectada através de ELISA após 18 horas de incubação. Ligantes monomélica e os derivados de cadeia simples dos mesmos foram incluídos como controlos.

[0063] A Figura 21 mostra a proliferação de células T após estimulação com Duocinas ou Duocinas de cadeia simples. 1,5 x l05 PBMC humanos CFSE-corados (população a granel) foram incubadas com diluições em série de Duocinas ou Duocinas de cadeia simples na presença do anticorpo anti-CD3 humana reticulada como estímulo primário subóptima. Após 6 dias, a proliferação de células T foi avaliada por citometria de fluxo.

[0064] A Figura 22 mostra um modelo de Vetor para a transcrio in vitro de RNAm que codificam os domínios extracelulares de ligantes TNFR e proteínas de fusão dos mesmos. O plasmídeo PstI constrói-hag-Kozak-seg (OPT) - 7NSE.^r-2hBgUTR-A120 foram usadas como moldes para a transcrição in vitro de RNA que codificam ligantes e proteínas de fus do receptor de TNF-(TNFR). As inserções codificam domínios extracelulares de ligantes TNFR, que são funcionalmente ativos como homotrímeros. Dois tipos diferentes de sequências de codificação para os ligantes do receptor de FNT foram gerados: (i) as inserções incluindo um único domínio extracelular do receptor de TNF, por conseguinte, que codifica para trímeros ligados não- covalentes e (ii) construções de cadeia única, em que as inserções incluiu três cópias do domínio extracelular separados por domínios ligante curto (aminoácidos codificados: G3SG3), por conseguinte, que codifica para covalentes trímeros ligados. Para gerar proteínas de fus de dois ligantes de TNFR que foram ligados por um ligante. Nomenclatura: As construções que codificam sequências de proteínas humanas são encurtadas por um "h", sequências de proteína de murídeo são encurtados por um "m". Os números de "1" e "3" indica a quantidade de cópias dos domínios extracelulares do ligante do TNFR codificado.

[0065] Figura 23 mostra a expressão intracelular de proteínas de fusão após a electroporação IVT-RNA. As células K562 foram electroporadas com IVT-RNA que codifica para os domínios extracelulares de ligantes ou proteínas de fusão TNFR destes. 6 horas após a electroporação, a exportação da proteína estava bloqueada com GolgiPlug e GolgiSTOP e após 12 horas de incubação, as células foram coradas intracelularmente para CD27L, CD40L, OX40L ou 4-1BBL, respectivamente. Como controle negativo, as células K562 que foram electroporadas sem RNA (MOCK) e coradas em conformidade. (A) coloração intracelular de ligantes TNFR mediante electroporao de h3_CD40L-h3_CD27L construir em comparação com construções h3_CD27L- andh3_CD40L-individuais. (B) coloração intracelular de ligantes TNFR mediante electroporao de h3_CD40L-h3_OX40L construir em comparação com h3_OX40L- e construções h3_CD40L-individuais. (C) coloração intracelular de ligantes TNFR mediante electroporao de h3_4- lBBL-h3_CD27L construir em comparação com h3_CD27L- e construções h3_4-lBBL-individuais. (D) de coloração intracelular de ligantes TNFR mediante electroporao de hl_CD40L-hl_CD27L, hl_4-lBBL-hl_CD40L e hl_4- lBBL-hl_CD27L constrói.

[0066] A Figura 24 mostra a expressão de superfície celular de receptores de TNF em transfectantes estáveis de HT1080 e K562 após a transfecção transitória. (A) Os transfectantes de receptor de TNF-estáveis de HT 1080 foram coradas com anti-CD27-PE, anti-CD40-FITC, anti-4-LBB-PE e anti-OX40-PE. (B) células K562 foram electroporadas com plasmídeos que codificam sequência de codificao de comprimento completo de CD27 humano, CD40, 4-1BB e OX40. Um dia após a electroporação, as células foram coradas com anti- CD27-PE, anti-CD40-FITC, anti-4-LBB-PE e anti-OX40-PE, respectivamente.

[0067] A Figura 25 mostra a ativação reforçada do receptor de TNF por TNFL (l) -TNFL (2) construes -fusion sob configurações trans-apresentação. As células K562 foram electroporados em uma placa de multi-cavidades de electroporação (96- cavidade) com diferentes quantidades de IVT-RNA que codificam para os domínios extracelulares de ligantes ou proteínas de fusão TNFR destes. RNA-valores são indicados como pmol de RNA com referência à proteína codificada correspondente. Após incubação durante a noite, os sobrenadantes foram transferidos para as camadas de células confluentes dos dois transfectantes-receptor de TNF estáveis correspondentes da linha celular HT1080 (ver Figura 24A). As células K562, quer MOCK-electroporado (como controlo) ou a electroporao com os correspondentes TNF-receptor de plasmeos sobre o um dia antes, foram adicionados a camadas de células confluentes de HT1080-TNFR-transfectantes e sobrenadantes, a fim de gerar definições de trans-de apresentação (célula de transativação celular) para as proteínas de fusão. Após 8 horas de co-incubação, os sobrenadantes livres de células foram recolhidos, e as concentrações de IL-8 foram medidos, o qual é libertado por células HT1080 em cima do receptor de TNF-dependente de ativação de NF-kappaB. (A) mostra a liberação de IL-8, devido à ativação de HT1080 CD40 após incubação com sobrenadantes de células K562 electroporadas com RVT-RNA que codifica h3_CD27L-h3_CD40L. h3_CD40L construções simples e a construção de fusão h3_CD27L-h3_CD40L sem trans-apresentação (+ K562 MOCK) resultaram em IL-8- secreção após a electroporação de pelo menos um RNA pmol com referência às proteínas de fusão codificadas. Sob condições de trans-apresentação mediadas por CD27 K562, a construção h3_CD27L-h3_CD40L ativação de CD40 induzida na mesma extensão com cerca de 100 vezes menos quantidade de IVT-R A, com referência à proteína codificada. (B) CD27-ativao ap electroporao de IVT-R como codificando h3_CD27L ou h3_CD27L- h3_CD40L sem condições de trans-apresentação não foi detectada através da medição da secreção de IL-8. Com trans- apresentação por K562 CD40, CD27-ativação foi detectado ap K562-electroporação de construo de fus h3_CD27L-h3_CD40L. (C) apresenta a IL-8 de libertação devido à ativação de HT1080 OX40 quando da incubação com sobrenadantes de RVT-RNA que codificam h3_CD27L-h3_OX40L. h3_OX40L construções simples e a construção de fusão h3_CD27L-h3_OX40L sem trans-apresentação (+ K562 MOCK) resultaram em IL-8-secreção após a electroporação de cerca de 1 pmol de RNA e mais com referência às proteínas codificadas. Sob condições de trans- apresentação mediadas por CD27 K562, a construo de fus h3_CD27L-h3_OX40L ativação de CD40 induzida na mesma extensão com cerca de 10 vezes inferior quantidade de IVT-RNA com referência à proteína codificada. (D) CD27-ativao ap electroporao de IVT-RNA que codificam h3_CD27L ou h3_CD27L- h3_OX40L sem condições de trans-apresentação não foi detectada através da medição da secreção de IL-8. Com trans- ativação por apresentação K562 OX40 CD27- foi detectado ap K562-electroporação de h3_CD27L-h3_CD40L RNA constrói. (E) mostra a concentração de IL-8, devido à ativação de HT1080 CD27 após incubação com sobrenadantes de IVT-RNA que codificam h3_CD27L-h3_4-lBBL. h3_CD27L construções simples e a construção de fusão h3_CD27L-h3_4-lBBL sem trans- apresentação (+ K562 MOCK) não induziu a IL-8-secreção. Sob condições de trans-apresentação mediadas por K562 4-1BB a construo de fus h3_CD27L-h3_4-lBBL ativação induzida de CD27. (F) h3_4-lBBL construções simples e a construção de fusão h3_CD27L-h3_4-lBBL sem trans-apresentação (+ K562_MOCK) não induziu a IL-8-secreção. Sob condições de trans-apresentação mediadas por K562_CD27 a construo de fus h3_CD27L-h3_4-lBBL ativação induzida de 4- IBB. (L) mostra a IL-8 de libertação devido à ativação de HT1080 CD40 após incubação com sobrenadantes de células K562 electroporadas com IVT-RNA que codifica h3_41BBL-h3_CD40L e hl_41BBL-hl_CD40L. h3_CD40L construções individuais e ambos construo de fus sem apresentação trans (+ K562 MOCK) resultou na IL- 8-secreção após a electroporação de pelo menos um RNA pmol com referência às proteínas codificadas. Sob condições de trans- apresentação mediadas por K562 41BB ambas as construções de fusão, h3_41BBL-h3_CD40L e hl_41BBL-hl_CD40L, induzida por ativação de CD40 na mesma extensão com cerca de 10 vezes inferior quantidade de IVT-RNA (com referência à proteína codificada). (H) h3_4-lBBL construções individuais e ambas as construções de fusão, h3_41BBL-h3_CD40L e hl_41BBL-hl_CD40L, sem trans-apresentação (+ K562 MOCK) não induziu a IL-8- secreção. Sob condições de trans-apresentação mediadas por CD40 K562 ambas as construções de fusão induzida por ativação de 4- IBB na mesma medida.

[0068] A Figura 26 mostra os Efeitos de h3_CD27L- h3_CD40L e fusão h3_CD40L-h3_CD27L constrói em CD8 + proliferação de células T. iDCs foram electroporadas com claudina-6 IVT-RNA + IVT-RNA que codifica h3_CD27L-h3_CD40L, h3_CD40L-h3_CD27L e construções individuais h3_CD27L + h3_CD40L, ou RNA de controle, respectivamente. Células T CD8 + (HLA-A2 + de doadores) foram electroporadas com codificação IVT-RNA para uma CD8 específicas claudina-6- + receptor de células T ou que codifica para uma CD8 específicas do TPTE + receptor de células T e depois coradas com CFSE. IDCs electroporadas e CD8 + células T foram co-cultivadas em uma proporção de 01:10, durante 5 dias antes de proliferação de células T CD8 + de células T foi analisada por FACS. Histograma representativos de CFSE análise para claudina-6- TCR + CD8 + de células T são apresentados em (A) e para TPTE- TCR + CD8 + de células T são apresentados em (B). A análise detalhada da proliferação baseado em picos indicando divisões celulares foi feito pelo software Fluxo de Jo. Por este meio, as percentagens de células T que entraram em divisão, indicado por “% de células divididas 'o número médio de divisões de células, que entrou em divisão, indicado pelo índice de proliferação', foi calculado, ambas mostradas em (C). Aplicação de construes de fus de ambos h3_CD27L-h3_CD40L e h3_CD40L-h3_CD27L resultou em um aumento da proliferação de células T CD8 + de células T de uma forma específica ao antigénio, enquanto que a aplicação de dois RNAs que codificam para os dois ligantes de TNFR correspondentes não teve nenhum efeito sobre a proliferação.

[0069] A Figura 27 mostra os Efeitos de h3_4-lBBL- h3_CD27L e fusão hl_4-lBBL-hl_CD27L constrói em CD8 + proliferação de células T. iDCs foram electroporadas com claudina-6 IVT-RNA + IVT-RNA que codifica h3_4-lBBL-h3_CD27L, hl_4-lBBL-hl_CD27L e construções individuais h3_CD27L + h3_4- lBBL, ou RNA de controlo, respectivamente. Células T CD8 + (HLA-A2 + de doadores) foram electroporadas com codificação IVT-RNA para uma CD8 específicas claudina-6- + receptor de células T ou que codifica para uma TPTE- específico CD8 + do receptor de células T e depois coradas com CFSE. IDCs electroporadas e CD8 + células T foram co-cultivadas em uma proporção de 01:10, durante 5 dias antes de proliferação de células T CD8 + de células T foi analisada por FACS. Histograma representativos de CFSE análise para claudina-6- TCR + CD8 + de células T são apresentados em (A) e para TPTE- TCR + CD8 + de células T são apresentados em (B). A análise detalhada da proliferação baseado em picos indicando divisões celulares foi feito pelo software Fluxo de Jo. Por este meio, as percentagens de células T que entraram em divisão, indicado por “% de células divididas 'o número médio de divisões de células, que entrou em divisão, indicado pelo índice de proliferação', foi calculado, ambas mostradas em (C). Aplicação de ambos hl_4 lBBL-M-construções de fus CD27L h3_4-lBBL-h3_CD27L e resultou em um aumento da proliferação de células T CD8 + de células T de uma maneira especifica para o antigénio, enquanto que a aplicação de dois RNAs que codificam para os dois ligantes de TNFR correspondentes não teve nenhum efeito sobre a proliferação.

[0070] A Figura 28 mostra os Efeitos de Duocinas recombinantes em células CD8+ a proliferação de células T. iDCs foram electroporadas com claudina-6 IVT-RN A. CD8 + células T (HL A- A2 + doadores) foram electroporadas com codificação PvY-RNA para uma CD8 específicas ciaudin-6- + receptor de células T e depois coradas com CFSE. Um dia após a electroporação, iDCs e CD8 + células T foram co-cultivadas em uma proporção de 1:10 durante 4 dias; 10 nM das proteínas recombinantes indicadas cada uma foram adicionadas às co- culturas. CD8 + proliferação de células T foi analisada por FACS. Histograma representativos de CFSE análise para claudina-6-TCR + CD8 + de células T são apresentados em (A). A análise detalhada da proliferação baseado em picos indicando divisões celulares foi feito pelo software Fluxo de Jo. Por este meio, as percentagens de células T que entraram em divisão, indicados por “% de células divididas 'o número médio de divisões de células, que entrou em divisão, indicado pelo índice de proliferação', foi calculado, tanto mostrado em (B) e (C), respectivamente. A adição de todos os três Duocinas resultou em um aumento da proliferação de células T CD8 + de células T de uma maneira especifica para o antigénio, enquanto que a adição dos dois correspondentes ligantes TNFR individuais não teve nenhum efeito sobre a proliferação.

[0071] A Figura 29 mostra a ligação simultânea de Duocinas a receptor imobilizado e PBMC que conduzem à ativação e proliferação de células T. 200 ng / poço de receptor-Fc foram imobilizados em placas de microtitulação durante a noite a 4 ° C. Os locais de ligação residuais foram bloqueados com meio RPMI 1640 + 10% de FCS, durante 1 h. Diluições em série de Duocinas foram incubadas com os receptores imobilizados durante 1 h, e posteriormente as proteínas não ligadas foram removidas por lavagem. 1,5x10 5 PBMC humanos CFSE-corados (população a granel) foram adicionados à placa de microtitulação na presença (ou ausência) de anticorpo anti-CD3 humana reticulada como estímulo primário subóptima. Após 6 dias, a proliferação de células T CD4 + e CD8 + de células T foi avaliada por citometria de fluxo por CFSE diluição.

[0072] A Figura 30 mostra a ligação simultânea de Duocinas de cadeia simples de receptor e PBMC que conduzem à ativação e proliferação de células T imobilizada. 200 ng / poço de receptor-Fc foram imobilizados em placas de microtitulação durante a noite a 4 ° C. Os locais de ligação residuais foram bloqueados com meio RPMI 1640 + 10% de FCS, durante 1 h. Diluições em série de scDuocinas foram incubadas com os receptores imobilizados durante 1 h, e posteriormente as proteínas não ligadas foram removidas por lavagem. 1,5x10 5 PBMC humanos CFSE-corados (população a granel) foram adicionados à placa de microtitulação na presença (ou ausência) de anticorpo anti-CD3 humana reticulada como estímulo primário subóptima. Após 6 dias, a proliferação de células T CD4 e CD8 foi avaliada em citometria de fluxo por diluio CFSE.

[0073] A Figura 31 mostra a estabilidade de Duocinas selecionadas e Duocinas de cadeia simples em plasma humano. 200 nm (unidades funcionais TNF ligante) dos Duocinas purificadas e Duocinas de cadeia simples foram preparados em 50% de plasma humano. As amostras foram congeladas a -20 ° C imediatamente após a preparação (0 d) ou após a incubação a 37 ° C durante 1 d, 3 d e 7 d. O nível de proteína intacta foi determinado em ELISA por meio da ligação de unidades de ligante homotriméricas C-terminal para o receptor imobilizado (150 ng / cavidade) e detecção do marcador FLAG de N- terminai. As concentrações de proteína nas amostras de plasma diluídas foram interpoladas a partir de uma curva padrão de proteína purificada. A quantidade de proteína de fusão detectada no dia 0 foi definida como 100%.

[0074] A Figura 32 mostra as propriedades farmacocinéticas de um duocina murino selecionada e duocina de cadeia simples em ratos CD1. 25 ug de proteína purificada foram injectados na veia da cauda de murganhos fêmea CD1 (12-16 semanas, 30-35 g, 3 ratos por construo) em um volume total de 150 ul. As amostras de sangue foram tiradas 3 min, 30 min, 1 h, 2 h, 6 h, 1 d, e 3 d após a injecção, incubado em gelo durante 30 minutos, e centrifugou-se a 13000 g durante 30 min a 4 ° C. As amostras de soro foram armazenadas a -20 ° C. Os níveis séricos das proteínas de fusão foram determinados em ELISA por meio de ligação a receptor imobilizado (150 ng / cavidade) correspondente para o ligante C-terminal e a detecção por meio da FLAG-tag N-terminal. As concentrações no soro de todas as proteínas foram obtidas por interpolação a partir de uma curva padrão de proteína purificada. Para efeitos de comparação, a concentração em 3 min foi definida como 100%. Meia-vida iniciais e terminais (t 1 / 2α3-60min, t 1 / 2β1-24h) e AUC foram calculados com o Excel.

[0075] A Figura 33 mostra a expressão do receptor em CMSP humanas e de ligação de Duocinas de cadeia simples para subpopulações de células imunes. 2.5xl0 5 PBMC (população a granel) humana foram incubadas com 10 nM de um único Duocinas de cadeia em presença ou ausência de anticorpo anti-CD3 humana reticulada como estímulo primário subóptima. Após 3 dias a 37 ° C, diferentes subpopulações foram identificadas em citometria de fluxo por coloração marcador CD (anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD14, anti-CD20 e anti-CD56) e a ligação de single- Duocinas cadeia para as diferentes subpopulações foi avaliada através da detecção da sua FLAG-tag. Além disso, estimuladas e não estimuladas. As PBMC também foram incubadas sem Duocinas de cadeia simples, subpopulações foram identificados após 3 dias de cultura e a expressão de superfície de CD40, CD27, OX40 e 4- IBB foi determinada por coloração de anticorpos.

[0076] A Figura 34 mostra a Ligação de um duocina de cadeia simples de aco-cis para células imunes humanas e indução de proliferação de células T. 2,5 x l05 PBMC (população a granel) humana foram incubadas com 10 nM sc4- lBBL-scCD27L na presença ou ausência de anticorpo anti-CD3 humana reticulada como estímulo primário subóptima. Após 3 dias a 37 ° C, diferentes subpopulações foram identificadas em citometria de fluxo por coloração marcador CD (anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD20 e anti-CD56), a expressão de superfície de CD27 e 4- IBB foi determinada por coloração de anticorpo, e a ligação do duocina de cadeia simples foi avaliada por detecção da sua FLAG-tag. 1,5 x 105 CFSE marcado com PBMC (população a granel, diferente lote PBMC) foram incubadas com 30, 3, 0,3 ou 0 nM sc4-lBBL-scCD27L na presença ou ausência de anticorpo anti-CD3 humana reticulada como estímulo primário subóptima. Após 6 dias, a proliferação de células T CD4 e CD8 foram determinados em citometria de fluxo por CFSE diluição.

[0077] A Figura 35 mostra a ligação de um duocina de cadeia simples de actuação trans às células imunes humanas e indução de proliferação de células T. 2,5x10 5 PBMC (população a granel) humana foram incubadas com 10 nM sc4- lBBL-scCD40L na presença ou ausência de anticorpo anti-CD3 humana reticulada como estímulo primário subóptima. Após 3 dias a 37 ° C, diferentes subpopulações foram identificadas em citometria de fluxo por coloração marcador CD (anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD20 e anti-CD56), a expressão de superfície de CD40 e 4- IBB foi determinada por coloração de anticorpo e a ligação do duocina de cadeia simples foi avaliada por detecção da sua FLAG-tag. 1.5 x l05 CFSE marcado com PBMC (população a granel, lote diferente PBMC) foram incubadas com 30, 3, 0,3 ou 0 nM sc4-lBBL-scCD40L na presença ou ausência de anticorpo anti-CD3 humana reticulada como estímulo primário subóptima. Após 6 dias, a proliferação de células T CD4 e CD8 foram determinados em citometria de fluxo por CFSE diluição.

[0078] A Figura 36 mostra a Ligação de um duocina de cadeia simples de actuação trans às células imunes humanas e indução de proliferação de células T. 2.5xl0 5 PBMC (população a granel) humana foram incubadas com 10 nM scCD40L-scCD27L na presença ou ausência de anticorpo anti-CD3 humana reticulada como estímulo primário subóptima. Após 3 dias a 37 ° C, diferentes subpopulações foram identificadas em citometria de fluxo por marcador CD coloração (anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD20 e anti-CD56), a expressão de superfície de CD40 e CD27 foi determinada por colorao de anticorpo e a ligação do duocina de cadeia simples foi avaliada por detecção da sua FLAG-tag. 1,5x10 5 CFSE marcado com PBMC (população a granel, diferente lote PBMC) foram incubadas com 30, 3, 0,3 ou 0 nM scCD40L-scCD27L na presença ou ausência de anticorpo anti-CD3 humana reticulada como estímulo primário subóptima. Após 6 dias, a proliferação de células T CD4 e CD8 foram determinados em citometria de fluxo por diluição CFSE-.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0079] Embora a presente invenção é descrita em detalhe abaixo, é para ser entendido que esta invenção não está limitada a metodologias, protocolos e reagentes particulares descritos aqui, uma vez que estes podem variar. É também para ser compreendido que a terminologia aqui utilizada é para o propósito de descrever apenas concretizações particulares, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção que será limitado apenas pelas reivindicações anexas. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm os mesmos significados que comumente entendido por um técnico versado no assunto.

[0080] No que se segue, será descrito os elementos da presente invenção. Estes elementos são listados com concretizações específicas, no entanto, deve ser entendido que eles podem ser combinados em qualquer forma e em qualquer número de criar concretizações adicionais. As diversas concretizações exemplificativas descritas e preferidas não devem ser interpretadas de forma a limitar a presente invenção apenas ao descrito explicitamente nas concretizações. Esta descrição deve ser entendida para suportar e abrangem concretizações que se combinam as concretizações explicitamente descritas com qualquer número dos elementos descritos e / ou preferidos. Além disso, quaisquer alterações e combinações de todos os elementos descritos neste pedido de patente deverá ser considerado divulgado pela descrição do presente pedido, a menos que o contexto indique o contrário.

[0081] Preferencialmente, os termos aqui utilizados são definidos conforme descrito em "A multilingual glossário de termos biotecnológicas: (Recomendações da IUPAC)", Leuenberger HGW, B. Nagel, e H. Kolbl, Eds, Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Suíça (1995).

[0082] A prática da presente invenção irá empregar, salvo indicação em contrário, métodos convencionais de química, bioquímica, biologia celular, imunologia, e técnicas de DNA recombinantes, que são explicadas na literatura da área (ver, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2 nd Edition, J. Sambrook et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

[0083] Ao longo deste relatório descritivo e das reivindicações que se seguem, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra "compreender", e variações, tais como "compreende" e "compreendendo", será entendida como implicando a inclusão de um elemento declarado, inteiro ou passo ou grupo de membros, inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, inteiro ou passo ou grupo de membros, inteiros ou etapas, embora em algumas concretizações, tais outro membro, inteiro ou passo ou grupo de membros, inteiros ou etapas pode ser excluído, ou seja, o objecto consiste na inclusão de um elemento declarado, inteiro ou passo ou grupo de membros, inteiros ou passos. Os termos "um" e "uma" e "o" e de referência semelhante ao utilizado no contexto da descrio da inveno (especialmente no contexto das reivindicaes) devem ser entendidos para cobrir ambos o singular e o plural, a menos que aqui indicado em contrário ou claramente contradito pelo contexto. Recitação de gamas de valores aqui destina-se apenas a servir como um método abreviado de referir individualmente cada valor separado que cai dentro da faixa. A menos que de outro modo aqui indicado, cada valor individual é incorporado na especificação como se fosse aqui individualmente recitado. Todos os modos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que aqui indicado de outro modo ou de outro modo claramente contrariado pelo contexto. O uso de qualquer e todos os exemplos, ou linguagem exemplificativa (por exemplo, "tal como"), aqui fornecido destina-se apenas a ilustrar melhor a invenção e não constitui uma limitação do escopo da invenção reivindicada de outro modo. Nenhuma linguagem na especificao deve ser entendida como indicando qualquer elemento não reivindicado essencial para a prática da invenção.

[0084] Vários documentos são citados ao longo do texto desta especificação. Cada um dos documentos aqui citados (incluindo todas as patentes, pedidos de patentes, publicações científicas, as especificações do fabricante, instruções, etc.), quer supra ou infra, são aqui incorporados por referência na sua totalidade. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não tem direito a anteceder tal divulgação em virtude da invenção anterior.

[0085] O termo "citocina" se refere geralmente a proteínas que são importantes na sinalização celular e atuam através de receptores. No contexto da presente invenção, o termo se refere particularmente para ligantes da superfamília TNF, mais particularmente, o domínio extracelular desses ligantes que formam homotrímeros solúveis ativos.

[0086] O termo "ligante da superfamia TNF", tal como aqui utilizado, também inclui variantes de um dado ligante da superfamília do TNF desde que estas variantes sejam funcionais, mais particularmente, têm um domínio extracelular que seja capaz de formar um homotrímero capaz de se ligar a um receptor do ligante.

[0087] O termo "variante de um ligante da superfamília TNF", de acordo com a invenção, se refere, em particular, para os mutantes, variantes de splicing, isoformas, conformações, variantes alicas, variantes de espie e homólogos de espécies, em particular aqueles que estão naturalmente presentes. Uma variante alélica se refere a uma alteração da sequência normal de um gene, o significado dos quais é frequentemente pouco claro. O sequenciamento do gene completo muitas vezes identifica em umerosas variantes alicas de um dado gene. Uma espécie homóloga é uma sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos com uma espécie diferente de origem a partir do que uma dada sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos. O termo "variante de um ligante da superfamília TNF " deve abranger todas as variantes pós- traducionalmente modificados e variantes de conformação.

[0088] De acordo com a presente invenção, o primeiro ligante e o segundo ligante de TNF superfamília são preferencialmente seleionados a partir do grupo consistindo de CD40L, CD27L, 4-1BBL, OX40L, abril, CD30L, EDA-A1, A2-EDA, FasL, GITRL, luz, LT-alfa, TL1A, TNF-alfa, TRAIL, RANKL, TWEAK e, mais preferencialmente a partir do grupo consistindo de CD40L, CD27L, 4-1BBL, OX40L e.

[0089] CD40 iigand (CD40L) é também conhecido como CD154, TNFSF5, TRAP ou gp39 e é uma glicoproteína transmembranar de tipo II, que pertence à superfamília do TNF. Em uma concretização, o termo CD40L, tal como aqui utilizado, se refere a CD40L humano. O número de acesso UniProt de CD40L humano é P29965. Em uma concretização, o CD40L tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[0090] O ligante CD27 (CD27L) é também conhecido como CD70 ou TNFSF7 e é uma glicoproteína transmembranar de tipo II que pertence à superfamília do TNF. Em uma concretização, o termo CD27L, tal como aqui utilizado, se refere a CD27L humano. O número de acesso UniProt de CD27L humano é P32970. Em uma concretização, CD27L tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[0091] O ligante 4-1BB (4- 1 BBL) é uma glicoproteína transmembranar de tipo II, que pertence à superfamília do TNF e também é referido como TNFSF9. Em uma concretização, o termo 4-1 BBL, tal como aqui utilizado, se refere a 4-1 BBL humano. O número de acesso UniProt de 4-1 BBL humano é P41273. Em uma concretização, 4-1 BBL tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

[0092] O ligante OX40 (OX40L), também conhecido como gp34 ou TNFSF4, é uma glicoproteína transmembranar de tipo II que pertence à superfamília do TNF. Em uma concretização, o termo OX40L, tal como aqui utilizado, se refere a OX40L humano. O número de acesso UniProt de OX40L humano é P23510. Em uma concretização, OX40L tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

[0093] Um ligante indutor de proliferação (APRIL), também conhecido como TALL-2, TRDL-1 ou TNFSF13, é uma proteína transmembranar de tipo II, que é um membro da superfamília do TNF. Em uma concretização, o termo abril, tal como aqui utilizado, se refere a abril humano. O número de acesso UniProt de abril humano é 075.888.

[0094] O ligante CD30 (CD30L), também conhecido como TNFSF8, é uma proteína de membrana do tipo II, que pertence à superfamília do TNF. Em uma concretização, o termo CD30L, tal como aqui utilizado, se refere a CD30L humano. O número de acesso UniProt de CD30L humano é P32971.

[0095] Ectodisplasina-Al (EDA-A1) é uma proteína transmembranar de tipo II que pertence à superfamília do TNF. É uma variante de splicing de ectodisplasina-A (EDA). Em uma concretização, o termo EDA-Al, tal como aqui utilizado, se refere a EDA-A1 humano. O número de acesso de UniProt humana EDA-A1 é Q92838-1.

[0096] Ectodisplasina-A2 (EDA-A2) é uma proteína transmembranar de tipo II que pertence à superfamília do TNF. É uma variante splicing de ectodisplasina-A (EDA). Em uma concretização, o termo EDA-A2, tal como aqui utilizado, se refere a EDA-A2 humano. O número de acesso de UniProt humana EDA-A2 é Q92838-3.

[0097] O ligante Fas (FasL) é também conhecido como CD95L ou TNFSF6 e é uma proteína transmembranar de tipo II que pertence à superfamília do TNF. Em uma concretização, o termo de FasL, como aqui utilizado, se refere a FasL humano. O número de acesso UniProt de FasL humano é P48023.

[0098] O ligante GITR (GITRL) é uma proteína transmembranar de tipo II que pertence à superfamília do TNF e foi designado TNFSF18. Em uma concretização, o termo GITRL, tal como aqui utilizado, se refere a GITRL humano. O número de acesso UniProt de GITRL humano é Q9UNG2.

[0099] LIGHT também é conhecido como HVEML ou TNFSF14 e é uma proteína transmembranar de tipo II, que pertence à superfamília do TNF. Em uma concretização, o termo LIGHT, como aqui utilizado, se refere a LIGTH humana. O número de acesso UniProt de LIGTH humano é 043.557.

[00100] A linfotoxina-alfa (LT-alfa) é também conhecido como o TNF-beta ou TNFSFl e é um membro da superfamia TNF. Em uma concretização, o termo LT-alfa, tal como aqui utilizado, se refere a LT-alfa humano. O número de acesso UniProt de LT-alfa humano é P01374.

[00101] TL1A é uma proteína transmembranar de tipo II, que pertence à superfamília do TNF e foi designado TNF membro da superfamília 15 (TNFSF15). Em uma concretização, o termo TL1A, tal como aqui utilizado, se refere a TL1A humano. O número de acesso UniProt de TL1 humano A é O95150-1.

[00102] Fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa), também conhecido como caquectina ou TNFSF2, é uma proteína transmembranar de tipo II que pertence a superfamília TNF. Em uma concretização, o termo TNF-alfa, tal como aqui utilizado, se refere ao TNF-alfa humano. O número de acesso UniProt de TNF-alfa humano é P01375.

[00103] ligante indutor de apoptose TNF-relacionada (TRAIL), também conhecido como ligante Apo-2 ou TNFSFIO, é uma proteína transmembranar de tipo II que pertence ao TNF superfRNAily. Em uma concretização, o termo TRAIL, tal como aqui utilizado, se refere a TRAIL humano. O número de acesso UniProt de TRAIL humano é P50591.

[00104] O ligante do ativador de receptor de NF-kB (RANK) (RANKL), também referido como TRANCE, ODF, OPGL ou TNFSFl 1, é uma proteína transmembranar de tipo II que pertence ao TNF superfRNAily. Em uma concretização, o termo RANKL, tal como aqui utilizado, se refere a RANKL humana. O número de acesso UniProt de RANKL humana é 014.788.

[00105] TWEAK é uma proteína transmembranar de tipo II que pertence ao TNF superfRNAily e é também referido como ligante AP03 ou TNFSF12. Em uma concretização, o termo TWEAK, tal como aqui utilizado, se refere a TWEAK humano. O número de acesso UniProt de TWEAK humano é 043.508.

[00106] Em uma concretização, o receptor do primeiro ligante e o receptor do segundo ligante estão localizados na mesma célula ("cis"), em que, de um modo preferido, o primeiro ligante e o segundo ligante são selecionadas a partir do grupo consistindo de CD27L, 4 -1BBL e OX40L. Em uma concretização, a referida célula é uma célula T, de preferência, um T CD4 + e / ou CD8 + da célula T. Em uma concretização, a referida célula T é uma célula T ativada.

[00107] Em outra concretização, o receptor do primeiro ligante e o receptor do segundo ligante estão localizados em diferentes células ("trans"). As referidas células diferentes podem ser do mesmo tipo ou de diferentes tipos. Em uma concretização, as referidas células são diferentes uma célula apresentadora de antigénio (APC), tal como uma cula dendrica e uma cula T. Em outra concretização, as referidas células são diferentes uma célula B e uma célula T. Em uma concretização, o primeiro ligante ou o segundo ligante é o CD40L e o respectivo outro ligante é selecionado a partir do grupo consistindo de CD27L, 4-1BBL e OX40L. Em uma concretização, a referida célula T é um CD4 + e / ou CD8 + da célula T. Em uma concretização, a referida célula T é uma célula T ativada.

[00108] Em uma concretização, a proteína de fusão de citocina ativa o receptor do primeiro ligante e / ou o receptor do segundo ligante. Em uma concretização, a proteína de fusão de citocina é uma proteína de fusão de citocina de ativação cis, ativando simultaneamente o receptor do primeiro ligante e o receptor do segundo ligante localizada na mesma célula. Em outra concretização, a proteína de fusão de citocina é uma proteína de fusão de citocina trans-ativação, ativando simultaneamente o receptor do primeiro ligante e o receptor do segundo ligante localizado em células diferentes. Em uma concretização, a proteína de fusão de citocina ativa a via NF-kB e / ou induz a libertação de IL-8 a partir da célula (s) que expressam o receptor (s) do primeiro ligante e / ou o segundo ligante.

[00109] Em uma concretização, a proteína de fusão de citocina ativa as células T e / ou induz a proliferação de células T. Em uma concretização, a proteína de fusão de citocina induz a proliferação específica de antigénio de células T. Em uma concretização, as referidas células T são CD4 + e / ou CD8 + células T. Em uma concretização, as referidas células T são as células T ativadas.

[00110] O termo "domínio extracelular", como aqui utilizado, se refere à parte extracelular C-terminal de um ligante do TNF compreendendo superfamília o domínio de homologia de TNF (THD). O domínio extracelular é caracterizado pela sua capacidade de formar um trímero (homo) capaz de se ligar a um receptor do ligante, e poderá também ser referido como "domínio de ligação ao receptor".

[00111] Um "fragmento ou variante" do domínio extracelular que pode ser utilizado de acordo com a presente invenção é um fragmento ou variante funcional do domínio extracelular que tem a capacidade de formar um trímero (homo) capaz de se ligar a um receptor da ligante. Assim, um fragmento ou variante adequada compreende pelo menos um domínio de TNF homologia funcional (THD).

[00112] Os termos "parte" ou "fragmento" são aqui utilizados indiferentemente e referem-se a um elemento contínuo. Por exemplo, uma parte de uma estrutura, tal como uma sequência de aminoácidos ou proteína, se refere a um elemento contínuo da referida estrutura. Uma parte ou fragmento de uma sequência de proteína compreende preferivelmente uma sequência de, pelo menos, 6, em particular, de pelo menos 8, pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 150 ou, pelo menos, 200 aminoácidos consecutivos da sequência de proteína.

[00113] Para os fins da presente invenção, "variantes" de uma sequência de aminoácidos compreendem variantes de inserção de aminoácidos, variantes de adição de aminoácidos, variantes de deleção amino ácidos e / ou variantes de substituição de aminoácidos. Amino ácido variantes de deleção que compreendem a deleção no N-terminal e / ou a extremidade C-terminal da proteína são também chamados N-terminal e / ou variantes de truncagem C-terminal.

[00114] Amino ácido variantes de inserção compreendem inserções de único ou dois ou mais aminoácidos em uma sequência de aminoácidos particular. No caso de variantes de sequência de aminoácidos possuindo uma inserção, um ou mais resíduos de aminoácidos são introduzidos em um sítio particular em uma sequência de aminoácidos; embora a insero aleatia com rastreio apropriado do produto resultante também é possível.

[00115] As variantes de adição de aminoácidos compreendem fusões amino e / ou carbóxi-terminal de um ou mais aminoácidos, tais como 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, ou mais aminoácidos.

[00116] As variantes de deleção de aminoácidos são caracterizadas pela deleção de um ou mais aminoácidos da sequência, tais como por deleção de 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, ou mais aminoácidos. As deleções podem estar em qualquer posição da proteína.

[00117] As variantes de substituição de aminoácidos são caracterizadas por pelo menos um resíduo na sequência a ser removido e outro resíduo a ser inserido no seu lugar. É dada preferência a modificações que estejam em posições na sequência de aminoácidos que não são conservadas entre proteínas homólogas ou peptídeos e / ou a substituição de aminoácidos com outros os que possuam propriedades semelhantes. Preferencialmente, as substituies de aminoácidos em variantes de proteína são substituições de aminoácidos conservadoras. Uma substituição de aminoácidos conservativa envolve a substituio de um aminoido por outro da mesma família de aminoácidos, isto é, os aminoácidos que estão relacionados nas suas cadeias laterais (por exemplo, em termos de carga eléctrica e / ou tamanho). Os aminoácidos que ocorrem naturalmente são geralmente divididos em quatro famílias: ácido (aspartato, glutamato), básicos (lisina, axginine, histidina), não polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), e não carregados polar (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina) aminoácidos. Fenilalanina, triptofano, e tirosina são por vezes classificados conjuntamente como aminoácidos aromáticos.

[00118] De preferência, o grau de similaridade, preferencialmente identidade entre uma dada sequência de aminoácidos e uma sequência de aminoácidos que é uma variante da referida dada sequência de aminoácidos será de pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%. O grau de semelhança ou de identidade é dada preferência para uma região de aminoácidos que é pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou cerca de 100% de todo o comprimento da sequência de aminoácidos de referência. Por exemplo, se a sequência de aminoácidos de referência é constituída por 200 aminoácidos, o grau de similaridade ou de identidade é dada de preferência durante pelo menos cerca de 20, pelo menos aproximadamente 40, pelo menos aproximadamente 60, pelo menos aproximadamente 80, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 120, pelo menos cerca de 140, pelo menos cerca de 160, pelo menos cerca de 180, ou cerca de 200 aminoácidos, de preferência os aminoácidos contínuos. Em concretizações preferidas, o grau de similaridade ou de identidade é determinado para todo o comprimento da sequência de aminoácidos de referência.

[00119] O alinhamento para determinar a similaridade de sequência, de preferência de identidade de sequência pode ser feito com as ferramentas conhecidas do estado da técnica, utilizando, de preferência, o melhor alinhamento de sequências, por exemplo, utilizando Align, usando as configurações padrão, de preferência, EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap open 10,0, Gap Extend 0,5.

[00120] A "Similaridade de sequência" indica a percentagem de aminoácidos que ou são idênticos ou que representam substituições de aminoácidos conservativas. A "Identidade de sequência" entre duas sequências de aminoácidos indica a percentagem de aminoácidos que são idênticos entre as sequências.

[00121] O termo "percentagem de identidade" destina-se a denotar uma percentagem de resíduos de aminoácidos que são idênticos entre as duas sequências a serem comparadas, obtido após o melhor alinhamento, sendo puramente estatística esta percentagem e as diferenças entre as duas sequências a serem distribuídos aleatoriamente e ao longo toda a sua extensão. As comparações de sequências entre duas sequências de aminoácidos são convencionalmente realizada por comparação destas sequências, depois de ter alinhado-los de forma ótima, referida comparação ser efectuada pelo segmento ou pelo "janela de comparação" para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. O alinhamento óptimo das sequências para comparação pode ser produzido, além manualmente, por meio do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, 1981, App anúncios. Matemática. 2, 482, por meio do algoritmo de homologia local de Neddleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, por meio do método de busca de similaridade de Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sei. EUA 85, 2444, ou por meio de programas de computador que usam esses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin.).

[00122] A percentagem de identidade é calculada determinando o número de posições idênticas entre as duas sequências a serem comparadas, dividindo este valor pelo número de posições comparadas e multiplicando o resultado obtido por 100 de modo a obter a percentagem de identidade entre estas duas sequências.

[00123] O termo "proteína de fusão" geralmente se refere a proteínas criados pela união de duas ou mais distintas (polipeptídeos ou proteínas, de preferência cabeça- a-cauda (ou seja, N-terminal para C-terrninus ou vice-versa), o que resulta em uma única proteína com propriedades funcionais derivadas de cada uma das proteínas originais. De acordo com a presente invenção, o termo "proteína de fusão de citocina" também engloba complexos multiméricos, por exemplo, dimérico ou trimérico de proteínas de fusão distintas, os quais são aqui referidos como "subunidades". De um modo preferido, as subunidades não-covalentemente ou covalentemente (por exemplo, via ligações dissulfeto) se associam para formar a proteína de fusão de citocina.

[00124] Uma subunidade preferida de acordo com a presente invenção tem a fórmula geral

[00125] tal como aqui definido, em que, de preferência, três destas subunidades associadas de forma não covalente através dos domínios extracelulares ou seus fragmentos ou variantes do primeiro ligante e nos domínios extracelulares ou seus fragmentos ou variantes do segundo ligante para formar a proteína de fusão de citocina.

[00126] Outra subunidade preferida de acordo com a presente invenção tem a fórmula geral

[00127] tal como aqui, em que L compreende ainda um domínio de multimerização, de preferência, um domínio de dimerização, permitindo a formação de uma proteína de fusão de citocina multimérica, de preferência, dimérica, definida.

[00128] O termo "bloco", tal como aqui utilizado, se refere a uma unidade / entidade molecular que compreende três domínios extracelulares ou fragmentos ligados de forma covalente ou as suas variantes de um ligante da superfamia TNF. Em uma concretização, o bloco tem a fórmula geral A - GA - A- LA - A ou B - GB - B - GB -B, em que A, B, GA e GB são como aqui definido. Em uma concretização, o bloco compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos de acordo com uma das SEQ ID NOs: 9 - 12.

[00129] O termo "ligado de forma covalente", tal como aqui utilizado, se refere à ligação através de uma ligação covalente ou através de uma molécula de ligação covalente, tal como um ligante peptídico.

[00130] O termo "ligante peptídico", tal como aqui utilizado, se refere a um peptídeo adaptado para ligar porções / proteína de ligação, por exemplo, domínios extracelulares de ligantes da superfamia TNF, ou blocos dos mesmos, ou homotrimeros formados por estes domínios extracelulares. Um ligante peptídico de acordo com a presente invenção pode ter qualquer comprimento, isto é, compreendem qualquer número de resíduos de aminoácidos. No entanto, é, de preferência, suficiente para proporcionar um grau suficiente de flexibilidade para evitar que as porções conectados / ligados de interferir com a actividade do outro - por exemplo, a capacidade dos domínios extracelulares de um ligante do TNF superfamília para formar ahomotrimer capaz de se ligar um receptor do ligante, e / ou a capacidade de dois homotrimeros diferentes para se ligar a dois receptores diferentes na mesma célula ( "cis") ou em células diferentes ( "trans") - por exemplo, por impedimento estérico, e para permitir para um enrolamento proteico apropriado; no entanto, é, de preferência, suficientemente curto para proporcionar a estabilidade (por exemplo, estabilidade proteolítica) na célula.

[00131] Em concretizações preferidas, os ligantes de peptídeos têm um comprimento de 1 a 30 aminoácidos. Assim, de acordo com a presente invenção, um ligante peptídico pode ser composto por um único resíduo de aminoácido. De um modo preferido, um ligante peptídico longo liga o domínio extracelular (s) ou fragmento (s) ou variante (s) dos mesmos do primeiro ligante com o domínio extracelular (s) ou fragmentos) ou variante (s) do mesmo do segundo ligante, por exemplo, o primeiro homotrímero com o segundo homotrímero ou o primeiro bloco com o segundo bloco, ao passo que, em geral, um ligante peptídico curto é utilizado para ligar dois domínios extracelulares ou seus fragmentos ou variantes do primeiro ou do segundo ligante, respectivamente, ou seja dois domínios extracelulares ou seus fragmentos ou variantes do mesmo ligante. No caso do ligante 4-1BBL, de preferência, um peptídeo longo ligante é usado para ligar dois dos seus domínios extracelulares, ou seus fragmentos ou variantes. Os ligantes peptídicos curtos podem consistir de 12 ou menos, tal como 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 aminoácidos, e, de preferência, de 1 a 7 aminoácidos. Os ligantes peptídicos longos podem consistir de 12 ou mais, tal como 12 a 30 ou 12 a 25 ou 12 a 20 aminoácidos.

[00132] Os aminoácidos do peptídeo ligante pode ser selecionado a partir de todos os aminoácidos de ocorrência natural ou não natural, em que os aminoácidos glicina (Gly, G), serina (Ser, S) e treonina (Thr, T) são os preferidos. Em uma concretização, o ligante peptídico é uma glycme-serina- rico em treonina ligante ou glicina-rico em serina ligante, em que pelo menos 50%, de preferência pelo menos 60%, mais preferencialmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90% dos aminoácidos são glicina ou serina ou treonina ou um resíduo de glicina ou serina, respectivamente. Em outra concretização, os aminoácidos são selecionados entre glicina, serina e treonina, ou seja, o ligador peptídico é composta exclusivamente de glicina, serina e treonina (referido como um ligante serina-treonina glicina-). Em ainda outra concretização, o ligante peptídico é composto exclusivamente de resuos de glicina e serina (referido como um ligante glicina-serina).

[00133] Os ligantes peptídicos preferidos de acordo com a presente invenção têm a fórmula geral (GGGGX) n, em que X é, em cada ocorrência, independentemente selecionados a partir de S e T, e n é um número inteiro selecionado de 1 a 6, de preferência 1 a 5; ou uma fórmula geral seleccionada a partir do grupo que consiste em GXG, GGXGG e GGGXGGG, em que X é S ou T.

[00134] Os ligantes peptídicos curtos preferidos têm uma fórmula geral seleccionada a partir do grupo que consiste em GXG, GGXGG, GGGXGGG e GGGGXGGGG, em que X é S ou T, ligante curto peptídeo de preferência S. Um particularmente preferido é GGGXGGG, em que X é S ou T, de um modo preferido S.

[00135] Ligantes peptídicos longos preferidos possuem a fórmula geral (GGGGX) “, em que X é, em cada ocorrência, independentemente selecionado a partir de S um T, e n é um número inteiro selecionado a partir de 3 a 6, de preferência 3 a 5, mais preferencialmente 3 e 4. Particularmente, os ligantes peptídicos longos preferidos são selecionados a partir do grupo que consiste de (GGGGS)3 (SEQ ID nO: 19), GGGGSGGGTGGGGS (SEQ ID nO: 20) e (GGGGS)4 (SEQ ID nO: 21).

[00136] De preferência, no caso da proteína de fusão de citocina compreende uma molécula / estrutura possuindo a fórmula geral de Fórmula I, como aqui definido,

[00137] L compreende um ligante peptídico longo, tal como aqui definido e ou LA e LB são, em cada ocorrência, independentemente selecionados de uma ligação covalente (por exemplo, uma ligação peptídica), um curto ligante peptídico tal como aqui definido e um ligante peptídico longo, tal como aqui definido.

[00138] De preferência, no caso de A ou B compreende o domínio extracelular ou um seu fragmento ou variante de 4- 1BBL, LA ou LB é, em cada ocorrência, independentemente selecionado a partir de ligantes peptídicos longas, tal como aqui definido. De preferência, no caso de nem A nem B compreende o domínio extracelular ou um seu fragmento ou variante de 4-1BBL, LA e LB são, em cada ocorrência, independentemente selecionados de uma ligação covalente (por exemplo, uma ligação peptídica) e um curto ligante peptídico como aqui definido.

[00139] De acordo com a presente invenção, LA e LB podem ser o mesmo ou diferente.

[00140] De acordo com a presente invenção, no caso da proteína de fusão de citocina compreende uma molécula / estrutura possuindo a fórmula geral de Fórmula I, como aqui definido,

[00141] L pode ainda compreender um domínio de multimerização permitindo a multimerização da proteína de fusão de citocina.

[00142] Em tais casos, L pode compreender um ptido ligante, tal como aqui definido, em que o domínio de multimerização foi inserido. Em uma concretização alternativa, L pode compreender dois elementos de ligação peptídicos como aqui definido ensanduichando o domínio de multimerização, em que os dois ligantes peptídicos podem ser o mesmo ou diferente. Em uma concretização, os dois elementos de ligação peptídicos são selecionados a partir de ligantes peptídicos curtos como aqui definido. Em ainda outra concretização, o domínio de multimerização representa o ligante peptídico composto por L.

[00143] Multimerização pode ocorrer por interacção não-covalente e / ou interacção covalente, em particular, através de uma ou mais ligações dissulfureto, entre múltiplos (por exemplo, 2, 3 ou 4, preferencialmente 2 ou 3, mais preferencialmente 2) domínios de multimerização.

[00144] os domínios de multimerização apropriados são conhecidos para um perito na arte e incluem, por exemplo, os domínios de trimerização, tal como um motivo de tenascina trimerização, um domínio colectina trimerização e estreptavidina, e os domínios de dimerização, tal como um domínio de cadeia pesada de IgE 2 (EHD2), um domínio de cadeia pesada de IgM 2 (MHD2), um domínio de cadeia pesada de IgG de 3 (GHD3), um domínio de cadeia pesada de IgA 3 (AHD2), um domínio de cadeia pesada de IgD 3 (DHD3), uma pesada de IgE domínio de cadeia 4 (EHD4), um domínio de cadeia pesada de IgM 4 (MHD4), um domínio Fc, e um domínio de dimerização uteroglobina. Em uma concretização, o domínio de dimerização é um domínio EHD2 ou um domínio MHD2, por exemplo, como descrito em WO 2013/156148 Al. Em uma concretização, o domínio de dimerização é um domínio EHD2 humano, o qual, de preferência, compreende ou consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23. Também estão incluídas variantes funcionais de qualquer um dos domínios anteriores, por exemplo, domínios que têm foi modificado de modo a estender a sua meia-vida e ou aumentar a sua eficiência. Modificações adequados são conhecidos para um perito na arte e incluem, mas não estão limitadas a modificações do domínio de Fe, que aumentam a sua afinidade para com o FcRn, conforme descrito, por exemplo, em Zalevsky, J. et al. (2010), Nature Biotechnology, 28 (2): 157-9 (por exemplo, N434S, V259I / V308F, M252Y / S254T / T256E, M428L / N434S, e V259 308F / M428L).

[00145] No caso da proteína de fusão de citocina compreende uma molécula / estrutura (ou, pelo menos, um, de preferência três, subunidades) que possui a fórmula geral de Fórmula II, tal como aqui definido,

[00146] L compreende preferivelmente um ligante peptídico longa, tal como aqui definido.

[00147] Os ligantes peptídicos, tal como aqui descritos podem ser substituídos com moléculas não peptídicos, por exemplo, oligômeros não peptídicos e polímeros de comprimentos adequados. Tais concretizações equivalentes são expressamente incluídas na presente invenção.

[00148] De um modo preferido, na proteína de fusão de citocina de acordo com a presente invenção, - o primeiro ligante é CD40L, e o segundo ligante é CD27L; - o primeiro ligante é CD27L, e o segundo ligante é CD40L; - o primeiro ligante é CD40L, e o segundo ligante é 4-1BBL; - o primeiro ligante é 4-1BBL, e o segundo ligante é CD40L; - o primeiro ligante é CD27L, e o segundo ligante é 4-1BBL; - o primeiro ligante é 4-1BBL, e o segundo ligante é CD27L; - o primeiro ligante é CD40L, e o segundo ligante é OX40L; - o primeiro ligante é OX40L, e o segundo ligante é CD40L; - o primeiro ligante é CD27L, e o segundo ligante é OX40L; - o primeiro ligante é OX40L, e o segundo ligante é CD27L; - o primeiro ligante é OX40L, e o segundo ligante é 4-1BBL; ou - o primeiro ligante é 4-1BBL, e o segundo ligante é OX40L.

[00149] Em uma concretização, a proteína de fusão de citocina compreende uma molécula / estrutura (ou, pelo menos, um, de preferência três, subunidades) que possui a fórmula geral de Fórmula II, tal como aqui definido, em que o segundo ligante, isto é, o ligante C-terminal, é CD40L.

[00150] Um "marcador ou etiqueta que permite a detecção e / ou isolamento da proteína de fusão de citocina" pretende incluir quaisquer marcadores / corantes conhecidos no estado da técnica para esses fins. Particularmente preferidos são os marcadores de afinidade, tais como proteína de ligação a quitina (CBP), proteína de ligação a maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST) e poly (His) (por exemplo, His 6 ); etiquetas de solubilização, tais como a tioredoxina (TRX) e poli (NANP); marcadores de cromatografia, tal como um identificador FLAG; marcadores de epitopo, tais como V5-tag, marca Myc e HA-tag; e fluorescentes ou luminescentes etiquetas ou rótulos, tais como proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP, YFP, RFP, etc.), corantes fluorescentes e da luciferase. Em uma concretização, o marcador / corante é um FLAG-tag.

[00151] A sequência de aminoácidos de um (marcador ou corante polipeptídeo pode ser introduzido em qualquer posição dentro da sequência de aminoácidos da proteína de fusão de citocina, e pode, por exemplo, tomar a forma de um circuito no interior da estrutura da proteína codificada (por exemplo, dentro de qualquer dos ligantes peptídicos aqui ou mesmo descritos dentro dos domínios extracelulares do primeiro e do segundo ligante, desde que a etiqueta / marca de não interferir com a sua função), ou pode ser N-terminal ou C- terminal fundido. O marcador ou corante pode conter adicionalmente um local de clivagem que permite uma remoção do marcador ou corante da proteína de fusão de citocina. marcadores da mesma forma, não-peptídicos ou tags, por exemplo, corantes fluorescentes, pode ser conjugado com a proteína de fusão de citocina, em qualquer local adequado.

[00152] Proteína de fusão de citocina, de acordo com a invenção pode também compreender uma sequência de aminoácidos para facilitar a secreção da molécula, tal como um sinal de secreção N-terminal. De um modo preferido, o sinal de secreção é uma sequência de sinal que permite uma passagem suficiente através da via de secreção e / ou a secreção para o meio extracelular. De preferência, a sequência de sinal de secreção é clivável e é removida a partir da proteína de fusão de citocina madura. A sequência de sinal de secreção é de preferência escolhida com respeito à célula ou organismo que a proteína de fusão de citocina é produzido em Em uma concretização, a sequência de sinal de secreção compreende ou consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:15 ou SEQ ID NO: 22.

[00153] A proteína de fusão de citocina da invenção pode ainda compreender um domínio de ligação que serve, por exemplo, para melhorar a selectividade para um tipo de célula específico. Isto pode ser conseguido, por exemplo, fornecendo um domínio de ligação que se liga a um antígeno específico expresso sobre a superfície do referido tipo celular.

[00154] A proteína de fusão de citocina, de acordo com a presente invenção pode ainda compreender uma ou mais modificações que aumentam a estabilidade da proteína de fusão de citocina. O termo "estabilidade" da proteína de fusão de citocina se refere a "meia-vida" da proteína de fusão de citocina, por exemplo, in vivo. "Meia-vida" se refere ao período de tempo que é necessário para eliminar metade da actividade, uma quantidade, ou número de moléculas.

[00155] A proteína de fusão de citocina pode, por exemplo, ser conjugado com ahalf-vida útil do módulo de extensão. Tais módulos são conhecidos de uma pessoa perita na arte e incluem, por exemplo, albumina, um domínio de ligação a albumina, um domínio de ligação de imunoglobulina, um motivo de ligação ao FcRn, e, em particular, um polímero. Os polímeros particularmente preferidos incluem polietileno glicol (PEG), amido de hidroxietilo (HES), o ácido poli-siico e sequências peptídicas de PEG-miméticas.

[00156] O termo "ligação" de acordo com a invenção se refere preferencialmente a uma ligação específica. Um agente de ligação, tal como uma proteína de fusão de citocina, de acordo com a presente invenção, é específico para um alvo pré-determinado, se for capaz de se ligar ao referido alvo pré-determinado, enquanto que não é capaz de se ligar a outros alvos.

[00157] Uma "molécula de ácido nucleico", de acordo com a invenção de preferência ácido desoxirribonucleico (DNA) ou de ácido ribonucleico (RNA), mais preferencialmente, de RNA (por exemplo, RNAm), mais preferencialmente, RNA transcrito in vitro (IVT RNA) ou de RNA sintético. Uma molécula de ácido nucleico pode, de acordo com a invenção estar na forma de uma molécula que é de cadeia simples ou de cadeia dupla e lineares ou covalentemente fechadas para formar um círculo.

[00158] No contexto da presente invenção, o termo "DNA" se refere a uma molécula que compreende os resíduos de desoxirribonucleótido e de preferência é totalmente ou substancialmente composto por resíduos de desoxirribonucleótido. "Desoxirribonucleido" se refere a um nucleótido que não possui um grupo hidroxilo na posição 2 'posio de um grupo β-D-ribofuranosilo. O termo "DNA" inclui DNA isolado, tal como DNA parcialmente ou completamente purificada, DNA essencialmente puro, DNA sintético e DNA recombinante gerado e inclui DNA modificado que difere do DNA que ocorre naturalmente por meio de adição, deleção, substituição e / ou alteração de uma ou mais nucleotídeos. Tais alteraes podem incluir a adição de material não- nucleótido, tal como para a extremidade (s) de um DNA ou internamente, por exemplo, em um ou mais nucleotídeos do DNA. Nucleotídeos de moléculas de DNA também podem compreender nucleotídeos não convencionais, tais como os nucleotídeos que não ocorrem naturalmente ou nucleotídeos sintetizados quimicamente. Estes DNA alterados podem ser referidos como análogos ou análogos de DNA que ocorrem naturalmente.

[00159] No contexto da presente invenção, o termo "RNA" se refere a uma molécula que compreende os resíduos de ribonucleotídeos e preferencialmente é inteiramente ou substancialmente composto por resíduos de ribonucleótido. "Ribonucleótidoredutase" se refere a um nucleótido com um grupo hidroxilo na posição 2 'de um grupo β-D-ribofuranosilo. O termo "RNA" compreende RNA isolado tal como parcialmente ou completamente purificada RNA, essencialmente RNA puro, RNA sintico, e RNA recombinante gerado e inclui RNA modificado que difere do RNA que ocorre naturalmente por meio de adição, deleção, substituição e / ou alteração de uma ou mais nucleotídeos. Tais alteraes podem incluir a adição de material não-nucleótido, tal como para a extremidade (s) de um RNA ou internamente, por exemplo, em um ou mais nucleotídeos do RNA. Nucleotídeos de moléculas de RNA também pode compreender nucleidos não convencionais, tais como os nucleotídeos que não ocorrem naturalmente ou nucleidos sintetizados quimicamente ou desoxinucleidos. Estes RNAs alterados podem ser referidos como anogos ou anogos de RNA de ocorrência natural. De acordo com a invenção, "RNA" se refere a RNA de cadeia simples ou RNA de cadeia dupla.

[00160] De acordo com a presente invenção, o termo "RNA mensageiro (mRNA)" se refere a uma "transcrição", que pode ser gerado através da utilização de um molde de DNA e pode codificar um peptídeo ou proteína. Tipicamente, um RNAm inclui uma 'região -untranslated, uma região de codificação de proteína, e um 3' 5 -untranslated região. No contexto da presente invenção, o RNAm pode ser gerado por transcrição in vitro a partir de um molde de DNA. A metodologia de transcrição in vitro é conhecido para por um técnico versado no assunto. Por exemplo, há uma variedade de Kits de transcrição in vitro disponíveis comercialmente.

[00161] De acordo com a invenção, o RNA pode ser modificado. Por exemplo, o RNA pode ser estabilizado por uma ou mais modificações que têm efeitos estabilizadores sobre RNA.

[00162] O termo "alteração", no contexto de RNA, tal como utilizado de acordo com a presente invenção inclui qualquer modificação de RNA que não está naturalmente presente no referido RNA.

[00163] Em uma concretização da invenção, o RNA utilizado de acordo com a invenção não tem destapados 5'- trifosfatos. A remoção de tais não niveladas 5'-trifosfatos pode ser conseguida por tratamento de RNA com uma fosfatase.

[00164] O RNA de acordo com a invenção pode ter modificado de ocorrência natural ou de ocorrência não natural ribonucleidos (sintéticos), a fim de aumentar a sua estabilidade e / ou diminuir a citotoxicidade e / ou modular a seu potencial imunoestimulador. Por exemplo, em uma concretização, no RNA usado, de acordo com a invenção uridina é substituído parcial ou completamente, de preferência completamente, por pseudouridina.

[00165] Em uma concretização, o termo "modificao" se refere ao fornecimento de um RNA com um 5 '-CaP ou 5' analógico-CAP. O termo "5 'CAP" se refere a uma estrutura de cobertura encontrado na extremidade 5' de uma molécula de RNAm e geralmente consiste em um nucleótido guanosina ligado ao mRNA através de uma invulgar 5' para 5' ligação trifosfato. Em uma concretização, esta é guanosina metilada na posição-7. O termo "convencional 5 '-CaP" se refere a um RNA que ocorre naturalmente 5' CAP, de um modo preferido para a tampa 7-metilguanosina (m 7 L). No contexto da presente invenção, o termo "5'-tampão" inclui um 'análogo de 5-CAP que se assemelha a estrutura de tampa e de RNA é modificado para possuir a capacidade de estabilizar o RNA se a ele ligado, de um modo preferido in vivo e / ou in uma célula. Fornecendo um RNA com um 5'-tampão ou 5 'analógico-CAP pode ser conseguida por transcrição in vitro de um molde de DNA, na presença do referido 5' ou 5 'CAP-CAP analógico, em que o referido 5' é co-CAP -transcricionalmente incorporados na cadeia de RNA gerado, ou o RNA pode ser gerado, por exemplo, por transcrição in vitro, e o 5 'CAP pode ser gerado pós- transcricionalmente utilizando enzimas de nivelamento, por exemplo, o nivelamento enzimas de vírus vaccinia.

[00166] O RNA pode compreender modificações adicionais. Por exemplo, uma modificação do RNAm utilizado na presente invenção pode ser uma extensão ou truncamento do poli (A) da cauda que ocorre naturalmente.

[00167] O termo "estabilidade" de RNA se refere a '^alf-vida" de RNA. 'Meia-vida' se refere ao período de tempo que é necessário para eliminar metade da actividade, uma quantidade, ou número de moléculas. No contexto a presente invenção, a meia-vida de um RNA é indicativa para a estabilidade do referido RNA.

[00168] Se, de acordo com a presente invenção, é desejável diminuir a estabilidade de RNA, também é possível modificar RNA de modo a interferir com a função de elementos como acima descrito o aumento da estabilidade de RNA.

[00169] De acordo com a presente invenção, o RNA pode ser obtido por síntese química ou por transcrição in vitro de um molde de DNA adequado. No contexto da presente invenção, o termo "transcrição" se refere a um processo, em que o código genético em uma sequência de DNA é transcrito em RNA. Subsequentemente, o RNA pode ser traduzido em proteína. De acordo com a presente invenção, o termo "transcrição" compreende "a transcrição in vitro", em que o termo "in vitro de transcrição" se refere a um processo em que o RNA, em particular RNAm, é sintetizada in vitro em um sistema isento de células, de preferência, utilizando extratos celulares apropriados. De um modo preferido, vetores de clonagem são aplicados para a geração de transcritos. Estes vetores de clonagem são geralmente concebidos como a transcrição. Vetores e estão de acordo com a presente invenção abrangidos pelo termo "vetor". O promotor para controlar a transcrição pode ser qualquer promotor para qualquer polimerase de RNA. Exemplos particulares de polimerases de RNA são as polimerases de T7, T3, e SP6 RNA. Um molde de DNA para transcrição in vitro, pode ser obtido por clonagem de um ácido nucleico, em particular de DNAc, e introduzí-lo em um vetor apropriado para a transcrição in vitro. O cDNA pode ser obtido por transcrição reversa do RNA. De um modo preferido, vetores de clonagem são utilizados para a produção de transcrições que são geralmente designados vetores de transcrição.

[00170] O termo "tradução", de acordo com a invenção relaciona-se com o processo nos ribossomas de uma célula pelo qual uma cadeia de RNA mensageiro dirige a montagem de uma sequência de aminoácidos para fazer um peptídeo ou proteína.

[00171] O termo "peptídeo", de acordo com a invenção compreende oligo- e polipeptídeos e se refere a substâncias que compreendem dois ou mais, de preferência três ou mais, preferencialmente 4 ou mais, preferencialmente 6 ou mais, preferencialmente, de 8 ou mais, preferencialmente, de 9 ou mais, de preferência 10 ou mais, de preferência, 13 ou mais, de preferência 16 mais, de um modo preferido 21 ou mais e de preferência até 8, 10, 20, 30, 40 ou 50, em particular, 100 aminoácidos ligados de forma covalente através de ligações peptídicas. O termo "proteína" se refere a peptídeos grandes, de um modo preferido para os peptídeos com mais de 100 resíduos de aminoácidos, mas, em geral, os termos "peptídeos" e "proteínas" são sinônimos e são usados aqui de forma intercambiáveis.

[00172] O termo "sequência de controle de expressão", tal como aqui utilizado, pretende referir-se a uma sequência de ácido nucleico que permite a expressão da molécula de ácido nucleico operativamente ligado em uma célula hospedeira desejada ou em um ambiente in vitro. As sequências de controle de expressão adequadas são conhecidas por um técnico versado no assunto e incluem promotores, por exemplo, os promotores de RNA, tal como um de promotor T7, T3 ou SP6.

[00173] A molécula de ácido nucleico, de acordo com a presente invenção pode estar contida / compreendida em um vetor. O termo "vetor", como aqui utilizado, inclui quaisquer vetores conhecidos do especialista, incluindo vetores de plasmídeo, vetores cosmídicos, vetores de fagos, tais como fagos lambda, os vetores virais, tais como vetores adenovirais ou de baculovírus, ou vetores de cromossomas artificiais tais como cromossomas artificiais bacterianos (BAC), cromossomas artificiais de levedura (YAC), cromossomas artificiais ou PI (PAC). Os referidos vetores incluem express, bem como vetores de clonagem. Os vetores de express compreendem plasmídeos, bem como vetores virais e, geralmente, contêm uma sequência de codificação desejada e sequências de DNA adequadas necessárias para a expressão da sequência de codificação operativamente ligada em um organismo hospedeiro particular (por exemplo, bactérias, leveduras, plantas, insectos, ou de mamífero) ou em sistemas de expressão in vitro. Os vetores de clonagem são geralmente utilizados para manipular e amplificar um determinado fragmento de DNA desejado e podem carecer de sequências funcionais necessários para a expressão dos fragmentos de DNA desejados.

[00174] O termo "célula" ou "célula hospedeira" se refere preferencialmente a uma célula intacta, isto é, uma célula com uma membrana intacta que não foi libertado seus componentes intracelulares normais, tais como enzimas, organelos, ou material genético. Uma célula intacta é, de preferência, uma célula viável, isto é, uma célula viva capaz de realizar as suas funções metabólicas normais. De um modo preferido, o referido termo se refere de acordo com a invenção para qualquer célula que possa ser transfectada ou transformada com um ácido nucleico exógeno. De preferência, a célula quando transfectada ou transformada com um ácido nucleico exógeno e transferida para um receptor pode expressar o ácido nucleico no receptor. O termo "célula" inclui células procarióticas, tais como células bacterianas e células eucarióticas, tais como células de leveduras, células de fungos ou células de mamíferos. As células bacterianas adequadas incluem células a partir de cepas bacterianas gram- negativas, tais como cepas de Escherichia coli, Proteus, Pseudomonas e, e cepas bacterianas gram-positivas, tais como cepas de Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus e Lactococcus. As células de fungos adequadas incluem células a partir de espécies de Trichoderma, Neurospora e Aspergillus. As células de levedura adequadas incluem células a partir de espécies de Saccharomyces (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (por exemplo, a Schizosaccharomyces pombe), Pichia (por exemplo, Pichia pastoris e Pichia methanolica), e Hansenula. As células de mamífero adequadas incluem, por exemplo, células CHO, células BHK, células HeLa, células COS, células HEK 293 e semelhantes. No entanto, células de anfíbios, células de insectos, células vegetais e quaisquer outras células utilizadas na arte para a expressão de proteínas heterólogas podem ser usadas também. As células de mamífero são particularmente preferidas para a transferência adoptiva, tais como células de humanos, ratos, hamsters, porcos, cabras e primatas. As células podem ser derivadas a partir de um grande número de tipos de tecidos e incluem as células primárias e as linhas de células, tais como células do sistema imunológico, em particular, as células apresentadoras de antígenos (APCs), tais como células dendríticas, células B e células T, as células-tronco, tais como células-tronco hematopoiéticas e células-tronco mesenquimatosas, e outros tipos de células. Uma célula apresentadora de antígeno é uma célula que apresenta antígeno no contexto do complexo de histocompatibilidade principal na sua superfície. As células T podem reconhecer este complexo usando o seu receptor de células T (TCR).

[00175] O termo "organismo não humano", tal como aqui utilizado, pretende incluir os primatas não-humanos ou outros animais, em particular mamíferos, tais como vacas, cavalos, porcos, ovelhas, cabras, cães, gatos, coelhos, porquinhos da índia, hamsters ou roedores, tais como ratinhos e ratos.

[00176] As composições farmacêuticas da invenção são, de preferência estéril e contêm uma quantidade eficaz das proteínas de fusão de citocinas, molulas de idos nucleicos ou culas aqui descritas para gerar a reacção desejada ou o efeito desejado.

[00177] As composições farmacêuticas são normalmente fornecidas em uma forma de dosagem uniforme e podem ser preparadas de um modo conhecido per se. Uma composição farmacêutica pode, por exemplo, estar na forma de uma solução ou suspensão.

[00178] Uma composição farmacêutica pode compreender ainda um ou mais veículos e / ou excipientes, os quais são de preferência farmaceuticamente aceitável. O termo "farmaceuticamente aceitável", tal como aqui utilizado, se refere à inexistência de toxicidade de um material que, de preferência, não interage com a acção do agente ativo da composição farmacêutica.

[00179] O termo "veículo" se refere a um componente orgânico ou inorgânico, de natureza natural ou sintética, em que o componente ativo é combinado para facilitar, estimular ou ativar a aplicação. De acordo com a invenção, o termo "veículo" também inclui um ou mais enchimentos compatíveis sólidos ou líquidos, diluentes ou substâncias de encapsulamento, que são adequados para administração a um sujeito.

[00180] As substâncias de suporte possíveis para administração parentérica são, por exemplo, água estéril, Ringer, lactato de Ringer, solução de cloreto de sódio estéril, polialquilenoglicóis, naftalenos hidrogenados e, em particular, polímeros, copolímeros de láctido biocompatível, de lactido / glicólido ou copolímeros de polioxietileno / polioxi-propileno.

[00181] O termo "excipiente", tal como aqui utilizado, destina-se a incluir todas as substâncias que podem estar presentes em uma composição farmacêutica e que não são ingredientes ativos, tais como sais, aglutinantes, lubrificantes, espessantes, agentes tensioativos, conservantes, emulsionantes, tampão substâncias, agentes aromatizantes, ou corantes.

[00182] Os sais que não são farmaceuticamente aceitáveis, podem ser utilizados para a preparação de sais f armaceuticamente aceitáveis e estão incluídos na invenção. Os sais farmaceuticamente aceitáveis deste tipo compreendem, de forma não limitante aqueles preparados a partir dos seguintes ácidos: bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico ácidos clorídrico, succínico, e outros semelhantes. Os sais farmaceuticamente aceitáveis também podem ser preparados como sais de metais alcalinos ou sais de metais alcalino-terrosos, tais como sais de sódio, sais de potássio ou sais de cálcio.

[00183] Os conservantes adequados para utilização em uma composição farmacêutica incluem cloreto de benzalcio, clorobutanol, parabenos e timerosal.

[00184] As substâncias tampão adequados para utilização em uma composição farmacêutica incluem ácido acético em um sal, ido crico em um sal, ido bico em um sal e ido fosfico em um sal.

[00185] Os agentes e composições aqui descritos podem ser administrados por qualquer via convencional, tal como através de administração parentérica, incluindo por injecção ou infusão. A administração é preferivelmente parentérica, por exemplo, intravenosamente, intra-arterialmente, subcutaneamente, intradermicamente ou intramuscularmente.

[00186] As composições farmacêuticas adequadas para administração parentérica compreendem, normalmente, uma preparação aquosa ou não-aquosa estéril do composto ativo, que é preferencialmente isotónica com o sangue do receptor. Exemplos de transportadores compatíveis / solventes / diluentes são solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotónica. Além disso, óleos normalmente fixos, estéreis são utilizados como solução ou meio de suspensão.

[00187] Os agentes e composições aqui descritos são administrados em quantidades eficazes. Uma "quantidade eficaz" se refere à quantidade, que atinge uma reacção desejado ou um efeito desejado sozinho ou em conjunto com outras doses. No caso de tratamento de uma determinada doença ou de uma condição particular, a reacção desejada de um modo preferido se refere à inibição do curso da doença. Este compreende a abrandar o progresso da doença e, em particular, interromper ou reverter o progresso da doença. A reacção desejada em um tratamento de uma doença ou de uma condição pode também ser atraso do aparecimento ou uma prevenção do aparecimento da referida doen ou o referido estado. Uma quantidade eficaz de um agente ou composio aqui descrito dependerá do estado a ser tratado, a severidade da doença, os parâmetros individuais do sujeito, incluindo a idade, condição fisiológica, tamanho e peso, a duração do tratamento, do tipo de uma terapia de acompanhamento (se presente), a via de administração específica e fatores semelhantes. Consequentemente, as doses administradas dos agentes aqui descritos podem depender de uma variedade de tais parâmetros. No caso em que uma reacção de um indivíduo ser insuficiente com uma dose inicial, doses mais elevadas (ou doses mais elevadas eficazmente alcançadoa por uma via diferente, mais localizada de administração) pode ser utilizado.

[00188] Tal como aqui utilizado, o termo "kit de partes (em resumo: kit)" se refere a um artigo de fabricação compreendendo um ou mais recipientes e, opcionalmente, um suporte de dados. Os referidos um ou mais recipientes podem ser cheios com um ou mais dos meios ou reagentes acima mencionados. Os recipientes adicionais podem ser incluídos no kit que contêm, por exemplo, diluentes, tampões e outros reagentes. O referido suporte de dados pode ser um suporte de dados não-eletrônico, por exemplo, um transportador de dados gráficos, tais como um folheto informativo, uma folha de informação, um código de barras ou um código de acesso, ou um suporte de dados eletrônico, tais como um disquete, um disco compacto (CD), um disco versátil Digital (DVD), um circuito integrado ou de um outro suporte de dados eletrônico baseada em semicondutores. O código de acesso pode permitir o acesso a um banco de dados, por exemplo, um banco de dados de internet, um sistema centralizado, ou um banco de dados descentralizado. O referido suporte de dados pode compreender instruções para a utilização da proteína de fusão de citocina, molécula de ácido nucleico, celular e / ou a composição farmacêutica da presente invenção.

[00189] Os agentes e composições aqui descritos podem ser administrados a um sujeito, por exemplo, in vivo, para tratar ou prevenir uma variedade de distúrbios, tais como aqueles aqui descritos.

[00190] De acordo com a invenção, o termo "doença" se refere a qualquer estado patológico, em particular, o câncer, doenças infecciosas, doenças inflamatórias, doenças metabólicas, doenças auto-imunes, doenças degenerativas, doenças associadas a apoptose e rejeições de transplantes.

[00191] Tal como aqui utilizado, o termo "câncer" inclui uma doença caracterizada por um crescimento celular aberrante regulamentado, proliferação, diferenciação, adesão e / ou migração. Por "célula cancerosa" entende-se uma célula anormal que cresce por uma rápida proliferação celular descontrolada e continua a crescer após os estímulos que iniciaram o novo crescimento cessar. O termo "câncer", de acordo com a invenção compreende leucemias, seminomas, melanomas, teratoma, linfomas, neuroblastomas, gliomas, câncer rectal, câncer do endométrio, câncer do rim, câncer supra-renal, câncer da tiróide, câncer do sangue, câncer da pele, câncer do cérebro, câncer do colo do útero, câncer do intestino, câncer do fígado, câncer do cólon, câncer do estômago, câncer do intestino delgado, câncer da cabeça e pescoço, câncer gastrointestinal, câncer do nódulo linfático, câncer do esófago, câncer colo-retal, câncer do pâncreas, do ouvido, câncer de nariz e garganta (ENT), câncer de mama, câncer da próstata, câncer do útero, câncer do ovário e câncer do pulmão e as suas metástases. Exemplos destes são os carcinomas do pulmão, carcinomas da mama, carcinomas da próstata, carcinomas do cólon, carcinomas das células renais, carcinomas do colo do útero, ou metástases dos tipos de câncer ou tumores descritos acima.

[00192] O termo "câncer", de acordo com a invenção também compreende as metástases cancerosas. Por "metástase" se entende a propagação das células cancerosas do seu local original para outra parte do corpo. A formação de metástases é um processo muito complexo e depende de descolamento de células malignas do tumor primário, invasão da matriz extracelular, a penetração das membranas endoteliais do porão para entrar na cavidade do corpo e vasos, e em seguida, depois de ser transportado pelo sangue, a infiltração de órgãos alvo. Por fim, o crescimento de um novo tumor, ou seja, um tumor secundário ou tumor metastático, no local alvo depende de angiogénese. Metástase de tumor muitas vezes ocorre mesmo após a remoção do tumor primário porque as células tumorais ou componentes podem permanecer e desenvolver o potencial metastático. Em uma concretização, o termo "metástases", de acordo com a invenção se refere a "metástase" se refere a que uma metástase remota que é a partir do tumor primário e o sistema de linfonodo regional.

[00193] O termo "doença infecciosa" se refere a qualquer doença que pode ser transmitida de indivíduo para indivíduo ou de organismo para organismo, e é causada por um agente microbiano (por exemplo, resfriado comum). Os exemplos de doenças infecciosas incluem doenças infecciosas virais, tais como AIDS (HIV), hepatite A, B ou C, herpes, herpes- zóster (varicela), sarampo alemão (vírus da rubéola), febre amarela, dengue, etc flavivírus, os vírus da gripe , hemorrágicas doenças infecciosas (vírus Marburg ou Ébola) e síndrome respiratório agudo severo (SARS), doenças infecciosas bacterianas, tais como a doença do Legionário (Legionella), doenças sexualmente transmissíveis (por exemplo, clamídia ou gonorreia), úlcera gástrica (Helicobacter), cólera (Vibrio), a tuberculose, a difteria, a infecções por E. coli, Staphylococci, Streptococci ou Salmonella (tétano); infecções por patogénios protozoários tais como a malária, a doença do sono, leishmaniose; toxoplasmose, ou seja, infecções por Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania e Toxoplasma; ou infecções fúngicas, que são causadas, por exemplo, por Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis ou Candida albicans.

[00194] O termo "doença inflamatória" se refere a qualquer doença, que é caracterizada por, ou associada com altos níveis de inflamação em tecidos, em particular tecidos conjuntivos, ou degeneração destes tecidos. A doença inflamatória crónica é uma doença que é caracterizada pela inflamação persistente. Exemplos de doenças inflamatórias (crônica) incluem a doença celíaca, vasculite, lúpus, doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), doença do intestino irritável, aterosclerose, artrite, espondilite anquilosante, doença de Crohn, colite, hepatite ativa crónica, dermatite e psoríase.

[00195] O termo "doença metabólica" se refere a qualquer doença ou distúrbio que perturba o metabolismo normal. Exemplos incluem cistinose, diabetes, dislipidemia, hipertiroidismo, hipotiroidismo, hiperlipidemia, hipolipidemia, galactosemia, doença de Gaucher, a obesidade e a fenilcetonúria.

[00196] O termo "doença autoimune" se refere a qualquer doença / distúrbio no qual o corpo produz uma resposta imunogénica (isto é, sistema imunológico) para algum constituinte de seu próprio tecido. Em outras palavras,

[00197] O sistema imune perde a sua capacidade de reconhecer algum tecido ou sistema dentro do corpo como auto e alvos e ataca-lo como se fosse estrangeiro. As doenças autoimunes podem ser classificadas em aquelas em que predominantemente um órgão é afetado (por exemplo, anemia hemolítica e tiroidite anti-imune), e aqueles nos quais o processo de doença autoimune é difundido, através de diversos tecidos (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico). Por exemplo, a esclerose múltipla é pensada para ser causada por células T que atacam as bainhas que rodeiam as fibras nervosas do cérebro e da medula espinhal. Isso resulta em perda de coordenação, fraqueza e visão turva. As doenças autoimunes são conhecidas no estado da técnica e incluem, por exemplo, tiroidite de Hashimoto, doença de Grave, lúpus, esclerose múltipla, artrite reumatóide, anemia hemolítica, tiroidite anti-imunes, lúpus eritematoso sistémico, doença celíaca, doença de Crohn, colite, diabetes, escleroderma, psoríase, e outros semelhantes.

[00198] O termo "doença degenerativa" se refere a qualquer doença em que a função ou a estrutura dos tecidos ou órgãos afectados, cada vez mais se deteriorar ao longo do tempo. Exemplos incluem a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica (ALS), doença de Huntington, degeneração macular, esclerose múltipla, distrofia muscular, doença de Niemann-Pick, osteoporose e artrite reumatóide.

[00199] O termo "doenças associadas a apoptose" se refere a qualquer doença em que alterações de apoptose estão envolvidos. Exemplos incluem o câncer, doenças neurológicas, tais como a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose lateral amiotrófica (ALS) e acidente vascular cerebral, doenças cardíacas, tais como a isquemia- reperfusão e insuficiência cardíaca crónica, doenças infecciosas e doenças auto-imunes.

[00200] O termo "rejeição de transplante" se refere à rejeição de um tecido transplantado ou órgão pelo sistema imunológico do receptor, que pode, em última análise, destruir o tecido ou órgão transplantado.

[00201] O termo "medicamento", tal como aqui utilizado, se refere a uma substância / composição utilizada em terapia, ou seja, no tratamento de uma doença.

[00202] Por "tratar" entende-se a administrar um composto ou uma composição ou uma combinação dos compostos ou composições a um indivíduo, a fim de evitar ou eliminar uma doença, incluindo a redução do tamanho de um tumor ou no número de tumores em um sujeito; prender ou retardar a doença em um assunto; inibir ou retardar o desenvolvimento de uma nova doença em um indivíduo; diminuir a frequência ou gravidade dos sintomas e / ou recorrências em um sujeito que tem atualmente ou que já teve uma doença; e / ou prolongar, isto é, aumentar o tempo de vida do sujeito.

[00203] Em particular, o termo "tratamento de uma doença" inclui cura, encurtando a duração, melhorar, prevenir, retardar ou inibir a progressão ou agravamento de, ou prevenir ou retardar o aparecimento de uma doença ou dos seus sintomas.

[00204] O termo "sujeito" significa, de acordo com a invenção, um sujeito para o tratamento, em particular, um sujeito doente (também referida como "paciente"), incluindo os seres humanos, primatas não humanos ou outros animais, em particular mamíferos, tais como vacas, cavalos, porcos, ovelhas, cabras, cães, gatos, coelhos, porquinhos da índia, hamsters ou roedores, tais como camundongos e ratos. Em uma concretização particularmente preferida, o sujeito / paciente é um ser humano.

EXEMPLOS Exemplo 1: Clonagem, produção e purificação de Duocinas

[00205] O DNA que codifica a parte extracelular de CD40L humano (aa 116-261), CD27L humano (aa 52 -193), 4-1BBL humano (aa 71-254) e OX40L humano (aa 51-183) foi codon optimizado para a expressão em células humanas e sintetizado por Geneart (Life Technologies, Carlsbad, EUA), adicionando sítios de clonagem apropriados. Duocinas foram geradas por fusão de subunidades únicas de dois destes diferentes citocinas através de um de 15 aminoácidos (em caso de falta Duocinas 4-1BBL) ou 20 aminoácidos (no caso de Duocinas contendo 4- 1 BBL) glicina-serina ligante rico e clonagem no plasmídeo de expressão pIRESpuro3 (Clontech, mountain View, EUA). No terminal-N, os Duocinas foram fornecidos com uma sequência líder para a secreção de VH e uma etiqueta FLAG para a purificação e detecção. As seguintes Duocinas foram produzidas: CD40L-CD27L, CD27L-CD40L, CD40L, 4-1BBL-, 4- 1BBL-CD40L, CD27L-4-1BBL, 4-1BBL-CD27L, CD40L-OX40L, OX40L- CD40L, CD27L-OX40L, OX40L-CD27L, 4-1BBL-OX40L e OX40L-4-1BBL (Tab. 1). Todas as Duocinas foram produzidas a partir de células HEK293 transfectadas de forma estável e purificada a partir do sobrenadante de cultura celular por cromatografia de afinidade FLAG um-passo (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA), resultando em rendimentos de 0,3 a 1,9 mg / L de sobrenadante.

[00206] Duocinas foram analisadas em SDS-PAGE sob condições redutoras e não redutoras utilizando um gel de poliacrilamida a 12% e visualizadas por coloração com Azul Brilhante de Coomassie G250. A análise de SDS-PAGE revelou as massas moleculares esperadas das cadeias polipeptídicas monomélica (aproximadamente 33 kDa para Duocinas falta 4-1 BBL e 37 kDa para Duocinas contendo 4- 1BBL), tendo em conta a presença de potenciais locais de N-glicosilação em CD40L (1 local; aa 240), CD27L (2 locais; aa 63 e 170) e OX40L (4 sítios; aa. 90, 114, 152, e 157) (Fig 2, Esquema 1). Além disso, sob condições não redutoras todas as proteínas apresentaram uma segunda banda correspondente a menor massas moleculares de um dímero. A cromatografia de exclusão por tamanhos utilizando cromatografia líquida de alta eficiência sobre uma Yarra SEC-2000 (Phenomenex) com um caudal de 0,5 mL / min confirmou que a montagem homotrimérica dos Duocinas. O Duocinas CD40L 4-1BBL, 4-1BBL-CD40L, CD27L-4-1BBL e 4-1BBL- CD27L eluiu como um pico principal com uma massa molecular aparente na gama entre 80 e 100 kDa, sendo, portanto, um pouco menor do que o calculado massa molecular de 112 kDa, presumivelmente devido a uma estrutura mais compacta do Duocinas contendo 4-1BBL. Todos os outros Duocinas eluiu como pico principal com uma massa molecular aparente compreendida entre 130 e 160 kDa, o que se correlacionou com uma massa molecular de 30-50% maior do que a calculada, presumivelmente devido a N-glicosilação. Além disso, o Duocinas 4-1BBL-CD27L, 4-1BBL-CD40L, CD40L-OX40L, OX40L-CD40L e OX40L-4-1BBL mostrou picos menores correspondendo provavelmente a complexos de maior peso molecular (Figura 3 AB). Tabela 1: Duocinas e as suas propriedades bioquímicas

Exemplo 2: Propriedades de ligação ao receptor Duocinas

[00207] A ligação do receptor Duocinas foi analisada por ELISA, utilizando proteínas de fusão da região extracelular de CD40, CD27, 4-1BB e OX40, respectivamente, com a região Fcyl humano incluindo a região de dobradiça para montagem covalente (de CD40-Fc, CD27-Fc, 4-LBB-Fc, OX40-Fc). As proteínas de fusão receptor-Fc (200 ng / cavidade) foram revestidas durante a noite a 4 ° C e sítios de ligação restantes foram bloqueados com PBS, 2% de leite em pó desnatado (2% MPBS). Duocinas foram titulados em duplicado a partir de uma concentração de 316 nM e Duocinas ligados foram detectados com anticorpo anti-FLAG rato conjugado com HRP. Todos os Duocinas mostraram ligação específica para os seus respectivos receptores e nenhuma reactividade cruzada com outras proteínas de fusão receptor-Fc foi observada (Fig. 4). As interações dos receptores Duocina foram dependentes da dose com valores de EC50 nas faixas baixas nanomolares (Fig. 5 AB, Tab. 1).

[00208] Além disso, as Duocinas foram analisadas por citometria de fluxo para a ligação à linha celular de fibrossarcoma HT1080 modificadas para expressar o receptor de CD40, CD27, 4-1BB ou OX40, respectivamente (HT1080-CD40, HT1080-CD27, HT1080-4-1BB, HT1080- OX40). Aqui, 1,5 x 10 5 culas foram incubadas com 100 nM Duocinas e a ligação foi detectada utilizando um anticorpo anti-FLAG de ratinho marcado com PE. As células foram analisadas utilizando um analisador de MACSQuant 10 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) e os dados foram analisados utilizando FlowJo (ár, Ashland, EUA). A citometria de fluxo revelou que todos os Duocinas ligado as linhas de células que expressam os seus respectivos receptores (Fig. 6 AB).

Exemplo 3: Propriedades de ligação ao receptor Biespecifica de Duocinas

[00209] Biespecificidade das Duocinas foi avaliada por citometria de fluxo. 1,5 x 105 células HT1080 que expressam quer o receptor de CD40, CD27, 4-1BB ou OX40 (HT1080-CD40, HT1080-CD27, HT1080-4- IBB, HT1080-OX40) foram incubadas com 100 nM Duocinas seguido de incubação com os correspondentes proteína de fusão de Fc-receptor (10 nM) para detectar o segundo local de ligação. Os Duocina-receptor de complexos ligados às células foram detectadas utilizando um anticorpo de Fc um rato marcado com PE anti-humano, assim, apenas Duocinas reconhecer ambos os receptores, uma sobre a célula e a outra fornecida como uma proteína de fusão Fc solúvel, é capaz de produzir um fluorescente sinal. As células foram analisadas utilizando um analisador de MACSQuant 10 (Miltenyi Biotec) e os dados foram analisados utilizando FlowJo (ár, Ashland, EUA). Aqui, foi demonstrado que todos os Duocinas eram capazes de se ligar simultaneamente ambos os receptores, que cria capacidade de ligação dupla dos Duocinas (Fig. 7 AB).

Exemplo 4: Clonagem, produção e purificação de cadeia simples (Duocinas scDuocinas)

[00210] O DNA que codifica os derivados de cadeia simples da parte extracelular de CD40L humano (aa 116 - 261), CD27L humano (aa 52 - 193), 4-1BBL humano (aa 71-254) e OX40L humano (aa 51-183) foi codão -optimized para a expressão em células humanas e sintetizado por GeneArt (Life Technologies) a adição de locais de clonagem adequados. Em caso de scCD40L, scCD27L e scOX40L as três subunidades individuais das citocinas foram ligados através de um ligante GGGSGGG, enquanto um ligante (GGGGS)3 foi utilizado para sc4-lBBL. Duocinas de cadeia simples (scDuocinas) foram geradas por fusão de duas destes diferentes citocinas de cadeia simples por meio de um ligante glicina-serina rico de 15 aminoácidos e a clonagem no plasmídeo de expressão pIRESpuro3 (Clontech). No terminal-N, os scDuocinas foram fornecidos com uma sequência líder para a secreção de VH e uma etiqueta FLAG para a purificação e detecção. Os seguintes scDuocinas foram produzidos: scCD40L-scCD27L, scCD27L-scCD40L, scCD40L-sc4- lBBL, sc4-1BBL-SCCD40L, scCD27L-sc4-lBBL, sc4-lBBL-scCD27L, scCD40L-scOX40L, scOX40L-scCD40L, scCD27L-scOX40L, scOX40L- scCD27L, sc4-lBBL-scOX40L e scOX40L-sc4-1BBL (Tab.2). Todos os scDuocinas foram produzidos a partir de células HEK293 transf ectadas de forma estável e purificado a partir do sobrenadante de cultura celular por cromatografia de afinidade FLAG um-passo (Sigma-Aldrich), resultando em rendimentos de 1,4 a 4,0 mg L sobrenadante.

[00211] Duocinas de cadeia simples foram analisadas em SDS-PAGE sob condições redutoras e não redutoras utilizando um gel de poliacrilamida a 10% e visualizadas por coloração com Azul Brilhante de Coomassie G250. A análise de SDS-PAGE sob condições redutoras e não redutoras revelou as massas moleculares esperados das cadeias polipeptídicas trimicas (aproximadamente 97 kDa para Duocinas falta 4-1BBL e 111 kDa para Duocinas contendo 4-1BBL), tendo em conta a presença de potencial N- locais de glicosilao em CD40L (um sítio; aa 240), CD27L (2 locais; aa 63 e 170) e OX40L (4 sítios; aa 90, 114, 152 e 157) (figura 8, aba 2). Além disso, sob condições redutoras, todas as proteínas apresentaram uma segunda banda correspondente a complexos de maior peso molecular. O aparecimento de complexos de maior peso molecular foi especialmente pronunciado para scDuocinas contendo scOX40L. A cromatografia de exclusão por tamanhos utilizando cromatografia líquida de alta eficiência sobre uma Yarra SEC- 2000 (Phenomenex) com um caudal de 0,5 mL / min confirmou que a montagem homotrimico preferencial dos scDuocinas. ScCD40L- scCD27L e scCD27L-scCD40L eluiu como um pico principal com uma massa molecular aparente de 125 kDa, por conseguinte, ser ligeiramente maior do que a massa molecular calculada de 98 kDa. Todos os scDuocinas contendo scOX40L mostrou um pico principal correspondente a 140 e 160 kDa, com o tempo de retenção longo, presumivelmente devido à estrutura de scOX40L. Os compostos de scDuocinas scCD40L, sc4-lBBL e scCD27L eluiu como pico principal correspondente à massa molecular calculada de 110 kDa. Além disso, o scDuocinas scCD40L-sc4-lBBL, sc4-lBBL-scCD40L, scCD40L-scOX40L, scOX40L- scCD40L, sc4-lBBL-scOX40L e scOX40L-sc4-lBBL mostrou picos menores correspondendo provavelmente a complexos de massa molecular mais elevada (Fig. 9 AB). Tabela 2: Duocinas de cadeia simples e as suas propriedades bioquímicas

Exemplo 5: Propriedades de ligação ao receptor de Duocinas de cadeia simples

[00212] A ligação do de cadeia simples Duocinas foi analisado por ELISA, utilizando proteínas de fusão da região extracelular de CD40, CD27, OX40 4- IBB e, respectivamente, com a região Fcyl humano incluindo a região de dobradiça para montagem covalente receptor (CD40-Fc, CD27-Fc, 4-LBB-Fc, OX40-Fc). As proteínas de fusão receptor-Fc (200 ng poço) foram revestidas durante a noite a 4 ° C e sítios de ligação restantes foram bloqueados com PBS, 2% de leite em pó desnatado (2% MPBS). Duocinas de cadeia simples foram tituladas em duplicata a partir de uma concentração de 316 nM e scDuocinas ligados foram detectados com anticorpo anti-FLAG rato conjugado com HRP. Todas as scDuocinas mostraram ligação específica para os seus respectivos receptores e nenhuma reactividade cruzada com outras proteínas de fusão receptor- Fc foi observada (Fig. 10). As interações entre scDuocina e receptor foram dependentes da dose com valores de EC50 nas gamas baixas nanomolares (Fig. 11 AB, Tab. 2).

[00213] Além disso, as Duocinas de cadeia única foram analisadas por citometria de fluxo para a ligação à linhagem celular de fibrossarcoma HT1080 modificadas para expressar o receptor de CD40, CD27, 4-1BB ou OX40, respectivamente (HT1080-CD40, HT1080-CD27, HT1080-4-1BB, HT1080-OX40). Aqui, 1,5 x 105 células foram incubadas com 100 nM scDuocinas e a ligação foi detectada utilizando um anticorpo anti-FLAG de ratinho marcado com PE. As células foram analisadas utilizando um analisador de MACSQuant 10 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) e os dados foram analisados utilizando Fluxo Jo (ár, Ashland, EUA). A citometria de fluxo revelou que todos os scDuocinas ligado a linha de células que expressam os seus respectivos receptores (Fig. 12 AB). Exemplo 6: Propriedades de ligação ao receptor de Duocinas biespecíficas de cadeia simples

[00214] Biespecificidade de duocinas de cadeia simples foi avaliada por citometria de fluxo. 1,5 x 105 células HT1080 que expressam quer o receptor de CD40, CD27, 4-1BB ou OX40 (HT1080-CD40, CD27 HT1080-, HT1080-4-1BB, HT1080-OX40) foram incubadas com 100 scDuocinas nm, seguido de incubação com os correspondentes proteína de fusão de Fc-receptor (10 nM) para detectar o segundo local de ligação. O scDuocina- receptor de complexo foi detectado utilizando um anticorpo de Fe anti-humano de ratinho marcado com PE, assim, apenas scDuocinas que reconhecem ambos os receptores, uma sobre a célula e a outra fornecida como uma proteína de fusão Fc solúvel, é capaz de produzir um sinal fluorescente. As células foram analisadas utilizando um analisador de MACSQuant 10 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) e os dados foram analisados utilizando Fluxo Jo (ár, Ashland, EUA). Aqui, foi demonstrado que todos os scDuocinas eram capazes de se ligar simultaneamente ambos os receptores, que cria capacidade de ligação dupla da cadeia única Duocinas (Fig. 13-B).

Exemplo 7: Clonagem, produção e purificação de Duocinas de cadeia simples EHD2-ligada (EHD2-scDuocinas)

[00215] EHD2-scDuocinas foram geradas por fusão de uma citocina de cadeia simples no terminal-N e uma segunda citocina de cadeia simples C-terminal meio de ligantes GGSGG para o domínio 2 de cadeia pesada de IgE (EHD2) e clonagem no pSecTagA plasmídeo de expressão (Life Technologies, Carlsbad, EUA). No terminal-N, os EHD2-scDuocinas foram fornecidos com uma sequência líder para a secreção de IgK e uma etiqueta FLAG para a purificação e detecção. Os seguintes EHD2- scDuocinas foram produzidos: sc4-1 BBL-EHD2-scCD40L, sc4- lBBL-EHD2-scCD27L e scCD40L-EHD2-scCD27L (Tab. 3). Todos os EHD2-scDuocinas foram produzidos a partir de células HEK293 transf ectadas de forma estável e purificado a partir do sobrenadante de cultura celular por cromatografia de afinidade FLAG um-passo (Sigma-Aldrich), resultando em rendimentos de 3,7 a 8,0 mg / L de sobrenadante.

[00216] EHD2-scDuocinas foram analisadas em SDS-PAGE sob condições redutoras e não redutoras utilizando um gel de poliacrilamida a 4-15% e visualizado por coloração com Azul Brilhante de Coomassie G250. A análise de SDS-PAGE sob condições redutoras, revelou as massas esperadas moleculares das cadeias polipeptídicas hexavalente (cerca de 120 kDa), tendo em conta a presença de potenciais locais de N- glicosilação em CD40L (um local; aa 240) e CD27L (2 locais; aa 63 e 170) (Fig. 14, Tab. 3). Além disso, sob condições não redutoras todas as proteínas apresentaram uma segunda banda correspondente a dímeros formados por ligações dissulfureto entre os domínios EHD2. Aproximadamente 50% dos EHD2- scDuocinas mostrou ligação covalente. A cromatografia de exclusão por tamanhos utilizando cromatografia líquida de alta eficiência sobre uma Yarra SEC-2000 (Phenomenex) com um caudal de 0,5 mL / min confirmou que a montagem homodimérica dos EHD2-scDuocinas. Sc4-1BBL-EHD2- scCD27L eluiu como um pico principal com uma massa molecular aparente de 120 kDa correspondente ao monómero hexavalente (massa molecular calculada 122 kDa) e um pico menor com uma massa molecular aparente de 200 kDa mais provável correspondendo à dímero de dissulfeto-ligado (massa molecular calculada de 245 kDa). Da mesma forma, scCD40L-EHD2-scCD27L eluiu como pico principal com uma massa molecular aparente de 150 kDa correspondente ao monómero e um segundo pico menor com uma massa molecular aparente de 270 kDa correspondente ao dímero, no entanto, as massas moleculares determinadas por meio de SEC eram ligeiramente maior do que os calculados (110 kDa e 220 kDa, respectivamente). Para sc4-lBBL-EHD2-scCD40L a distribuição entre monómero e um fragmento mais pequeno era igual a dois grandes picos eluindo a massas moleculares aparentes de 123 kDa e 74 kDa. Além disso, todos os EHD2-scDuocinas mostrou picos menores correspondendo provavelmente a complexos de maior peso molecular (Fig. 15). Tabela 3: EHD2-scDuocinas e as suas propriedades bioquímicas

Exemplo 8: Propriedades de ligação a receptores de duocinas de cadeia simples EHD2-ligada (EHD2-scDuocinas)

[00217] A ligação do receptor de EHD2-scDuocinas foi analisada por ELISA, utilizando proteínas de fusão da região extracelular de CD40, CD27 e 4- IBB, respectivamente, com a região Fcyl humano incluindo a região de dobradiça para montagem covalente (de CD40-Fc, CD27-Fc, 4-LBB-Fc). As proteínas de fusão receptor-Fc (200 ng / cavidade) foram revestidas durante a noite a 4 ° C e sítios de ligação restantes foram bloqueados com PBS, 2% de leite em pó desnatado (2% MPBS). EHD2-scDuocinas foram titulados em duplicado a partir de uma concentração de 316 nM e ligado EHD2-scDuocinas foram detectados com HRP -conjugated anticorpo anti-FLAG rato. Todas as EHD2-scDuocinas mostraram ligação específica para os seus respectivos receptores e nenhuma reactividade cruzada com outras proteínas de fusão receptor-Fc foi observada (Fig. 16). As interacções entre EHD2-scDuocina e receptor foram dependentes da dose com valores ECso nas gamas nanomolares baixas (Fig. 17, Tab. 3).

[00218] Além disso, as EHD2-scDuocinas foram analisadas por citometria de fluxo para a ligação à linha celular de fibrossarcoma HT1080 modificadas para expressar o CD40, CD27 ou 4- receptor IBB, respectivamente (HT1080-CD40, HT1080-CD27, HT1080-4-1BB). Aqui, 1,5 x 105 células foram incubadas com 100 nM EHD2-scDuocinas e a ligação foi detectada utilizando um anticorpo anti-FLAG de ratinho marcado com PE. As células foram analisadas utilizando um analisador de MACSQuant 10 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) e os dados foram analisados utilizando Fluxo Jo (ár, Ashland, EUA). A citometria de fluxo revelou que todos EHD2-scDuocinas ligado a linha de células que expressam os seus respectivos receptores (Fig. 18).

Exemplo 9: Propriedades de ligação ao receptor de duocinas biespecíficas de cadeia simples EHD2-ligada (EHD2-scDuocinas)

[00219] Biespecificidade das EHD2-scDuocinas foi avaliada por citometria de fluxo. 1,5 x 105 células HT1080 que expressam quer o receptor de CD40, CD27 ou 4-1BB (HT1080- CD40, HT1080-CD27, HT1080-4- IBB) foram incubadas com 100 nM EHD2-scDuocinas seguido de incubação com a fusão de Fc- receptor correspondente proteína (10 nM) para detectar o segundo local de ligação. O complexo EHD2-scDuocina-receptor foi detectado usando anticorpo Fc de um rato marcado com PE anti-humano, assim, somente EHD2-scDuocinas que reconhecem ambos os receptores, uma sobre a célula e a outra fornecida como uma proteína de fusão Fc solúvel é capaz de produzir um sinal fluorescente. As células foram analisadas utilizando um analisador de MACSQuant 10 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) e os dados foram analisados utilizando Fluxo Jo (ár, Ashland, EUA). Aqui, foi demonstrado que todos os EHD2-scDuocinas eram capazes de se ligar simultaneamente ambos os receptores, que cria capacidade de ligação dupla do EHD2-scDuocinas (Fig. 19).

Exemplo 10: Ativação do receptor de Duocinas de cadeia simples EHD2-ligada (EHD2-scDuocinas)

[00220] A fim de avaliar a bioatividade de EHD2- scDuocinas, a ativação do receptor foi analisada por secreção EHD2-scDuocina mediada por IL-8 a partir de células HT1080 (Fig. 20, Tab. 3). Portanto, 2 x l04 células HT1080 que expressam quer a CD40, CD27 ou 4-1BB, respectivamente, foram cultivadas durante a noite em placas de microtitulação de 96 poços e o dia seguinte, o sobrenadante foi trocado para remover constitutivamente produzido de IL-8. Em seguida, as células foram incubadas em duplicado com diluições em série de EHD2-scDuocinas a partir de uma concentração de 316 nM durante 18 horas. A quantidade de IL-8 no sobrenadante foi determinada utilizando uma ELISA de IL-8 Kit (Immunotools, Freiburg, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Para efeitos de comparação foram incluídos os correspondentes ligantes monoespecíficos triméricos, solúveis seus derivados solúveis de cadeia simples (scCD40L, scCD27L, sc4-lBBL) (CD40L, CD27L) ou. Em culas HT1080-CD40, as testadas EHD2- scDuocinas induzida forte secreção de IL-8 de uma forma dose-dependente, resultando em IL-8 concentrações até 225 ngmL. Ambos os EHD2-scDuocinas contendo scCD40L (SC4- lBBL-EHD2- scCD40L e scCD40L-EHD2-scCD27L) levou à ativação do receptor de CD40 mais forte do que com monoespecífico, scCD40L solúvel. IL-8 a secreção induzida por ativação de 4- IBB foi observável para ambos os EHD2-scDuocinas segmentação 4- IBB, mas sc4-lBBL-EHD2-scCD40L mostrou uma actividade consideravelmente aumentada em comparação com sc4-lBBL-EHD2- scCD27L, que era tão ativa como monoespecífico, solúvel sc4- lBBL. Sc4-lBBL-EHD2-scCD27L e scCD40L-EHD2-scCD27L foram ambos capazes de induzir a secreção de IL-8 na ativação de CD27, mas a combinação de sc4-lBBL e scCD27L dentro do EHD2- scDuocina mostrou indução mais forte de IL-8 de liberação (Fig . 20). Estes experimentos estabeleceram que EHD2- scDuocinas são capazes de induzir a ativação do receptor, resultando em liberação IL-8 neste sistema de ensaio.

Exemplo 11: Efeitos de Duocinas e Duocinas de cadeia simples sobre a proliferação de células T

[00221] De modo a avaliar as capacidades proliferativas de Duocinas e scDuocinas, analisou-se a proliferação de células T na população de PBMC a granel. Para este efeito, PBMC humanos foram isolados a partir de doadores saudáveis, foram armazenados congelados a -80 ° C e descongeladas um dia antes da experiência. PBMC foram corados com uma concentração de l x l06 células / ml com 625 nM de éster diacetato de carboxifluoresceína succinimidyi (CFSE) utilizando o Kit de Proliferação Celular CellTrace CFSE (Life Technologies), seguindo as instruções do fabricante. Para a estimulação primária de células T de um anticorpo monoclonal de ligação cruzada de anti-CD3 humano (sistemas UCHT-1, R & D, Minneapolis, EUA) foi utilizado. Proliferação induzida por as proteínas de fusão em solução foi avaliada por incubação de 1.5xl0 5 PBMC por cavidade com diluições em série dos diferentes Duocinas ou scDuocinas durante 6 dias, seguido de análise de citometria de fluxo. Coloração adicional mediada por anticorpos foi realizada para identificar as células T (CD3-PE, Immunotools, Friesoythe, Alemanha).

[00222] Todos as bateladas testadas de PBMC necessária a estimulação primária com ligação cruzada de mAb anti-CD3 humano de proliferar. Aqui, uma concentração sub-ótima de anticorpo (5-30 ng / mL) foi utilizado para induzir a proliferação de células T em apenas até 20 por cento das células T. Todos os testados e Duocinas scDuocinas (combinações de CD40L e 4-1BBL, CD27L e CD40L, 4-1BBL ou e OX40L) foram inativos quando aplicado sem estímulo primário, mas induzida a proliferação de células T de uma forma dependente da dose quando aplicada em combinação com transversal ligada CD3 mAb anti-humano. Aqui, a proliferação foi aumentada de duas a três vezes já em baixas concentrações nanomolares das proteínas de fusão. Em todos os casos não há diferenças nos efeitos proliferativos foram detectáveis entre as diferentes orientações das citocinas dentro da Duocinas ou de cadeia simples Duocinas. As proteínas de fusão contendo CD40L e 4-1BBL ou CD27L e 4-1BBL mostrou as mesmas capacidades proliferativas independente do formato utilizado (Fig. 21).

Exemplo 12: Modelo de Vetor, clonagem e produção de RNA transcrito in vitro (PVT-RNA) - RNAm codificado Duocinas e scDuocinas

[00223] Construções de plasmídeos (PstI-hag-Kozak-sec- 2hBgUTR-A120), que foram utilizados como moldes para a transcrição in vitro de RNA que codificam o receptor do fator de necrose tumoral (TNFR) ligantes e proteínas de fusão dos mesmos, foram baseados em PstI-2hBgUTR-A120 (Holtkamp S. et al (2006), Blood, 108 (13):4009 - 17). A estrutura do plasmído foi obtido a partir de pCMV-Script (Stratagene, La Jolla / CA, EUA) através da introdução de um promotor de T7, o 5 '-humana alfa-globulina UTR, a sequência de Kozak, um peptídeo sinal de 78-pb derivado de uma classe de MHC I molécula (s; de sinal de secreção), duas cópias do humano 3 'UTR beta-globulina, a 120 bp de poli (a) -tail e o gene de resistência à canamicina. Inserções de codificação para os ligantes ou proteínas de fusão TNFR dos mesmos (consistentes com Duocinas ou scDuocinas) foram introduzidos por meio de reacções de fusão a frio com produtos de PCR (kit de fusão a frio, Biocat). As sequências de DNA da seção que codifica a proteína relevante estão listadas na Tabela 4 (Tab. 4).

[00224] As sequências de codificação para os ligantes trimicos humanos TNFR (CD40L, CD27L, OX40L e 4-1BBL) foram introduzidos por duas estratégias diferentes como se segue: (i) uma cópia da sequência extracelular do ligante do TNFR humano indicado, que é especificada como hl TNFR- ligante (hl_CD27L, hl_CD40L, hl_OX40L ou hl_41BBL), e (ii) três cópias da sequência extracelular do ligante do TNFR humano indicado ligado em linhagem e separados por um GS-ligante, um tal inserto humano é especificado como h3_TNFR-ligante (h3_CD40L , h3_CD27L, h3_OX40L ou h3_41BBL) e corresponde às proteínas de cadeia simples descritas acima. Para obter sequências que codificam para proteínas de fusão de duas sequências de TNFR-ligante hl TNFR-ligante ou h3 foram ligadas por um ligante de ácido 15-amino ((G4S) 3 -ligante), respectivamente (Fig. 22). RNA transcritos hl_TNFR-L (l) L-- hl_TNFR (2) correspondem a Duocinas e transcritos h3_TNFR-L (l) -H3 TNFR-L (2) correspondem a scDuocinas. As sequências de proteínas dos ligantes individuais TNFR-hl e h3_TNFR- ligantes estão listados na Tabela 5 (Tab. 5).

[00225] Para a geração de rvT- RNA, os plasmídeos foram linearizados a jusante da cauda poli (A) utilizando uma endonuclease de restrio de classe II. Os plasmídeos linearizados foram purificados por esferas magnéticas (MyOneTM Ácido Carboxílico Dynabeads®; Invitrogen), quantificadas espectrofotometricamente, e submetido a transcrição in vitro com RNA polimerase de T7 (Thermo Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. Além disso, o análogo de tampão P-S-Arca (D2) foi incorporada e, finalmente, o RNA foi purificado utilizando o kit Mega (Ambion). Tabela 4: DNA / sequências de aminoácidos de seções particulares de PstI-hag-Kozak-sec / N5ERT- 2hBgUTR-A120 e outros plasmídeos utilizados de acordo com a presente invenção Tabela 5: Sequências de aminoácidos das inserções variáveis de PstI-hag-Kozak-sec / NSER7 1 - 2hBgUTR-A120 e os plasmídeos que codificam os domínios extracelulares de ligantes de TNFR (as sequências de ligantes encontram-se sublinhadas)

Exemplo 13: Expressão intracelular de ligantes de receptor de TNF após a eletroporação IVT-RNA

[00226] K562, uma linhagem celular humana derivada de leucemia mielóide crônica (obtidas de ATCC, Manassas, Va., EUA) foi cultivada em RPMI 1640 GlutaMAX suplementado com FCS a 5% (ambos Gibco), 100 UI / mL de penicilina, e 100 ug / mL estreptomicina (Gibco). Por eletroporação de células K562 em um sistema de placa de 96-poços, as células foram lavadas uma vez em meio X-Vivol5 (Lonza) e ressuspensas a 500.000 células / 150 ul em X-Vivol5 novamente. 150? L de suspens de culas foram pipetados para a placa de 96 poços contendo já o necessário IVT-RNA para electroporação multipoço (Biorad). Depois de misturar, a electroporação foi realizada no sistema de electroporação Gene Pulser MXcell da Biorad (250 V, 1 x 30 ms de impulsos), que é um dispositivo de electroporao de 96 poços. Imediatamente após a electroporação, as células foram transferidas para uma nova placa de cultura por adio de 100 de meio fresco e descansaram durante cerca de 6 horas na incubadora. Para a coloração intracelular de K562, as células foram então incubadas com GolgiPlug e GolgiStop (BD Biosciences, San Jose, CA) durante 16 horas (durante a noite) de acordo com o protocolo do fabricante. No dia seguinte, as células foram lavadas com PBS e fixadas durante 20 min em BD Cytofix Buffer (BD Biosciences), à temperatura ambiente. Depois disso, as células foram novamente lavadas em PBS e permeabilizadas por lavagem e transferência das células em lx Perm / tampão de lavagem (BD Biosciences). Após 10 min de incubação as células foram coradas com anticorpos anti-TNFR ligante diluído em lx Perm / tampão de lavagem durante 30 min à temperatura ambiente no escuro, seguido de 3 passos de lavagem com lx Perm / tampão de lavagem. As células foram, em seguida, diretamente analisadas por citometria de fluxo utilizando um citômetro de fluxo FACS Canto II (BD Biosciences). A análise foi realizada utilizando o software FlowJo (Árvore Star, Ashland, Oregon, EUA).

[00227] Eletroporação de RNAm codificado ligantes TNFR, Duocinas e scDuocinas resultou na expressão da proteína intracelular, a qual foi detectável por coloração com anticorpo intracelular. Após a eletroporação de cosntruções de ligante TNFR individuais, CD27L, CD40L, OX40L e 4-1BBL foram detectados pelos anticorpos correspondentes (Fig. 23 AC). scDuocinas, codificados por h3_CD40L-h3_CD27L, h3_CD40L- h3_OX40L e h3_4-lBBL-h3_CD27L, foram detectados em conformidade com cada um dos dois anticorpos anti-TNFR ligante correspondente (fig.23 CA). Duocinas, codificadas por hl_CD40L-hl_CD27L, hl_41BBL-hl_CD40L e hl_4-lBBL-hl_CD27L, foram detectados em conformidade com cada um dos dois anticorpos correspondentes-anti-ligante de TNFR (fig.23 D).

[00228] Exemplo 14: propriedades de ativação do receptor de proteínas expressas após a electroporação de IVT- RNA que codifica TNFL (1) -TNFL (2) construções de fusão (Duocinas e scDuocinas correspondente, respectivamente)

[00229] Preparação de receptores de TNF (TNFR) linhas celulares que expressam / células: a linha de células HT1080 e TNFR estável transfectantes dos mesmos foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com GlutaMAX 5% de FCS, 100 RJ / ml de penicilina, e 100 ug / mL de estreptomicina. As expressões da superfície das células de receptores de TNF no HT1080-transfectantes foram analisadas por FACS. Para esse fim, as células foram coradas utilizando anticorpos contra a CD40-FITC (BioLegend), CD27-PE (BD), OX40-PE (BD) e 41BB-PE (BD) (Fig. 24 A).

[00230] De modo a gerar células K562 que expressam transitoriamente receptores TNF, as células K562 que foram lavadas uma vez em meio X-Vivol5 (Lonza) e re-suspenso até uma concentração final de 8 x 106 células / 250 mL em X- Vivol5 novamente. 8 x 106 células K562 foram electroporadas em 250 ul de meio com 20-40 ug de DNA de plasmídeo que codifica o receptor de comprimento completo de TNF humano de CD40, CD27, OX40 ou 4-1BB. A electroporação foi realizada em 250 uL de X-VIVO 15 em uma cuvete de electroporação 4 milímetros usando o ECM® 830 electroporação BTX Sistema (BTX, Holliston, Massachusetts, EUA) dispositivo (200 V, 3 x 8 ms de pulso). Imediatamente após a eletroporação, as células foram transferidas para uma nova placa de cultura contendo meio fresco sem antibiicos. No dia seguinte, as expressões da superfície das células de receptores de TNF foram verificados por análise de FACS (Fig. 24 B).

[00231] Geração de sobrenadantes contendo proteínas de fusão TNFR-ligante: K562 multi-eletroporação foi realizada tal como descrito acima. Imediatamente após a electroporação, as células foram transferidas para uma nova placa de cultura por adio de 100 de meio fresco e descansaram durante cerca de 3 horas na incubadora. Em seguida, as células foram centrifugadas e os sedimentos celulares foram ressuspensos em 250 ul de RPMI 1640 GlutaMAX com 0,5% de FCS, durante a incubação durante a noite (cerca de 16 horas). No dia seguinte, 100 ml de sobrenadantes contendo as proteínas de fusão segregadas foram transferidos para camadas confluentes de transfectantes-TNF-receptor HT1080.

[00232] A ativação NF-kappaB da via sobre a ativação de receptores de TNF medido por IL-8 de libertação de células HT1080: transfectantes-receptor de TNF de linha celular HT1080 foram utilizadas para ensaios de repórter, a fim de medir a ativação do receptor de TNF. Seguindo os transfectantes estáveis que expressam os receptores de TNF humanos foram usadas: HT1080 CD40, HT1080 CD27, OX40 e HT1080 HT1080 4-1BB; expressão na superfície celular antes do ensaio de repórter foi verificada por análise de FACS (Fig. 24 A). As células foram semeadas (2 x 10 4 culas / po) em placas de 96 poços de cultura de tecidos em meio RPMI 1640 com 5% de FCS e cultivadas durante a noite. O meio foi extraído e 100 ul de sobrenadantes de cultura de células de K562 electroporadas foram adicionados. Se desejado, K562 que expressam receptores de TNF, tal como indicado foram adicionalmente adicionados em 100 ul de meio RPMI 1640 GlutaMAX com 0,5% de FCS. Após 6-8 horas de incubação, os sobrenadantes livres de células foram recolhidos e IL8-as concentrações foram medidas por um kit de ELISA de IL8 (BioLegend) de acordo com o protocolo do fabricante.

[00233] A ativação do receptor CD40 nas HT1080 CD40 foi detectado ap electroporao de h3_CD40L e h3_CD27L- h3_CD40L. No entanto, aquando da aplicação de h3_CD27L- h3_CD40L, um forte aumento da ativação de CD40 relacionada com a quantidade de RNA aplicado foi detectado sob configurações trans-apresentação, a qual foi conseguida por adição de K562-CD27 permitindo, assim, uma célula-célula- interacção mediada pela traduzido Duocina (Fig.25 A). CD27- ativao ap electroporao de RNA que codificam RVT-h3_CD27L ou h3_CD27L-h3_CD40L sem configurações trans-apresentação não foi detectada através da medição da secreção de IL-8. Em configurações de trans-apresentação mediadas por K562 CD40, CD27-ativação foi detectado ap K562-electroporação da construo de fus h3_CD27L-h3_CD40L (Fig. 25 B).

[00234] Construções h3_OX40L e h3_CD27L-h3_OX40L mediada por ativação do receptor OX40. Mais uma vez, quando da aplicação de h3_CD27L-h3_OX40L um claro aumento de ativação OX40 relativa para a quantidade de RNA aplicado foi detectado sob configurações trans-apresentação mediadas por CD27 K562 (Fig. 25 C). A ativação CD27 por h3_CD27L-h3_OX40L foi apenas detectável sob configurações trans-apresentação mediadas por K562 OX40 (Fig. 25 D).

[00235] 4 IBB- e CD27-ativação mediante aplicação de h3_CD27L-h3_4-lBBL foram claramente detectáveis apenas em configurações trans-apresentação mediadas por CD27 K562 e K562 4-1BB, respectivamente (Fig. 25 EF).

[00236] Construções h3_4-lBBL-h3_CD40L e hl_4-lBBL- hl_CD40L mediada por ativação do receptor CD40, mesmo sem trans-apresentação. No entanto, um forte aumento da ativação de CD40 relacionada com a quantidade de RNA aplicado foi detectado sob configurações trans-apresentação mediadas por 4-1BB K562 (Fig. 25 L). A ativação de 41BB aquando da aplicação de h3_4-lBBL-h3_CD40L e de hl_4-lBBL-hl_CD40L foi claramente detectável apenas em configurações trans- apresentação mediadas por CD40 K562 (Fig. 25 H).

Exemplo 15: Efeitos de Duocinas e RNAm codificado scDuocinas sobre CD8 específicas de antigénio + proliferação de células T

[00237] Células HLA-A2 + mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram obtidas a partir de doações de sangue a partir da Transfusionszentrale no Hospital da Universidade de Mainz, Alemanha. Os monócitos foram isolados das PBMC por célula magnética-ativado triagem tecnologia (MACS) utilizando anticorpos anti-CD 14 MicroBeads (Miltenyi); os linfócitos do sangue periférico (PBLs, CD 14- fração) foram congeladas para futuro das células T-isolamento. Para a diferenciação em DC imaturas (IDC), os monócitos foram cultivados durante 4 - 5 dias em meio RPMI contendo 5% GlutaMAX humano AB de soro (Gibco), piruvato sódico (Gibco), aminoácidos não essenciais, 100 UI / ml de penicilina, e 100 ug / mL de estreptomicina, o fator estimulador de colónias de 1000 UI / mL de granulócitos-macrófagos e 1000 UI / ml de IL-4 (ambos de Miltenyi). Metade do meio foi substituído com meio fresco, uma vez durante estes 4-5 dias. iDCs foram colhidas e lavadas uma vez em meio X-Vivol5 antes da electroporação e ressuspensas a 300.000 - 500.000 células / 150 ul em X-Vivol5 novamente. 150? L de suspens de culas foram pipetados para a placa de 96 poços para eletroporação-multipoço, a placa já contendo o necessário IVT- RNA, nomeadamente RNA que codifica para o antigénio de claudina-6 mais RNAs que codificam a proteína TNFR-ligante-fusão, tal como indicado ou RNA irrelevante (que codifica a luciferase) para o controlo, respectivamente. Depois de se misturar a suspensão de células com RNA, electroporação foi realizada no dispositivo de electroporao de multi-cavidades (pulso de 300 V, 1 x 12 ms). Imediatamente após a electroporação, as células foram transferidas para uma nova placa de cultura através da adição de 100 ul de meio IMDM suplementado com de 5% soro AB humano e descansaram durante cerca de 1 - 3 horas na incubadora.

[00238] Células T CD8+ foram separadas pela tecnologia MACS usando MicroBeads anti-CD8 (Miltenyi) a partir restantes HLA-A2 + de linfócitos de sangue periférico, que foram congeladas após CD14 + -MACS-isolamento. CD8 + células T foram lavadas uma vez em meio X-vivol5 e ressuspensas a uma concentração final de 10 x 10 6 cpelulas / 250 μl de X-Vivol5 novamente. 10 x l06 células T CD8 + foram electroporados em 250 ul de meio com 10 ug de RNA IVT-codifica a cadeia alfa e 10 ug de IVT-RNA que codifica para a cadeia beta de uma claudina-6-TCR (restrito a HLA- A2 +). Como controle, RNAs que codificam para um TPTE-TCR (restrito a HLA-A2 + foram usadas). A electroporação foi realizada em 250 μl de X-Vivol5 em uma cuvete de electroporao 4 milímetros usando o BTX ECM® 830 dispositivo de electroporao Sistema (500 V, pulso de 1 x 3 ms). Imediatamente após a electroporação, as células foram transferidas para meio IMDM fresco suplementado com 5% de soro AB humano e descansou durante pelo menos 1 hora na incubadora. Em seguida, as células T foram marcadas com éster de succinimidilo carboxifluoresceína (CFSE) de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen).

[00239] A fim de analisar os efeitos mediados por TNFR-Iigand contruções foi realizada (IVT-RNA) de um ensaio de proliferação CFSE. Para esse fim, um total de 5.000 DCs electroporadas foram adicionados em um poço de uma placa de 96 poços contendo já 50.000 células T, que tinham sido eletroporadas com o RNA de codificação CLD6-TCR ou TPTE-TCR, respectivamente. A incubação foi efectuada em meio RPMI 1640 suplementado com GlutaMAX 5% de soro AB humano a 100 UI / mL de penicilina, e 100 mg / mL de estreptomicina. A proliferação de PBMC foi medida após 5 dias de incubação por citometria de fluxo e analisadas pelo software Fluxo Jo.

[00240] Co-electroporação DC com claudina-6 antigénio- RNA e h3_CD27L-h3_CD40L RNA ou h3_CD40L-h3_CD27L RNA resultou em um aumento da proliferação de CD8 + de células -T, mais particularmente, mais as células T entrou em divisão (aumento da “% de células divididas") e, em seguida, também dividido com mais frequência (aumento do índice de proliferação ") (Fig. 26 AC). Em contraste, a co-electroporação com claudina- 6 antigénio-RNA e construções individuais que codificam as duas proteínas separadas h3_CD40L e h3_CD27L não resultou em um aumento da proliferação de células T (Fig.26 A). Além disso, h3_CD27L- h3_CD40L não induziu uma proliferação considerável de células T de controlo, TPTE-TCR + CD8 + de células T, que mostra que as construções não ativar a proliferação de células T de uma forma não específica do antigénio (Fig. 26 B). h3_CD27L-h3_CD40L e h3_CD40L-h3_CD27L mediada efeitos comparáveis (Fig. 26 A). h3_CD27L-h3_CD40L é um exemplo de uma proteína de fusão, que, por um lado é capaz de se ligar e ativar o CD40 expresso em DCs e, por outro lado é capaz de se ligar a e ativar CD27 constitutivamente expressa em células T, desse modo, de ligação cruzada destas células em trans.

[00241] Da mesma forma, a co-eletroporação DC com antigénio-RNA e h3_4-lBBL-h3_CD27L RNA resultou em um aumento da proliferação de CD8 + de células -T, enquanto a co- electroporação com antigénio-RNA e construções individuais que codificam as duas proteínas separadas h3_4-l BBL e h3_CD27L não resultou em um aumento da proliferação de células T (Fig. 27 a). Além disso, h3_4-lBBL-h3_CD27L não induziu a proliferação de células T de controlo, TPTE-TCR + CD8 + células T que mostram que as construções não ativar a proliferação de células T de uma forma não específica do antigénio (Fig. 27 B).

[00242] h3_4-lBBL-h3_CD27L (scDuocina correspondente) e hl_4-lBBL-hl_CD27L (Duocina correspondente) mediada efeitos comparáveis (Fig. 27 A). h3_4-lBBL-h3_CD27L é um exemplo de uma proteína de fusão, que é capaz de se ligar a e ativar CD27 constitutivamente expressa em células T e ligam-se a e ativar 4- IBB expresso em células T após a ativação, assim, possivelmente, de ligação cruzada dos receptores em cis.

[00243] A fim de analisar os efeitos de Duocinas recombinantes, co-cultura de iDCs e células T foi iniciada um dia ap a electroporao com as contagens de células e proporções como descritos acima. Ao mesmo tempo, as proteínas recombinantes foram adicionadas como indicado. A proliferação de PBMC foi então medida após 4 dias de incubação.

[00244] A adição de proteínas de fusão recombinantes de CD40L-CD27L, 41BBL-CD40L e 4-1BBL-CD27L à célula T: DC co- culturas resultou em um aumento da proliferação de células T CD8 + -T células (Figura 28 a.). Mais células T entrou em divisão (aumento da “% de células divididas ') e, em seguida, também dividido com mais frequência (aumento do índice de proliferação') (Fig. 28 B). Em contraste, a adição de duas proteínas ligante de TNFR separadamente não resultou em um aumento da proliferação de células T.

Exemplo 16: Ligação simultânea de Duocinas a receptor imobilizado e PBMC que conduzem à ativação e proliferação de células T

[00245] Tem sido demonstrado que Duocinas compostas por 4-1BBL / CD40L, 4-1BBL / CD27L e CD40IJCD27L em solução são capazes de ativar as células T. Em uma outra experiência, analisou-se se estas Duocinas também ativar as células T, quando são apresentados por meio de ligação a um receptor imobilizado sobre uma superfície plástica, a restrição de ativação para a segunda especificidade de ligação ao receptor. Para esse fim, 200 ng / poço de receptor de Fc (CD40-Fc, CD27-Fc, 4-LBB-Fc, OX40-Fc) foram imobilizados em placas de microtitulação durante a noite a 4 ° C. Os locais de ligação residuais foram bloqueados com meio RPMI 1640 + 10% de FCS, durante 1 h. Diluições em série de Duocinas (CD40L-CD27L, 4-1BBL-CD40L, 4-1BBL-CD27L, OX40L-CD40L e OX40L-CD27L) foram incubadas com os receptores imobilizados durante 1 h, e posteriormente as proteínas não ligadas foram removidas por lavagem. Enquanto isso, as PBMC humanos foram coradas com uma concentração de l x lO6 células / ml com 625 nM de éster diacetato de carboxifluoresceína succinimidilo (CFSE) utilizando o Kit de Proliferação Celular CellTrace CFSE (Life Technologies), seguindo as instruções do fabricante. Para a estimulação primária de células T, o anticorpo monoclonal anti-CD3 humano (sistemas UCHT-1, R & D, Minneapolis, EUA) era de ligação cruzada com IgG anti-ratinho a uma razão molar de 1: 3. PBMC (1,5x10 5 culas por po) foram adicionados em conjunto com o estímulo primário para a placa de ensaio contendo as Duocinas ligados aos receptores imobilizados. Após 6 dias, a proliferação de células T foi determinada por citometria de fluxo. As células T foram identificados por coloração com anticorpos com CD3-PE, CD4- VioBlue e CD8-PE-Vio770. Para todos Duocinas um aumento da proliferação das células T CD4 + e CD8 + de células T foi observado, adicionalmente demonstrando que ambos os locais de ligação dos Duocinas são funcionais e que elas são capazes de induzir a co-estimulação de células T em conjunto com um estímulo primário fornecido através de CD3 (Fig. 29). Não se observou proliferação na ausência de estímulo CD3 apoiar a dependência da ativação de células T por Duocinas na ativação primária.

Exemplo 17: Ligação simultânea de Duocinas de cadeia simples a receptor imobilizado e PBMC que conduzem à ativação e proliferação de células T

[00246] Tem sido demonstrado que Duocinas de cadeia simples compostos por 4-1BBL / CD40L, 4-1BBL / CD27L e CD40L / CD27L na solução são capazes de ativar as células T. Em uma outra experiência, analisou-se se estas Duocinas de cadeia simples também ativam as células T, quando são apresentados por meio de ligação a um receptor imobilizado sobre uma superfície plástica, a restrição de ativação para a segunda especificidade de ligação ao receptor. Para esse fim, 200 ng de Fc-receptor bem (CD40-Fc, CD27-Fc, 4-LBB-Fc, OX40-Fc) foram imobilizados em placas de microtitulação durante a noite a 4 ° C. Os locais de ligação residuais foram bloqueados com meio RPMI 1640 + 10% de FCS, durante 1 h. Diluições em série de Duocinas de cadeia simples (scCD40L- scCD27L, sc4- 1BBL-SCCD40L, sc4-lBBL-scCD27L, scOX40L-scCD40L e scOX40L-scCD27L) foram incubadas com os receptores imobilizados durante 1 h, e posteriormente as proteínas não ligadas foram removidas por lavagem. Enquanto isso, as PBMC humanos foram coradas com uma concentração de lxlO 6 células / ml com 625 nM de éster diacetato de carboxifluoresceína succinimidilo (CFSE) utilizando o Kit de Proliferação Celular CellTrace CFSE (Life Technologies), seguindo as instruções do fabricante. Para a estimulação primária de células T de anticorpo monoclonal anti-CD3 humano (UCHT-1, R & D Systems, Minneapolis, EUA) era de ligação cruzada com IgG anti-ratinho a uma razão molar de 1:3. 1,5 x 105 PBMC por cavidade foram adicionados em conjunto com o estímulo primário para a placa de ensaio contendo as Duocinas de cadeia simples ligados aos receptores imobilizados. Após 6 dias, a proliferação de células T foi determinada por citometria de fluxo. As células T foram identificados por coloração com anticorpos com CD3- PE, CD4-VioBlue e CD8-PE-Vio770. Para todos os Duocinas de cadeia simples um aumento da proliferação das células T CD4 + e CD8 + foi observada células T, mais demonstrando que ambos os locais de ligação dos Duocinas de cadeia simples são funcionais e que eles são capazes de induzir a co-estimulação de células T em conjunto com um estímulo primário fornecida através CD3 (Fig. 30). Não se observou proliferação na ausência de estímulo CD3 apoiar a dependência da ativação de células T por Duocinas de cadeia simples na ativação primária.

Exemplo 18: Estabilidade de Duocinas e Duocinas de cadeia simples selecionadas em plasma humano

[00247] A estabilidade de Duocinas e Duocinas de cadeia simples foi testado in vitro utilizando plasma humano. 200 nm do Duocinas purificadas e Duocinas de cadeia simples foram preparados em 50% de plasma humano a partir de dadores saudáveis. As amostras foram congeladas a -20 ° C imediatamente após a preparação (0 d) ou após a incubação a 37 ° C durante 1 d, 3 d e 7 d. O nível de proteína intacta foi determinado utilizando ELISA, através de ligação de ligante de unidades homotriméricas C-terminal para o receptor imobilizado (150 ng / cavidade) e detecção do marcador FLAG de N-teiminal. As concentrações de proteína nas amostras de plasma diluídas foram interpoladas a partir de uma curva padrão de proteína purificada. A quantidade de proteína de fusão detectada no dia 0 foi definida como 100%. Seis Duocinas e seis Duocinas de cadeia simples foram testados, que cobre todas as combinações possíveis de ligantes, e todas as construções apresentaram uma diminuição dependente do tempo, no nível de proteína intacta, tal como revelado por um ensaio de ligação ao receptor. Após 7 dias, entre 50 e 70% Duocinas intactas eram detectáveis nas amostras de plasma para a maioria das combinações de ligantes (Fig. 31, do lado esquerdo). Apenas em caso de 4-1BBL-CD27L a quantidade de proteína intacta diminuiu para menos de 10% após 7 dias com uma redução de 40% no primeiro dia. Em geral, Duocinas de cadeia única mostraram redução da estabilidade com 20-50% de proteína intacta que fica depois de 7 dias (Fig. 31, lado direito).

Exemplo 19: Propriedades farmacocinéticas de um duocina de murino e duocina de cadeia única de murino selecionada em camundongo CD1

[00248] A biodisponibilidade in vivo de um duocina específicos de rato selecionadas e a sua correspondente duocina de cadeia simples foi estudado através da determinação das concentrações séricas após uma única injecção IV. Murganhos fêmea CD1 (12-16 semanas, 30-35 g, 3 ratos por duocina) recebeu uma injecção intravenosa de 25 ug m4- lBBL-mCD40L e msc4-lBBL-mscCD40L, respectivamente, em um volume total de 150 ul cada. As amostras de sangue foram tomadas a partir da veia da cauda de 3 min, 30 min, 1 h, 2 h, 6 h, I d, e 3 d depois de injeção, incubado em gelo durante 30 minutos, e centrifugou-se a 13000 g durante 30 min a 4 ° C. O soro foi separado dos componentes celulares e as amostras foram armazenadas a -20 ° C. Os níveis séricos das proteínas de fusão foram determinados em ELISA por meio de ligação a receptor imobilizado (150 ng / cavidade) correspondente para o ligante C-terminal e a detecção por meio da FLAG-tag N-terminal. As concentrações no soro de todas as proteínas foram obtidas por interpolação a partir de uma curva padrão de proteína purificada. Para efeitos de comparação, a concentração em 3 min foi definida como 100%. Meia-vida iniciais e terminais (t 1 / 2α3-60min, t 1 / 2β1-24h) foram calculados com o Excel. Ambos os M4-lBBL-mCD40L e msc4-lBBL- mscCD40L apresentou um aclaramento da corrente sanguínea com semi-vidas terminais de 3,8 (duocina de cadeia simples) e 5,6 h (duocina) e uma meia-vida inicial curto de 10-13 min em ambos os casos (Fig. 32). Em comparação com uma IgG de comprimento completo (cetuximab) utilizando reciclagem FcRn- mediada, ambas as construções foram rapidamente eliminadas. Uma comparação com uma proteína de fusão scFv-4-lBBL com uma meia-vida terminal de 6,6 horas (dados não mostrados) mostra que a meia-vida de m4-lBBL-mCD40L e msc4-lBBL-mscCD40L está dentro da mesma gama de aquelas proteínas de fus imunoestimuladoras funcionalmente relacionados. A depuração rápida geral de proteínas de fusão incluindo imunoestimuladores pontos Duocinas a célula alvo (isto é, célula imune) consumo específico.

Exemplo 20: Expressão do Receptor em CMSP humano e de ligação de Duocinas de cadeia simples para subpopulações de células imunes

[00249] De modo a determinar as populações de possíveis células alvo dentro de uma população de PBMC e as células alvo reais de Duocinas de cadeia simples, os PBMCs humanos foram caracterizados em detalhe. PBMC de doadores saudáveis, foram descongeladas e incubadas em uma placa de cultura de células durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, 2,5 x 105 PBMC humanas foram incubadas com 10 nM Duocinas de cadeia simples na presença ou ausência de anticorpo anti-CD3 humana reticulada como estímulo primário em uma resposta limitantes, concentração subóptima. Após 3 dias a 37 ° C, diferentes subpopulações foram identificadas em citometria de fluxo por coloração marcador CD (anti-CD3, anti-CD4, anti- CD8, anti-CD14, anti-CD20 e anti-CD56) e a ligação de single- Duocinas cadeia para as diferentes subpopulações foi avaliada através da detecção da sua FLAG-tag. Além disso, estimuladas e não estimuladas. As PBMC também foram incubadas sem Duocinas de cadeia simples, subpopulações foram identificados após 3 dias de cultura e a expressão de superfície de CD40, CD27, OX40 e 4- IBB foi determinada por coloração de anticorpos. Não estimulados PBMC foram compostas de aprox. 40% de células T CD8 +, 40% de células T CD4 +, células 15% de B e 5% de células NK (Fig. 33, canto superior esquerdo). Devido ao tratamento da PBMC, todos os monócitos aderidos às superfícies de plástico e não estavam presentes na experiência. Após 3 dias de estimulação com mAb anti-CD3, a quantidade de células T CD8 + de células T aumentou para cerca de 80%, acompanhado com uma ligeira diminuição em percentagem de todos os outros tipos de células (Fig. 33, canto inferior esquerdo). Os receptores CD40 e CD27 foram expressos constitutivamente em células B (CD40) e os dois tipos de células T (CD27) independente da estimulação. Enquanto 4- IBB e OX40 não estavam presentes em nenhum PBMC não estimuladas, cerca de 80% estimularam células T CD4 + e 40% células T CD8 + estimulada expressa ambos os receptores (Fig.33, painel do meio). Consistente com expressões do receptor, as três testadas que actuam em trans de cadeia simples Duocinas (scCD40L-scCD27L, sc4-lBBL-scCD40L e scOX40L-scCD40L) ligado quase exclusivamente para células B estimuladas e não estimuladas (Fig. 33, parte superior direita). Os Duocinas de actuação cis de cadeia simples (SC4- lBBL-scCD27L e scOX40L-scCD27L) ligada unicamente à acção af de CD4 + células T na configuração não estimulado e a uma grande porção de células T CD4 + e CD8 + de células T após estimulação (Fig. 33, à direita inferior). Em resumo, estas experiências mostram que as moléculas que actuam em trans como alvo culas B independentes de estimulação, ao passo que construções de actuação cis, dirigir-ativada de CD8 + e de CD4 + células T.

Exemplo 21: Ligação de um duocina de cadeia simples de aco- cis para células imune humanas e indução de proliferação das células T

[00250] A ligação entre a ligação de células imunes humanas e indução de proliferação das células T foi examinado por uma acção-cis duocina de cadeia simples selecionados. Para isso, 2,5x10 5 PBMC humano (população a granel) foram incubadas com 10 nM sc4-lBBL-scCD27L na presença ou ausência de anticorpo anti-CD3 humana reticulada como estímulo primário subóptima. Após 3 dias a 37 ° C, diferentes subpopulações foram identificadas em citometria de fluxo por coloração marcador CD (anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti- CD20 e anti-CD56). A expressão de superfície de CD27 e 4-1BB foi determinada por coloração de anticorpo e a ligação do duocina de cadeia simples foi avaliada por detecção da sua FLAG-tag. 1.5xl0 5 PBMC CFSE-marcados (população a granel, diferente lote PBMC) foram incubadas com 30, 3, 0,3 ou 0 nM sc4-lBBL-scCD27L na presença ou ausência de anticorpo anti- CD3 humana reticulada como estímulo primário subóptima. Após 6 dias, a proliferação de células T CD4 + e CD8 + de células T foi determinada por citometria de fluxo em CFSE diluição. Quando aplicado em combinação com o anticorpo anti-CD3 humana reticulada como estímulo primário, sc4-lBBL-scCD27L reforçada a proliferação mediada por CD3 inicial de células T CD4 + e de células T CD8 + por 30% já a baixas concentrações de 0,3 nM (Fig. 34, à direita inferior). Geralmente, mais de de células T CD8 + (80%) do que de de células T CD4 + (60%) começaram a proliferar. Este perfil de proliferação está de acordo com a constatação de que SC4-lBBL-scCD27L liga-se a ambas as células CD4 4-1BB- e que expressam CD27 + e CD8 + de células T na configuração estimulada (Fig. 34, canto inferior esquerdo). Sem estimulação anti-CD3, em proliferação de de células T CD8 + não foram observadas em absoluto e só a proliferação marginal de células T CD4 ~ 10% + células T foi encontrada (Fig. 34, parte superior direita). Esta taxa de proliferação basal não foi melhorada por sc4-lBBL-scCD27L, embora a ligação a CD4-expressando CD27 + células T foi observado (Fig.34, superior esquerdo), o que indica que Duocinas de aco-cis não actuam em culas T em repouso.

Exemplo 22: Ligação de um duocina de cadeia simples de atuação trans às células imune humanas e indução de proliferação das células T

[00251] A ligação entre a ligação de células imunes humanas e indução de proliferação das células T foi examinado por um duocina de cadeia simples de actuação trans selecionado. Para isso, 2,5x10 5 PBMC humano (população a granel) foram incubadas com 10 nM sc4-lBBL-scCD40L na presença ou ausência de anticorpo anti-CD3 humana reticulada como estímulo primário subóptima. Após 3 dias a 37 ° C, diferentes subpopulações foram identificadas em citometria de fluxo por coloração marcador CD (anti-CD3, anti-CD4, anti- CD8, anti-CD20 e anti-CD56). A expressão de superfície de CD40 e 4-1BB foi determinada por coloração de anticorpo, e a ligação do duocina de cadeia simples foi avaliada por detecção da sua FLAG-tag. 1,5 x 105 CFSE marcado com PBMC (população a granel, diferente lote PBMC) foram incubadas com 30, 3, 0,3 ou 0 nM sc4-lBBL-scCD40L na presença ou ausência de anticorpo anti-CD3 humana reticulada como estímulo primário subóptima. Após 6 dias, a proliferação de células T CD4 + e CD8 + de células T foi determinada por citometria de fluxo em CFSE diluição. Quando aplicado em combinação com o anticorpo anti-CD3 humana reticulada como estímulo primário, sc4-lBBL-scCD40L aumentada fortemente a proliferação mediada por CD3 inicial de células CD4 + e CD8 + de células T em 5060% já a baixas concentrações de 0,3 nM. Geralmente, quase todas as células CD8 + de células T (90%) e cerca de 70% de CD4 + células T começaram a proliferar (Fig. 35, inferior direito). sc4-lBBL-scCD40L se liga inicialmente a células B que expressam constitutivamente CD40, permitindo uma trans- apresentação do módulo 4-1BBL deste duocina de cadeia simples de células T com primer 4-LBB-expressam (Fig. 35, inferior direito). Sem estimulação CD3, apenas uma (3%) marginal CD8 + proliferação de células T pode ser observada, e foi observado um ligeiro aumento de células em proliferação 9% mediante a adição de sc4-lBBL-scCD40L, indicando que uma fracção menor de CD8 + de células T pode responder a transativação na ausência de CD3 intencional disparo (fig. 35, painel superior), o que sugere que estas células estão em um estado pré-ativada.

Exemplo 23: Ligação de um duocina de cadeia simples de atuação trans às células imunes humanas e indução de proliferação das células T

[00252] A ligação entre a ligação de células imunes humanas e indução de proliferação das células T foi examinado por um segundo duocina de cadeia simples de atuação trans selecionado. Para isso, 2,5x10 5 PBMC humano (população a granel) foram incubadas com 10 nM scCD40L-scCD27L na presença ou ausência de anticorpo ligado a anti-CD3 humano cruzada como estímulo primário subóptima. Após 3 dias a 37 ° C, diferentes subpopulações foram identificadas em citometria de fluxo por coloração marcador CD (anti-CD3, anti-CD4, anti- CD8, anti-CD20 e anti-CD56). A expressão de superfície de CD40 e CD27 foi determinada por coloração de anticorpo e a ligação do duocina de cadeia simples foi avaliada por detecção da sua FLAG-tag. 1,5 x l05 CFSE marcado com PBMC (população a granel, lote diferente PBMC) foram incubadas com 30, 3, 0,3 ou 0 nM scCD40L-scCD27L na presença ou ausência de anticorpo anti-CD3 humana reticulada como estímulo primário subóptima. Após 6 dias, a proliferação de células T CD4 + e CD8 + de células T foi determinada por citometria de fluxo em CFSE diluição. Quando aplicado em combinação com o anticorpo anti-CD3 humana reticulada como estímulo primário, scCD40L- scCD27L reforçada a proliferação mediada por CD3 inicial de células CD4 + e de células T CD8 + em 20-35% já a baixas concentrações de 0,3 nM (Fig. 36, à direita inferior). De um modo geral, um pouco mais de células T CD8 + (60%) do que de células T CD4 + (45%) começaram a proliferar. CD27 foi expresso constitutivamente em todas as células T CD8 + e de CD4 + como revelado pela coloração com anticorpo, de ligação de scCD401L-scCD27L duocina foi detectada em 50% de todas as células T CD4 +, mas estava abaixo do nível de detecção em CD8 + células T. scCD40L-scCD27L Também se verificou que se ligam a população completa de células B que expressam constitutivamente CD40 (fig.36, canto inferior esquerdo). Por conseguinte, uma transativação directa por scCD40L-scCD27L via CD27 + de células CD4 - CD40 + interação célula B prontamente as contas de CD4 + proliferação de células T, ao passo que no caso de CD8 + de células T adicionais, até agora mecanismos não-especificada / células parecem necessário para permitir a forte transativação por esta única duocina cadeia. Sem qualquer estimulação de CD3, a proliferação de células T em resposta a duocina scCD40L-scCD27L aumenta de 1 a 10% e 5 a 25% de CD8 + e de CD4 + células T, respectivamente, (fig.36, superior direita) mostrando que alguns t as células são capazes de responder aos sinais co-estimuladores sem ativação CD3 intencional, novamente sugerindo a existência de uma subpopulação de células pré-ativadas.

[00253] Em resumo, a ativação considerável de células T mediada por scCD40L-scCD27L pode ser atribuída à expressão constitutiva de CD27 em todas as células T e CD40 em todas as células B (Fig. 36, canto superior esquerdo) levando a distorção prolongada e ativação de células imunes diferentes.

Claims

1. Proteína de fusão de citoquina caracterizada pelo fato de que é selecionada do grupo que consiste em: A) uma proteína de fusão de citocina compreendendo o domínio extracelular de um primeiro ligante da superfamília do fator de necrose tumoral (TNF) e o domínio extracelular de um segundo ligante da superfamília TNF, em que o primeiro ligante e o segundo ligante são diferentes, e em que os domínios extracelulares estão ligados covalentemente; e B) uma proteína de fusão de citocina compreendendo (i) três domínios extracelulares de um primeiro ligante da superfamília do fator de necrose tumoral (TNF) formando um primeiro homotrímero capaz de se ligar a um receptor do primeiro ligante e (ii) três domínios extracelulares de um segundo ligante da superfamília do TNF formando um segundo homotrímero capaz de se ligar a um receptor do segundo ligante, em que o primeiro ligante e o segundo ligante são diferentes e em que o primeiro homotrímero e o segundo homotrímero estão covalentemente ligados, preferencialmente através de um ou mais ligantes peptídicos, e em que na proteína de fusão de citocina de A) e B) o primeiro ligante é CD40L e o segundo ligante é 4-1BBL, em que o domínio extracelular de CD40L compreende ou consiste nos resíduos de aminoácidos 51 a 261 ou 116 a 261 da SEQ ID NO: 1 e o domínio extracelular de 4-1BBL compreende ou consiste nos resíduos de aminoácidos 71 a 254 da SEQ ID NO: 3, em que a proteína de fusão de citoquina de A) compreende três subunidades com a fórmula geral: em que A compreende o domínio extracelular do primeiro ligante, e B compreende o domínio extracelular do segundo ligante, em que L compreende um ligante peptídico, e em que a proteína de fusão de citoquina de A) é presente como um complexo trimérico, em que três domínios extracelulares do primeiro ligante formam um primeiro homotrímero capaz de se ligar a um receptor do primeiro ligante, e três domínios extracelulares do segundo ligante formam um segundo homotrímero capaz de se ligar a um receptor do segundo ligando; e em que a proteína de fusão de citoquina de B) compreende uma molécula / estrutura tendo a fórmula geral em que A compreende o domínio extracelular do primeiro ligante, e B compreende o domínio extracelular do segundo ligante, e em que L compreende um ligante peptídico, e LA e LB são, em cada ocorrência, independentemente selecionados de uma ligação covalente e um ligante peptídico.

2. Proteína de fusão de citoquina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que em B), o L compreende adicionalmente um domínio de multimerização, preferencialmente um domínio de dimerização, permitindo a multimerização, preferencialmente dimerização, da proteína de fusão de citoquina.

3. Proteína de fusão de citoquina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o domínio de dimerização é selecionado do grupo consistindo num domínio 2 de cadeia pesada de IgE (EHD2), um domínio 2 de cadeia pesada de IgM (MHD2), um domínio 3 da cadeia pesada de IgG (GHD3), domínio 3 da cadeia pesada da IgA (AHD2), domínio 3 da cadeia pesada da IgD (DHD3), um domínio 4 da cadeia pesada da IgE (EHD4), domínio 4 da cadeia pesada da IgM (MHD4), um domímio Fc, um domínio de dimerização de uteroglobina e variantes funcionais de qualquer um dos anteriores.

4. Proteína de fusão de citoquina, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que está presente como um complexo multimérico, preferencialmente dimérico.

5. Molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que codifica uma proteína de fusão de citoquina conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou uma subunidade da mesma.

6. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que é operativamente ligada a uma sequência de controle de expressão.

7. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicações 5 ou 6, caracterizada pelo fato de que está contida em um vetor.

8. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que é uma molécula de RNA, preferencialmente uma molécula de RNA transcrita in vitro (IVT).

9. Célula microbiana caracterizada pelo fato de que é transformada ou transfectada com uma molécula de ácido nucleico conforme definida por qualquer uma das reivindicações 5 a 8.

10. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende, como agente ativo, uma proteína de fusão de citoquina conforme definida por qualquer uma das reivindicações 1 a 4, uma molécula de ácido nucleico conforme definida por qualquer uma das reivindicações 5 a 8 ou uma célula microbiana conforme definida pela reivindicação 9, e, opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou excipiente.

11. Kit caracterizado pelo fato de que compreende uma proteína de fusão de citoquina conforme definida por qualquer uma das reivindicações 1 a 4, uma molécula de ácido nucleico conforme definida por qualquer uma das reivindicações 5 a 8, uma célula microbiana conforme definida pela reivindicação 9 ou uma composição farmacêutica conforme definida pela reivindicação 10.

12. Uso de uma proteína de fusão de citoquina conforme definida por qualquer uma das reivindicações 1 a 4, uma molécula de ácido nucleico conforme definida por qualquer uma das reivindicações 5 a 8, uma célula microbiana conforme definida pela reivindicação 9, ou uma composição farmacêutica conforme definida pela reivindicação 10 caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar uma doença selecionada a partir do grupo que consiste de câncer, doenças infecciosas, doenças inflamatórias, doenças metabólicas, doenças autoimunes, doenças degenerativas, doenças associadas a apoptose e rejeições de transplantes.