CN113912675A

CN113912675A - 一种具有镇痛活性的蜈蚣多肽及其应用

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Publication number: CN113912675A
Application number: CN202111114047.7A
Authority: CN
Inventors: 徐寒梅; 戚微岩; 于瑞河; 刘晨
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2021-09-23
Filing date: 2021-09-23
Publication date: 2022-01-11
Anticipated expiration: 2041-09-23
Also published as: CN113912675B

Abstract

本发明公开了一类具有镇痛活性的蜈蚣多肽及其应用，属于生物医药技术领域。本发明中，所述多肽具有氨基酸序列X_a‑X_b‑X_c‑Val‑Val‑Thr‑X_d‑X_e‑X_f‑X_g，或其药学上可以接受的盐，该多肽对机械刺激性、理化刺激性、神经病理性疼痛具有良好抑制作用，镇痛效果在各实验模型中表现良好，具体效果为显著提高小鼠痛阈值，延长小鼠热耐受时间，小鼠自主运动、兴奋性等不良反应均低于正常值。

Description

一种具有镇痛活性的蜈蚣多肽及其应用

技术领域

本发明属于生物药物领域，更具体地说，涉及一类具有镇痛活性的蜈蚣多肽及其应用。

背景技术

少棘蜈蚣是我国的一种传统中药，有败毒抗癌、息风解痉之功效。少棘蜈蚣(S.subspinipesmutilans L.Koch)是模棘蜈蚣的近似种。主要分布于中国和日本。在长江中下游常见。白天潜伏在石块下或乱石间，黑夜四出捕食昆虫(如蟀蟋、蚱蜢、金龟子和各种蛾类)，也能用毒颚杀死小型的脊椎动物(如麻雀、蜥蜴、蛇等)。对于人类而言，少棘蜈蚣的叮咬会产生剧烈的疼痛，这种疼痛类似于高温灼烧感。近年来，人们通过分离纯化技术从蜈蚣毒液中提取到许多活性分子。

疼痛的产生过程比较复杂，涉及到疼痛感受器、传导神经、疼痛中枢等因素。引发疼痛的原因主要有以下几点：(1)外界存在的一系列机械性刺激以及发生炎症反应时组织的局部水肿，会压迫神经末梢引起疼痛；(2)物理及化学性质的刺激会通过感觉神经元使痛觉中枢产生兴奋，引起疼痛；(3)周围神经的病理性损伤使交感神经纤维受到刺激，最终刺激大脑皮质过度兴奋，引起神经病理性疼痛；(4)机体受到外界刺激后由损伤细胞或者伤害性感受器释放的致痛物质会刺激局部感受器，使中枢神经系统兴奋引起疼痛。

早期的镇痛药大致可以分为非甾体类(阿司匹林)，阿片受体类(吗啡)以及其他辅助性镇痛药(抗惊厥)。它们对于慢性疼痛、神经病理性疼痛以及炎症都具有较好的作用效果，但局限性和副反应一直是一个瓶颈问题得不到很好的改善。例如阿司匹林对人体循环系统损伤较大，尤其是消化与造血系统；吗啡具有严重的成瘾性、耐受性、呼吸窘迫等一系列不良反应；抗惊厥药物的过敏性及副反应也一直得不到很好的改善。寻找新靶点的镇痛药或创造优化新结构化合物一直是药学工作者需要迫切解决的问题。相对于传统镇痛药而言，作用于离子通道类镇痛多肽由于来源广泛、毒副作用小、半衰期长、药效明显等特点为研究者带来了新的曙光。生物膜离子通道(ion channels of biomembrane)是一类贯穿细胞膜脂质双分子层且中央带有亲水性孔道的膜蛋白，是神经、骨骼肌、心肌细胞等生物电产生的基础。此通道与感受器电位发生、神经兴奋传导和中枢神经系统调控等多种生命活动过程密切相关，并伴有高度选择性。根据某一种特定的生物膜离子通道只允许一种或几种特定的离子发生高渗，可分为钠离子通道、钾离子通道、钙离子通道和酸性敏感离子通道等。一般Ca²⁺离子和K⁺离子在细胞膜内外保持平衡，通过调节中枢内钾离子和钠离子的浓度，可以抑制神经元的兴奋性，这也是中枢神经系统发挥中枢镇痛作用的一种机制。而Na⁺离子通道的活动性决定了痛觉冲动的形成和传递，许多镇痛药都是通过抑制电压门控钠离子通道，阻断痛觉兴奋传导通路。近年，随着关于疼痛分子机理研究的深入，研究者发现离子通道的构象变化与机体是否产生疼痛息息相关，其中钠离子通道(Na_V)起到了最主要作用。现代分子生物学研究表明该亚型Na_V1.7是一种治疗疼痛的新靶点，在发挥正常生理功能时可使兴奋细胞去极化，并将信号分子通过突触从灰质后角传输到伤害性感受器，最终使机体出现痛觉反应。在动物毒素中存在大量作用于离子通道的多肽，极具开发空间。现研究较为透彻的几种多肽结构有从少棘蜈蚣中提取的μ-SLPTXSsm6a；从东亚钳蝎中提取的BmKAGAP；从虎纹捕鸟蛛中提取的HWTX-I；从黑曼巴蛇中提取的Mambalgins等。

毒素多肽的研究一直是领域内的热点，例如，中国专利申请号为CN201510413789.8，申请公布日为2015年11月25日的专利文件公开了一种蜈蚣镇痛多肽SLP_RhTx，其基因以及应用。所述蜈蚣镇痛多肽由27个氨基酸组成，分子量为2967.3道尔顿，全序列为LNNPCNGVTCPSGYRCSIVDKQCIKKE。所述蜈蚣镇痛多肽可以激活并随之失活TRPV1通道，特异性地失活TRPV1热激活通路，从而产生镇痛功能。但是目前从蜈蚣中提取蜈蚣毒素多肽的方法比较复杂，纯化方法繁琐。本发明借助高通量测序技术，联合计算机模拟分析，又经体内实验验证，高效快捷的筛选得到一类具有良好镇痛活性及低毒副作用的蜈蚣多肽。

发明内容

1.要解决的问题

针对现有的镇痛药物存在毒副作用等问题，本发明提供一类具有镇痛活性的蜈蚣多肽及其应用，本发明的多肽作用于离子通道，具有镇痛功效，经各种实验模型验证，具有较好的镇痛效果且耐受性等不良反应较低，极具开发前景。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一类具有镇痛活性的蜈蚣多肽，具有氨基酸序列X_a-X_b-X_c-Val-Val-Thr-X_d-X_e-X_f-X_g，所述的X_a、X_b、X_c、X_d、X_e、X_f、X_g为任意氨基酸或缺失，仍具有镇痛作用的多肽，或其药学上可以接受的盐。

更进一步地，所述的多肽序列在上述的序列基础上，所述的X_a为Pro、Ser、Thr中任意一种或缺失，X_b为Ala、Phe中任意一种或缺失，X_c为Pro、Gly或Thr中任意一种或缺失，X_d为Tyr、Ser或Thr中任意一种或缺失，X_e为Gly、Ser中任意一种或缺失，X_f为Gly、Thr中任意一种或缺失，X_g为Phe、Thr中任意一种或缺失仍具有镇痛作用的多肽，仍具有镇痛作用的多肽，或该多肽药学上可以接受的盐。

上述的多肽在制备预防和/或治疗疼痛的产品中的应用。

一种预防和/或治疗疼痛的产品，其活性成分为上述的多肽。

上述产品具体可为药物。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂和稳定剂等。

本发明的药物可以制成注射液、干粉针剂、片剂或粒剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

更进一步地，所述的疼痛包括机械刺激性、理化刺激性或神经病理性疼痛。

现阶段临床中以抗炎性镇痛药及阿片类镇痛药为主。抗炎性镇痛药临床主要用于慢性钝痛如头痛、牙痛、肌肉关节痛、痛经等，这类药不易成瘾，在临床上运用十分广泛。阿片类镇痛药(麻醉性镇痛药)，是一类能消除或减轻疼痛并改变对疼痛情绪反应的药物，但是会存在一定的副作用，如便秘、嗜睡、感觉迟钝、恶心、呕吐、呼吸抑制和依赖性等，对生理与心理会产生严重的依赖性，所以严重限制了它在临床上的广泛应用。除麻醉性镇痛药，很多作用于中枢神经系统的药物都被应用于控制疼痛，如抗抑郁药、抗惊厥药、神经安定药等，在一定程度上具有直接的镇痛作用或潜在的镇痛活性，但副反应随着剂量的增大越发剧烈。例如阿司匹林对人体循环系统损伤较大，尤其是消化与造血系统；吗啡具有严重的成瘾性、耐受性、呼吸窘迫等一系列不良反应；抗惊厥药物的过敏性及副反应也一直得不到很好的改善。因此，本发明通过高通量测序技术，获得少棘蜈蚣mRNA转录组，利用本实验室构建的多肽活性筛选平台进行分析筛选，再利用各种实验动物模型筛选，最终获得具有全新结构的作用于离子通道的镇痛多肽。并且，经各种实验模型验证，其耐受性等不良反应较低，极具开发前景。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)已上市镇痛多肽齐考诺肽含有2对二硫键，具有复杂的二级结构，合成时易发生错配，合成工艺复杂且成本较高，而本发明的蜈蚣多肽为单一链状结构，结构简单，容易合成、分离和纯化；

(2)一线镇痛药物吗啡具有严重的成瘾性、耐受性、呼吸窘迫等一系列不良反应，而本发明的蜈蚣多肽不良反应和毒副性反应均较弱；

(3)本发明涉及的多肽镇痛效果在各实验模型中表现良好，具体效果为显著提高小鼠痛阈值，延长小鼠热耐受时间，且起效较快。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员均可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修饰或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1

本发明涉及的一类具有镇痛活性的蜈蚣多肽

其一命名为WG-11，其具有氨基酸序列Pro-Ala-Pro-Val-Val-Thr-Tyr-Gly-Gly-Phe，或者该多肽在药学上可接受的盐，具有镇痛作用，这类多肽对理化刺激性、病理性、神经性疼痛具有良好抑制作用；

其二命名为WG-12，其具有氨基酸序列Gly-Val-Val-Thr，或者该多肽在药学上可接受的盐，具有镇痛作用，这类多肽对理化刺激性、病理性、神经性疼痛具有良好抑制作用；

其三命名为WG-13，其具有氨基酸序列Val-Val-Thr-Tyr-Gly-Thr-Phe，或者该多肽在药学上可接受的盐，具有镇痛作用，这类多肽对理化刺激性、病理性、神经性疼痛具有良好抑制作用；

其四命名为WG-14，其具有氨基酸序列Thr-Phe-Pro-Val-Val-Thr，或者该多肽在药学上可接受的盐，具有镇痛作用，这类多肽对理化刺激性、病理性、神经性疼痛具有良好抑制作用；

其五命名为WG-15，其具有氨基酸序列Pro-Val-Val-Thr-Ser-Gly，或者该多肽在药学上可接受的盐，具有镇痛作用，这类多肽对理化刺激性、病理性、神经性疼痛具有良好抑制作用。

实施例中以多肽WG-11、WG-12、WG-13、WG-14、WG-15作为对象，研究其抑制疼痛的活性，该类多肽纯度为95％以上。

实施例2

镇痛多肽在镇痛热板实验中对疼痛的抑制作用

昆明种小鼠，雌性，体重20±2g。室内温度保持在20～24℃。将小鼠放在温度为55±0.5℃的恒温金属板上，以小鼠接触金属板开始计时，至其出现舔后足或跳跃反应的时间为其痛阈指标。

1.实验动物：昆明种雌性小白鼠

小鼠饲养于实验鼠笼具通风系统中；饲养温度22℃左右；正常昼夜更替；所有实验动物自由饮水摄食；所购实验动物，在本实验室饲养3～5天适应实验环境；所有动物实验均在8:00～18:00进行；实验动物给药后均为单笼饲养。

2.实验设备：电子天平、热板测试仪、笼具通风系统、1mL注射器、Ultra超纯水系统

3.实验试剂：蜈蚣多肽WG-11、蜈蚣多肽WG-12、蜈蚣多肽WG-13、蜈蚣多肽WG-14、蜈蚣多肽WG-15、0.9％的NaCl溶液、盐酸吗啡注射液。

4.实验方法：实验前先测基础痛阈，测两次取平均值计算，两次中间间隔5分钟。剔除反应潜伏期小于10s或大于30s的小鼠。为防止小鼠足部烫伤，设60s为截止时间。将筛选合格的小鼠按随机数字表分为阴性对照组、阳性对照组和蜈蚣多肽WG-11组、蜈蚣多肽WG-12组、蜈蚣多肽WG-13组、蜈蚣多肽WG-14组、蜈蚣多肽WG-15组共7组，每组10只。其中阴性对照组注射0.9％的NaCl溶液；阳性对照组注射剂量为5mg/kg的吗啡；蜈蚣多肽WG-11组、蜈蚣多肽WG-12组、蜈蚣多肽WG-13组、蜈蚣多肽WG-14组、蜈蚣多肽WG-15组作为实验组，分别给予对应的药物，给药剂量为20mg/kg。给药途径：腹腔注射。

分别在给药后15、30、60、90、120、180、300min后再次记录小鼠痛阈值，实验独立重复3次，结果用

表示，并进行统计T检验，与生理盐水阴性组对比，*P<0.05为显著性差异，**P<0.01为极显著性差异；与阳性对照组对比，^P<0.05为显著性差异，^^P<0.01为极显著性差异。各组内比较给药前后小鼠对热板的耐受时间变化，组间比较各组小鼠痛阈值大小。计算给药后可能最大镇痛百分率，评价药物的镇痛效果。

5.实验结果：

5.1小鼠热阈值检测结果

蜈蚣多肽组在热板镇痛动物模型中能发挥良好的镇痛作用，结果见表1：与生理盐水阴性组相比，五种蜈蚣多肽均可有效提高小鼠热阈值。实验结果具有统计学意义。

5.2 PMAP评价结果

PAMP经计算得出WG-11约为57.23％、WG-12约为55.65％、WG-13约为54.27％、WG-14约为51.47％、WG-15约为53.32％，这五种多肽均具有很好的镇痛效果。

表1小鼠热板实验中各时间段痛阈值的检测结果

注：与阴性对照组比，*P<0.05，**P＜0.01；与阳性对照组比，^P<0.05，^^P＜0.01

实施例3

镇痛多肽在福尔马林致痛实验中对疼痛抑制率的影响

模拟急性组织损伤所致的持续性疼痛。在动物一肢足背皮下注射稀释的福尔马林溶液，导致动物的行为改变如安静时屈腿、运动时跛行以及舔足等。这些行为的程度(如舔足时间)与福尔马林浓度成正比，一般认为它是疼痛的象征。此外，其它行为如理毛、探索和运动活动等也受福尔马林注射的影响。

昆明种小鼠，雌雄各半，体重20±2g。室内温度保持在23～24℃。依据随机数字表将小鼠分组，分别设置阴性对照组、阳性对照组和蜈蚣多肽WG-11组、蜈蚣多肽WG-12组、蜈蚣多肽WG-13组、蜈蚣多肽WG-14组、蜈蚣多肽WG-15组，每组10只。其中0.9％的Na Cl溶液组作为阴性对照组；吗啡剂量为10mg/kg，作为阳性对照组；蜈蚣多肽组给药剂量为0.5umol/只。各组实验鼠给药5min后，使用1mL注射器向小鼠右后足底皮下注射5％福尔马林(甲酵含量5％)溶液20μL，注射后立即将小鼠放置于大玻璃烧杯中观察其1h内的痛反应，以舔右足时间作为行为学反应指标。在烧杯后面置一面与平台约成30°角的镜子，同时从正面和镜面用秒表记录每5s出现舔、咬、抖被注射足的累积时间，持续观察记录时间为60min，分别为Ⅰ相(0-10min)和Ⅱ相(10-60min)，利用福尔马林致小鼠炎性疼痛模型考察受试药急性给药后的镇痛作用。计算阳性对照组和蜈蚣多肽WG-11组、蜈蚣多肽WG-12组、蜈蚣多肽WG-13组、蜈蚣多肽WG-14组、蜈蚣多肽WG-15组分别对Ⅰ相和Ⅱ相疼痛反应的抑制率。

实验结果：

表2各组小鼠Ⅰ相和Ⅱ相舔足累计时间比较

注：与阴性组比，*P<0.05，**P＜0.01；与阳性对照组比，^{^}P<0.05，^{^^}P＜0.01

自主设计的镇痛多肽在福尔马林致痛实验中的数据与生理盐水组对比均具有显著性差异，与阳性对照组对比多数具有显著性差异。说明蜈蚣多肽WG-11、蜈蚣多肽WG-12、蜈蚣多肽WG-13、蜈蚣多肽WG-14、蜈蚣多肽WG-15具有良好的镇痛效果。详见表12。实验结果具有统计学意义。

实施例4

蜈蚣多肽在癌症侵袭痛模型CIP中对神经痛的影响作用

1.材料

1.1动物

雄性BALB/c小鼠，室温18～22℃，光照12h(6:00～18:00)和黑暗12h(18:00～6:00)环境，自由进水饮食饲养；预适应环境1周后，选取若干只体质量,18～22g小鼠进入正式实验(所有实验均于19:00～24:00进行)。

1.2实验装置及试剂

vonFery单纤丝；微量注射器、蜈蚣多肽WG-11溶液、蜈蚣多肽WG-12溶液、蜈蚣多肽WG-13溶液、蜈蚣多肽WG-14溶液、蜈蚣多肽WG-15溶液；生理盐水。

1.3方法

BALB/c小鼠，暴露右侧坐骨神经，将含5×10⁴Meth A肉瘤细胞的腹水注射至远离后二头肌腱分支处坐骨神经转子附近的近端神经，封闭伤口，左侧实施假手术注入相同体积的生理盐水。接种后的第2-7天使用von Fery单纤丝测试双足的机械敏感度。测定小鼠对机械刺激反应的痛阈值。将待测小鼠放在0.5×0.5cm金属网孔的疼痛测试架上，用透明塑料盒罩住，其足部可暴露于金属网孔中，待其探究活动基本消失后，依次用不同刺激力度的纤维丝，以1次/s的频率，垂直刺激小鼠双侧后肢足爪底中外侧皮肤表面，观察小鼠的缩足反应，连续试验5次，记录出现3次或3次以上缩足反应的最小纤维丝值作为小鼠的机械痛阈值。4-7天连续3天机械痛阈值≤0.07g的成模小鼠，随机分为模型组，阳性药组和蜈蚣多肽WG-11组、蜈蚣多肽WG-12组、蜈蚣多肽WG-13组、蜈蚣多肽WG-14组、蜈蚣多肽WG-15组，每组10只。其中0.9％的NaCl溶液组作为阴性对照组；吗啡剂量为10mg/kg，作为阳性对照组；蜈蚣多肽组给药剂量为20mg/kg。吗啡及蜈蚣多肽于第8、9、10天腹腔注射，模型组注射同体积生理盐水。并于第10天给药前及给药后30、60、120、180、240min等时间点测评机械痛阈值依据。

1.4机械敏感度测试结果

纤维丝测定的小鼠痛阈值

表3小鼠CIP模型第10天痛阈值

注：与阴性对照组比，*P<0.05，**P＜0.01；

实施例5

蜈蚣多肽对类风湿关节炎中关节疼痛的影响

1.材料

1.1动物

雌性Wistar大鼠，室温18～22℃，光照12h(6:00～18:00)和黑暗12h(18:00～6:00)环境，自由进水饮食饲养；预适应环境1周后，选取70只体质量，150～200g大鼠进入正式实验。

1.2实验装置及试剂

Randall-Selitto反应测定仪；弗氏不完全佐剂；弗氏完全佐剂，蜈蚣多肽WG-11、蜈蚣多肽WG-12、蜈蚣多肽WG-13、蜈蚣多肽WG-14、蜈蚣多肽WG-15；生理盐水，布洛芬。

1.3方法

取70只Wistar大鼠，每鼠右踝关节腔内注射油包水型CFA，注射针头从右外踝后外侧凹陷处刺入皮下，然后针头转向足尖部，再刺入胫腓骨和距骨之间的踝关节腔，进针深度约5mm，注射容量为0.03ml。然后随机分为7组，模型组，布洛芬组(10mg/kg)，蜈蚣多肽WG-11组、蜈蚣多肽WG-12组、蜈蚣多肽WG-13组、蜈蚣多肽WG-14组、蜈蚣多肽WG-15组，模型组给予生理盐水，其他组分别给予对应的药物，给药剂量为20mg/kg。给药途径：腹腔注射。

1.4踝关节压痛值测定

注射4周后，使用Randall-Selitto反应测定仪给鼠踝关节从侧面施加连续递增的压力，当其后足缩回时，由显示器上读出所加的压力数值(mmHg)作为压痛阈指标。

表4大鼠踝关节腔内注射佐剂后关节压痛痛阈值

注：与阴性组比，*P<0.05，**P＜0.01

实施例6

蜈蚣多肽对大鼠切口疼痛的影响

1.材料

1.1动物

雄性SD大鼠，室温18～22℃，光照12h(6:00～18:00)和黑暗12h(18:00～6:00)环境，自由进水饮食饲养；预适应环境1周后，选取60只体质量，250～300g大鼠进入正式实验。

1.2实验装置及试剂

眼科镊、手术剪，异氟醚，蜈蚣多肽WG-11、蜈蚣多肽WG-12、蜈蚣多肽WG-13、蜈蚣多肽WG-14、蜈蚣多肽WG-15；生理盐水。

1.3方法

取60只大鼠，将大鼠吸入1.4％异氟醚，左后爪进行消毒后，从足底近端0.5cm处像足趾部作一长约1cm的切口，切口皮肤后，用眼科镊挑起足底肌肉并纵向切割，但保持肌肉的起止及附着完整，按压止血后，用细线缝合皮肤共两针即成为切口疼痛模型。术后一小时给予药物，分为模型组，蜈蚣多肽WG-11组、蜈蚣多肽WG-12组、蜈蚣多肽WG-13组、蜈蚣多肽WG-14组、蜈蚣多肽WG-15组，模型组给予生理盐水，其他组分别给予对应的药物，给药剂量为20mg/kg。给药途径：腹腔注射。给药后采用累积疼痛评分法评定疼痛行为的变化。评分标准：后爪翘起不能着地，有舔足动作，记2分；后爪着地而不持重，记1分；后爪着地且持重，记0分。累积疼痛评分法：观察给药前、后1小时内疼痛行为学的变化，没5分钟1次，观察1小时，共12次，以5分钟内常出现的行为记分，总分24分。

1.4踝关节压痛值测定

用累积疼痛评分法评定疼痛行为的变化。

表5大鼠累积疼痛评分

注：与阴性组比，*P<0.05，**P＜0.01

实施例7

蜈蚣多肽在旷场实验中对小鼠自发性活动与探索行为的影响作用

1.材料与方法

1.1实验动物

昆明雌性小鼠60只。

饲养条件：室温(23±1)℃；湿度(50±5)％；日光灯采光，光暗周期12/12(光照时间为7:00～19:00)；动物自由获取水和食物。

1.2实验仪器

采用计算机实时监测分析系统SMART VIDEO-TRACKING(美国、SMARTv3.0.02)。该仪器主要由4个40cm×40cm×40cm实验敞箱组成，箱子顶部中央安置有与记录系统相连接的摄像机，通过系统分析小鼠实时图像以获得小鼠在旷场中的行为数据。

2.实验方法：

实验开始前对每只小鼠进行体质量统计学检测，剔除检测不合格的小鼠，并按照随机数字表分为阴性对照组、蜈蚣多肽WG-11组、蜈蚣多肽WG-12组、蜈蚣多肽WG-13组、蜈蚣多肽WG-14组、蜈蚣多肽WG-15组。其中生理盐水组作为阴性对照组注射0.9％NaCl溶液；蜈蚣多肽WG-11组、蜈蚣多肽WG-12组、蜈蚣多肽WG-13组、蜈蚣多肽WG-14组、蜈蚣多肽WG-15组分别给予对应药物，给药剂量为10umol/kg。给药方式为腹腔注射。

首先确认旷场装置是清洁、无味道的。在操作软件中记录小鼠的编号、日期、状态；其次，动物实验必须提前送到行为学实验室专用临时笼架，适应环境3小时左右，减少动物紧张；将小鼠从笼内取出(小鼠背向实验者)，将小鼠放置在装置中央后迅速轻柔关闭装置上盖，打开录像记录系统，记录小鼠在旷场内的活动。总时间5min。观察完后用75％乙醇及时清洗方箱内壁及底面，以免上次动物余留的信息(如动物的大、小便、气味)影响下次测试结果。最后将本轮小鼠放回笼内，开始进行下一批小鼠测试。所有小鼠观察完后间隔1h和24h分别按以上步骤再次检测相关指标。用Origin 8.0软件统计小鼠中心停留时间、运动时间、爬壁次数以及穿越格子数作为最终数据。

3.实验结果：

表6小鼠旷场实验运动距离(m)

注：与生理盐水组比，*P<0.05，**P＜0.01

表7小鼠旷场实验中心区域进入次数

注：与生理盐水组比，*P<0.05，**P＜0.01

表8小鼠旷场实验外周区域进入次数

注：与生理盐水组比，*P<0.05，**P＜0.01

表9小鼠旷场实验中心区域停留时间(s)

注：与生理盐水组比，*P<0.05，**P＜0.01

表10小鼠旷场实验外周区域停留时间/s

注：与生理盐水组比，*P<0.05，**P＜0.01

表11小鼠旷场实验中心区域运动距离(m)

注：与生理盐水组比，*P<0.05，**P＜0.01

表12小鼠旷场实验外周区域运动距离/m

注：与生理盐水组比，*P<0.05，**P＜0.01

蜈蚣多肽WG-11组、蜈蚣多肽WG-12组、蜈蚣多肽WG-13组、蜈蚣多肽WG-14组、蜈蚣多肽WG-15组在旷场实验中各项指标与生理盐水组对比均无显著性差异，对小鼠自发性行为等无明显不良状况。详见表3～9。实验结果具有统计学意义。

实施例8

蜈蚣多肽在强迫游泳实验中对小鼠抗运动疲劳的影响作用

1.材料与方法

1.1实验动物

昆明雌性小鼠70只，体质量18～22g，室温18～22℃，自由进水饮食饲养；预适应环境1周后，进入正式实验(所有实验均于19:00～24:00进行)。

1.2实验装置

实验装置均由本实验室自行制作；烧杯，恒温水浴锅，秒表，计数器，奥尼ANC酷睿HD1080P高清摄像头。

1.3方法

实验前将70只小鼠按照随机数字表分为阴性对照组、阳性对照组、蜈蚣多肽WG-11组、蜈蚣多肽WG-12组、蜈蚣多肽WG-13组、蜈蚣多肽WG-14组、蜈蚣多肽WG-15组。其中生理盐水组作为阴性对照组注射0.9％NaCl溶液；吗啡剂量为10mg/kg，作为阳性对照组；蜈蚣多肽WG-11组、蜈蚣多肽WG-12组、蜈蚣多肽WG-13组、蜈蚣多肽WG-14组、蜈蚣多肽WG-15组分别给予对应药物，给药剂量为10umol/kg。给药方式为腹腔注射。

操作者将小鼠放入装有温水的圆形烧杯，直径10cm，水深10cm，水温23～25℃，用摄像系统记录动物5min内的运动状态时间。运动状态是指动物主动挣扎，躯体处于漂浮扭动状态。所有小鼠观察完后间隔1h和24h分别按以上步骤再次检测小鼠在水中的运动时间。

2.实验结果

表13小鼠强迫游泳实验运动时间(s)

注：与生理盐水组比，*P<0.05，**P＜0.01；与阳性对照组比，^P<0.05，^^P＜0.01

运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最直接的表现，游泳时间长短可以反应动物运动疲劳的程度，运动时间越低，毒副作用越大。蜈蚣多肽WG-11组、蜈蚣多肽WG-12组、蜈蚣多肽WG-13组、蜈蚣多肽WG-14组、蜈蚣多肽WG-15组在强迫游泳实验中的数据与生理盐水组对比均无显著性差异，与阳性对照组对比多数具有显著性差异，少部分具有极显著性差异。说明蜈蚣多肽WG-11组、蜈蚣多肽WG-12组、蜈蚣多肽WG-13组、蜈蚣多肽WG-14组、蜈蚣多肽WG-15组相比较吗啡具有更低的毒副反应效应。详见表10。实验结果具有统计学意义。

实施例9

镇痛多肽在悬尾实验中对小鼠抗抑郁性的影响作用

1.材料与方法

1.1实验动物

昆明雌性小鼠，室温18～22℃，光照12h(6:00～18:00)和黑暗12h(18:00～6:00)环境，自由进水饮食饲养；预适应环境1周后，选取70只体质量18～22g小鼠进入正式实验(所有实验均于19:00～24:00进行)。

1.2实验装置

实验装置均由本实验室自行制作；包括悬尾箱(20cm×20cm×30cm)，侧立，周壁及底面均为黑色，秒表，计数器，奥尼ANC酷睿HD1080P高清摄像头。

1.3方法

操作者用不粘胶将小鼠尾尖部1/3处悬于悬尾箱内，使其头部正对镜头离箱底约10cm，用摄像系统记录动物6min内不动状态潜伏期及及4min内不动状态持续时间。不动状态是指动物放弃主动挣扎，躯体处于悬垂不扭动状态。

2实验结果

表14小鼠悬尾实验不动状态维持时间/s

注：与生理盐水组比，*P<0.05，**P＜0.01；与阳性对照组比，^{^}P<0.05，^{^^}P＜0.01

利用小鼠悬尾后企图逃脱但又无法逃脱，从而放弃挣扎，进入特有的抑郁不动状态，实验过程中记录动物不动时间来反映抑郁状态，悬尾运动时间越小，毒副作用越大。蜈蚣多肽WG-11组、蜈蚣多肽WG-12组、蜈蚣多肽WG-13组、蜈蚣多肽WG-14组、蜈蚣多肽WG-15组在悬尾实验中的数据与生理盐水组对比均无显著性差异，与阳性对照组对比多数具有显著性差异。说明蜈蚣多肽相比较吗啡具有更低的毒副反应效应。详见表14。实验结果具有统计学意义。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 一种具有镇痛活性的蜈蚣多肽及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> WG-11(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

Pro Ala Pro Val Val Thr Tyr Gly Gly Phe

1 5 10

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> WG-12(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

Gly Val Val Thr

1

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> WG-13(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

Val Val Thr Tyr Gly Thr Phe

1 5

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> WG-14(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

Thr Phe Pro Val Val Thr

1 5

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> WG-15(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

Pro Val Val Thr Ser Gly

1 5

Claims

1.一种多肽，其特征在于：其具有氨基酸序列X_a-X_b-X_c-Val-Val-Thr-X_d-X_e-X_f-X_g，或其药学上可接受的盐，其中X_a为Pro、Ser、Thr中任意一种或缺失，X_b为Ala、Phe中任意一种或缺失，X_c为Pro、Gly或Thr中任意一种或缺失，X_d为Tyr、Ser或Thr中任意一种或缺失，X_e为Gly、Ser中任意一种或缺失，X_f为Gly、Thr中任意一种或缺失，X_g为Phe、Thr中任意一种或缺失。

2.根据权利要求1中所述的多肽，其特征在于：具有氨基酸序列Pro-Ala-Pro-Val-Val-Thr-Tyr-Gly-Gly-Phe，或其药学上可以接受的盐。

3.根据权利要求1中所述的多肽，其特征在于：具有氨基酸序列Gly-Val-Val-Thr，或其药学上可以接受的盐。

4.根据权利要求1中所述的多肽，其特征在于：具有氨基酸序列Val-Val-Thr-Tyr-Gly-Thr-Phe，或其药学上可以接受的盐。

5.根据权利要求1中所述的多肽，其特征在于：具有氨基酸序列Thr-Phe-Pro-Val-Val-Thr，或其药学上可以接受的盐。

6.根据权利要求1中所述的多肽，其特征在于：具有氨基酸序列Pro-Val-Val-Thr-Ser-Gly，或其药学上可以接受的盐。

7.一种药物组合物，其特征在于含有活性成分为权利要求1-6任意一种所述的多肽和药学可接受辅料。

8.根据权利要求1-6任意一种所述的多肽或权利要求7所述的药物组合物在制备预防和/或治疗疼痛的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的疼痛包括理化刺激性疼痛、病理性疼痛。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的理化刺激性包括热刺激、机械刺激；病理性包括福尔马林刺激、类风湿性病痛、癌痛、术后疼痛。