CN117427083A - 阿洛酮糖在制备治疗阿尔兹海默病药物中的应用及药物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及阿洛酮糖在制备治疗阿尔兹海默病药物中的应用及药物，属于医药技术领域，具体为阿洛酮糖在制备治疗阿尔兹海默病药物中的应用；一种治疗阿尔兹海默病的药物，所述药物的有效成分包含阿洛酮糖；本发明研究发现阿洛酮糖具有明显的抗AD活性，本发明首次公开了阿洛酮糖在制备治疗阿尔兹海默病药物中的应用，阿洛酮糖安全性高，有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及阿洛酮糖在制备治疗阿尔兹海默病药物中的应用及药物。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是以进行性的认知功能障碍和行为损害为特点的慢性中枢神经系统退行性疾病，是老年痴呆最常见的类型。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。AD的病因病机复杂，受Tau蛋白异常磷酸化、氧化应激损伤、神经炎症、谷氨酸代谢失衡、线粒体功能损伤等因素影响，65岁以前发病者，称早老性痴呆；65岁以后发病者称老年性痴呆。
目前治疗阿尔茨海默病的药物主要有以下几种：改善认知功能，可给予胆碱酯酶抑制剂，是目前用于改善轻中度阿尔茨海默病患者认知功能的主要药物，胆碱酯酶抑制剂代表性的药物有安理申、卡巴拉汀、加兰他敏等，还可以使用美金刚，能拮抗N-甲基-D门冬氨酸受体，具有调节谷氨酸活性的作用，用于中晚期阿尔茨海默病患者的治疗；控制精神症状，可给予抗抑郁药和抗精神病药物来治疗患者在疾病的某一阶段出现的精神症状，如幻觉、妄想、抑郁、焦虑、睡眠紊乱等。
目前，有关阿洛酮糖的用途主要集中在食品和医疗领域，食品领域：阿洛酮糖可以提高食品中的持水能力，服用添加阿洛酮糖的大豆凝胶会减慢胃的排空速度，从而延长“饱腹感”。在烘焙食品中添加阿洛酮糖可以保持它们的柔软和湿润，并具有良好的入口即化感。同时，阿洛酮糖可以与食物中蛋白质产生美拉德反应，并产生令人愉快的风味；医疗领域：阿洛酮糖与甲硝唑一起使用，可以降低药物剂量，并可以防止毛滴虫产生耐药性。阿洛酮糖也可作为一种潜在的驱虫剂，能够特异性抑制线虫L1阶段的运动性、生长和生殖成熟度，干扰线虫的代谢表达。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了阿洛酮糖在制备治疗阿尔兹海默病药物中的应用及药物。
本发明的技术方案如下：
阿洛酮糖在制备治疗阿尔兹海默病药物中的应用。
根据本发明优选的，上述应用中，所述药物含有一种或多种药学上可接受的载体或辅剂。
进一步优选的，上述应用中，所述的辅剂为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸促进剂、表面活性剂或润滑剂中的至少一种。
根据本发明优选的，上述应用中，所述药物的剂型为胶囊、丸剂、片剂、口服液、颗粒剂、酊剂或注射剂。
一种治疗阿尔兹海默病的药物，所述药物的有效成分包含阿洛酮糖。
根据本发明优选的，所述药物含有一种或多种药学上可接受的载体或辅剂。
进一步优选的，所述辅剂为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸促进剂、表面活性剂或润滑剂中的至少一种。
根据本发明优选的，所述药物的剂型为胶囊、丸剂、片剂、口服液、颗粒剂、酊剂或注射剂。
本发明的有益效果如下：
本发明首次公开了阿洛酮糖在制备治疗阿尔兹海默病药物中的应用，阿洛酮糖安全性高，有广阔的应用前景。
附图说明
图1为阿洛酮糖处理3dpf的斑马鱼至6dpf的致死曲线图；
图中：虚线表示1％的致死率LG1。
图2为明暗交替刺激下阿洛酮糖AD样斑马鱼游动轨迹及游动距离的影响图；
图中：A为不同处理组斑马鱼游动距离及游动轨迹代表图，每组n＝9；B为不同处理组斑马鱼在黑暗、光照条件下的游动距离以及明暗交替刺激下游动总距离，结果以mean±SEM表示，每组n＝9；与Ctl组相比，###P<0.001，####P<0.0001；与AlCl3模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图3为明暗交替刺激下阿洛酮糖对AD样斑马鱼运动速度变化的影响图；
图中：坐标表示不同处理组每组斑马鱼不同个体每分钟游动的速度，以mean±SEM表示，横坐标表示三个明暗交替循环的时长，每组n＝9。
图4为阿洛酮糖对AD样斑马鱼脑部细胞凋亡的影响图；
图中为斑马鱼幼鱼脑部俯视图，虚线框为统计区域，比例尺为500μm。
图5为斑马鱼脑部凋亡细胞数量统计图；
图中：各组斑马鱼脑部细胞凋亡数目以mean±SEM表示，每组n＝8，与Ctl组相比，####P<0.0001；与AlCl3模型组相比，****P<0.0001。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中未详加说明的内容均按本领域现有技术。
主要材料来源
野生AB系斑马鱼来自山东省科学院生物研究所。
阿洛酮糖购自美国Nutricost。
一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(红色荧光)购自碧云天生物技术有限公司；AlCl3购自上海Aladdin公司；多奈哌齐(Donepezil)购自MedChemExpress生物科技公司；去离子水购自北京博奥拓达科技有限公司。
材料配制
阿洛酮糖用斑马鱼培养水配制成20mg/mL的母液，现用现配，所述斑马鱼培养水含5.0mM NaCl，0.17mM KCl，0.4mM CaCl2，0.16mM MgSO4，检测时利用斑马鱼培养水稀释至实验所需浓度；AlCl3用去离子水配制成140mM的母液，4℃保存备用，检测时用斑马鱼培养水稀释成80μM的工作液；多奈哌齐用去离子水溶解配制成的10mg/mL母液，-20℃保存备用，检测时用斑马鱼培养水稀释成4μM的工作液。
实施例1
斑马鱼胚胎获取
雌雄斑马鱼分开喂养，照明14h/黑暗10h交替进行，定时喂以人工颗粒状饵料和刚孵出的卤虫无节幼体(Artemia nauplii)。取健康、性成熟的斑马鱼按雌雄为1:2或2:2的比例放入交配缸内，次日9-10时获得受精卵。对受精卵进行洗涤后移入斑马鱼胚胎培养水中，28±0.5℃下控光培养。
安全作用剂量筛选与设定
3dpf(day post fertilization，受精后天数)时，在显微镜下挑选发育正常的AB系斑马鱼幼鱼，选取8个浓度的阿洛酮糖对其进行处理，每个浓度3重复，每个重复10条幼鱼，置于28±0.5℃恒温培养箱中培养，每24h更换一次相应的溶液，培养至6dpf，观察并记录斑马鱼死亡数和畸形情况，以样品浓度为横坐标，以致死率为纵坐标绘制死亡率曲线，计算1％致死浓度(LC1)，LC1是无观察效应浓度(no observed effect concentration，NOEC)，即一种外源物质不对斑马鱼造成任何有害作用的最高浓度，在LC1以下选取三个浓度，进行斑马鱼明暗交替行为学和脑部细胞凋亡检测，评价阿洛酮糖的抗AD活性。
实施例2
抗AD活性评价方法
a.明暗交替行为学检测方法
将3dpf的斑马鱼幼鱼随机分为空白对照组也记为Ctl组、AD模型组也记为模型组(AlCl3)，阳性对照组(AlCl3+多哌奈齐)也记为多哌奈齐组、三个浓度阿洛酮糖组(AlCl3+不同浓度的阿洛酮糖)，每组3重复，每个重复10条鱼。其中Ctl组加入斑马鱼培养水，AD模型组加入80μM的AlCl3溶液，阳性对照组同时加入80μM的AlCl3溶液和4μM的多哌奈齐溶液，三个浓度阿洛酮糖组分别加入80μM和不同浓度的阿洛酮糖溶液，置于28±0.5℃的恒温培养箱中培养，每天更换一次相应的溶液，连续处理至6dpf。各组随机选取8-10条幼鱼，使用斑马鱼培养水清洗2次，将其置于48孔板中。每孔加入1mL斑马鱼培养水，置于Zebrabox(斑马鱼成鱼观察柜)中使其适应10min，利用斑马鱼幼鱼行为分析仪采集斑马鱼的行为轨迹，行为测试时间共计60min，包含三个明暗交替循环，即10min光照，10min黑暗，每1min输出1次行为学数据。运用Zeblab软件进行处理，参照下列公式分析斑马鱼在光照、黑暗和明暗交替循环中的总运动距离，以及在明暗交替循环中的速度变化。
D'＝inaD+smlD+larD (1)
D总＝D'0-60+D'60-120+…+D'3540-3600 (2)
DDark＝D'0-60+…+D'540-600+D'1200-1260+…+D'1740-1800+D'2400-2460+…+D'3940-3600(3)
DLight＝D'600-660+…+D'1140-1200+D'1800-1860+…+D'2340-2400+D'3000-3060+…+D'3540-3600(4)
(1)式中：inaD、smlD和larD分别为某一时间段内的低速、中速和高速游动距离，D′为某一时间段内低、中、高速游动距离之和；
(2)式中：D′0-60为某个个体在0-60秒内低、中、高速游动距离之和，以此类推；D总、DDark和DLight分别表示在60min内某个个体游动总距离、在黑暗时间内游动总距离和在光照时间内游动总距离。
(3)式中：D′60为某个个体在60秒内低、中、高速游动距离之和，表示该个体在60秒内的平均速度。
利用GraphPad Prism软件对结果进行统计分析，采用Two-way ANOVA分析，统计结果用mean±SEM表示，P<0.05表明差异具有统计学意义。
b.脑部细胞凋亡TUNEL染色方法
按a分组处理斑马鱼幼鱼，6dpf时将处理过的斑马鱼用PBS(磷酸盐缓冲液)清洗2-3次，除去残留处理液，转移至EP管中，加入适量的麻醉剂，使幼鱼麻醉后吸出麻醉剂，按如下方法进行处理：
(1)加入体积浓度4％PFA(PFA为多聚甲醛)，室温下对斑马鱼组织固定90min。
(2)吸出体积浓度4％PFA，加入PBS置于摇床上轻摇浸洗5-10min，重复3次；
(3)加入含有体积浓度3％双氧水的甲醇溶液，轻摇浸洗10-15min；
(4)加入PBS轻摇浸洗5-10min，重复3次；
(5)吸干PBS，加入体积浓度0.3％的TritonX-100和0.1％(0.1moL/L)柠檬酸钠通透剂，室温孵育15min；
(6)吸出混合液，PBS轻摇浸洗5-10min，重复3次；
(7)吸干PBS，加入50μL的TUNEL(原位末端凋亡法)反应混合液(现用现配)，在37℃恒温培养箱中避光孵育90min；
(8)吸出混合液，在避光条件下加入PBS轻摇浸洗5-10min，重复3次。
(9)在载玻片上调整斑马鱼的位置使其为背部朝上，于荧光显微镜下观察斑马鱼脑部细胞凋亡情况，并进行图像采集，利用Image-Pro Plus软件统计斑马鱼脑部凋亡的细胞数目，利用GraphPad Prism软件对结果进行统计分析，采用Brown-Forsythe and WelchANOVA分析，统计结果用mean±SEM表示，P<0.05表明差异具有统计学意义。
效果例
安全剂量筛选结果
选择25、50、100、200、400、800、1600、3200ug/mL的阿洛酮糖对3dpf的斑马鱼进行处理至6dpf，结果如图1所示，在阿洛酮糖样品达到3200μg/mL时仍未引起斑马鱼的畸形和死亡，表明阿洛酮糖在3200μg/mL以下无明显毒副作用。选取阿洛酮糖750、1500和3000μg/mL三个浓度进行抗AD活性评价。
抗AD活性—明暗交替行为学检测结果
斑马鱼在5dpf时开始出现自主运动行为，在6dpf时，对斑马鱼幼鱼进行明暗交替行为学测试。测试结果如图2中A所示。与Ctl组相比，AlCl3模型组斑马鱼的游动轨迹明显减少，且无论在光照环境还是在黑暗环境中，AlCl3模型组斑马鱼的游动距离均显著少于Ctl组如图2中B，且AlCl3模型组斑马鱼的速度变化在光刺激前后也明显低于Ctl组如图3。以上结果表明，AlCl3降低了斑马鱼的运动能力和反应能力，斑马鱼表现出了AD样行为，表明斑马鱼AD模型构建成功。
与AlCl3模型组相比，多哌奈齐和750、1500和3000μg/mL阿洛酮糖分别与AlCl3共同处理后，斑马鱼的游动轨迹明显增多如图2中A，在黑暗环境中的游动距离和在明暗交替循环中游动总距离均显著增加如图2中B，速度变化也明显加快如图3。其中，与多哌奈齐相比，1500μg/mL的阿洛酮糖处理组斑马鱼的游动距离更长且速度变化更快，表明阿洛酮糖提高了斑马鱼幼鱼的运动能力和对明暗交替刺激的反应能力，对AlCl3诱导的斑马鱼AD样行为起到了改善作用。
抗AD活性—脑部细胞凋亡情况
检测斑马鱼脑部细胞凋亡结果显示如图4，Ctl组未检测到明显的细胞凋亡，而AlCl3模型组的斑马鱼脑部细胞凋亡数目显著增加；与AlCl3模型组相比，多哌奈齐和阿洛酮糖处理组的斑马鱼脑部细胞凋亡数目显著减少，差异具有统计学意义如图5，表明阿洛酮糖能显著减少AD样斑马鱼的脑部细胞凋亡。
在本实验条件下，阿洛酮糖样品在3200μg/mL以下无明显毒副作用。
抗AD活性评价结果显示，与AlCl3模型组相比，经750、1500和3000μg/mL阿洛酮糖处理后的斑马鱼游动轨迹、游动距离和速度变化均显著增加，脑部细胞凋亡数目显著减少，表明阿洛酮糖提高了斑马鱼幼鱼对明暗交替刺激的反应能力，并减少了AD样斑马鱼的脑部细胞凋亡，具有明显的抗AD活性；
本发明研究发现阿洛酮糖具有明显的抗AD活性，本发明首次公开了阿洛酮糖在制备治疗阿尔兹海默病药物中的应用，阿洛酮糖安全性高，有广阔的应用前景。
Claims (8)
1.阿洛酮糖的应用，其特征在于，阿洛酮糖在制备治疗阿尔兹海默病药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物含有一种或多种药学上可接受的载体或辅剂。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的辅剂为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸促进剂、表面活性剂或润滑剂中的至少一种。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为胶囊、丸剂、片剂、口服液、颗粒剂、酊剂或注射剂。
5.一种治疗阿尔兹海默病的药物，其特征在于，所述药物的有效成分包含阿洛酮糖。
6.如权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物含有一种或多种药学上可接受的载体或辅剂。
7.如权利要求6所述的药物，其特征在于，所述辅剂为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸促进剂、表面活性剂或润滑剂中的至少一种。
8.如权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为胶囊、丸剂、片剂、口服液、颗粒剂、酊剂或注射剂。
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