CN116715743B - 一种蜈蚣多肽SLP_Ssm1a及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
一种蜈蚣多肽SLP_Ssm1a及其编码基因和应用，生物医学技术领域，本发明提供的少棘蜈蚣多肽SLP_Ssm1a，其氨基酸全序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了编码所述蜈蚣多肽SLP_Ssm1a的基因，包括成熟肽部分相应基因和信号肽部分相应基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供的蜈蚣多肽SLP_Ssm1a，对KCNA1通道具有明显抑制作用，该毒素能够选择性的作用于钾通道亚型KCNA1，能作为研究KCNA1通道的工具分子。另外，该多肽具有结构简单、人工合成简便、功效快速、专一性强等特点，在辅助研究癫痫等疾病中具有广阔应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种蜈蚣多肽SLP_Ssm1a及其编码基因和应用。
背景技术
少棘蜈蚣(Scoropendra subspinipes mutilans)，主要分布于中国和日本，在我国长江中下游常见。
少棘蜈蚣的第一对足经过长期进化，形成钩状、锋利、尖端有毒腺口、外包裹坚硬的甲壳质的螯。蜈蚣的毒螯中有用于分泌和储存毒液的毒腺，毒腺呈囊泡状分布，周围的小泡可区分为亚毒腺，这样的结构有利于毒腺细胞在胞外形成更大的储存毒液的空间。毒液本身可入药用，有败毒抗癌、息风解痉的功效。
蜈蚣毒腺中含有丰富的多肽成分，目前已经证实，这些多肽成分大多为神经毒素。它们可以选择性的抑制钠离子通道、钾离子通道或是钙离子通道，因此从蜈蚣毒液中挖掘活性多肽具有广泛的应用前景。
钾离子通道蛋白是细胞膜上一种十分重要的跨膜蛋白，在生命中扮演着非常重要的角色。钾通道在心脏、神经、骨骼肌、血管和腺体等细胞中广泛分布，是目前被发现的离子通道蛋白中，种类最多、作用最为复杂的一种离子通道蛋白。钾离子通道蛋白种类十分繁多，其中，钾离子通道亚型KCNA1，也称Kv1.1，是一种电压门控钾离子通道，在神经元和肌肉细胞的电信号传导中发挥着关键作用。
KCNA1通道的失调与各种神经和肌肉疾病有关，包括癫痫、共济失调和肌肉强直。遗憾的是，目前针对这些疾病的研究，并未开发出较好的分子工具，可以特异且高效地作用于KCNA1通道。因此，挖掘更多更好靶向KCNA1通道蛋白的工具药物，并进一步开发相应的药物干预蛋白质功能，实现疾病预防与治疗，是药物研发领域的头等大事。
公开(公告)号：CN102671185A，发明名称《少棘蜈蚣多肽毒素omega-SLPTX-Ssm1a的应用》，给出了omega-SLPTX-Ssm1a一级序列包括83个氨基酸残基，其中六个半胱氨酸形成三对二硫键，分子量为8811.3Da。编码该毒素的基因包括426个核苷酸，其中包括信号肽、前体肽和成熟肽。少棘蜈蚣毒素omega-SLPTX-Ssm1a对大鼠背根神经节上的钙离子通道电流有非常显著的增强作用，是一种新型的钙通道的激动剂。该发明中的少棘蜈蚣毒素omega-SLPTX-Ssm1a能够增加钙通道的开放使钙离子内流，能够用于制备治疗钙通道疾病的药物，也能作为一种新的钙通道研究的工具试剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种少棘蜈蚣多肽SLP_Ssm1a及其编码基因和应用。
本发明的一种蜈蚣多肽SLP_Ssm1a，所述的蜈蚣多肽SLP_Ssm1a的氨基酸全序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述的蜈蚣多肽SLP_Ssm1a为KCNA1通道抑制剂。
本发明编码蜈蚣多肽SLP_Ssm1a的基因，所述蜈蚣多肽SLP_Ssm1a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述的蜈蚣多肽SLP_Ssm1a基因包括成熟肽部分相应基因和信号肽部分相应基因。
进一步地，所述蜈蚣多肽SLP_Ssm1a成熟肽部分相应基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
本发明的一种蜈蚣多肽SLP_Ssm1a应用，其用于制备治疗癫痫的药物。
本发明的一种蜈蚣多肽SLP_Ssm1a应用，其用于制备辅助研究癫痫的药物开发分子工具。
本发明提供的少棘蜈蚣多肽SLP_Ssm1a，是从少棘蜈蚣粗毒中通过分子筛和反向高效液相色谱分离纯化得到，其氨基酸全序列如SEQ ID NO.1所示。该多肽包括53个氨基酸残基，分子量为5954.5道尔顿，等电点为6.45，分子内含有两对二硫键，其配对方式为1-3，2-4。
本发明还提供了编码上述技术方案所述蜈蚣多肽SLP_Ssm1a的基因，包括成熟肽部分相应基因和信号肽部分相应基因，所述蜈蚣多肽SLP_Ssm1a基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。由231个核苷酸组成，自5’端至3’端的基因序列，包括信号肽和成熟肽，SEQID NO.3所示为成熟肽。
本发明提供的蜈蚣多肽SLP_Ssm1a，对KCNA1通道具有明显抑制作用，该毒素能够选择性的作用于钾通道亚型KCNA1，能作为研究KCNA1通道的工具分子。
本发明提供的蜈蚣多肽SLP_Ssm1a，通过抑制KCNA1通道介导神经元过度兴奋的作用，能作为研究临床药物的潜在靶标。另外，该多肽具有结构简单、人工合成简便、功效快速、专一性强等特点，在辅助研究癫痫等疾病中具有广阔应用前景。
与公开(公告)号：CN102671185A专利相比，本发明与其在氨基酸序列对比上，仅有5.88％相似度(一般80％以上，认为相似)。本发明与其是不同的多肽。在功能上，如多肽作用的离子通道，分子机制、靶点结合等方面同样存在显著差异，本发明是钾通道抑制剂，而公开(公告)号：CN102671185A专利为钙通道增强剂。因此，本发明可以用于开发治疗癫痫的药物或者辅助研发的分子工具。
附图说明
图1为蜈蚣多肽SLP_Ssm1a的cDNA、氨基酸序列、多肽三级结构以及分离纯化结果图；其中，图1A为蜈蚣多肽SLP_Ssm1a的cDNA序列，氨基酸序列；图1B为蜈蚣多肽SLP_Ssm1a的AlphaFold2模拟出的三级结构；图1C为蜈蚣毒素经过G50分子筛的分离图，其中，Ⅳ号峰为目的峰；图1D为蜈蚣毒素反向HPLC图谱，其中箭头所指的为目的多肽SLP_Ssm1a；图1E为蜈蚣多肽SLP_Ssm1a的质谱鉴定结果和二硫键配对方式；
图2为蜈蚣多肽SLP_Ssm1a对KCNA1通道抑制活性结果图；其中，图2A为蜈蚣多肽SLP_Ssm1a抑制小鼠KCNA1通道的电流图，A为Bath，B添加100nM蜈蚣多肽SLP_Ssm1a，C添加1μM蜈蚣多肽SLP_Ssm1a，D添加5μM蜈蚣多肽SLP_Ssm1a，E添加10μM蜈蚣多肽SLP_Ssm1a，F添加50μM蜈蚣多肽SLP_Ssm1a；图2B为蜈蚣多肽SLP_Ssm1a抑制小鼠KCNA1通道的浓效依赖关系曲线图；
图3为蜈蚣多肽SLP_Ssm1a对小鼠DRG神经元放电频率影响结果图；其中，图3上方对照组和下方给药组分别指用10μM蜈蚣多肽SLP_Ssm1a处理前后小鼠DRG神经元放电频率。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1
本实施例的蜈蚣多肽SLP_Ssm1a的分离纯化
蜈蚣多肽SLP_Ssm1a的分离纯化步骤如下：
(1)分子筛。100mg冻干蜈蚣粗毒溶于10ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.0)，4℃，12000rpm，离心10min，取上清液，用0.45μm滤膜过滤后，采用自装柱(填料为Sephadex G-50,2.6 100cm)进行初步分离。采用0.1M磷酸盐缓冲液(PBS)，流速设置为2ml/min，洗脱液经280nm紫外检测样本中蛋白质或者多肽浓度，合并具有多活性的部分，冻干后保存于-20℃。整合收集后的溶液在280nm紫外吸收值，绘制洗脱曲线。
(2)找出目的多肽所在的洗脱峰，确定Ⅳ号峰为蜈蚣多肽SLP_Ssm1a所在部位，进一步采用反向高效液相色谱法进行纯化(RP-HPLC)。用2ml 0.1M PBS溶解具有多活性的部分，4℃，12000rpm离心15min，取上清，用0.45μm滤膜过滤，上样于反相液相色谱PhenomenexC18(250×4.6mm)柱，以水和乙腈构成的洗脱系统洗脱，设置流速为1ml/min，检测波长为280/215nm。收集蜈蚣多肽SLP_Ssm1a，冻干，冻存于-20℃。
如图1-C和图1-D所示，少棘蜈蚣粗毒经过分子筛分离后，经反向HPLC分离，其中箭头标示为目的峰。
毒素分子质量的鉴定均使用美国Bruker公司生产ProFLEXTMIII型质谱仪，采用MALDI-TOF进行检测；反射模式检测毒素分子量；激光重复率5.00Hz；N2激光波长337nm；离子源加速电压1(IS/1)20kV；仪器的控制和数据的处理由Brucker公司开发的控制软件完成。用0.1％TFA-50％乙腈-49.9％去离子水混合液制备基质CCA(α-cyano-4-hydroxyc-innamic acid)的饱和液，然后取1μl样品和1μl CCA的饱和混合液，再取0.5μl混合液于质谱的样品盘上进行点样，处于室温干燥环境中检测分子量。使用内标法或者外标法校正。
上一步质谱鉴定测定蜈蚣多肽SLP_Ssm1a分子量，结果如图1-E所示，少棘蜈蚣毒素SLP_Ssm1a的成熟肽分子量为5954.5Da，分子内含有两对二硫键。
实施例2
蜈蚣多肽SLP_Ssm1a氨基酸序列以及基因序列鉴定
2.1经质谱鉴定纯度达到99.9％的蜈蚣多肽SLP_Ssm1a采用Edman降解原理，利用全自动氨基酸测序仪测得部分序列，再根据蜈蚣多肽SLP_Ssm1a的基因序列最终确定完整的氨基酸序列。
2.2少棘蜈蚣毒腺总RNA提取：
A.取活少棘蜈蚣毒腺组织于液氮中保存，取500mg组织，加入10ml总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBCOBRL公司)，5mm和3mm研磨珠各1个和3个，使用组织研磨机(GeneReady Ultimate，杭州遂真生物技术有限公司)4℃研磨至匀浆。
B.加入等体积氯仿溶液，震荡15s之后，室温静置10min后，4℃，12000rpm离心10min，转移无水相至干净离心管中。
C.向有无水相的离心管中加入等体积异丙醇，-20℃放置10min，4℃，12000rpm，离心5min，沉淀用75％乙醇洗3次，晾干，管底沉淀物即为少棘蜈蚣毒腺总RNA。
2.3少棘蜈蚣毒腺mRNA的纯化：
少棘蜈蚣毒腺mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的mRNAIsolation Systems试剂盒。
A.取500μl DEPC水溶解少棘蜈蚣毒腺500μg总RNA，65℃水浴10min，加入3μl的Oligo(dT)探针与13μl 20×SSC溶液，混匀，室温冷却，命名为A液。
B.磁珠(SA-PMP)加水轻弹混匀后，磁力架吸附30s，弃上清，加入0.5×SSC悬浮，至磁力架吸附30s，最后加0.1ml 0.5×SSC悬浮，命名为B液。
C.将A液加入B液，室温静置10min，磁力架吸附30s，弃上清，0.1×SSC洗涤4次，弃上清。加入0.1ml DEPC水重新悬浮，磁力架吸附30s，收集上清，此时上清中为纯化的少棘蜈蚣毒腺mRNA。
D.加入1/10体积的3M乙酸钠，pH 5.2，等体积异丙醇，于-70℃静置30min，4℃，12000rpm，离心10min，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。
2.4少棘蜈蚣毒腺cDNA文库构建：
采用CLONTRCH公司CreatorTM SMART TM cDNALibrary Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒。
2.4.1cDNA第一链合成(mRNA反转录)：
1)在0.5ml无菌的离心管加入1μl少棘蜈蚣毒腺mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III、3’PCR引物，加2μl去离子水使总体积达到5μl。
2)混匀离心管中的试剂并离心，72℃保温2min，冰上孵育2min。在离心管中加入
1.0μl 20mM二硫苏糖醇(DDT)、1.0μl 10mMdNTP混合物、1.0μl PowerrScript反转录酶、2.0μl 5×第一链缓冲液，混匀，离心。
3)42℃1h。
4)置于冰上，终止第一链的合成。
5)取2μl合成的cDNA第一链备用。
2.4.2长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链
1)PCR仪95℃预热。
2)2μl cDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl 10×Advantage 2PCR缓冲、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。
3)在PCR仪中按以下程序扩增：95℃20s，22循环，95℃5s，68℃6min。
4)循环结束后，抽提离心管中合成的cDNA双链。
2.4.3使用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(PROMEGA公司)试剂盒抽提PCR产物，步骤如下：
1)将通过PCR得到的cDNA双链产物与等体积膜结合缓冲液混匀，之后转入离心纯化柱，室温静置5min后，16000g离心1min，倒掉收集管内废液。
2)加入700μl含乙醇洗脱液，16000g离心1min，倒掉收集管内废液。
3)重复步骤2。
4)16000g离心5min。
5)将离心纯化柱置于新的离心管中。
6)16000g离心1min，管底溶液即为所纯化的cDNA双链。
2.4.4感受态细胞DH5α的制备：
1)挑选单个DH5α菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素LB培养基中，37℃培养过夜，次日取菌液，按1：100再接种于50ml LB培养液中，37℃震荡2h。当OD600为0.35，获得细菌培养物。
2)将培养物转移到已消毒的一次性50ml聚丙烯管中(冰块预冷)，冰上静置10min。
3)4℃，400rpm离心，回收菌体。
4)倒出上清，保留沉淀，倒置1min排尽残留培养液。
5)每50ml细菌培养物用2ml已经预冷的0.1M CaCl2重悬，分装备用。
2.4.5酶切、连接以及连接产物的转化：
1)在微量离心管中加入1μl Takara pMD18-T载体、4μl少棘蜈蚣cDNA双链溶液，全量为5μl。
2)加入5μl(等量)的连接酶缓冲混合物。
3)16℃反应2h。
4)全量(10μl)加入至100μl DH5α感受态细胞中，置于冰中30min。
5)42℃加热90s，冰中静置1min。
6)加入37℃预热过的LB培养基890μl，37℃缓慢震荡培养60min。
7)取200μl培养基涂布于含X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上37℃培养16h。
8)每个LB平皿用5ml LB培养基洗涤菌落，加入30％甘油。此时构建的cDNA约含1×106个单独克隆。
2.5蜈蚣多肽SLP_Ssm1a基因克隆：
一对简并引物(5'CCTTGTTGTTCTTTTGACACT 3'，5'CARCATATATTTYARATAGAT 3)用于扩增蜈蚣多肽SLP_Ssm1a的成熟肽部分，另一对简并引物(5'GARTYCSTRTCSCAGAAAAGN3'，5'CTTCCTTTAAACGGAATTTCT 3)用于扩增蜈蚣多肽SLP_Ssm1a的信号肽部分。
由此获得编码蜈蚣多肽SLP_Ssm1a的cDNA全序。
编码该蜈蚣多肽SLP_Ssm1a的核苷酸序列如下：
ATGGAGAGAAAAATTATTTTCCTGTGTTTCCTTGTTGTTCTTTTGACACTTCCTGAATTTATTTCGTCTGAAGTTAACAAAAAAGAAATTCCGTTTAAAGGAAGAAAATTTCCTTATAAAAGTGAGTGTACGGAGGCCTGTGCA ACCGCATTTACGGGTGGAGATGAAAGCAGAATAGAATATGGAGACCCTGGCTTCTTTAAGTGTACTTGTTATTATT CCACTGGTTAA。下划线部分的片段编码SLP_Ssm1a的成熟肽。
PCR反应条件如下：94℃30s，60℃30s，72℃45s，35个循环。
SLP_Ssm1a的化学合成：
1)蜈蚣多肽SLP_Ssm1a的化学合成方法：根据编码蜈蚣多肽SLP_Ssm1a的氨基酸测序，用自动多肽合成仪合成其全序列，通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。
2)采用飞行质谱法(MOLDI-TOF)与反相高效液相色谱法分析纯化的蜈蚣多肽SLP_Ssm1a的分子量。
蜈蚣多肽SLP_Ssm1a是少棘蜈蚣基因编码的一种单链多肽，分子量5954.5Da。蛋白序列为：
MERKIIFLCFLVVLLTLPEFISSEVNKKEIPFKGRKFPYKSECTEACATAFTGGDESRIEYGDPGFFK CTCYYSTG。下划线部分为SLP_Ssm1a的成熟肽。
3.KCNA1离子通道抑制剂活性
通过瞬转表达体系，使HEK293过表达小鼠KCNA1通道，研究SLP_Ssm1a与KCNA1的相互作用。
倒置显微镜下选择细胞膜较为光滑、细胞质均匀的细胞，使用EPC-9膜片钳放大器(HEKA公司，德国)进行实验记录。在室温20-25℃条件下进行膜片钳试验。五步拉制法制备硼硅酸盐玻璃微电极(505℃、速度19)，电极阻抗约为3～5MΩ，高温抛光后置于电极盒备用。在电极与细胞膜形成高阻(1～5GΩ)封接后，-80mV电压钳制将膜吸破，形成全细胞状态进行电流记录。待测样本采用对应通道的电极浴液配制，通过切换灌流管给药，灌流管每个管口直径0.5mm，管口距所记录的细胞<100μm。在成功封接破膜形成全细胞膜片钳记录模式后，通过rsc-200灌流加药系统切换灌流管。串联电阻(Rs)在实验过程中始终保持在5-8MΩ的范围之内保持不变，系统串联电阻补偿一般在30-60％只见。试验数据使用PatchMaster软件分析，数据的进一步分析使用Igor软件。所有结果均采用平均值(Average)±标准误差(SEM)的行使表示，n表示试验的数据个数。
如图2-B所示，SLP_Ssm1a可以抑制KCNA1通道，并呈现浓度依赖关系，其IC50为5.02±1.09μM(n＝3)；如图2-A所示，A-E分别代表Bath对照、0.1μM、1μM、5μM、10μM和50μM的SLP_Ssm1a，结果如图2所示。
4.SLP_Ssm1a对小鼠DRG放电频率的影响
4.1小鼠DRG的急性分离：
4.1.1挑选健康的C57B雄性小鼠(18-22g)，短颈处死，迅速剪开背部皮肤，沿脊柱两侧剪断肋骨，取出腰段脊柱，剔除多余肌肉组织。
4.1.2脊柱对半剖开，放入10ml DMEM培养液中(已经用混合气体(95％O2，5％CO2)饱和)。
4.1.3取出DRG，使用精细角膜剪和镊子除去神经节周围组织，取到足够的DRG后(15～20个)，用维纳斯剪将其剪碎加入5ml富氧DMEM培养基中。
4.1.4加入胶原蛋白酶和胰蛋白酶(4ml DMEM，胶原蛋白酶2.2mg，胰蛋白酶1.2mg)，37℃，180rpm-200rpm消化20～40min(20min)。待DRG组织完全消化后，加入蛋白酶抑制剂(5ml，1.2mg胰蛋白酶抑制剂)。
4.1.5室温，800-100rpm，离心3min，去培养基。
4.1.6用新鲜细胞培养液(10％FBS，0.1％双抗)重新悬浮细胞，滴加到铺在35mm细胞培养皿底部的细胞爬片上，培养箱中静置30min待细胞贴附。
4.2SLP_Ssm1a使小鼠DRG的放电频率增加
使用EPC-9膜片钳放大器(HEKA公司，德国)进行实验记录。在电极与细胞膜形成高阻(1～5GΩ)封接后，-80mV电压钳制将膜吸破，形成全细胞状态进行动作电位记录。待测样本采用对应通道的电极浴液配制，通过切换电极给药，排药管每个管口直径0.5mm，管口距所记录的细胞<100μm。在成功封接破膜形成全细胞膜片钳记录模式后，通过rsc-200灌流加药系统切换灌流管。实验在室温(22～26℃)进行。
在试验中，灌流10μM的SLP_Ssm1a会抑制KCNA1通道功能，导致神经元兴奋性增高，进而引起小鼠DRG放电频率增加，结果如图3所示。
Claims (5)
1.一种蜈蚣多肽SLP_Ssm1a应用，其特征在于所述的蜈蚣多肽SLP_Ssm1a用于制备辅助研究癫痫的药物开发分子工具；所述的蜈蚣多肽SLP_Ssm1a的氨基酸全序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种蜈蚣多肽SLP_Ssm1a应用，其特征在于所述的蜈蚣多肽SLP_Ssm1a为KCNA1通道抑制剂。
3.根据权利要求1所述的一种蜈蚣多肽SLP_Ssm1a应用，其特征在于编码所述的蜈蚣多肽SLP_Ssm1a的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求3所述的一种蜈蚣多肽SLP_Ssm1a应用，其特征在于所述的蜈蚣多肽SLP_Ssm1a基因包括成熟肽部分相应基因和信号肽部分相应基因。
5.根据权利要求4所述的一种蜈蚣多肽SLP_Ssm1a应用，其特征在于所述蜈蚣多肽SLP_Ssm1a成熟肽部分相应基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
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| CN102671185A (zh) * | 2012-05-31 | 2012-09-19 | 中国科学院昆明动物研究所 | 少棘蜈蚣多肽毒素omega-SLPTX-Ssm1a的应用 |
| CN102993289A (zh) * | 2012-12-04 | 2013-03-27 | 中国科学院昆明动物研究所 | 少棘蜈蚣多肽毒素kappa-SLPTX-Ssm4a及其基因和应用 |
| CN107987144A (zh) * | 2017-12-14 | 2018-05-04 | 中国科学院昆明动物研究所 | 一种蜈蚣多肽SLP_SsTx及其编码基因和应用 |
-
2023
- 2023-07-24 CN CN202310909227.7A patent/CN116715743B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102671185A (zh) * | 2012-05-31 | 2012-09-19 | 中国科学院昆明动物研究所 | 少棘蜈蚣多肽毒素omega-SLPTX-Ssm1a的应用 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116715743A (zh) | 2023-09-08 |
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