CN113645990A

CN113645990A - 改良的前列腺凋亡反应-4(par-4)多肽及其生产和使用方法

Info

Publication number: CN113645990A
Application number: CN202080027553.XA
Authority: CN
Inventors: 湛昌国; 维韦克·M·兰格奈克; 郑芳; 金庆宝
Original assignee: University of Kentucky Research Foundation
Current assignee: University of Kentucky Research Foundation
Priority date: 2019-04-10
Filing date: 2020-04-10
Publication date: 2021-11-12
Also published as: WO2020210596A1; US20220153805A1

Abstract

本申请公开的是在癌细胞中具有前列腺凋亡反应‑4(Par‑4)促凋亡活性和增强生物半衰期的多肽分子，以及相关方法。具体而言，本公开提供了包含Par‑4多肽融合蛋白的组合物，以及使用所述组合物诱导癌细胞凋亡的方法，其中所述癌细胞是转移性的。

Description

改良的前列腺凋亡反应-4(PAR-4)多肽及其生产和使用方法

相关应用

本申请要求2019年4月10日提交的美国临时申请序列号62/832,155的优先权，该申请的全部公开内容通过引用纳入本文。

技术领域

本申请公开的主题一般涉及在癌细胞中具有前列腺凋亡反应-4(Par-4)促凋亡活性和增强生物半衰期的多肽分子。本申请公开的主题还涉及编码此类多肽分子的核酸分子、重组多肽分子的制备方法、包括此类多肽分子的组合物、诱导癌细胞凋亡的方法以及治疗癌症的方法。

简介

前列腺凋亡反应-4(Par-4)是一种在一些组织中广泛表达的肿瘤抑制性蛋白。1994年，Par-4基因首次被发现是大鼠前列腺癌细胞系中的早期凋亡基因，所述细胞系使用离子霉素孵化凋亡细胞死亡。(l,2)事实证明，Par-4的过表达足以引起大多数癌细胞的凋亡。(3)与这一观察一致，有报道发现Par-4基因在子宫内膜癌中发生突变，(4)并在许多不同类型的癌症中明显下调，包括肾细胞癌，(5)乳腺癌，(6,7)胃癌和胰腺癌，(8)胶质母细胞瘤，(9)和神经母细胞瘤。(10)Par-4的下调与肿瘤复发和病人生存率降低相关。(7)

Par-4的核心结构域(人Par-4中的氨基酸残基145-204；大鼠Par-4中的137-195)，被称为癌细胞选择性凋亡(SAC)，作为其促凋亡活性的效应结构域。(11)值得注意的是，这个结构域在小鼠、大鼠和人类的同源物中是100％保守的，这意味着Par-4在对肿瘤的监视中起着关键作用。(11)事实上，成熟的Par-4蛋白及其SAC结构域都能通过(由例如生化压力或DNA损伤的内在刺激激活，主要由Bcl-2和Bax调节的)内在途径(12)和(对例如Fas配体的外部刺激反应中激活的)外在途径诱导细胞凋亡。(13)

起初，人们认为Par-4蛋白只在细胞质和细胞核中定位和作用，用于诱导细胞凋亡，(1,14)但随后的研究发现，Par-4蛋白可以分泌到细胞外空间发挥作用。(2)细胞外的Par-4蛋白与癌细胞表面表达的应激反应蛋白如葡萄糖调节蛋白78(GRP78)结合后，可通过FADD、半胱天冬酶(caspase)-8和-3的激活来诱导细胞凋亡。(2)

研究还表明，接触纯化的重组Par-4蛋白不仅能诱导多种类型的癌细胞凋亡，而且还能抑制体内肿瘤的生长。(3,15)因此，以前与Par-4相关的药物发现工作主要集中在开发能促进Par-4从正常细胞中分泌的小分子药物，以达到Par-4依赖性抑制肿瘤生长的效果。Arylquin1(16)和抗疟疾药物氯喹(chloroquine)(CQ)(17)已被发现是正常细胞或癌细胞中分泌Par-4的强诱导剂。

重组的野生型Par-4在小鼠的循环系统中只停留很短的时间。因此，由于Par-4在体内血清中的持久性有限，这可能削弱了分泌的Par-4肿瘤抑制活性。众所周知，蛋白质药物的实际疗效可以通过改善其药代动力学(PK)概况而大大增加。(18-24)

因此，本领域仍然需要一种具有改进的体内生物半衰期并同时保持Par-4有益生物活性的组合物。

发明简述

对于本领域的普通技术人员来说，在研究了本文所提供的信息后会明白本申请的主题满足了部分或全部上述需求。

发明简述描述了本申请主题的几个实施方式，并在许多情况下列出了这些实施方式的变化和排列组合。发明简述仅仅是众多不同实施方式的示例性说明。提及一个或多个特定实施方式的代表性特征也同样是示例性的。这种实施方式通常可以在有或没有所述一个或多个特征的情况下存在；同样，这些特征也可以应用于本申请主题的其他实施方式，无论所述实施方式是否在发明简述中列出。为避免过度重复，发明简述没有列出或建议这种特征的所有可能组合。

本申请主题包括具有前列腺凋亡反应-4(Par-4)活性和增强生物半衰期的多肽分子。本申请主题还包括编码此类多肽分子的核酸分子，重组多肽分子的制备方法，包括此类多肽分子的组合物，诱导癌细胞凋亡的方法，以及治疗癌症的方法。

本申请公开的多肽分子相对于野生型Par-4具有Par-4活性和增强的生物半衰期。在一些实施方式中，多肽分子包括融合蛋白提供的Par-4多肽部分和第二多肽分子。

在一些实施方式中，Par-4多肽部分是包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列的多肽。在一些实施方式中，Par-4多肽部分是包含相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列有修饰的多肽。在一些实施方式中，Par-4多肽部分是包含相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列有删除的多肽。在一些实施方式中，Par-4多肽部分是包含相对于SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2序列有插入的多肽。在一些实施方式中，Par-4多肽部分是包含相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列有取代(substitution)的多肽。

在一些实施方式中，Par-4多肽组成是包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列的片段的多肽。在一些实施方式中，Par-4多肽组成是包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列的变体的多肽。

在一些实施方式中，第二多肽分子包含含有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列的免疫球蛋白Gl可结晶片段(Fc)的多肽。在一些实施方式中，第二多肽分子是包含相对于SEQID NO:3或SEQ ID NO:4序列有修饰的多肽。在一些实施方式中，第二多肽分子是包含相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列有删除的多肽。在一些实施方式中，第二多肽分子是包含相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列有插入的多肽。在一些实施方式中，第二多肽分子是包含相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列有取代的多肽。

在一些实施方式中，第二多肽分子是SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列的片段。在一些实施方式中，第二多肽分子是SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列的变体。

本申请主题还包括在癌细胞中诱导细胞凋亡的方法，所述方法涉及使癌细胞与本申请多肽分子接触。在一些实施方式中，所述癌细胞是转移性的。

本申请主题还包括治疗受试者癌症的方法，所述方法涉及向需要的受试者给与本申请公开的多肽分子。

本申请主题进一步包括核酸分子。本申请公开的核酸分子包括编码上述多肽分子的核苷酸序列或其互补序列。在这方面，核酸分子编码的多肽分子相对于野生型Par-4来说，具有Par-4的活性和增强的生物半衰期。该核酸分子包括编码本申请公开的Par-4多肽的序列，所述序列与编码本申请公开的第二多肽分子序列可操作地连接。在一些实施方式中，核酸分子编码的多肽分子包含作为融合蛋白提供的Par-4多肽部分和第二多肽分子。

本申请主题进一步包括含有本申请公开的核酸分子的载体。本申请主题进一步包括某种细胞，所述细胞包括含有本申请公开的核酸分子的载体。本申请主题进一步包括使用本申请公开的核酸分子制备本申请公开多肽分子的方法。

本申请主题进一步包括含有本申请公开的多肽分子的组合物，例如药物组合物，所述多肽分子相对于野生型Par-4而言，具有Par-4活性和增强的生物半衰期。所述组合物可包含本领域普通技术人员知晓的用于多肽分子稳定性的药学上可接受的运载体。

本申请主题还包括在癌细胞中诱导细胞凋亡的方法，所述方法涉及使癌细胞与本申请公开的组合物接触。在一些实施方式中，所述癌细胞是转移性的。

本申请主题还包括治疗受试者癌症的方法，所述方法涉及向需要的受试者给与本申请公开的组合物。

附图简要说明

本发明的新颖特征在所附的权利要求中有具体阐述。通过参考以下使用本发明原理的说明性实施方式的详细描述和如下附图，可以更好地理解本发明的特征和优点：

图1显示了小鼠中重组Par-4蛋白的血清持久性是有限的。(A)纯化的TRX融合的Par-4或六组氨酸标记的Par-4(分别为TRX-Par-4和6xHis-Par-4)的SDS-PAGE。小鼠静脉注射5mg/kgTRX-Par-4或6xHis-Par-4。通过Western印迹法评估TRX-Par-4(B)和6xHis-Par-4(C)的相对血清浓度。用针对Par-4的抗体检测重组Par-4蛋白，并通过化学发光法进行观察。小鼠IgGl的轻链被用作内部加样对照。两幅图是有代表性的印迹。

图2显示了Par-4Ex的制备。(A)Par-4Ex或Fc(Ml)-Par-4的示意图。(B)用pET-22b(+)/6xhis-Par-4转化并用IPTG诱导的细菌提取物中Par-4蛋白的Western印迹分析。在免疫印迹之前，细菌提取物的可溶性部分(S)与不溶性部分(I)通过离心进行分离。(C)纯化的Par-4Ex蛋白的SDS-PAGE。可溶性Par-4Ex蛋白是通过蛋白A色谱法(蛋白A(ProteinA))分离出来的，然后再进行一个额外的离子交换色谱步骤(离子交换(Ion exchanger))以达到所需的纯度。

图3显示了重组的Par-4和Par-4Ex蛋白在E0771(鼠乳腺癌细胞系)细胞中引起的凋亡。(A)纯化后的Par-4Ex的SDS-PAGE。(B)用载剂或纯化的Par-4(6xHis-Par-4)或Par-4Ex(各100nM)处理细胞。处理后24小时，通过对半胱天冬酶3活性的免疫细胞化学(ICC)对细胞凋亡进行评分。结果代表三份样本的平均数，数值以平均值±S.D.表示，星号(*)表示经学生t检验，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图4显示了小鼠中重组Par-4和Par-4Ex蛋白的血清浓度(％)与时间的关系曲线。大肠杆菌(E.Coli)衍生的Par-4Ex(■)或6xHis-Par-4(□)通过静脉(i.v.)注射给药，剂量为5mg/kg，通过ELISA测定血清蛋白浓度。结果代表每组三份样本的平均值，以平均值±标准误差表示。

图5显示重组Par-4蛋白抑制肿瘤(E0771)的转移性生长。将细胞(1.5x10⁵个细胞)注入B6C3H小鼠的尾静脉(n＝5)。(A)给药5小时后，通过尾静脉每隔一天注射载剂或250μg纯化的Par-4(6xHis-Par-4)或Par-4Ex，持续12天(共计1500μg蛋白质/小鼠)。(B)给药5小时后，通过尾静脉每隔一天注射载剂或150或75μg纯化的Par-4Ex，持续12天(总共900和450μg的蛋白质/小鼠)。四周后，对小鼠进行安乐死，然后计数肺部结节的数量。数据以平均值±SEM表示。单星号和双星号分别表示P<0.05和P<0.01。

序列表简要描述

SEQ ID NO:1包含大鼠Par-4的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2包含人Par-4的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3包含Fc多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4包含修饰的Fc多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5包含编码修饰的大鼠Par-4(Par-4Ex)多肽的核酸序列。

SEQ ID NO:6包含修饰的大鼠Par-4(Par-4Ex)多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7包含编码修饰的人Par-4(Par-4Ex)多肽的核酸序列；以及

SEQ ID NO:8包含修饰的人Par-4(Par-4Ex)多肽的氨基酸序列。

示例性实施方式的描述

本文阐述了本申请公开的主题的一个或多个实施方式的细节。本领域的普通技术人员在研究了本文提供的信息后，将了解本文所述的实施方式以及其他实施方式的修改。本文件提供的信息，特别是所述示范性实施方式的具体细节，主要是为了让人们清楚地了解，并不应从中理解不必要的限制。如果发生冲突，将以本文的说明书，包括定义，为准。

本申请主题包括具有前列腺凋亡反应-4(Par-4)活性和增强生物半衰期的多肽分子。本申请主题还包括编码此类多肽分子的核酸分子、重组多肽分子的制备方法、包含此类多肽分子的组合物、诱导癌细胞凋亡的方法，以及治疗癌症的方法。

多肽分子

本文公开的多肽分子相对于野生型Par-4具有Par-4活性和增强的生物半衰期。在一些实施方式中，多肽分子包括融合蛋白提供的Par-4多肽部分和第二多肽分子。

在一些实施方式中，Par-4多肽部分是包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列的多肽。在一些实施方式中，Par-4多肽部分是包含相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列有修饰的多肽。在一些实施方式中，Par-4多肽部分是包含相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列有删除的多肽。在一些实施方式中，Par-4多肽部分是包含相对于SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2序列有插入的多肽。在一些实施方式中，Par-4多肽部分是包含相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列有取代的多肽。

如本文所用“修饰”是指修饰多肽的氨基酸序列或核酸分子的核苷酸序列，分别包括氨基酸和核苷酸的删除、插入和取代。修饰多肽的方法对于本领域的技术人员来说是常规的，例如通过使用重组DNA方法或直接合成。

如本文所使用的，当提及核酸分子或多肽时，“删除”是指与参考序列如野生型序列相比，从核酸分子的任一末端删除一个或多个核苷酸，或从多肽的任一末端删除一个或多个氨基酸。

如本文所使用的，当提及核酸分子或多肽时，“插入”描述了在参考序列如野生型序列中，在核酸分子中包含一个或多个额外的核苷酸，或在多肽中包含一个或多个氨基酸。因此，与野生型序列相比，含有一个或多个插入的分子在该序列的线形长度内含有一个或多个额外的残基。

如本文所用，对核酸分子和多肽的“添加”是指与参考核酸分子或多肽相比，在任一末端添加核苷酸或氨基酸。

如本文所使用的，“取代”是指用替代的核苷酸或氨基酸替换参考序列中的一个或多个核苷酸或氨基酸，而不改变分子的(用残基数量所描述的)长度。因此，分子中的一个或多个取代不会改变分子的氨基酸残基或核苷酸的数量。

当用于参考多肽时，术语“多肽片段”或“片段”指的是与参考多肽本身相比，氨基酸残基被删除的多肽。片段也可以是“功能片段”，在这种情况下，该片段保留了本文所述的参考多肽的部分或全部活性。

术语“多肽变体”是指与参考多肽不同的氨基酸序列，例如，一个或多个氨基酸的取代。参考多肽的变体也指参考多肽的片段的变体，例如，相对于参考多肽，其中有一个或多个氨基酸被取代的片段。变体也可以是“功能性变体”，其中变体保留了本文所述参考蛋白的部分或全部活性。

如本文所用，多肽的“活性”是指野生型Par-4表现出的任何活性，例如与应激反应蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)结合，在癌细胞中的凋亡活性，以及抑制肿瘤活性。经修饰多肽的活性可以是未修饰的多肽活性的任何百分比水平，包括但不限于与未修饰的多肽相比50％的活性、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％，或更多的活性。

在一些实施方式中，Par-4多肽部分包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源的序列。在一些实施方式中，多肽分子包含的Par-4多肽部分含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列的片段，所述片段在包括癌细胞选择性凋亡(SAC)核心域的区域中具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列100％的同源性。在一些实施方式中，多肽分子包含的Par-4多肽部分含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列的片段，其中相对于SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2序列1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基被删除。

序列“同一性”或“同源性”具有本领域公认的含义，两个核酸分子或多肽分子或其区域之间的序列同一性百分比可以用已发表的技术来计算。序列同一性可以沿着多核苷酸或多肽的全长来测量，也可以沿着分子的一个区域测量。虽然存在许多方法来测量两个多核苷酸或多肽之间的同一性，但术语“同一性”是本领域技术人员所熟知的(Carrillo,H.&Lipman,D.,SIAM J Applied Math 48:1073(1988))。

沿着两个多核苷酸或多肽的全长比较的序列同一性是指沿着分子的全长相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。例如，如果一个多肽A有100个氨基酸，多肽B有95个氨基酸，这些氨基酸与多肽A的1-95个氨基酸相同，那么当沿着多肽A的全长与多肽B的全长比较序列同一性时，多肽B具有95％的同一性。另外，多肽A和多肽B的序列同一性可以沿着各个多肽的区域，如20个氨基酸的类似区域，进行比较。在这种情况下，如果多肽A和B沿该区域有20个相同的氨基酸，则该区域的序列同一性为100％。例如，在一些实施方式中，本文所述多肽分子的Par-4多肽部分可以与野生型Par-4的Par-4核心域(人Par-4中的氨基酸残基145-204；以及大鼠Par-4中的137-195)有100％的一致性，该核心域被称为癌症细胞选择性凋亡(SAC)。

如上所述，除了Par-4多肽部分外，所述多肽分子还包括与Par-4多肽部分组成融合蛋白的第二多肽分子。

在一些实施方式中，第二多肽分子包括包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列的免疫球蛋白Gl可结晶片段(Fc)的多肽。在一些实施方式中，第二多肽分子是包含相对于SEQID NO:3或SEQ ID NO:4序列有修饰的多肽。在一些实施方式中，第二多肽分子是包含相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列有删除的多肽。在一些实施方式中，第二多肽分子是包含相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列有插入的多肽。在一些实施方式中，第二多肽分子是包含相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列有取代的多肽。

在一些实施方式中，第二多肽分子包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列。在一些实施方式中，第二多肽分子包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列的片段，其中相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基被删除。在一些实施方式中，第二多肽分子包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的变体，其中多肽的半胱氨酸(Cysteine)残基相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列已被突变。在一些实施方式中，第二多肽分子包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4片段的变体，其中多肽的半胱氨酸残基相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列已被突变，并且其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列已被删除。在一些实施方式中，第二多肽分子包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的变体，所述变体包含C6S、C12S和C15S的取代。在一些实施方式中，第二多肽分子包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4片段的变体，所述变体包含C6S、C12S和C15S的取代，并且其中相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基被删除。

在一些实施方式中，该多肽分子包含本申请公开的第二多肽分子的实施方式，所述第二多肽分子定位在本申请公开的Par-4多肽部分实施方式的N末端附近。

术语“氨基末端”或“N末端”和“羧基末端”或“C末端”在此用于表示多肽内的位置。在上下文允许的情况下，这些术语是针对多肽的特定序列或部分表示接近或相对的位置。例如，在多肽内位于参考序列的羧基末端的某一序列是位于参考序列的羧基末端的近端，但不是必需在整个多肽的羧基末端。

在一些实施方式中，本申请公开的多肽分子包括SEQ ID NO:6的序列。在一些实施方式中，本申请公开的多肽分子包括SEQ ID NO:8的序列。

本申请公开的主题还包括在癌细胞中诱导细胞凋亡的方法，所述方法涉及使癌细胞与本申请公开的多肽分子接触。在一些实施方式中，所述癌细胞是转移性的。

本申请公开的主题还包括治疗受试者癌症的方法，所述方法涉及向需要的受试者给与本申请公开的多肽分子。

如本文所用，术语“治疗”或“处理”涉及对癌症的任何治疗，包括但不限于减少癌症严重性的预防治疗，以及治疗性处理。在这方面，可以理解的是，治疗可以涉及治愈癌症，或基本治愈癌症，或改善癌症的至少一个症状，或降低癌症的严重程度。

如本文所用，术语“受试者”指的是给药的对象。本申请公开的方法的对象可以是脊椎动物，例如哺乳动物。本申请公开的方法的对象可以是人或非人。因此，根据本申请公开的主题，提供了兽医的治疗用途。

核酸分子

本申请公开的主题进一步包括核酸分子。本申请公开的核酸分子包括编码上述多肽分子的核苷酸序列或其互补序列。在这方面，核酸分子编码的多肽分子相对于野生型Par-4来说，具有Par-4的活性和增强的生物半衰期。核酸分子包括编码本申请公开的Par-4多肽的序列，所述序列与编码本申请公开的第二多肽分子的序列可操作地连接。在一些实施方式中，核酸分子编码的多肽分子包括融合蛋白提供的Par-4多肽部分和第二多肽分子。

术语“互补”是指两个核苷酸序列(一个序列和其互补序列)，所述两个核苷酸序列包括反平行的核苷酸序列，在反平行的核苷酸序列中互补的碱基残基之间形成氢键后能够相互配对。正如本领域所熟知的，两个互补链的核酸序列在各自的从5'到3'的方向观察时是互相反向互补。

如本文所使用的，提及核酸分子序列的“可操作地连接”，是指核酸分子序列在功能上彼此相关。例如，编码第一多肽的第一核酸分子可以与编码第二多肽的第二核酸分子可操作地连接，由此核酸分子可以转录和翻译以表达功能性融合蛋白。

在一些实施方式中，核酸分子包括编码包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列的多肽的序列。在一些实施方式中，核酸分子包括编码包含相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列有修饰的多肽的序列。在一些实施方式中，核酸分子包括编码包含相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列有删除的多肽的序列。在一些实施方式中，核酸分子包括编码包含相对于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2序列有插入的多肽的序列。在一些实施方式中，核酸分子包括编码包含相对于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2序列有取代的多肽的序列。

在一些实施方式中，核酸分子包括编码包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列片段的多肽的序列。在一些实施方式中，核酸分子包括编码包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列变体的多肽的序列。

在一些实施方式中，核酸分子包括编码第二多肽分子的序列，所述第二多肽分子包括包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列的免疫球蛋白Gl可结晶片段(Fc)的多肽。在一些实施方式中，核酸分子包括编码包含相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列有修饰的多肽的序列。在一些实施方式中，核酸分子包括编码包含相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列有删除的多肽的序列。在一些实施方式中，核酸分子包括编码包含相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列有插入的多肽的序列。在一些实施方式中，核酸分子包括编码包含相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列有取代的多肽的序列。

在一些实施方式中，核酸分子包括编码SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列的片段的序列。在一些实施方式中，核酸分子包括编码SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列的变体的序列。

在一些实施方式中，核酸分子包括编码与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％同源性的序列。在一些实施方式中，核酸分子包括编码SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列的片段的序列，其中相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基被删除。在一些实施方式中，核酸分子包括编码SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的变体的序列，其中多肽的半胱氨酸残基相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列已被突变。在一些实施方式中，核酸分子包括编码SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的片段的变体的序列，其中多肽的半胱氨酸残基相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列已被突变，并且其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列已被删除。在一些实施方式中，核酸分子包括编码SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的变体的序列，所述变体包括C6S、C12S和C15S的取代。在一些实施方式中，核酸分子包括编码SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4片段的变体的序列，所述变体包括C6S、C12S和C15S的取代，并且其中相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基被删除。

在一些实施方式中，所述核酸分子包括编码本申请公开的第二多肽分子的实施方式的序列，所述第二多肽分子定位在编码本申请公开的Par-4多肽部分实施方式的N末端近端。

在一些实施方式中，本申请公开的核酸分子包括SEQ ID NO:5的序列，或其互补序列。在一些实施方式中，本申请公开的核酸分子包括SEQ ID NO:7的序列，或其互补序列。

本申请公开的主题进一步包括含有本申请公开的核酸分子的载体。本申请公开的主题进一步包括含有本申请公开核酸分子的载体的细胞。本申请公开的主题进一步包括使用本申请公开的核酸分子制备本申请公开的多肽分子的方法。

如本文所用，“载体”是可复制的核酸分子，当该载体被转化到适当的宿主细胞中时，可从核酸分子中表达一种或多种异源蛋白。“宿主细胞”是用于接收、维持、繁殖和扩增载体的细胞。宿主细胞也可用于表达载体所编码的多肽。

组合物

本申请公开的主题进一步包括含有本申请公开的多肽分子的组合物，例如药物组合物，所述多肽分子相对于野生型Par-4而言，具有Par-4活性和增强的生物半衰期。组合物可包括本领域的普通技术人员知晓的药学上可接受的运载体，并提供多肽分子的稳定性。

组合物包含融合蛋白提供的含有Par-4多肽部分和第二多肽分子的多肽分子。

在一些实施方式中，该组合物包括多肽分子，其中Par-4多肽部分是包含SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2序列的多肽。在一些实施方式中，该组合物包括多肽分子，其中Par-4多肽部分是包含相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列有修饰的多肽。在一些实施方式中，该组合物包括多肽分子，其中Par-4多肽部分是包含相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列有删除的多肽。在一些实施方式中，该组合物包括多肽分子，其中Par-4多肽部分是包含相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列有插入的多肽。在一些实施方式中，该组合物包括多肽分子，其中Par-4多肽部分是包含相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列有取代的多肽。

在一些实施方式中，该组合物包括多肽分子，其中Par-4多肽组分是包含SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2序列的片段的多肽。在一些实施方式中，该组合物包括多肽分子，其中Par-4多肽组分是包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列的变体的多肽。

在一些实施方式中，组合物包括多肽分子，其中Par-4多肽部分包括与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列。在一些实施方式中，该组合物包括多肽分子，其中该多肽分子包括含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列的片段的Par-4多肽部分，所述片段与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列在包括癌细胞选择性凋亡(SAC)核心域的区域内具有100％同源性。在一些实施方式中，该组合物包括多肽分子，其中该多肽分子包括含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列的片段的Par-4多肽部分，其中相对于SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的序列，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基被删除。

如上所述，除Par-4多肽部分外，本申请公开的组合物的多肽分子包括第二多肽分子，与Par-4多肽部分形成融合蛋白。

在一些实施方式中，组合物包括多肽分子，其中第二多肽分子包括含有SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4序列的免疫球蛋白Gl可结晶片段(Fc)的多肽。在一些实施方式中，组合物包括多肽分子，其中第二多肽分子是包括相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列有修饰的多肽。在一些实施方式中，该组合物包括多肽分子，其中第二多肽分子是包括相对于SEQID NO:3或SEQ ID NO:4序列有删除的多肽。在一些实施方式中，该组合物包括一个多肽分子，其中第二多肽分子是包括相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列有插入的多肽。在一些实施方式中，该组合物包括多肽分子，其中第二多肽分子是包括相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列有取代的多肽。

在一些实施方式中，该组合物包括多肽分子，其中第二多肽分子是SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列的片段。在一些实施方式中，该组合物包括多肽分子，其中第二多肽分子是SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列的变体。

在一些实施方式中，组合物包括多肽分子，其中第二多肽分子包括与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列。在一些实施方式中，该组合物包括多肽分子，其中第二多肽分子包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列的片段，其中相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基已经被删除。在一些实施方式中，该组合物包括多肽分子，其中第二多肽分子包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的变体，其中多肽的半胱氨酸残基相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列已被突变。在一些实施方式中，该组合物包括多肽分子，其中第二多肽分子包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4片段的变体，其中多肽的半胱氨酸残基相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列已被突变，并且其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列已被删除。在一些实施方式中，该组合物包括多肽分子，其中第二多肽分子包括含有C6S、C12S和C15S取代的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的变体。在一些实施方式中，该组合物包括多肽分子，其中第二多肽分子包括含有C6S、C12S和C15S取代的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的变体，并且其中相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基被删除。

在一些实施方式中，组合物包括本申请公开的多肽分子，其中本申请公开的第二多肽分子位于本申请公开的Par-4多肽部分的实施方式的N末端近端。

在一些实施方式中，组合物包括多肽分子，其中本申请公开的多肽分子包括SEQID NO:6的序列。在一些实施方式中，本申请公开的多肽分子包括SEQ ID NO:8的序列。

本申请公开的主题还包括在癌细胞中诱导细胞凋亡的方法，所述方法涉及将癌细胞与本申请公开的组合物接触。在一些实施方式中，所述癌细胞是转移性的。

本申请公开的主题还包括治疗受试者癌症的方法，所述方法涉及向需要的受试者给与本申请公开的组合物。

虽然本申请使用的术语被认为是本领域的普通技术人员所能理解的，但为了便于解释本申请公开的主题，我们提出了某些定义。

除非另有定义，本申请使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

除非另有说明，本申请整个公开内容中提到的所有专利、专利申请、已发表的申请和出版物、GenBank序列、数据库、网站和其他公开的材料都通过引用全部纳入本申请。

在提及URL或其他此类标识符或地址时，可以理解的是，此类标识符可以改变，互联网上的特定信息可以有变化，但通过搜索互联网可以找到同等信息。对信息的引用证明了此类信息的可用性和公开传播。

如本文所使用的，任何保护性基团、氨基酸和其他化合物的缩写，除非另有说明，否则符合其常用的、公认的缩写，或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(见Biochem.(1972)11(9):1726-1732)。

尽管与本文所述的方法、装置和材料相似或等同的任何方法、装置和材料可用于本申请公开的主题的实施或测试，但本文描述了具有代表性的方法、装置和材料。

在某些情况下，本申请公开的核苷酸和多肽被包括在公开可用的数据库中，例如

和SWISSPROT。包括序列在内的信息以及与此类公开数据库中包括的此类核苷酸和多肽有关的其他信息都明确地通过引用纳入本申请。除非另有说明或显而易见，对这些可公开可用的数据库的引用是指截至本申请提交日期的数据库的最新版本。

根据长期以来的专利法惯例，术语“一个”、“一种”和“该”在本申请(包括权利要求书)中使用时指的是“一个或多个”。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括多个此类细胞，如此等等。

除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的表达成分数量、特性如反应条件等的所有数字都应理解为在所有情况下被术语“约”所修饰。因此，除非有相反的指示，本说明书和权利要求书中规定的数字参数是近似值，可以根据本申请公开的主题所寻求获得的理想特性而变化。

如本文所使用的，当提及质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的数值或数量时，术语“大约”意指包括从特定的数量在一些实施方式中具有±20％的变化、在一些实施方式中具有±10％的变化、在一些实施方式中具有±5％的变化、在一些实施方式中具有±1％的变化、在一些实施方式中具有±0.5％的变化，在一些实施方式中具有±0.1％的变化，在一些实施方式中具有±0.01％的变化，在一些实施方式中具有±0.001％的变化，因为这种变化适合于实施所公开的方法。

如本文所使用的，范围可以表示为从一个“大约的”特定值，和/或到另一个“大约的”特定值。还应理解的是，本申请公开的一些数值，并且除了数值本身之外，各个数值在本申请中也被披露为该特定数值的“大约的”数值。例如，如果公开数值“10”，那么也公开了“约10”。也可以理解为，也公开了两个特定单位之间的各个单位。例如，如果公开10和15，那么也公开了11、12、13和14。

本申请公开的主题通过下列具体但非限制性的实施例进一步说明。以下实施例可包括数据汇编，所述数据是在与本发明相关的开发和实验过程中在不同时间收集的数据的代表。

实施例

Par-4Ex蛋白设计。设计理想的Par-4Ex作为候选治疗药物必须考虑到一些问题。例如，理想的Par-4Ex的分子量必须明显大于Par-4的分子量(～40kDa)。再比如，扩展蛋白的额外氨基酸残基可能影响与GRP78的结合，从而使扩展蛋白(Par-4Ex)对癌细胞失去活性。考虑到这样的问题，并考虑到SAC结构域更接近C末端，本发明人在Par-4的N末端增加了额外的氨基酸残基，以进行这些实施例中所描述的研究。

此外，为了延长Par-4的生物半衰期，希望避免扩展蛋白(Par-4Ex)对人类可能产生的免疫原性。为此，本发明人从人类蛋白片段中选择了额外的氨基酸残基，但没有人类蛋白的不必要的生物功能。第一个人类蛋白片段的候选者是人类免疫球蛋白G1(IgGl)的第一个233个氨基酸残基，被称为可结晶片段(Fc)。事实上，尽管最近的研究确实显示Fc融合并没有改善在大肠杆菌中表达的候选蛋白质药物的生物半衰期(27)，但是与人IgGl的Fc区(IgGlFc)的蛋白质融合是延长蛋白质治疗剂的生物半衰期最常用的策略之一(25，26)。

野生型IgGlFc将通过分子间二硫键形成二聚体。因此，Par-4Ex的二聚体可能阻断Par-4和GRP78之间的分子间结合界面，因此有可能失去Par-4与GRP78的结合亲和力。考虑到这个问题，Fc区的三个半胱氨酸残基(#6、#12和#15)都被改变为丝氨酸残基，以避免Par-4Ex可能的二聚化。为方便起见，突变体Fc被称为Fc(Ml)，指的是本研究中测试的Fc的第一个突变体(突变体1或Ml)。因此，本研究中测试的第一个Par-4Ex蛋白也可表示为Fc(Ml)-Par-4。

用于Par-4Ex融合蛋白的Par-4多肽序列和用于Par-4Ex融合蛋白的免疫球蛋白G1可结晶片段(Fc)的多肽序列在序列表中列出。SEQ ID.NO5-8显示了保留与GRP78结合的有益功能的核苷酸和蛋白质的示例性序列。

6xHis-Par-4和Par-4Ex的克隆、表达和纯化。TRX-Par-4、6xHis-Par-4和Par-4Ex的细菌表达构建体是通过将各个基因亚克隆到pET-22b(+)载体中产生的。如Burikhanov等人以前的报告(2)中所述，TRX-Par-4的构建体是通过在载体pThio-His(加利福尼亚州卡尔斯巴德的Invitrogen公司)中亚克隆大鼠Par-4序列与硫氧还蛋白cDNA(TRX)表达框来制备的。用各个构建体转化大肠杆菌BL21(DE3)Star^TM细胞(马萨诸塞州沃尔瑟姆的ThermoFisher Scientific公司)并用0.5mM IPTG(密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司)诱导。在IPTG诱导后10小时收获细胞。然后用Tris缓冲盐水(25mM Tris碱，pH7.4，138mM NaCl和2.7mM KC1)清洗细胞，然后在4℃下以2,000x g离心5min。通过将细胞颗粒重新悬浮在25mM Tris-Cl，pH7.4中制备细胞匀浆并进行超声处理。为了去除细胞碎片或未破碎的细胞，将全部细胞匀浆在10,000x g下离心20分钟。

为了纯化TRX-Par-4或6xHis-Par-4蛋白，将产生的上清液加载到HisPur^TM Cobalt树脂(Resin)(Thermo Fisher Scientific公司)上，所述树脂已用洗涤缓冲液(25mM Tris,pH 7.4,500mM NaCl,0.05％Triton X-100和50mM咪唑)预平衡。在用洗涤缓冲液大量洗涤后，通过在150mM NaCl条件下用咪唑逐步梯度洗脱液洗脱结合的His标记的蛋白质。

为了纯化Par-4Ex蛋白，将所得上清液加载到用20mM Tris-HCl(pH 7.4)预平衡的rmp蛋白A琼脂糖快速柱(Protein A Sepharose Fast Flow)(GE Healthcare生命科学公司)。然后，将混合物装入柱子，用5个柱体积(CV)的20mM Tris-HCl(pH 7.4)(含200mMNaCl)进行洗涤，直到达到OD₂₈₀<0.02。然后，用含有200mM NaCl的50mM乙酸钠(pH4.0)洗脱蛋白质。为了进行缓冲液交换，在20mM Tris-HCl(pH 7.4)中使用Millipore离心过滤单元(Centrifugal Filter Units)透析洗脱液。然后将蛋白质溶液加载到用20mM Tris-HCl(pH7.4)预平衡的Q琼脂糖快速柱(Q-Sepharose Fast Flow)(宾夕法尼亚州匹兹堡GEHealthcare生命科学公司)，进行第二轮色谱分离。Par-4Ex蛋白以NaCl(100-800mM)的逐步梯度从Q-Sepharose柱上洗脱。为了进行缓冲液交换，在储存缓冲液(50mM Hepes，20％山梨醇，1M甘氨酸，pH7.4)使用Millipore离心过滤单元透析洗脱液。整个纯化过程是在8℃的冷室中进行的，纯化的蛋白质储存在-80℃直到活性测试。它们的纯度通过SDS-PAGE在4-12％的NuPAGE Novex Bis-Tris凝胶(Life Technologies公司)上进行分析。

Western印迹法。用pET-22b(+)/6xhis-Par-4或pET-22b(+)/Par-4Ex转化的细菌提取物中的重组蛋白通过Western印迹，使用从Santa Cruz Biotechnology公司(得克萨斯州达拉斯)获得的山羊抗大鼠Par-4 IgG进行分析(根据制造商说明书中所述1:3000稀释)。预吸附的HRP结合的抗山羊IgG(Santa Cruz Biotechnology公司)以1:4000的比例作为第二抗体，最后使用Pierce Biotechnology公司(马萨诸塞州沃尔瑟姆)的SuperSignal WestDura延长时间底物(Extended Duration Substrate)通过化学发光检测Par-4蛋白。

免疫细胞化学和细胞凋亡分析。把100nM纯化的Par-4Ex或6xhis-Par-4与载玻片上的细胞接触。处理24小时后，使用指定的抗半胱天冬酶3IgG对细胞进行免疫细胞化学(ICC)分析，然后用与Alexa Fluor-488(绿色荧光)或Alexa Fluor-594(红色荧光)(Molecular Probes公司)连接的适当第二抗体染色。通过TUNEL检测、半胱天冬酶3免疫染色或4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色来确定凋亡的细胞核。如前所述，共进行了三个独立的实验，在荧光显微镜下对各个实验中大约300个细胞的凋亡进行评分。(28)

小鼠中的药代动力学研究。通过尾静脉向小鼠注射各种重组蛋白或生理盐水，剂量为5mg/kg体重。在静脉注射(i.v.)蛋白后的不同时间点，从隐静脉(saphenous vein)收集血样(每个15-30μL)到经过肝素处理的毛细管中。通过离心(15分钟，5,000x g)将血浆从收集的血液中分离出来。200ng血浆蛋白在100μL0.05M PBS,pH 7.4中,被固定在96孔平底EIA板(Corning公司)中，在4℃过夜(或37℃2小时)。将液体从板中倒出，其余的放在纸巾上沥干。用阻断缓冲液(0.05M PBS，pH7.4，含1mg/ml酪蛋白)(250μL/孔)在室温(RT)下阻断涂布的孔30分钟。用洗涤缓冲液(0.05M PBS，pH 7.4)(250μL/孔)洗涤两次后，在每个孔中加入多个浓度范围内的阻断缓冲液中的100μL山羊抗大鼠Par-4 IgG(Santa CruzBiotechnology公司)。然后平板使用粘贴塑料覆盖，并且在室温下持续震荡孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤三次后，预先吸附的HRP结合的第二抗体(抗山羊IgG-HRP)(70μL/孔)，用阻断缓冲液以1:30,000的比例稀释，加入每个孔中，在室温下振荡器上孵育1小时。然后用洗涤缓冲液(250μL/孔)洗三次孔，再将250μLTMB底物加入孔中。将ELISA板保持在黑暗中，直到出现所需的颜色。用100μL的0.5M HCl停止反应。使用微孔板阅读器在450nm处测量吸光度(＝显示的蓝色)。所有的测量都是一式三份或一式四份。用GraphPad Prism 5.01软件将获得的PK数据(与时间依赖的酶浓度)([E]_t)拟合为一个双指数方程(29)：

所述方程同时考虑了动物体内蛋白质的分布过程(快速阶段，与k₁相关)和消除过程(缓慢阶段，与k₂有关)。与融合蛋白的消除率常数k₂相关的t_1/2被称为生物t_1/2或消除t_1/2。

乳腺癌的肺转移。将E0771细胞(1.5x10⁵个细胞)注射到免疫缺陷的B6C3H小鼠(n＝5)的尾静脉。给药后5小时，在12天内每隔一天通过尾静脉静脉(i.v.)注射6xHis-Par-4或Par-4Ex，剂量为每只小鼠每次250或150或75μg/次注射(12天内共注射1500或900或450μg蛋白/只小鼠)。四周后，对小鼠进行安乐死，并对肺部进行拍照。然后对肺部结节的数量进行计数。

结果。重组Par-4的药代动力学。在Zhao等人以前的报告中(15)证明了在具有免疫能力的C57/BL6小鼠中静脉给与重组TRX-Par-4或TRX-SAC蛋白(在大肠杆菌中制备)可明显抑制小鼠中LLC1(Lewis肺癌1系)细胞的肺转移，(15)这意味着细胞外Par-4和SAC蛋白都能抑制体内的转移性肿瘤生长。硫氧还蛋白(TRX)融合蛋白是经常使用的工具，当哺乳动物蛋白在大肠杆菌中异源表达时，可增加其溶解度和表达量。(30)然而，尽管对各种癌细胞进行了大量的体外和体内抗肿瘤活性试验，但TRX-Par-4和TRX-SAC蛋白的药代动力学特征还没有确定。(2,15,17)因此，要确定TRX-Par-4或未融合的Par-4蛋白能在小鼠的循环系统中停留多长时间。为了解决这个问题，使用细菌表达系统制备了与6xHis标签或TRX的C末端融合的Par-4蛋白(分别为TRX-Par-4和6xHis-Par-4；见图1A)，然后将每个纯化的蛋白以5mg/kg的剂量通过尾静脉静脉注射到小鼠体内。在蛋白质注射后的不同时间点收集血样，用抗Par-4抗体进行Western印迹分析。结果显示，TRX-Par-4(～50kDa)和6xHis-Par-4(～38kDa)蛋白都从循环系统中被迅速移除(图1B和C)。TRX-Par-4在体内的浓度下降速度比6xHis-Par-4慢，前者在静脉注射后至多到90分钟内都能观察到，而6xHis-Par-4至多在30分钟时检测到的信号就非常低了。这些发现表明，由于Par-4蛋白的循环半衰期短，其体内的抗肿瘤活性可能受到限制。

在大肠杆菌中表达的Par-4和Par-4Ex蛋白同样诱导了癌细胞的凋亡。在制备TRX-Par-4和未融合的Par-4蛋白的同时，还使用大肠杆菌表达系统制备融合蛋白Par-4Ex，即Fc(Ml)-Par-4(～70kDa)，以获得足够的蛋白量用于该蛋白的体内特征研究。大肠杆菌衍生的可溶性Par-4Ex蛋白的纯化是用蛋白A亲和层析法进行的，然后进行额外的离子交换层析步骤以获得以下体内特征研究所需的纯度(图2B和C)。

在对纯化的重组Par-4和Par-4Ex蛋白进行体内测试之前，需要确定Par-4Ex是否保留Par-4独特的促凋亡活性，因为融合到Par-4的N末端的Fc(Ml)可能阻止或干扰Par-4和GRP78之间的蛋白质-蛋白质相互作用。为了解决这个关键问题，用100nM的6xHis-Par-4或Par-4Ex蛋白处理E0771(鼠乳腺癌细胞系)细胞，然后孵化24小时。用储存缓冲液(50mMHepes，20％山梨醇，1M甘氨酸，pH7.4)作为载剂对照。据观察，在特定的处理条件下，Par-4Ex和6xHis-Par-4蛋白在E0771细胞中诱导了类似水平的细胞凋亡(图3)，表明Par-4蛋白的抗肿瘤活性并没有因其N末端融合的Fc(Ml)而改变。这种对Par-4蛋白本身抗肿瘤活性的观察与Zhao等人(15)使用TRX-Par-4的结果一致。研究进一步证明，在基于细胞的抗肿瘤活性试验中，Par-4Ex与Par-4本身一样具有活性。

重组蛋白的生物半衰期。为了研究Par-4Ex与Par-4相比是否真的具有较长的生物半衰期，在小鼠中进行了药代动力学(PK)研究。基于对受试小鼠静脉注射每种蛋白质获得体内数据。产生的PK数据在图4中描述。结果显示，与6xHis-Par-4蛋白的生物半衰期(～3小时)相比，Par-4Ex的生物半衰期要长得多(～20.3小时)。

抑制转移性肿瘤生长的体内效力。为了研究由于生物半衰期延长而导致的较长时间的接触是否能提高Par-4的体内抗肿瘤活性，评估了Par-4Ex和6xHis-Par-4蛋白在具有免疫能力的C57/BL6小鼠中抑制E0771乳腺癌细胞肺转移的效率。通过尾静脉注射细胞(1.5x10⁵个细胞)，然后每隔一天静脉给与大肠杆菌衍生的Par-4Ex(250、150或75μg)或6xHis-Par-4(250μg)，连续12天(12天内每只小鼠共1500或900或450μg)。据观察，与载剂处理的对照相比，Par-4Ex和6xHis-Par-4蛋白都能显著抑制体内转移性肿瘤的生长，但在特定的处理条件下，两个蛋白处理组之间没有统计学差异(图5A)。然而，考虑到Par-4Ex蛋白的分子量(～70kDa)是6xHis-Par-4蛋白(～38kDa)的约1.8倍大，处理小鼠的重组Par-4蛋白的摩尔浓度是不相同的。这可能表明，Par-4Ex在抑制体内转移性肿瘤生长方面确实比6xHis-Par-4更有效，但在高剂量下它们的效力差异可能变得不那么明显。为了更恰当地解决这个问题，确定Par-4Ex的体内抗肿瘤活性是否会随着剂量的减少而减弱。根据获得的数据(图5B)，减少70％剂量的Par-4Ex蛋白(75μg/注射)也会对E0771乳腺癌细胞诱导的小鼠肺部转移产生实质性的抑制。相比之下，以前的研究(15)使用相同的动物模型考察了各种剂量Par-4(TRX-Par-4)的体内活性，发现250μg/注射是最小的有效剂量；在低于250μg/注射的任何测试剂量下，Par-4注射都不能显著减少E0771乳腺癌细胞的肺转移。综合上述情况，Par-4Ex在抑制转移性肿瘤生长方面确实比Par-4有提高的体内效力。

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用而纳入本申请，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独指明为通过引用而纳入一样，包括以下列表中列出的引用：

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可以理解的是，在不偏离本申请公开的主题范围的情况下，可以改变本申请公开的主题的各种细节。此外，上述描述仅用于说明的目的，而不是限制的目的。

序列表

<110> 肯塔基大学研究基金会

<120> 改良的前列腺凋亡反应-4（PAR-4）多肽及其生产和使用方法

<130> 13177N/2354US

<150> US 62/832,155

<151> 2019-04-10

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 332

<212> PRT

<213> 屋顶鼠(Rattus rattus)

<400> 1

Met Ala Thr Gly Gly Tyr Arg Ser Ser Gly Ser Thr Thr Asp Phe Leu

1 5 10 15

Glu Glu Trp Lys Ala Lys Arg Glu Lys Met Arg Ala Lys Gln Asn Pro

20 25 30

Val Gly Pro Gly Ser Ser Gly Gly Asp Pro Ala Ala Lys Ser Pro Ala

35 40 45

Gly Pro Leu Ala Gln Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Glu Leu Asn His

50 55 60

Gly Pro Ala Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Gly Pro Gly Ala Leu

65 70 75 80

Asn Cys Ala His Gly Ser Ser Ala Leu Pro Arg Gly Ala Pro Gly Ser

85 90 95

Arg Arg Pro Glu Asp Glu Cys Pro Ile Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala

100 105 110

Pro Ala Ser Arg Gly Asp Glu Glu Glu Pro Asp Ser Ala Pro Glu Lys

115 120 125

Gly Arg Ser Ser Gly Pro Ser Ala Arg Lys Gly Lys Gly Gln Ile Glu

130 135 140

Lys Arg Lys Leu Arg Glu Lys Arg Arg Ser Thr Gly Val Val Asn Ile

145 150 155 160

Pro Ala Ala Glu Cys Leu Asp Glu Tyr Glu Asp Asp Glu Ala Gly Gln

165 170 175

Lys Glu Arg Lys Arg Glu Asp Ala Ile Thr Gln Gln Asn Thr Ile Gln

180 185 190

Asn Glu Ala Ala Ser Leu Pro Asp Pro Gly Thr Ser Tyr Leu Pro Gln

195 200 205

Asp Pro Ser Arg Thr Val Pro Gly Arg Tyr Lys Ser Thr Ile Ser Ala

210 215 220

Pro Glu Glu Glu Ile Leu Asn Arg Tyr Pro Arg Thr Asp Arg Ser Gly

225 230 235 240

Phe Ser Arg His Asn Arg Asp Thr Ser Ala Pro Ala Asn Phe Ala Ser

245 250 255

Ser Ser Thr Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asp Leu Glu Lys Glu Val Leu

260 265 270

Arg Glu Arg Gln Glu Asn Leu Arg Leu Thr Arg Leu Met Gln Asp Lys

275 280 285

Glu Glu Met Ile Gly Lys Leu Lys Glu Glu Ile Asp Leu Leu Asn Arg

290 295 300

Asp Leu Asp Asp Met Glu Asp Glu Asn Glu Gln Leu Lys Gln Glu Asn

305 310 315 320

Lys Thr Leu Leu Lys Val Val Gly Gln Leu Thr Arg

325 330

<210> 2

<211> 339

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Ala Thr Gly Gly Tyr Arg Thr Ser Ser Gly Leu Gly Gly Ser Thr Thr

1 5 10 15

Asp Phe Leu Glu Glu Trp Lys Ala Lys Arg Glu Lys Met Arg Ala Lys

20 25 30

Gln Asn Pro Pro Gly Pro Ala Pro Pro Gly Gly Gly Ser Ser Asp Ala

35 40 45

Ala Gly Lys Pro Pro Ala Gly Ala Leu Gly Thr Pro Ala Ala Ala Ala

50 55 60

Ala Asn Glu Leu Asn Asn Asn Leu Pro Gly Gly Ala Pro Ala Ala Pro

65 70 75 80

Ala Val Pro Gly Pro Gly Gly Val Asn Cys Ala Val Gly Ser Ala Met

85 90 95

Leu Thr Arg Ala Ala Pro Gly Pro Arg Arg Ser Glu Asp Glu Pro Pro

100 105 110

Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ala Pro Pro Pro Gln Arg Asp Glu Glu Glu

115 120 125

Pro Asp Gly Val Pro Glu Lys Gly Lys Ser Ser Gly Pro Ser Ala Arg

130 135 140

Lys Gly Lys Gly Gln Ile Glu Lys Arg Lys Leu Arg Glu Lys Arg Arg

145 150 155 160

Ser Thr Gly Val Val Asn Ile Pro Ala Ala Glu Cys Leu Asp Glu Tyr

165 170 175

Glu Asp Asp Glu Ala Gly Gln Lys Glu Arg Lys Arg Glu Asp Ala Ile

180 185 190

Thr Gln Gln Asn Thr Ile Gln Asn Glu Ala Val Asn Leu Leu Asp Pro

195 200 205

Gly Ser Ser Tyr Leu Leu Gln Glu Pro Pro Arg Thr Val Ser Gly Arg

210 215 220

Tyr Lys Ser Thr Thr Ser Val Ser Glu Glu Asp Val Ser Ser Arg Tyr

225 230 235 240

Ser Arg Thr Asp Arg Ser Gly Phe Pro Arg Tyr Asn Arg Asp Ala Asn

245 250 255

Val Ser Gly Thr Leu Val Ser Ser Ser Thr Leu Glu Lys Lys Ile Glu

260 265 270

Asp Leu Glu Lys Glu Val Val Arg Glu Arg Gln Glu Asn Leu Arg Leu

275 280 285

Val Arg Leu Met Gln Asp Lys Glu Glu Met Ile Gly Lys Leu Lys Glu

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Glu Ile Asp Leu Leu Asn Arg Asp Leu Asp Asp Ile Glu Asp Glu Asn

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Glu Gln Leu Lys Gln Glu Asn Lys Thr Leu Leu Lys Val Val Gly Gln

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Leu Thr Arg

<210> 3

<211> 234

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Met Gln Glu Pro Lys Cys Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

50 55 60

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

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Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

165 170 175

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

180 185 190

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

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Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

210 215 220

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

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<210> 4

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser

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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

50 55 60

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

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Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

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His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

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Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

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<211> 1701

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

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Arg Ser Ser Gly Ser Thr Thr Asp Phe Leu Glu Glu Trp Lys Ala Lys

245 250 255

Arg Glu Lys Met Arg Ala Lys Gln Asn Pro Val Gly Pro Gly Ser Ser

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275 280 285

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565

<210> 7

<211> 1725

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgcaggagc ctaagtcctc cgacaaaact cacacatccc caccgtcccc agcacctgaa 60

ctcctggggg gatcctcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 120

tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 180

aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 240

gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 300

ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 360

aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 420

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cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 540

acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 600

aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcacga ggctctgcac 660

aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aaatggcgac cggtggctac 720

cggaccagca gcggcctcgg cggcagcacc acagacttcc tggaggagtg gaaggcgaaa 780

cgcgagaaga tgcgcgccaa gcagaacccc ccgggcccgg cccccccggg agggggcagc 840

agcgacgccg ctgggaagcc ccccgcgggg gctctgggca ccccggcggc cgccgctgcc 900

aacgagctca acaacaacct cccgggcggc gcgccggccg cacctgccgt ccccggtccc 960

gggggcgtga actgcgcggt cggctccgcc atgctgacgc gggcggcccc cggcccgcgg 1020

cggtcggagg acgagccccc agccgcctct gcctcggctg caccgccgcc ccagcgtgac 1080

gaggaggagc cggacggcgt cccagagaag ggcaagagct cgggccccag tgccaggaaa 1140

ggcaaggggc agatcgagaa gaggaagctg cgggagaagc ggcgctccac cggcgtggtc 1200

aacatccctg ccgcagagtg cttagatgag tacgaagatg atgaagcagg gcagaaagag 1260

cggaaacgag aagatgcaat tacacaacag aacactattc agaatgaagc tgtaaactta 1320

ctagatccag gcagttccta tctgctacag gagccaccta gaacagtttc aggcagatat 1380

aaaagcacaa ccagtgtctc tgaagaagat gtctcaagta gatattctcg aacagataga 1440

agtgggttcc ctagatataa cagggatgca aatgtttcag gtactctggt ttcaagtagc 1500

acactggaaa agaaaattga agatcttgaa aaggaagtag taagagaaag acaagaaaac 1560

ctaagacttg tgagactgat gcaagataaa gaggaaatga ttggaaaact caaagaagaa 1620

attgatttat taaatagaga cctagatgac atagaagatg aaaatgaaca gctaaagcag 1680

gaaaataaaa ctcttttgaa agttgtgggt cagctgacca ggtag 1725

<210> 8

<211> 574

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser

1 5 10 15

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

20 25 30

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

35 40 45

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

50 55 60

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

65 70 75 80

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

85 90 95

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

100 105 110

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

115 120 125

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

130 135 140

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

165 170 175

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

180 185 190

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

195 200 205

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

210 215 220

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Met Ala Thr Gly Gly Tyr

225 230 235 240

Arg Thr Ser Ser Gly Leu Gly Gly Ser Thr Thr Asp Phe Leu Glu Glu

245 250 255

Trp Lys Ala Lys Arg Glu Lys Met Arg Ala Lys Gln Asn Pro Pro Gly

260 265 270

Pro Ala Pro Pro Gly Gly Gly Ser Ser Asp Ala Ala Gly Lys Pro Pro

275 280 285

Ala Gly Ala Leu Gly Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala Asn Glu Leu Asn

290 295 300

Asn Asn Leu Pro Gly Gly Ala Pro Ala Ala Pro Ala Val Pro Gly Pro

305 310 315 320

Gly Gly Val Asn Cys Ala Val Gly Ser Ala Met Leu Thr Arg Ala Ala

325 330 335

Pro Gly Pro Arg Arg Ser Glu Asp Glu Pro Pro Ala Ala Ser Ala Ser

340 345 350

Ala Ala Pro Pro Pro Gln Arg Asp Glu Glu Glu Pro Asp Gly Val Pro

355 360 365

Glu Lys Gly Lys Ser Ser Gly Pro Ser Ala Arg Lys Gly Lys Gly Gln

370 375 380

Ile Glu Lys Arg Lys Leu Arg Glu Lys Arg Arg Ser Thr Gly Val Val

385 390 395 400

Asn Ile Pro Ala Ala Glu Cys Leu Asp Glu Tyr Glu Asp Asp Glu Ala

405 410 415

Gly Gln Lys Glu Arg Lys Arg Glu Asp Ala Ile Thr Gln Gln Asn Thr

420 425 430

Ile Gln Asn Glu Ala Val Asn Leu Leu Asp Pro Gly Ser Ser Tyr Leu

435 440 445

Leu Gln Glu Pro Pro Arg Thr Val Ser Gly Arg Tyr Lys Ser Thr Thr

450 455 460

Ser Val Ser Glu Glu Asp Val Ser Ser Arg Tyr Ser Arg Thr Asp Arg

465 470 475 480

Ser Gly Phe Pro Arg Tyr Asn Arg Asp Ala Asn Val Ser Gly Thr Leu

485 490 495

Val Ser Ser Ser Thr Leu Glu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Glu Lys Glu

500 505 510

Val Val Arg Glu Arg Gln Glu Asn Leu Arg Leu Val Arg Leu Met Gln

515 520 525

Asp Lys Glu Glu Met Ile Gly Lys Leu Lys Glu Glu Ile Asp Leu Leu

530 535 540

Asn Arg Asp Leu Asp Asp Ile Glu Asp Glu Asn Glu Gln Leu Lys Gln

545 550 555 560

Glu Asn Lys Thr Leu Leu Lys Val Val Gly Gln Leu Thr Arg

565 570

Claims

1.一种组合物，所述组合物包括。

前列腺凋亡反应-4(Par-4)多肽，所述多肽包括

与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列具有至少90％同源性的序列，或

与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列在包括癌细胞选择性凋亡(SAC)核心域的区域中具有100％同源性的片段；以及

第二多肽分子。

其中所述Par-4多肽和所述第二多肽分子作为融合蛋白提供。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列，有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基被移除。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包括选自SEQ ID NO:6或8的序列。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述融合蛋白包括免疫球蛋白Gl可结晶片段(Fc)多肽，所述多肽包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列或其片段，其中相对于SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4的序列或其变体，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基被移除，其中相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列，所述多肽的半胱氨酸残基被突变。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述Fc多肽位于所述Par-4多肽的N末端近端。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述Fc多肽包括突变：C6S、C12S和C15S。

7.一种诱导癌细胞凋亡的方法，所述方法包括：使所述癌细胞与权利要求1所述的组合物接触。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述癌细胞是转移性的。

9.一种多肽分子，所述多肽分子包括。

前列腺凋亡反应-4(Par-4)多肽，所述多肽包括

与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列具有至少90％的同源性的序列，或

第二多肽分子，

其中所述Par-4多肽和所述第二多肽分子作为融合蛋白提供。

10.根据权利要求9所述的多肽，其中，相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列，1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个残基被删除。

11.根据权利要求10所述的多肽分子，其中，所述多肽分子包括选自SEQ ID NO:6或8的序列。

12.根据权利要求10所述的多肽分子，其中，所述融合蛋白包括免疫球蛋白Gl可结晶片段(Fc)多肽，所述多肽包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列或其片段，其中相对于SEQID NO:3或SEQ ID NO:4的序列或其变体，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基被删除，其中相对于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列，所述多肽的半胱氨酸残基被突变。

13.根据权利要求12所述的多肽分子，其中，所述Fc多肽位于在所述Par-4多肽的N末端近端。

14.根据权利要求13所述的多肽分子，其中，所述Fc多肽包括下述取代：C6S、C12S和C15S。

15.一种诱导癌细胞凋亡的方法，所述方法包括：使所述癌细胞与权利要求9所述的多肽分子接触。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述癌细胞是转移性的。

17.一种核酸分子，所述核酸分子包括：编码融合蛋白的核苷酸序列或其互补序列，所述融合蛋白包括

前列腺凋亡反应-4(Par-4)多肽，所述多肽包括

与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列具有至少90％同源性的序列，或

第二多肽分子。

18.根据权利要求17所述的核酸分子，所述核酸分子包括选自SEQ ID NO:5或7的序列，或其互补序列。

19.一种载体，所述载体包括权利要求17所述的核酸分子。

20.一种细胞，所述细胞包括权利要求19所述的载体。