CN103172748B - 一种抗恶性淋巴瘤融合蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗恶性淋巴瘤融合蛋白，其包含人激活蛋白-1的抑制剂SARI和人B细胞激活因子BAFF的突变蛋白msBAFF，其中msBAFF是人B细胞激活因子BAFF的217-224位氨基酸被2个甘氨酸取代后的突变体。本发明还提供该融合蛋白的制备方法。经基因工程策略获得本发明所述的重组融合蛋白后对其进行体外抗瘤作用检测显示，能在细胞和动物水平有效抑制肿瘤的生长。

Description

一种抗恶性淋巴瘤融合蛋白及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术、生物药物领域，具体地，本发明涉及人强效抑制剂SARI(Suppressor of AP-1,Regulated by IFN)蛋白和B细胞激活因子（B cellactivating factor belonging to the TNF family，BAFF）的突变后的蛋白msBAFF组成的抗恶性淋巴瘤融合分子，及其制备方法。

背景技术

恶性淋巴瘤严重威胁人类生命健康。迄今为止，用于治疗这些疾病的主要方法仍是放疗、化疗，但放疗、化疗同时杀伤肿瘤细胞和正常细胞，毒副作用极大。肿瘤的生物治疗是一个充满希望的研究领域，它对克服肿瘤治疗中的毒副作用，提高治疗效率具有不可忽视的作用。近年来，有关AP-1和BAFF的研究为这一目标的实现提供了新的途径。

激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）是生物体中细胞核内重要的转录因子，参与靶基因调节。AP-1在包括恶性淋巴瘤在内的90%以上的肿瘤细胞中过度表达,是C-MYC、MMP1、MMP3、TNF、TSG6等多种肿瘤相关基因的转录调控因子。调控上述多种基因的表达,对细胞的增殖、浸润转移、凋亡及转化、免疫调节、分化方面起着重要作用，在肿瘤发生发展的基因活动网络中具有关键作用。因此，AP-1的活化与肿瘤密切相关，被认为是进行肿瘤治疗的重要新靶标。最新研究发现，AP-1的强效抑制剂SARI（Suppressor ofAP-1,Regulated byIFN)只选择性诱导肿瘤或表型转化细胞凋亡，而不杀伤人类正常细胞亦无毒副作用。

BAFF（B cell activating factor belonging to the TNF family）是TNF家族成员，有膜结合型和可溶性两种形式，二者的生物学活性基本一致。人BAFF全长为285个氨基酸。近年研究表明，BAFF过表达与恶性淋巴瘤的发生密切相关。在人天然BAFF中，217-224八个氨基酸对该分子活化淋巴细胞至关重要，已有实验证实这八个氨基酸残基被两个甘氨酸残基替换后所得到的BAFF突变体（msBAFF）只能结合BAFF受体，而不能活化淋巴细胞。此突变体在体内可竞争与受体的结合，从而阻断BAFF的生物学活性，抑制淋巴细胞的活化与增殖，因而目前已开始考虑用其作为治疗BAFF相关疾病的竞争性抑制剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗恶性淋巴瘤融合蛋白，其包含人激活蛋白-1的抑制剂SARI和人B细胞激活因子BAFF的突变蛋白msBAFF，其中msBAFF是人B细胞激活因子BAFF的217-224位氨基酸被2个甘氨酸取代后的突变体。

所述抗恶性淋巴瘤融合蛋白，优选地，在所述人激活蛋白-1的抑制剂SARI和突变蛋白msBAFF之间连接有TAT蛋白转导结构域多肽TAT-PTD。所述TAT蛋白转导结构域多肽TAT-PTD的编码序列优选为SEQ ID NO:6所示的序列。

本发明所述的抗恶性淋巴瘤融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述融合蛋白的编码序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供上述的重组融合蛋白的制备方法，主要包含以下步骤：

1）提取人外周血单核细胞的总RNA并将其反转录为cDNA；

2）以步骤1）中的cDNA为模板，使用SEQ ID NO:3-4所示的核苷酸序列为引物扩增人激活蛋白-1的抑制剂SARI的cDNA；

3）将步骤2）所得的人激活蛋白-1的抑制剂SARI的cDNA及含有人B细胞激活因子BAFF的突变蛋白msBAFF的基因片段的载体酶切后连接，构建含所述人激活蛋白-1的抑制剂SARI基因片段和所述突变蛋白msBAFF的基因片段的重组质粒；

其中msBAFF是人B细胞激活因子BAFF的217-224位氨基酸被2个甘氨酸取代后的突变体；

4）将步骤3）获得的重组质粒转化大肠杆菌，诱导表达获得所述重组融合蛋白。

其中，步骤3）所述含有人B细胞激活因子BAFF的突变蛋白msBAFF的基因片段的载体优选为pET28a-G₄S-9R-G₄S-mBAFF，其中G₄S为4个甘氨酸和一个丝氨酸组成的柔性接头，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；9R为TAT蛋白转导结构域多肽TAT-PTD。

其中，步骤4）所述大肠杆菌优选为BL21Rossetta菌株。

经基因工程策略所获得的本发明所述的重组融合蛋白后对其进行体外抗癌作用检测显示，能有效抑制淋巴瘤的生长。

鉴于msBAFF所具有的良好靶向性和竞争抑制作用，并基于SARI安全有效的抗瘤作用，将msBAFF和SARI融合在一起，并在两个分子之间引入具有膜转位作用的多肽TAT-PTD，以msBAFF蛋白作为靶向载体运送SARI蛋白转位至细胞内，进而与细胞核内的AP-1结合来治疗恶性淋巴瘤，可达到高效、安全、特异的抗瘤目的。

本发明借助基因工程的策略构建由均具有明显抗癌效应的SARI和恶性B细胞特异靶向分子msBAFF组成的融合分子，其优点在于：（1）现有研究已经证实SARI在多种肿瘤细胞中低表达或不表达，而在对应的正常细胞中高表达，将SARI高表达后可明显抑制多种肿瘤的增殖与发展。因此，SARI具有很好的肿瘤治疗应用前景；（2）msBAFF是人BAFF的突变体，可与其受体结合，但不产生受体后效应，而恶性B细胞系白血病的细胞表面有大量的BAFF受体表达，因此msBAFF可作为一种理想的特异性靶向分子；（3）G₄S为4个甘氨酸与1个丝氨酸相连组成的柔性接头，发明人通过实验已经证实G₄S可显著提高融合蛋白的细胞毒性；（4）9R为9个精氨酸残基，为穿膜肽主要成分，可显著提高融合蛋白的内吞效应；（5）pET28a/Rossetta系统是发明人通过筛选而优化的优选表达体系，具有表达稳定、表达量高等诸多优点，且获得带有6×His标签肽的目的蛋白，易于纯化，大大提高了融合蛋白的产率。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1为pET28a质粒图谱；

图2为融合基因SARI-G₄S-9R-G₄S-mBAFF（SGRB）测序图谱；

图3A-图3C为蛋白质免疫印迹图谱，其中，图3A中1-2为Rossetta/pET-SGRB重组菌IPTG诱导后表达产物（箭头指示处）；3为Rossetta/pET28a重组菌IPTG诱导后表达产物；4为Rossetta菌株IPTG诱导后表达产物；5为低分子量蛋白marker；图3B中1为低分子量蛋白marker；2为Rossetta/pET-SGRB重组菌IPTG诱导后的SGRB包涵体；图3C为Rossetta/pET-SGRB重组菌IPTG诱导SGRB表达产物经Western blot分析；

图4A-图4C为激光共聚焦检测SGRB在白血病细胞的定位分布,其中，图A为Raji细胞；图B为Namalwa细胞；图C为Jeko细胞；

图5A-图5C为流式细胞仪检测SGRB对白血病细胞的杀伤效应，其中，图A为Raji细胞；图B为Namalwa细胞；图C为Jeko细胞；

图6A-图6C为SGRB处理后裸鼠动物模型的肝脏切片图谱，其中，图6A为未注射Raji细胞的正常裸鼠肝脏组织；图6B为注射Raji细胞的裸鼠模型经SGRB处理后肝脏中有轻度癌细胞浸润；图6C为注射Raji细胞的裸鼠模型未经SGRB处理，肝脏中有严重的癌细胞浸润。

具体实施方式

为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

总技术方案为：

1.用单核细胞分离液在全血中分离人外周血单核细胞，提总RNA并反转录为cDNA。

2.以上述步骤制备的cDNA为模板，经常规PCR扩增编码人SARI的cDNA，所使用到的上下游引物序列分别为：SEQ ID NO:35’-GCGGAATT CACATGCATGCATGTCTATGC TGGCTGAAC-3’，（下划线所示碱基为引入的限制性内切酶位点，EcoRI）,下游引物序列为:SEQ ID NO:45’CGAAGCTTGGGGTACCTCATTTGGAATCTTTCTTCTTC-3’（下划线所示碱基为引入的限制性内切酶位点，KpnI）,在使用上述两种限制性内切酶双酶切后，回收目的片段。

3.使用上述两种限制性内切酶双酶切pET-PinX1-G4S-9R-G4S-mBAFF质粒（Zhang li et al，Selective killing of Burkitt’s lymphomacells by mBAFF-targeted delivery ofPinX1，Leukemia(2010),1–10）后，回收切开的线性pET-G4S-9R-G4S-mBAFF质粒。

4.将酶切后的SARI与pET-G₄S-9R-G₄S-mBAFF（图1）连接，转化大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆。

5.经IPTG诱导，表达蛋白，经SDS-PAGE及Western blot对蛋白在宿主菌中的存在部位、表达水平等进行分析鉴定，采用Ni²⁺-NTA亲和层析系统对蛋白进行纯化。必要时辅以分子筛纯化策略,以便进一步提高目的蛋白的纯度。

实施例1人SARI基因的克隆

1.1分离人外周血单核细胞

(1)取抗凝血5ml，与PBS缓冲液1:1混匀。

(2)取淋巴细胞分离液(中国TBD生物技术发展中心)10ml。

(3)用滴管小心将(1)所得混合液加于(2)所得分离液液面上，室温放置5分钟。

(4)2000rpm水平离心20分钟，收集白膜层。

(5)PBS缓冲液洗涤细胞两次，2000rpm离心10分钟，弃上清，所得沉淀含人外周血单核细胞。

1.2细胞总RNA的提取

采用Trizol提取细胞总RNA，操作步骤按Trizol试剂说明书进行。

(1)在所得细胞中，按照1×10⁷个细胞中加入1ml Trizol液，反复吹打裂解细胞。

(2)室温放置5分钟，使细胞充分裂解。

(3)加入0.5ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置5分钟。

(4)4℃，12000rpm离心15分钟，液体分为三层。

(5)取无色水相移至另一干净EP管中，加等量异丙醇颠倒混匀，室温放置10分钟。

(6)4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清。

(7)加入75％乙醇洗涤RNA沉淀。

(8)4℃，7500rpm离心5分钟，弃上清。加入无水乙醇洗涤沉淀，利于尽快去除水分。

(9)加入20μl DEPC水溶解沉淀，紫外分光光度计测其浓度。

1.3RT-PCR

1.3.1逆转录合成cDNA

1.3.2PCR

扩增SARI片段的条件：94℃×2分钟预变性；（94℃×30秒，60℃×30秒，72℃×1分钟）×30个循环；72℃×10分钟；引物见SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，所用反应体系如下：

1.4构建人SARI/G₄S/9R/msBAFF表达质粒

（1）将PCR扩增的SARI片段以EcoR I/Kpn I双酶切，经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后，经E.Z.N.A.Gel Extract Kit纯化回收目的片段。

（2）将pET-GRB质粒以EcoR I/Kpn I双酶切，取少量行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切效果，剩余酶切产物用E.Z.N.A.Gel Extract Kit纯化回收。

（3）将酶切并纯化好的目的片段分别与载体16℃连接12小时，连接产物转化于感受态大肠杆菌BL21Rossetta菌株，经酶切鉴定，得到重组原核表达质粒pET-SGRB（图2）。

实施例2目的蛋白的诱导表达及鉴定

1.目的蛋白的表达

(1)挑取含重组原核表达质粒pET-SGRB和对照质粒pET28a的单菌落，分别接种于3ml LB液体培养基(含50μg/ml Amp)中，37℃、220rppm，振荡培养过夜。

(2)将振荡培养过夜的菌液按1%分别接种于5ml LB液体培养基(含50μg/ml Amp)中，37℃、250r/min振荡培养3小时，至对数中期[OD(600)≈0.6]。

(3)分别加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃、220r/min诱导表达4小时。

(4)SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。

2.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

(1)各取诱导表达后的菌液1ml，10000×g离心1min，弃上清。

(2)加入1×SDS-PAGE上样缓冲液各100μl重悬沉淀，沸水浴10分钟。

(3)参照《现代分子生物学实验技术》灌制SDS-PAGE胶。5%的积层胶，15%的分离胶，1×SDS Tris-Gly电泳缓冲液。

(4)各取20μl样品上样，电泳。电泳结束后取下胶，考马斯亮蓝染色。凝胶成像仪记录结果并分析目的蛋白的表达情况。

3.诱导表达条件的优化

对pET-SGRB的表达条件进行优化

(1)将振荡培养过夜含重组原核表达质粒pET-SGRB的菌液按1%分别接种于5ml LB液体培养基(含50μg/mlAmp)中，37℃、250r/min振荡培养3小时，至对数中期。

(2)分别加入IPTG至终浓度为0.1、0.5、1.0和2.0mmol/L。

(3)在37℃，220r/min诱导表达4小时。

(4)SDS-PAGE检测蛋白的表达，确定IPTG诱导蛋白表达的最佳浓度。

(5)重复步骤(1)-(4)，依照确定的最佳IPTG诱导浓度进行诱导表达，分别取加入IPTG后1-24小时的培养物各1ml，经SDS-PAGE检测蛋白的表达，确定诱导表达的最佳时间。

(6)重复步骤(1)-(4)，依照确定的最佳IPTG诱导浓度和诱导时间，使表达菌分别在20℃、25℃、30℃、37℃生长，确定诱导表达的最佳温度。

4.蛋白质免疫印迹(Western Blotting)

(1)将振荡培养过夜的含重组原核表达质粒pET-SGRB和对照质粒pET28a的大肠杆菌按1%分别接种于5ml LB液体培养基中，37℃、220r/min振荡培养3小时，至对数中期[D(600)≈0.6]。

(2)经1mmol/L IPTG20℃诱导表达4小时后，分别取1ml菌液，10000×g离心1分钟，弃上清，加入1×SDS-PAGE上样缓冲液各100μl重悬沉淀，沸水浴10分钟。各取15μl上样行SDS-PAGE，方法同前。

(3)电泳结束后，取下胶，切除多余部分，放入转移缓冲液浸泡。同时剪1张与凝胶大小一样的硝酸纤维素膜和8张比凝胶稍小的滤纸放入转移缓冲液浸泡。

(4)安装转移装置：依次将4张滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、另4张滤纸放在有海绵的塑料支架上，每层平放时均除去气泡，最后用塑料支架夹紧，放入电转移槽内，硝酸纤维素膜一侧靠正极，凝胶一侧靠负极。

(5)接通电源，恒压15V，室温转移1小时。

(6)转移结束后，依次去掉各层，凝胶用考马斯亮蓝染色以检查转移效果。硝酸纤维素膜用记号笔标记好方向后用丽春红S染色，显色后用记号笔标出Marker位置，然后用双蒸水洗膜直至完全洗去丽春红S。

(7)TBS缓冲液洗膜10分钟。

(8)用封阻缓冲液室温下封闭12小时，封闭非特异结合位点。

(9)TBS-Tween/Triton缓冲液室温下洗膜两次，每次10分钟。

(10)TBS缓冲液室温下洗膜两次，每次10分钟。

(11)加入鼠抗人His抗体(一抗)(含3%BSA TBS buffer稀释1000倍)，室温下水平轻摇1小时，使目的蛋白与一抗结合。

(12)室温下用TBS-Tween/Triton缓冲液洗膜两次，每次10分钟。

(13)TBS缓冲液室温下洗膜两次，每次10分钟。

(14)加入HRP标记的羊抗鼠IgG(二抗)(含3%BSA TBS缓冲液稀释100倍)，室温下水平轻摇1小时，使一抗与二抗反应。

(15)室温下用TBS-Tween/Triton缓冲液洗膜4次，每次10分钟，以除去未结合的二抗。

(16)按说明书加入显色剂DAB显色15分钟，观察结果(图3A)。

实施例3目的蛋白的分离与纯化

1.目的蛋白的大量表达

(1)将含有重组原核表达质粒pET-SGRB的大肠杆菌接种于5ml LB培养液(含50μg/ml Amp)中，37℃、220rpm振荡过夜。

(2)将振荡过夜的菌液按1%分别接种于500ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液，37℃剧烈振荡3小时，至对数中期[D(600)≈0.6]。

(3)加入IPTG至终浓度1mmol/L。

(4)20℃继续振荡24小时。

(5)4℃、4000g离心15分钟收集细菌。

2.重组蛋白表达方式的鉴定

(1)每克细菌加入3ml TE buffer(pH8.0)。

(2)在冰浴中超声破菌直至粘稠的菌液变得清亮。

(3)4℃、4000g离心15分钟，分别收集上清和沉淀，各取少量加入SDS-PAGE上样缓冲液进行SDS-PAGE电泳，以确定融合蛋白是以分泌形式表达，还是形成包涵体（图3B、图3C）。

3.洗涤包涵体

(1)上清暂置4℃保存。将沉淀用9倍体积的洗涤缓冲液重悬，室温放置5分钟。

(2)4℃、12000g离心15分钟。

(3)重复上述操作一次，上清中加入终浓度为1mmol/L的PMSF暂置4℃保存。

4.溶解包涵体

(1)将沉淀加入4ml缓冲液A，并加入PMSF至终浓度0.1mmol/L。

(2)搅拌60分钟，直至溶液呈半透明状。

(3)10000g离心30分钟，上清再次加入PMSF，沉淀暂置4℃保存。

5.目的蛋白的纯化(按Qiagen公司说明书进行)

由于SGRB蛋白是以包涵体形式表达的，所以我们按照包涵体形式的蛋白进行纯化。

(1)取1ml50%Ni^2＋-NTA slurry加入4ml包涵体溶解物上清，并加入PMSF至终浓度0.1mmol/L，室温轻轻振荡混匀60分钟。

(2)将上述混合物装柱，紫外检测仪进行检测。

(3)打开夹子，控制流速在0.2ml/min，收集流出液并置4℃保存。

(4)用Buffer A洗柱，直至吸收峰出现后吸光度小于0.01，收集流出液置4℃保存。

(5)用Buffer B洗柱，直至吸收峰出现后吸光度小于0.01，收集流出液置4℃保存。

(6)用Buffer C洗柱，直至吸收峰出现后吸光度不再变化(因为咪唑本身有一定的吸光值)，收集洗脱液加入PMSF后置4℃保存。

(7)用Buffer D洗柱，直至吸光度小于0.01，收集洗脱液置4℃保存。

6.透析复性

(1)准备透析袋：在含2%NaHCO₃和1mmol/L EDTA的溶液中煮10分钟，用去离子水冲洗干净，再于1mmol/L EDTA的溶液中煮10min，最后浸泡于1mmol/L EDTA中置4℃保存。

(2)用Buffer A把Buffer C和Buffer D洗脱液混合后稀释至50ml，搅拌混匀，加入PMSF至终浓度0.1mmol/L，装入透析袋。

(3)将透析袋放入装有1L复性液的烧杯中，4℃，12小时，其间搅拌数次。

(4)弃去复性液，加入新的复性液，4℃，10小时，其间搅拌数次。

(5)将透析袋取出移至装有1L TE缓冲液的烧杯中，4℃，10小时，其间搅拌数次。

(6)取出复性后的液体，装入干净的小烧杯中，冷冻干燥后置-70℃保存。

(7)将冻干的融合蛋白行SDS-PAGE电泳。

包涵体洗涤缓冲液的配制：0.5%Triton X-100，10mmol/L EDTA，pH8.0

蛋白纯化用缓冲液(纯化以包涵体形式存在的蛋白)的配制：

Buffer A：100mmol/L NaH₂PO₄，10mmol/LTris,8mol/L尿素，pH8.0

Buffer B：取200ml BufferA，用HCl调pH值至6.3

Buffer C：取200ml BufferA，加入2.72g咪唑，调pH值至5.9

Buffer D：取200ml BufferA，用HCl调pH值至4.5

复性液的配制：0.8mol/L尿素，0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽，0.9mmol/L还原型谷胱甘肽，10mmol/L Tris,pH8.0

TE缓冲液的配制：10mmol/L Tris,1mmol/L EDTA，pH8.0

实施例4目的蛋白的生物学活性鉴定

1.样品的准备各取出少量蛋白冻干粉末加入0.5ml消毒无热原水溶解，以牛血清白蛋白标准品为参照，紫外分光光度计测蛋白浓度。

2.重组蛋白SGRB的活性鉴定

2.1重组目的蛋白SGRB对靶细胞的特异性结合实验及转位能力分析

（1）SGRB对靶细胞的特异性结合实验：

采用ELISA法检测。将处于对数生长期的恶性淋巴瘤细胞株及对照细胞以1×10⁵接种于96孔培养板，0.025％的戊二醛4℃固定，脱脂奶粉封闭，分别加入不同浓度的SGRB，37℃反应1h，以抗-His单抗为一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗进行反应，加入邻苯二胺（OPD）显色，硫酸终止反应，在490nm波长处测各孔吸光度（A）值。

（2）免疫荧光法检测SGRB转导进入细胞入核的能力：

取对数生长期的恶性淋巴瘤细胞株及对照细胞，悬浮于培养液并计数，分置各试管内，将适当浓度的SGRB与恶性淋巴瘤细胞株及对照细胞混合，并于不同时间点各取1管终止反应，收集细胞并用0.2%TritonX-100溶液透化固定后的细胞，以抗-His单抗为一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗进行反应，最后在激光共聚焦下观察结果。

2.2SGRB诱导恶性淋巴瘤细胞凋亡的检测

培养恶性淋巴瘤细胞株，然后采用以下几种方法检测重组蛋白诱导其凋亡的情况：

（1）细胞凋亡的形态学特征观察：在恶性淋巴瘤细胞株中加入不同浓度的SGRB或对照蛋白（msBAFF、SARI），设对照，培养12、24、36、48、72ｈ后于倒置显微镜下观察（图4A至图4C）。

（2）DNA断裂实验：在处于对数生长期的恶性淋巴瘤细胞株中加入不同浓度的SGRB蛋白或对照蛋白（msBAFF、SARI），作用72h后收集细胞，用PBS洗涤，加细胞裂解液消化，用常规酚-氯仿-异戊醇法抽提DNA，行1.0%琼脂糖凝胶电泳。

（3）流式细胞仪检测：用annexin V/PI染色法，以不同浓度的重组蛋白或对照蛋白（msBAFF、SARI）处理细胞24ｈ并设对照。收集106个细胞，PBS洗1次，按annexin-V-FLUOS/PI试剂盒说明书进行双标记，然后用流式细胞仪检测凋亡（图5A至图5C）。

2.3体外实验比较SGRB蛋白和非融合蛋白对肿瘤细胞的杀伤作用

选用恶性淋巴瘤细胞株及正常B淋巴细胞进行MTT比色试验：调整细胞浓度，以每孔200μl接种于96孔培养板，加入不同浓度的SGRB或对照蛋白（msBAFF、SARI），每组重复3孔。培养48ｈ后，用碧云天公司的细胞凋亡检测试剂盒，加入PI后用流式细胞仪检测细胞凋亡比例。

2.4动物实验观察融合蛋白对荷瘤鼠模型的抑瘤效果

（1）用人恶性淋巴瘤细胞Raji建立荷瘤裸鼠动物模型，并分为3组；

（2）各组分别注射SGRB、对照蛋白msBAFF、SARI或生理盐水，每隔2天给药1次，共5次；

（3）给药一段时间后，处死裸鼠取肿瘤组织行快速冰冻切片，多聚甲醛固定后，免疫组化法检测蛋白在肿瘤组织中的分布情况（图6A至-图6C）。

结果表明：

细胞及动物实验显示，SGRB能高效进入人恶性白血病B细胞内，并有效抑制细胞的增殖，在B细胞性恶性白血病裸鼠模型上可明显观察到对动物的保护作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。

Claims (8)

1.一种抗恶性淋巴瘤融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，所述融合蛋白包括人激活蛋白-1的强效抑制剂SARI和人B细胞激活因子BAFF的突变蛋白msBAFF，其中msBAFF是人B细胞激活因子BAFF的217-224位氨基酸被2个甘氨酸取代后的突变体。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人激活蛋白-1的抑制剂SARI和突变蛋白msBAFF之间连接有编码核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的具有膜转位作用的多肽TAT-PTD。

3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的编码序列如SEQ ID NO: 2所示。

4.如权利要求1所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包含步骤：

1）提取人外周血单核细胞的总RNA并将其反转录为cDNA；

2）以步骤1）中的cDNA为模板，使用SEQ ID NO: 3-4所示的核苷酸序列为引物扩增人激活蛋白-1的抑制剂SARI的cDNA；

3）将以步骤2）所得的人激活蛋白-1的抑制剂SARI的cDNA及含有人B细胞激活因子BAFF的突变蛋白msBAFF的基因片段的载体酶切后连接，构建含所述人激活蛋白-1的抑制剂SARI基因片段和所述突变蛋白msBAFF的基因片段的重组质粒；

其中msBAFF是人B细胞激活因子BAFF的217-224位氨基酸被2个甘氨酸取代后的突变体；

4）将步骤3）获得的重组质粒转化大肠杆菌，诱导表达获得所述重组融合蛋白。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3）所述含有人B细胞激活因子BAFF的突变蛋白msBAFF的基因片段的载体为pET28a-G₄S-9R-G₄S-mBAFF，其中G₄S为4个甘氨酸和一个丝氨酸组成的柔性接头，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；9R为TAT蛋白转导结构域多肽TAT-PTD。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述TAT蛋白转导结构域多肽TAT-PTD的编码序列如SEQ ID NO:6所示。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤4）所述大肠杆菌为BL21 Rossetta菌株。

8.权利要求1所述的融合蛋白在制备抗恶性淋巴瘤制剂中的应用。