CN114409803A - 流感病毒三聚体亚单位疫苗及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基于三聚化HA的亚单位流感病毒疫苗。本发明使用昆虫细胞体外表达流感病毒H1N1 HA蛋白三聚体形成区域LAH在N端、且H1N1 HA1、H3N2 HA1或B型HA1蛋白在C端的融合三聚体蛋白H1N1 HA1c‑trimer、H3N2 HA1c‑trimer或B HA1c‑trimer，且与各自HA1单体蛋白相比，三聚体蛋白的免疫效果更好，能够使小鼠产生更高滴度的针对流感病毒HA1的特异性抗体。本发明的三聚体形式HA1克服了HA1单体免疫原性不足的缺点，提高了小鼠产生的针对流感病毒HA1的特异性抗体水平；这种设计可以用于提高流感病毒HA1免疫原性，使其作为一种更为有效地疫苗使用。

Description

流感病毒三聚体亚单位疫苗及其应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及流感病毒三聚体亚单位疫苗及其应用。
背景技术
流行性感冒病毒(influenza virus)，简称流感病毒。是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的代表种，包括人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流感的病原体。
流感病毒是一种负链RNA病毒，包含编码至少12种蛋白质的八个RNA片段(PB2，PB1，PB1-F2，PA、PA-X、HA、NA、NP、M1、M2、NS1和NS2)。其中两种蛋白质，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，是细胞表面糖蛋白，使病毒能够分别进入(通过受体结合和膜融合)和逃离宿主细胞；由于HA和NA容易在传播过程中发生突变，导致免疫原性发生改变，所以根据的HA和NA抗原性区别，流感病毒又可以分为不同的亚型，例如H1N1、H5N1、H3N2等。
HA是病毒颗粒的主要表面抗原，也是病毒中和抗体(Abs)的主要目标，HA是一种合成为单个多肽链(HA0)的同源三聚体，随后被宿主细胞蛋白酶切割以达到具有融合能力的状态。因此，成熟的HA三聚体由HA1和HA2亚单位组成，它们在切割后通过一个二硫键保持交联。HA三聚体可分为两个结构和功能域，头部和茎，分别包括受体结合位点和融合机制。HA1亚单位形成膜远端的球状头部和膜近端茎部区的一部分。HA2亚单位代表茎部区的主要成分。HA的头部介导受体结合，而HA2亚单位代表茎部区是介导膜融合作用的主要部分。中和抗体反应主要针对HA的免疫显性结构域。然而，由于头部区域表位的高度遗传可塑性，抗体反应是毒株特异性的，缺乏与不同HA亚型的广泛交叉反应性。相比之下，HA茎部的序列和结构在不同的流感亚型中更加保守，广泛中和该结构域的抗体被认为是对抗各种流感病毒株的潜在方法。虽然不同亚型的HA氨基酸序列存在差异，但是其HA1的氨基酸数量及空间结构具有很强的保守性，通过结构生物学解析的不同亚型HA比较我们发现，其空间结构基本一致。
最保守的HA茎部区之一是55个氨基酸长的α螺旋(LAH)。已有研究表明，在体外表达的LAH能够自发组装成为可溶性的三聚体蛋白复合物，这也和HA在病毒表面形成天然三聚体有紧密的联系。利用这一特点，可以将LAH与重要病毒抗原蛋白融合，形成依赖于LAH的三聚体可溶蛋白，提高抗原的免疫原性。
目前，病毒疫苗的种类主要包括：灭活疫苗、核酸疫苗、重组蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗、减毒疫苗。灭活疫苗：灭活疫苗是传统的经典技术路线，即在体外培养病毒，然后将其灭活，使之没有毒性。灭活疫苗的优点是制备方法简单快速，安全性比较高，但灭活疫苗也有缺点，如接种剂量大、免疫期短，最可怕的缺点是有时候会造成抗体依赖增强效应(ADE)，使病毒感染加重。腺病毒载体疫苗：腺病毒载体疫苗是用经过改造后无害的腺病毒作为载体，装入病毒的表面重要蛋白基因，制成腺病毒载体疫苗，刺激人体产生抗体，优点是安全、高效、引发的不良反应少；缺点是重组病毒载体疫苗以5型腺病毒作载体，但绝大多数人成长过程中曾感染过5型腺病毒，体内可能存在能中和腺病毒载体的抗体，降低疫苗效果。核酸疫苗：核酸疫苗包括mRNA疫苗和DNA疫苗，是将编码表面蛋白的基因，mRNA或者DNA直接注入人体，利用人体细胞在人体内合成表面蛋白，刺激人体产生抗体。核酸疫苗的优点是研制时不需要合成蛋白质或病毒，流程简单，安全性相对比较高；缺点是无成功先例。减毒疫苗：是用已批准上市的减毒流感病毒疫苗作为载体，携带病毒表面蛋白，共同刺激人体产生针对两种病毒的抗体；由于减毒流感病毒容易感染鼻腔，所以这种疫苗仅通过滴鼻的方式就可以完成疫苗接种。重组蛋白疫苗：也称基因工程重组亚单位疫苗，是通过基因工程方法，大量生产病毒最有可能作为抗原的表面蛋白，把它注射到人体，刺激人体产生抗体；重组亚单位疫苗的优点是安全、高效、可规模化生产；比较成功的基因工程亚单位疫苗是乙型肝炎表面抗原疫苗。
发明内容
本发明针对流感病毒，我们依据流感病毒HA蛋白的天然三聚体结构，以及亚单位疫苗的优势，设计了三聚体形式的流感病毒亚单位疫苗；该疫苗是使用昆虫细胞体外表达流感病毒H1N1 HA2蛋白三聚体形成区域LAH在N端、且H1N1 HA1、H3N2 HA1或B型HA1蛋白在C端的融合三聚体蛋白H1N1 HA1c-trimer、H3N2 HA1c-trimer或B HA1c-trimer，且与各自单体蛋白(H1N1 HA1-monomer、H3N2 HA1-monomer、BHA1-monomer)相比，三聚体蛋白的免疫效果更好，能够使小鼠产生更高滴度的针对流感病毒HA1的特异性抗体。本发明的三聚体形式HA1克服了HA1单体免疫原性不足的缺点，大大提高了小鼠针对流感病毒HA1的特异性抗体的水平。所以，本发明的三聚体疫苗具有优异的免疫原性，为针对流感病毒疫苗的设计提供了一种全新的形式。
具体地，本发明提供以下实施方案：
1.流感病毒抗原，其中
(1)所述流感病毒抗原从5’端到3’端的方向依次包括：
流感病毒A/California/07/2009H1N1 HA蛋白三聚体形成区LAH区K403-N474，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1，
以及流感病毒H1N1 HA1区，所述流感病毒H1N1 HA1区与A/California/07/2009H1N1 HA1区D18-S340的氨基酸序列同源性大于90％，例如大于90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或等于100％，且存在差异的位点在流感病毒H1N1 HA1区的loop区，所述流感病毒H1N1 HA1区例如选自：
A/California/07/2009H1N1 HA1区D18-S340，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2，
或A/Michigan/45/2015H1N1 HA1区D18-S340，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3，
或A/Brisbane/02/2018H1N1 HA1区D18-S340，其氨基酸序列为SEQ ID NO：4，
或A/Hawaii/70/2019H1N1 HA1区D18-S340，其氨基酸序列为SEQ ID NO：5；
(2)所述流感病毒抗原从5’端到3’端的方向依次包括：
流感病毒A/California/07/2009H1N1 HA蛋白三聚体形成区LAH区K403-N474，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1，
以及流感病毒H3N2 HA1区，所述流感病毒H3N2 HA1区与A/HongKong/45/2019H3N2HA1区D18-E341的氨基酸序列同源性大于90％，例如大于90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或等于100％，且存在差异的位点在流感病毒H3N2 HA1区的loop区，所述流感病毒H3N2 HA1区例如选自：
A/HongKong/45/2019H3N2 HA1区D18-E341，其氨基酸序列为SEQ ID NO：6，
或A/Kansas/14/2017H3N2 HA1区D18-E341，其氨基酸序列为SEQ ID NO：7，
或A/Singapore/INFIMH-160019/2016H3N2 HA1区D18-E341，其氨基酸序列为SEQID NO：8，
或A/Hong Kong/4801/2014H3N2 HA1区D18-E341，其氨基酸序列为SEQ ID NO：9；或
(3)所述流感病毒抗原从5’端到3’端的方向依次包括：
流感病毒A/Califomia/07/2009H1N1 HA蛋白三聚体形成区LAH K403-N474，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1，
以及B型流感病毒HA1区，所述B型流感病毒HA1区与B/Brisbane/60/2008HA1区D16-A356的氨基酸序列同源性大于90％，例如大于90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或等于100％，且存在差异的位点在B型流感病毒HA1区的loop区，所述B型流感病毒HA1区例如选自：
B/Brisbane/60/2008HA1区D16-A356，其氨基酸序列为SEQ ID NO：10，
或B/Colorado/06/2017HA1区D16-A354，其氨基酸序列为SEQ ID NO：11，
或B/Washington/02/2019HA1区D16-A356，其氨基酸序列为SEQ ID NO：12；
优选地，其中所述流感病毒抗原为三聚体蛋白。
2.如项1所述的流感病毒抗原，其进一步包括在5’端的分泌信号肽(例如氨基酸序列为SEQ ID NO：13的流感病毒A/California/07/2009H1N1HA蛋白信号肽；氨基酸序列为SEQ ID NO：14的GP67信号肽，或其他流感病毒H1N1 HA1、流感病毒H3N2 HA1或B型流感病毒HA1的信号肽)以及在3’端的纯化标签(例如，6×His标签)和终止密码子(例如：TAA、TAG或TGA)。
3.如项1或2所述的流感病毒抗原，其包含如下列(1)或(2)所示氨基酸序列：
(1)如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ IDNO：25所示的流感病毒抗原的氨基酸序列；
(2)(1)中的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个氨基酸或更多个氨基酸且不改变(1)的抗原性的由(1)衍生的多肽或其类似物，且自身能够形成三聚体。
4.分离的多核苷酸，其编码项1-3中任一项所述的流感病毒抗原，优选地所述分离的多核苷酸包含如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ IDNO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38或SEQID NO：39所示的序列。
5.重组载体或者表达盒，其包含项4所述的分离的多核苷酸。
6.转基因细胞系或者重组菌，其包含项5所述的重组载体或者表达盒。
7.如项6所述的转基因细胞系，其源自昆虫细胞，例如昆虫细胞Sf9或Hi5。
8.如项1-3中任一项所述的流感病毒抗原在制备抗流感病毒药物，例如疫苗中的用途。
9.如项8所述的用途，其中将所述流感病毒抗原与佐剂合用。
10.试剂盒，其含有如项1-3中任一项所述的流感病毒抗原、如项4所述的分离的多核苷酸，或者如项5所述重组载体或者表达盒，如项6所述的转基因细胞系或者重组菌，优选地，所述试剂盒进一步包含佐剂。
在本发明的流感病毒三聚体疫苗设计中，将A/California/07/2009H1N1 HA蛋白三聚体形成区LAH设计在如上三种流感病毒HA1区域的5’端还是3’端尤为重要，因为发明人在尝试将其设计在5’端时，并不能表达出完整的预期蛋白。
附图说明
图1：H1N1 HA1c-trimer、H1N1 HA1-monomer的WB鉴定；
图2：H1N1 HA1c-trimer分子筛层析和SDS-PAGE鉴定；
图3：H1N1 HA1-monomer分子筛层析和SDS-PAGE鉴定；
图4：H1N1 HA1c-trimer的分析超速离心确定；
图5：H1N1 HA1c-trimer、H1N1 HA1-monomer免疫后小鼠血清抗体滴度测定；
图6：不同HA1晶体结构相似性比较，图a为A/California/04/2009H1N1 HA1、A/Brisbane/10/2007H3N2 HA1、B/Brisbane/60/2008HA1的结构的合并图，图b为A/California/04/2009H1N1 HA1的结构，图c为A/Brisbane/10/2007H3N2 HA1的结构，图d为B/Brisbane/60/2008HA1的结构；
图7：不同H1N1 HA1序列同源性比较；
图8：不同H3N2 HA1序列同源性比较；
图9：不同B型HA1序列同源性比较；
图10：H3N2 HA1c-trimer、H3N2 HA1-monomer的WB鉴定；
图11：H3N2 HA1c-trimer分子筛层析和SDS-PAGE鉴定；
图12：H3N2 HA1-monomer分子筛层析和SDS-PAGE鉴定；
图13：H3N2 HA1c-trimer的分析超速离心确定；
图14：H3N2 HA1c-trimer、H3N2 HA1-monomer免疫后小鼠血清抗体滴度测定；
图15：B HA1c-trimer、B HA1-monomer的WB鉴定；
图16：B HA1c-trimer分子筛层析和SDS-PAGE鉴定；
图17：B HA1-monomer分子筛层析和SDS-PAGE鉴定；
图18：B HA1c-trimer的分析超速离心确定；
图19：B HA1c-trimer、B HA1-monomer免疫后小鼠血清抗体滴度测定。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：H1N1 HA1c-trimer、H1N1 HA1-monomer蛋白重组表达质粒构建
设计以下两种HA1重组表达片段：
a.H1N1 HA1c-trimer：5′-SP+LAH+HA1+6×His+终止密码子-3′；
b.H1N1 HA1-monomer：5′-SP+HA1+6×His+终止密码子-3′。
其中
SP为GP67信号肽，氨基酸序列为SEQ ID NO：14；
LAH为流感病毒A/California/07/2009H1N1 HA蛋白三聚体形成区LAH(K403-N474)，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1；
HA1为流感病毒A/California/07/2009H1N1 HA1区D18-S340，其氨基酸序列为SEQID NO：2。
根据昆虫细胞密码子的偏爱性，优化编码以上两个氨基酸序列的核酸序列，分别得到除去SP和6×His剩下的片段的优化的编码核酸序列为SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：40，再通过EcoRI和XhoI两个酶切位点将全长序列连接到pFastBacl(Gibco)载体上形成H1N1HA1重组表达质粒。
实施例2：H1N1 HA1c-trimer、H1N1 HA1-monomer蛋白试表达与鉴定
用实施例1得到的重组质粒转化DH10Bac感受态细胞(购自Invitrogen)，37℃过夜培养，通过蓝白斑筛选和PCR鉴定出阳性克隆。提取重组的杆状病毒DNA(Bacmid)，通过测序鉴定正确的重组子。用Bacmid转染昆虫细胞Sf9(Invitrogen)，转染3天后收取培养上清，得到第1代重组杆状病毒。连续扩毒2代，所获第3代杆状病毒。收集病毒，使用HR标记的Anti-His抗体(MBL)进行蛋白质印迹Western blot(WB)检测。
经过WB检测H1N1 HA1c-trimer及H1N1 HA1-monomer能够正常表达，且H1N1 HA1c-trimer表达水平显著高于H1N1 HA1-monomer(如图1所示)，所以我们选择H1N1 HA1c-trimer构建体作为优选方案，H1N1 HA1-monomer作为对照构建继续进行后续实验。
实施例3：H1N1 HA1c-trimer、H1N1 HA1-monomer蛋白表达、纯化与鉴定
用实施例2得到的所获第3代杆状病毒进行第四代扩增后，进行病毒滴度测定。根据滴定结果选取合适的病毒MOI感染Sf9或者昆虫细胞系Hi5(Invitrogen)做表达，48小时后离心收集细胞上清。
将收集的上清，以5000rpm离心30分钟，经过0.22μm滤膜过滤，与HisTrap excel柱结合(5mL，GE Healthcare)，以20mM Tris、150mM NaCl、pH8.0、20mM咪唑洗脱非特异结合的蛋白，以20mM Tris、150mM NaCl、pH8.0、100mM咪唑洗脱目的蛋白。收集目的蛋白浓缩后进行分子筛层析Superdex 200Increase 10/300GL或Superdex 200Hiload 16/60(GEHealthcare)。目的峰通过SDS-PAGE(还原性)确定，结果如图2、图3所示。得到纯化的H1N1HA1c-trimer及H1N1 HA1-monomer抗原。经过分析超速离心，结果如图4所示，测得H1N1HA1c-trimer的分子量为155kDa，与三聚体理论分子量一致(H1N1 HA1蛋白单体的分子量为44kDa，三聚体标签为9kDa，整体三聚体理论分子量约159kDa)，可以判定为三聚体。
实施例4：小鼠免疫实验
将实施例3得到的H1N1 HA1-monomer、H1N1 HA1c-trimer抗原按照下表1的方法于生理盐水中稀释，并与等体积佐剂进行分组乳化，然后对6周龄的Balb/c小鼠(维通利华)进行分组免疫。免疫策略为通过大腿肌肉注射的方式，每只小鼠分别在第0天进行1次疫苗免疫，每次100μL的接种体积。第14天对小鼠进行尾部取血。小鼠血清在静置一段时间后血清析出，通过3000rpm离心10分钟获得血清，将血清在56℃，30分钟灭活后，用于ELISA结合检测。
表1：动物免疫分组情况
Figure BDA0003446793610000081
Figure BDA0003446793610000091
实施例5：小鼠免疫后血清ELISA检测实验
将上一步实施例4制备的小鼠血清，进行ELISA检测，测定HA1特异性抗体水平。向ELISA板中的每孔加入200ng实施例3得到的纯化的H1N1 HA1-monomer蛋白，然后各孔用ELISA包被液(50mM的Na2CO3、NaHCO3缓冲液，pH 9.6)在4℃下包被过夜；弃去包被液后，每孔加入150μL 5％脱脂奶粉室温封闭1小时。封闭结束后，用含0.05％吐温20的PBS洗ELISA板2次，每孔加入梯度稀释的抗原免疫后血清或PBS免疫后血清100μL，室温孵育1小时；弃去上清后用含0.05％吐温20的PBS洗ELISA板5次；每孔加入1∶3000稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体(二抗，购自中杉金桥)100μL，室温孵育1小时；弃去二抗后用含0.05％吐温20的PBS洗ELISA板5次，每孔加入50μL ELISA显色液显色15分钟，每孔加入50μL 2M H2SO4终止反应，酶标仪读取OD450数值；抗体滴度(Titer)计算方法为，以未加血清组的阴性对照数值×2.1倍，将高于该数值的最低稀释倍数取1g值，即算得每组血清抗体滴度。结果显示，5μg组H1N1 HA1c-trimer免疫组小鼠血清中结合H1N1 HA1抗原的抗体滴度(T5组1.903)显著高于H1N1 HA1-monomer(M5组1.482)及PBS对照组(1.000)(图5)，说明三聚体形式HA1的免疫原性更好。
实施例6：不同类型HA1的结构比较
为证明利用LAH标签形成HA1三聚体具有通用性，我们从PDB数据库获取不同亚型的HA1的结构生物学数据，包括：A/California/04/2009H1N1(PDB：3UBQ)的HA1、A/Brisbane/10/2007H3N2(PDB：1RU7)的HA1、B/Brisbane/60/2008(PDB：4FQM)的HA1。将上述结构数据用Pymol软件打开，并进行结构比对后，我们发现，不同类型的HA1具有很高的结构相似性，空间结构具有一致性(图6)。根据以上比对结果，可以认为利用实例1中构建形式，LAH与不同亚型的HA1抗原均可以形成类似实例3制备的HA1三聚体形式蛋白，可用于提高HA1单体抗原的免疫原性。
实施例7：不同HA1的序列同源性比较
为证明利用A/California/07/2009H1N1的LAH标签形成H1N1 HA1三聚体具有通用性，我们从GISAID数据库获取不同的H1N1 HA1的氨基酸序列，包括：A/California/07/2009H1N1 HA1(EPI176504)、A/Hawaii/70/2019H1N1 HA1(EPI1617983)、A/Brisbane/02/2018H1N1 HA1(EPI1212834)、A/Michigan/45/2015H1N1 HA1(EPI662594)。将上述序列进行比对后，我们发现，以上H1N1 HA1与A/California/07/2009H1N1具有很高的序列相似性，同源性均大于94％(图7)，存在差异的氨基酸位点位于不影响空间结构的loop区。根据以上比对结果，我们认为利用实施例1中构建形式，A/California/07/2009H1N1的LAH与上述不同的H1N1HA1抗原均可以形成类似实施例3制备的H1N1 HA1三聚体形式蛋白，用于提高H1N1HA1抗原的免疫原性，达到诱导更高滴度的抗体的效果。
同样，为证明利用A/California/07/2009H1N1的LAH标签形成H3N2 HA1三聚体具有通用性，我们从GISAID数据库获取不同的H3N2 HA1的氨基酸序列，包括：A/HongKong/45/2019H3N2 HA1(EPI1397376)、A/Kansas/14/2017H3N2 HA1(EPI1146345)、A/Singapore/INFIMH-160019/2016H3N2 HA1(EPI780183)、A/Hong Kong/4801/2014H3N2 HA1(EPI539576)。将上述序列进行比对后，我们发现，以上H3N2 HA1与A/HongKong/45/2019H3N2 HA1具有很高的序列相似性，同源性均大于96％(图8)，存在差异的氨基酸位点位于不影响空间结构的loop区。根据以上比对结果，我们认为利用实例1中构建形式，A/California/07/2009H1N1的LAH与上述不同的H3N2 HA1抗原均可以形成实施例3制备的H3N2 HA1三聚体形式蛋白，用于提高H3N2 HA1抗原的免疫原性，达到诱导更高滴度的抗体的效果。
同样，为证明利用A/California/07/2009H1N1的LAH标签形成B型HA1三聚体具有通用性，我们从GISAID数据库获取不同的B型HA1的氨基酸序列，包括：B/Brisbane/60/2008HA1(EPI498048)、B/Colorado/06/2017HA1(EPI969380)B/Washington/02/2019HA1(EPI187623)。将上述序列进行比对后，我们发现，以上B型HA1与B/Brisbane/60/2008HA1具有很高的序列相似性，同源性均大于98％(图9)，存在差异的氨基酸位点位于不影响空间结构的loop区。根据以上比对结果，我们认为利用实施例1中构建形式，A/California/04/2009H1N1的LAH与上述不同的B型HA1抗原均可以形成实施例3制备的B型HA1三聚体形式蛋白，用于提高B型HA1抗原的免疫原性，达到诱导更高滴度的抗体的效果。
实施例8：H3N2 HA1c-trimer、H3N2 HA1-monomer蛋白重组表达质粒构建
设计以下两种HA1重组表达片段：
a.H3N2 HA1c-trimer：5′-SP+LAH+HA1+6×His+终止密码子-3′；
b.H3N2 HA1-monomer：5′-SP+HA1+6×His+终止密码子-3′。
其中
SP为GP67信号肽，氨基酸序列为SEQ ID NO：14；
LAH为流感病毒A/California/07/2009H1N1 HA蛋白三聚体形成区LAH(K403-N474)，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1；
HA1为流感病毒A/HongKong/45/2019H3N2 HA1区D18-E341，其氨基酸序列为SEQID NO：6。
根据昆虫细胞密码子的偏爱性，优化编码以上两个氨基酸序列的核酸序列，分别得到除去SP和6×His剩下的片段的优化的编码核酸序列为SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：41，再通过EcoRI和XhoI两个酶切位点将全长序列连接到pFastBac1(Gibco)载体上形成H3N2HA1重组表达质粒。
实施例9：H3N2 HA1c-trimer、H3N2 HA1-monomer蛋白试表达与鉴定
用实施例8得到的重组质粒转化DH10Bac感受态细胞(购自Invitrogen)，37℃过夜培养，通过蓝白斑筛选和PCR鉴定出阳性克隆。提取重组的杆状病毒DNA(Bacmid)，通过测序鉴定正确的重组子。用Bacmid转染昆虫细胞Sf9(Invitrogen)，转染3天后收取培养上清，得到第1代重组杆状病毒。连续扩毒2代，所获第3代杆状病毒。收集病毒，使用HR标记的Anti-His抗体(MBL)进行蛋白质印迹Western blot(WB)检测。
经过WB检测H3N2 HA1c-trimer及H3N2 HA1-monomer能够正常表达，且H3N2 HA1c-trimer表达水平显著高于H3N2 HA1-monomer(如图10所示)，所以我们选择H3N2 HA1c-trimer构建体作为优选方案，H3N2HA1-monomer作为对照构建继续进行后续实验。
实施例10：H3N2 HA1c-trimer、H3N2 HA1-monomer蛋白表达、纯化与鉴定
用实施例9得到的所获第3代杆状病毒进行第四代扩增后，进行病毒滴度测定。根据滴定结果选取合适的病毒MOI感染Sf9或者昆虫细胞系Hi5(Invitrogen)做表达，48小时后离心收集细胞上清。
将收集的上清，以5000rpm离心30分钟，经过0.22μm滤膜过滤，与HisTrap excel柱结合(5mL，GE Healthcare)，以20mM Tris、150mM NaCl、pH8.0、20mM咪唑洗脱非特异结合的蛋白，以20mM Tris、150mM NaCl、pH8.0、100mM咪唑洗脱目的蛋白。收集目的蛋白浓缩后进行分子筛层析Superdex 200Increase 10/300GL或Superdex 200Hiload 16/60(GEHealthcare)。目的峰通过SDS-PAGE(还原性)确定，结果如图11、图12所示。得到纯化的H3N2HA1c-trimer及H3N2 HA1-monomer抗原。经过分析超速离心，结果如图13所示，测得H3N2HA1c-trimer的分子量为188kDa，与三聚体理论分子量一致(H3N2 HA1蛋白单体的分子量为60kDa，三聚体标签为9kDa，整体三聚体理论分子量约207kDa，)，可以判定为三聚体。
实施例11：小鼠免疫实验
将实施例10得到的H3N2 HA1-monomer、H3N2 HA1c-trimer抗原按照下表2的方法于生理盐水中稀释，并与等体积佐剂进行分组乳化，然后对6周龄的Balb/c小鼠(维通利华)进行分组免疫。免疫策略为通过大腿肌肉注射的方式，每只小鼠分别在第0天进行1次疫苗免疫，每次100μL的接种体积。第14天对小鼠进行尾部取血。小鼠血清在静置一段时间后血清析出，通过3000rpm离心10分钟获得血清，将血清在56℃，30分钟灭活后，用于ELISA结合检测。
表2：动物免疫分组情况
Figure BDA0003446793610000121
Figure BDA0003446793610000131
实施例12：小鼠免疫后血清ELISA检测实验
将上一步实施例11制备的小鼠血清，进行ELISA检测，测定HA1特异性抗体水平。向ELISA板中的每孔加入200ng实施例10得到的纯化的H3N2 HA1-monomer蛋白，然后各孔用ELISA包被液(50mM的Na2CO3、NaHCO3缓冲液，pH 9.6)在4℃下包被过夜；弃去包被液后，每孔加入150μL 5％脱脂奶粉室温封闭1小时。封闭结束后，用含0.05％吐温20的PBS洗ELISA板2次，每孔加入梯度稀释的抗原免疫后血清或PBS免疫后血清100μL，室温孵育1小时；弃去上清后用含0.05％吐温20的PBS洗ELISA板5次；每孔加入1∶3000稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体(二抗，购自中杉金桥)100μL，室温孵育1小时；弃去二抗后用含0.05％吐温20的PBS洗ELISA板5次，每孔加入50μL ELISA显色液显色15分钟，每孔加入50μL 2M H2SO4终止反应，酶标仪读取OD450数值；抗体滴度(Titer)计算方法为，以未加血清组的阴性对照数值×2.1倍，将高于该数值的最低稀释倍数取1g值，即算得每组血清抗体滴度。结果显示，H3N2 HA1c-trimer免疫组小鼠血清中结合H3N2 HA1抗原的抗体滴度(3.251)显著高于H3N2HA1-monomer(2.288)及PBS对照组(1.000)(图14)，说明三聚体形式HA1的免疫原性更好。
实施例13：B HA1c-trimer、B HA1-monomer蛋白重组表达质粒构建
设计以下两种HA1重组表达片段：
a.B HA1c-trimer：5′-SP+LAH+HA1+6×His+终止密码子-3′；
b.B HA1-monomer：5′-SP+HA1+6×His+终止密码子-3′。
其中
SP为GP67信号肽，氨基酸序列为SEQ ID NO：14；
LAH为流感病毒A/California/07/2009H1N1 HA蛋白三聚体形成区LAH(K403-N474)，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1；
HA1为流感病毒B/Brisbane/60/2008HA1区D16-A356，其氨基酸序列为SEQ ID NO：10。
根据昆虫细胞密码子的偏爱性，优化编码以上两个氨基酸序列的核酸序列，分别得到除去SP和6×His剩下的片段的优化的编码核酸序列为SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：42，再通过EcoRI和XhoI两个酶切位点将全长序列连接到pFastBac1(Gibco)载体上形成B HA1重组表达质粒。
实施例14：B HA1c-trimer、B HA1-monomer蛋白试表达与鉴定
用实施例13得到的重组质粒转化DH10Bac感受态细胞(购自Invitrogen)，37℃过夜培养，通过蓝白斑筛选和PCR鉴定出阳性克隆。提取重组的杆状病毒DNA(Bacmid)，通过测序鉴定正确的重组子。用Bacmid转染昆虫细胞Sf9(Invitrogen)，转染3天后收取培养上清，得到第1代重组杆状病毒。连续扩毒2代，所获第3代杆状病毒。收集病毒，使用HRP标记的Anti-His抗体(MBL)进行蛋白质印迹Westernblot(WB)检测。
经过WB检测B HA1c-trimer及B HA1-monomer能够正常表达，且BHA1c-trimer表达水平显著高于B HA1-monomer(如图15所示)，所以我们选择B HA1c-trimer构建体作为优选方案，B HA1-monomer作为对照构建继续进行后续实验。
实施例15：B HA1c-trimer、B HA1-monomer蛋白表达、纯化与鉴定
用实施例14得到的所获第3代杆状病毒进行第四代扩增后，进行病毒滴度测定。根据滴定结果选取合适的病毒MOI感染Sf9或者昆虫细胞系Hi5(Invitrogen)做表达，48小时后离心收集细胞上清。
将收集的上清，以5000rpm离心30分钟，经过0.22μm滤膜过滤，与HisTrap excel柱结合(5mL，GE Healthcare)，以20mM Tris、150mM NaCl、pH8.0、20mM咪唑洗脱非特异结合的蛋白，以20mM Tris、150mM NaCl、pH8.0、100mM咪唑洗脱目的蛋白。收集目的蛋白浓缩后进行分子筛层析Superdex 200Increase 10/300GL或Superdex 200Hiload 16/60(GEHealthcare)。目的峰通过SDS-PAGE(还原性)确定，结果如图16、图17所示。得到纯化的BHA1c-trimer及B HA1-monomer抗原。经过分析超速离心，结果如图18所示，测得B HA1c-trimer的分子量为194kDa，与三聚体理论分子量一致(B HA1蛋白单体的分子量为34kDa，三聚体标签为9kDa，整体三聚体理论分子量约207kDa)，可以判定为三聚体。
实施例16：小鼠免疫实验
将实施例15得到的B HA1-monomer、B HA1c-trimer抗原按照下表3的方法于生理盐水中稀释，并与等体积佐剂进行分组乳化，然后对6周龄的Balb/c小鼠(维通利华)进行分组免疫。免疫策略为通过大腿肌肉注射的方式，每只小鼠分别在第0天进行1次疫苗免疫，每次100μL的接种体积。第14天对小鼠进行尾部取血。小鼠血清在静置一段时间后血清析出，通过3000rpm离心10分钟获得血清，将血清在56℃，30分钟灭活后，用于ELISA结合检测。
表3：动物免疫分组情况
Figure BDA0003446793610000151
实施例17：小鼠免疫后血清ELISA检测实验
将上一步实施例16制备的小鼠血清，进行ELISA检测，测定HA1特异性抗体水平。向ELISA板中的每孔加入200ng实施例15得到的纯化的B HA1-monomer蛋白，然后各孔用ELISA包被液(50mM的Na2CO3、NaHCO3缓冲液，pH 9.6)在4℃下包被过夜；弃去包被液后，每孔加入150μL5％脱脂奶粉室温封闭1小时。封闭结束后，用含0.05％吐温20的PBS洗ELISA板2次，每孔加入梯度稀释的抗原免疫后血清或PBS免疫后血清100μL，室温孵育1小时；弃去上清后用含0.05％吐温20的PBS洗ELISA板5次；每孔加入1∶3000稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体(二抗，购自中杉金桥)100μL，室温孵育1小时；弃去二抗后用含0.05％吐温20的PBS洗ELISA板5次，每孔加入50μL ELISA显色液显色15分钟，每孔加入50μL 2M H2SO4终止反应，酶标仪读取OD450数值；抗体滴度(Titer)计算方法为，以未加血清组的阴性对照数值×2.1倍，将高于该数值的最低稀释倍数取1g值，即算得每组血清抗体滴度。结果显示，BHA1c-trimer免疫组小鼠血清中结合B HA1抗原的抗体滴度(3.191)显著高于B HA1-monomer(2.709)及PBS对照组(1.000)(图19)，说明三聚体形式HA1的免疫原性更好。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0003446793610000171
Figure BDA0003446793610000181
Figure BDA0003446793610000191
Figure BDA0003446793610000201
Figure BDA0003446793610000211
Figure BDA0003446793610000221
Figure BDA0003446793610000231
Figure BDA0003446793610000241
Figure BDA0003446793610000251
Figure BDA0003446793610000261
Figure BDA0003446793610000271
Figure BDA0003446793610000281

Claims (10)

1.流感病毒抗原，其中
(1)所述流感病毒抗原从5’端到3’端的方向依次包括：
流感病毒A/California/07/2009H1N1 HA蛋白三聚体形成区LAH区K403-N474，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1，
以及流感病毒H1N1 HA1区，所述流感病毒H1N1 HA1区与A/California/07/2009H1N1HA1区D18-S340的氨基酸序列同源性大于90％，例如大于90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或等于100％，且存在差异的位点在流感病毒H1N1 HA1区的loop区，所述流感病毒H1N1 HA1区例如选自：
A/California/07/2009H1N1 HA1区D18-S340，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2，
或A/Michigan/45/2015 H1N1 HA1区D18-S340，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3，
或A/Brisbane/02/2018 H1N1 HA1区D18-S340，其氨基酸序列为SEQ ID NO：4，
或A/Hawaii/70/2019 H1N1 HA1区D18-S340，其氨基酸序列为SEQ ID NO：5；
(2)所述流感病毒抗原从5’端到3’端的方向依次包括：
流感病毒A/Califomia/07/2009 H1N1 HA蛋白三聚体形成区LAH区K403-N474，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1，
以及流感病毒H3N2 HA1区，所述流感病毒H3N2 HA1区与A/HongKong/45/2019 H3N2HA1区D18-E341的氨基酸序列同源性大于90％，例如大于90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或等于100％，且存在差异的位点在流感病毒H3N2 HA1区的loop区，所述流感病毒H3N2 HA1区例如选自：
A/HongKong/45/2019 H3N2 HA1区D18-E341，其氨基酸序列为SEQ ID NO：6，
或A/Kansas/14/2017 H3N2 HA1区D18-E341，其氨基酸序列为SEQ ID NO：7，
或A/Singapore/INFIMH-160019/2016 H3N2 HA1区D18-E341，其氨基酸序列为SEQ IDNO：8，
或A/Hong Kong/4801/2014 H3N2 HA1区D18-E341，其氨基酸序列为SEQ ID NO：9；或
(3)所述流感病毒抗原从5’端到3’端的方向依次包括：
流感病毒A/California/07/2009 H1N1 HA蛋白三聚体形成区LAH K403-N474，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1，
以及B型流感病毒HA1区，所述B型流感病毒HA1区与B/Brisbane/60/2008 HA1区D16-A356的氨基酸序列同源性大于90％，例如大于90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或等于100％，且存在差异的位点在B型流感病毒HA1区的loop区，所述B型流感病毒HA1区例如选自：
B/Brisbane/60/2008 HA1区D16-A356，其氨基酸序列为SEQ ID NO：10，
或B/Colorado/06/2017 HA1区D16-A354，其氨基酸序列为SEQ ID NO：11，
或B/Washington/02/2019 HA1区D16-A356，其氨基酸序列为SEQ ID NO：12；
优选地，其中所述流感病毒抗原为三聚体蛋白。
2.如权利要求1所述的流感病毒抗原，其进一步包括在5’端的分泌信号肽(例如氨基酸序列为SEQ ID NO：13的流感病毒A/California/07/2009H1N1 HA蛋白信号肽，氨基酸序列为SEQ ID NO：14的GP67信号肽，或其他流感病毒H1N1 HA1、流感病毒H3N2 HA1或B型流感病毒HA1的信号肽)以及在3’端的纯化标签(例如，6×His标签)和终止密码子(例如：TAA、TAG或TGA)。
3.如权利要求1或2所述的流感病毒抗原，其包含如下列(1)或(2)所示氨基酸序列：
(1)如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25所示的流感病毒抗原的氨基酸序列；
(2)(1)中的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个氨基酸或更多个氨基酸且不改变(1)的抗原性的由(1)衍生的多肽或其类似物，且自身能够形成三聚体。
4.分离的多核苷酸，其编码权利要求1-3中任一项所述的流感病毒抗原，优选地所述分离的多核苷酸包含如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ IDNO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38或SEQID NO：39所示的序列。
5.重组载体或者表达盒，其包含权利要求4所述的分离的多核苷酸。
6.转基因细胞系或者重组菌，其包含权利要求5所述的重组载体或者表达盒。
7.如权利要求6所述的转基因细胞系，其源自昆虫细胞，例如昆虫细胞Sf9或Hi5。
8.如权利要求1-3中任一项所述的流感病毒抗原在制备抗流感病毒药物，例如疫苗中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其中将所述流感病毒抗原与佐剂合用。
10.试剂盒，其含有如权利要求1-3中任一项所述的流感病毒抗原、如权利要求4所述的分离的多核苷酸，或者如权利要求5所述重组载体或者表达盒，如权利要求6所述的转基因细胞系或者重组菌，优选地，所述试剂盒进一步包含佐剂。
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