CN116769007A - 蜈蚣镇痛多肽PvTx及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
蜈蚣镇痛多肽PvTx及其编码基因和应用，涉及生物医学技术领域。所述的蜈蚣镇痛多肽PvTx，由SEQ ID NO:1中的氨基酸序列组成。编码蜈蚣镇痛多肽PvTx基因序列如SEQ ID NO:2所示。蜈蚣镇痛多肽PvTx作为TRPV1通道激动剂介导TRPV1脱敏反应药物的应用。蜈蚣镇痛多肽PvTx通过激活TRPV1介导TRPV1热激活通路的失活，产生镇痛活性，作为制备镇痛药物的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及蜈蚣镇痛多肽PvTx及其编码基因和应用。
背景技术
少棘蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans)是我国传统的动物中药，具有息风镇痉、通络止痛和攻毒散结的功效。少棘蜈蚣是一种典型的产毒动物，其毒腺可以产生和分泌种类复杂、功能多样的活性多肽，这些多肽主要通过靶向人或者其他动物肌肉、神经或者心血管等系统的离子通道类受体来发挥功能，由于离子通道在人体的肌肉、神经和心血管等系统扮演着功能调节的关键作用，因此，蜈蚣叮咬时释放的毒液，会导致相应的离子通道受体功能紊乱，从而产生肌肉强直、神经麻痹和心脏功能异常等中毒症状。因此，少棘蜈蚣毒液是人类从自然中获取人类离子通道受体调控多肽的天然宝库，通过改造和可控的使用蜈蚣中靶向离子通道的活性多肽，我们便可以人为的调控由离子通道受体所介导的生理行为，譬如调控心脏功能、神经系统兴奋性或者疼痛感知等，从而实现变毒为药的过程。
TRPV1是一种离子通道蛋白，在人类的痛觉感知和体温调节等生理活动中扮演着重要角色，可以被物理或化学刺激激活，如伤害性热刺激、2APB、质子、辣椒素等化学物质。这些刺激使TRPV1由关闭态转化为开放态，引起胞外阳离子内流，改变可兴奋细胞的细胞膜兴奋性，进而引起一系列的生理现象，比如辣椒引起的灼热感和高温灼烧带来的痛感。因此，阻断TRPV1的激活就能防止痛觉的产生。然而，由于TRPV1参与人体体温的调控，因此阻断TRPV1会导致体温上升，从而导致一系列生理功能的异常。因此，通过阻断TRPV1来开发药物存在着巨大的开发难度。
目前以TRPV1离子通道作为靶点的药物开发种类极少，相关产品还有待继续开发。
公开号为CN105085646A，专利名称为“蜈蚣镇痛多肽SLP_RhTx及其基因和应用”给出了蜈蚣镇痛多肽SLP_RhTx，SLP_RhTx的成熟肽序列为：LNNPCNGVTCPSGYRCSIVDKQCIKKEK，通过激活TRPV1介导TRPV1热激活通路的失活，产生镇痛活性，作为制备镇痛药物的应用。并公开了蜈蚣镇痛多肽SLP_RhTx可以激活并随之失活TRPV1通道，特异性地失活TRPV1热激活通路，从而产生强效的镇痛功能，同时并不影响体温调节系统的平衡。
公开号为CN104356218A，专利名称为“少棘蜈蚣镇痛肽前体蛋白Ssm-A及其产物Ssm-A1和Ssm-A2的制备”，公开了少棘蜈蚣镇痛肽前体蛋白Ssm-A，活性天然产物Ssm-A1，活性天然产物Ssm-A2。并给出了少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A1和Ssm-A2在制备疼痛治疗药物中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种少棘蜈蚣多肽毒素PvTx及其基因和应用。
本发明的蜈蚣镇痛多肽PvTx，所述的PvTx氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
本发明编码蜈蚣镇痛多肽PvTx的基因，所述的编码蜈蚣镇痛多肽PvTx的基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。
本发明的蜈蚣镇痛多肽PvTx应用，它用于制备镇痛药物。
进一步地，所述的蜈蚣镇痛多肽PvTx用于制备以TRPV1作为靶点的镇痛药物。
本发明的蜈蚣镇痛多肽PvTx应用，它用于制备辅助研究镇痛药物的分子工具。
本发明提供的少棘蜈蚣多肽毒素PvTx，是从少棘蜈蚣粗毒中通过分子筛和反相高效液相色谱法分离纯化得到，其氨基酸序列(SEQ ID NO:1)为AEPKRCSAERVKHCRERKCASPCCRDGECHCGCK，该多肽包括34个氨基酸残基，分子量为3829.15Da，等电点为8.74，分子内含有四对二硫键，其配对方式为1-2，3-7，4-8，5-6。
少棘蜈蚣多肽毒素PvTx的基因克隆包括：
少棘蜈蚣毒腺总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及构建cDNA文库，设计引物，利用PCR方法获得PvTx基因。一对简并引物(5'GCAGTTGTCATTATACAATCT 3'，5'CGRCAASTYTRATCATTTASA 3')用于扩增蜈蚣镇痛多肽PvTx的成熟肽部分，另一对简并引物(5'CCRCSCYARAAATCCTSAAAN 3'，5'GCAGAACATCTTTTAGGTTCT 3')用于扩增蜈蚣镇痛多肽PvTx的信号肽部分。
基因测序结果表明，PvTx的基因(SEQ ID NO:2)由177个核苷酸组成，自5’端到3’端基因序列为，
ATGAATCGAACATTGACTATGATTTTTCTCCTCTGTTTGATATCTTGTTATGCAGTTGTCATTATACAATCTGCAGAACCTAAAAGATGTTCTGCTGAACGAGTAAAACATTGCCGAGAACGCAAATGTGCAAGCCCTTGTTGC CGAGATGGAGAATGCCATTGCGGCTGTAAATGA。下划线部分片段为编码蜈蚣镇痛肽PvTx成熟肽的核苷酸序列。
本发明镇痛肽可以激活TRPV1通道并特异性地介导TRPV1热激活通路失活，从而产生强效的镇痛功能，同时并不影响体温调节系统的平衡。另外该镇痛肽具有结构简单、人工合成方便、起效迅速，镇痛活性强等特点，是以TRPV1作为镇痛药物靶点的优秀候选药物分子，具有重要的镇痛药物开发应用前景。
本发明与《蜈蚣多肽SLP_RhTx及其基因和应用》存在以下区别：(1)PvTx和SLP_RhTx的氨基酸序列完全不同，SLP_RhTx的成熟肽序列为：LNNPCNGVTCPSGYRCSIVDKQCIKKEK，本发明PvTx的序列为：AEPKRCSAERVKHCRERKCASPCCRDGECHCGCK，两者没有相似性，本发明PvTx是一个全新的多肽序列；(2)PvTx和SLP_RhTx的编码基因序列完全不同，本发明PvTx为一个全新的基因；(3)PvTx和SLP_RhTx均可以作用于TRPV1靶点，但PvTx和SLP_RhTx的氨基酸序列不一样，因此其发挥功能的关键氨基酸位点以及与TRPV1靶点的结合过程是完全不同的。
本发明在少棘蜈蚣毒液中筛选出一条全新的多肽，据功能试验验证，与现有少棘蜈蚣多肽的关键氨基酸位点存在明显差异，并且这条全新多肽与TRPV1靶点结合过程完全不同，这为以TRPV1开发新的药物提供了新思路。
附图说明
图1为实施例的蜈蚣毒素经过G50分子筛的分离图，其中，A为215nm吸收值曲线，B为280nm吸收值曲线，Ⅳ号峰为目的峰；
图2为蜈蚣毒素反向HPLC分离图，其中箭头为目的多肽PvTx；
图3为镇痛肽PvTx分子的质谱鉴定图；
图4为镇痛肽PvTx激动小鼠TRPV1通道电流曲线图；
图5为镇痛肽PvTx、辣椒素Cap和2APB在小鼠TRPV1上的浓效依赖关系曲线图；其中，A为Cap曲线，B为PvTx曲线，C为2APB曲线；
图6为蜈蚣镇痛肽PvTx介导体内TRPV1的失活产生镇痛活性与加入量关系柱状图。
具体实施方式
1.蜈蚣镇痛多肽PvTx的分离纯化
1.1Sephadex G-50凝胶过滤层析：
100mg冻干蜈蚣粗毒溶于10mL 0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.0)，12000rpm离心10分钟，取上清液用0.45μm滤膜过滤后上样于Sephadex G-50凝胶过滤柱(26×100cm)进行初步分离纯化。洗脱液为磷酸盐缓冲液，流速设置为2mL/min，洗脱液经215nm和280nm紫外检测样本中蛋白质或者多肽浓度(图1)，合并具有镇痛活性的部分，冻干后保存于-20℃。
1.2反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离：
用2mL 0.1M磷酸盐缓冲液溶解具有镇痛活性的部分，4℃，12000rpm离心15min，取上清用0.45μm滤膜过滤，上样于反相液相色谱C18柱，以水和乙腈构成的洗脱系统洗脱，设置流速为1mL/min。收集镇痛肽PvTx(图2)，冻干，保存于-20℃。使用Edman降解法对纯化所得的镇痛肽PvTx纯品进行N-端测序(model 491，ABI)。使用飞行质谱(MOLIDI-TOF)测定镇痛肽PvTx分子量(图3)。
蜈蚣镇痛多肽PvTx是少棘蜈蚣基因编码的一种单链多肽，分子量3829.15道尔顿。蛋白序列为：AEPKRCSAERVKHCRERKCASPCCRDGECHCGCK。
2.少棘蜈蚣镇痛肽PvTx基因克隆
2.1少棘蜈蚣毒腺总RNA提取：
A.取活少棘蜈蚣毒腺组织于液氮中保存，取500mg组织，加入10mL总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBCOBRL公司)，使用组织研磨机4℃研磨至匀浆。
B.加入等体积酚/氯仿溶液，震荡之后，室温静置10min，4℃，12000rpm离心10min，取上清，弃掉沉淀。
C.上清液加入等体积异丙醇，-20℃放置10min，4℃，12000rpm离心10min，沉淀用75％乙醇洗3次，晾干，管底沉淀物即为少棘蜈蚣毒腺总RNA。
2.2少棘蜈蚣毒腺mRNA的纯化：
少棘蜈蚣毒腺mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的mRNAIsolationSystems试剂盒。
1)A液：取500μL DEPC水溶解少棘蜈蚣毒腺500μg总RNA，65℃水浴10min，加入3μL的Oligo(dT)探针与13μL 20×SSC溶液，混匀，室温冷却。
2)B液：磁珠(SA-PMP)加水轻弹混匀后，磁力架吸附30s，弃上清，加入0.5×SSC悬浮，至磁力架吸附30s，最后加0.1mL 0.5×SSC悬浮。
3)A液加入B液，室温，静置10min，磁力架吸附30s，弃上清，0.1×SSC洗涤4次，弃上清。加入0.1mL DEPC水重新悬浮，磁力架吸附30s，收集上清，此时上清中为纯化的少棘蜈蚣毒腺mRNA。
4)加入1/10体积的3M乙酸钠，pH 5.2，等体积异丙醇，-70℃静置30min，4℃，12000rpm离心10min，弃上清，10μL DEPC沉淀溶解沉淀。
2.3少棘蜈蚣毒腺cDNA文库构建：采用CLONTRCH公司Creator SMART cDNALibraryConstruction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒。
2.3.1cDNA第一链合成(mRNA反转录)：
1)在0.5mL无菌的离心管加入1μL少棘蜈蚣毒腺mRNA、1μL SMART IV寡聚核苷酸、1μL CDS III、3’PCR引物，加2μL去离子水使总体积达到5μL。
2)混匀离心管中的试剂并离心，72℃保温2分钟，冰上孵育2min。在离心管中加入1.0μL 20mM二硫苏糖醇(DDT)、1.0μL 10mM dNTP混合物、1.0μL PowerrScript反转录酶、2.0μL 5×第一链缓冲液，混匀，离心。
3)42℃1h。
4)置于冰上，终止第一链的合成。
5)取2μL合成的cDNA第一链备用。
2.3.2长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链
1)PCR仪95℃预热。
2)2μL cDNA第一链(mRNA反转录)、80μL去离子水、10μL 10×Advantage 2PCR缓冲、2μL 50×dNTP混合物、2μL 5’PCR引物、2μL CDS III/3’PCR引物以及2μL大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。
3)在PCR仪中按以下程序扩增：95℃20s，22循环，95℃5s，68℃6min。
4)循环结束后，抽提离心管中合成的cDNA双链。
2.3.3使用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(PROMEGA公司)试剂盒抽提PCR产物，步骤如下：
1)将通过PCR得到的cDNA双链产物与等体积膜结合缓冲液混匀，之后转入离心纯化柱，室温静置5min后，16000g离心1min，倒掉收集管内废液。
2)加入700μL含乙醇洗脱液，16000g离心1min，倒掉收集管内废液。
3)重复步骤2。
4)16000g离心5min
5)将离心纯化柱置于新的离心管中。
6)16000g离心1min，管底溶液即为所纯化的cDNA双链。
2.3.4感受态细胞DH5α的制备：
1)挑选单个DH5α菌落，接种于3mL不含氨苄青霉素LB培养基中，37℃培养过
夜，次日取菌液，按1：100再接种于50mL LB培养液中，37℃震荡2h。当OD600为0.35，获得细菌培养物。
2)将培养物转移到已消毒的一次性50mL聚丙烯管中(冰块预冷)，冰上静置10min。
3)4℃，400r/min离心，回收菌体。
4)倒出上清，保留沉淀，倒置1min排尽残留培养液。
5)每50mL细菌培养物用2mL已经预冷的0.1M CaCl2重悬，分装备用。
2.3.5酶切、连接以及连接产物的转化：
1)在微量离心管中加入1μL Takara pMD18-T载体、4μL少棘蜈蚣cDNA双链溶液，全量为5μL。
2)加入5μL(等量)的连接酶缓冲混合物。
3)16℃反应2h。
4)全量(10μL)加入至100μL DH5α感受态细胞中，置于冰中30min。
5)42℃加热90s，冰中静置1min。
6)加入37℃预热过的LB培养基890μL，37℃缓慢震荡培养60min。
7)取200μL培养基涂布于含X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上37℃培养16h。
8)每个LB平皿用5mL LB培养基洗涤菌落，加入30％甘油。此时构建的cDNA
约含1×106个单独克隆。
3.蜈蚣镇痛肽PvTx基因克隆筛选
一对简并引物(5'GCAGTTGTCATTATACAATCT 3'，5'CGRCAASTYTRATCATTTASA
3')用于扩增蜈蚣镇痛多肽PvTx的成熟肽部分，另一对简并引物(5'CCRCSCYARAAATCCTSAAAN 3'，5'GCAGAACATCTTTTAGGTTCT 3')用于扩增蜈蚣镇痛多肽PvTx的信号肽部分。
PCR反应条件如下：94℃30s，60℃30s，72℃45s，35个循环。
将PCR反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA纯化试剂盒进行纯化。将纯化的目的片段，连接到pMD19-T载体上，获得连接产物。接着，转化至DH5α感受态细胞中，经在Amp抗性的LB平板上，培养16h后形成单菌落。
挑取含目的片段的阳性克隆送DNA测序公司测序。蜈蚣镇痛肽PvTx基因序列如SEQID NO:2所示。
4.蜈蚣镇痛肽PvTx对小鼠TRPV1通道的作用
通过瞬转表达体系，使HEK293过表达小鼠TRPV1通道，研究PvTx与TRPV1的相互作用。
倒置显微镜下选择细胞膜较为光滑、细胞质均匀的细胞，使用EPC-9膜片钳放大器(HEKA公司，德国)进行实验记录。在室温20-25℃条件下进行膜片钳试验。五步拉制法制备硼硅酸盐玻璃微电极(505℃、速度19)，电极阻抗约为3～5MΩ，高温抛光后置于电极盒备用。在电极与细胞膜形成高阻(1～5GΩ)封接后，-80mV电压钳制将膜吸破，形成全细胞状态进行电流记录。待测样本采用对应通道的电极浴液配制，通过切换灌流管给药，灌流管每个管口直径0.5mm，管口距所记录的细胞<100μm。在成功封接破膜形成全细胞膜片钳记录模式后，通过rsc-200灌流加药系统切换灌流管。串联电阻(Rs)在实验过程中始终保持在5-8MΩ的范围之内保持不变，系统串联电阻补偿一般在30-60％。试验数据使用PatchMaster软件分析，数据的进一步分析使用Igor软件。所有结果均采用平均值(Average)±标准误差(SEM)的形式表示，n表示试验的数据个数。
PvTx可以激动TRPV1通道(图4)，并呈现浓度依赖关系，其IC50为202.8±49.1μM(n＝3)(图5)。
5.PvTx介导TRPV1脱敏并产生镇痛作用
实验采用雄性C57B/6小鼠(18-22g)，分为四组(n＝3)。样品溶于无菌生理盐水，采用尾静脉注射方式给药，阴性对照给予相同体积的生理盐水。给药10min后，用红外测痛仪研究小鼠尾部对热辐射的反应时间。
在甩尾试验中，由于PvTx介导的TRPV1通道失活，产生了显著的镇痛活性，且PvTx产生的镇痛活性呈现浓度依赖的特性(图6)。
Claims (5)
1.蜈蚣镇痛多肽PvTx，其特征在于所述的PvTx氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
2.编码权利要求1所述的蜈蚣镇痛多肽PvTx的基因，其特征在于所述的编码蜈蚣镇痛多肽PvTx的基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。
3.如权利要求1所述的蜈蚣镇痛多肽PvTx应用，其特征在于所述的蜈蚣镇痛多肽PvTx用于制备镇痛药物。
4.根据权利要求3所述的蜈蚣镇痛多肽PvTx应用，其特征在于所述的蜈蚣镇痛多肽PvTx用于制备以TRPV1作为靶点的镇痛药物。
5.如权利要求1所述的蜈蚣镇痛多肽PvTx应用，其特征在于所述的蜈蚣镇痛多肽PvTx用于制备辅助研究镇痛药物的分子工具。
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