CN103626865A - 具有趋化活性的分泌蛋白及其编码序列和医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了具有白细胞趋化功能的SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的FAM3D分泌蛋白，编码该蛋白的多核苷酸，及含有多核苷酸的基因工程载体。还涉及药物组合物，含有所述蛋白或多核苷酸、基因工程载体和/或宿主细胞，及药物可接受的盐、载体或赋形剂。还涉及体外检测所述蛋白或多核苷酸表达水平变化的方法。所述蛋白或多核苷酸可用于预防和/或治疗肿瘤转移、肿瘤发生、炎症反应、肥胖和胰岛素抵抗、动脉硬化、血管损伤、病毒感染、过敏疾病、移植排斥、脑部疾病、自身免疫病、免疫调节、干细胞增殖分化、骨质疏松症及用于商品化试剂研究上述病状。还涉及以所述蛋白或多核苷酸作为靶开发化合物、抗体、多肽药物和商品化试剂。

Description

具有趋化活性的分泌蛋白及其编码序列和医药用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别地，本发明涉及具有多种功能的蛋白及编码其的多核苷酸、包含多核苷酸的基因工程载体、以及相应的药物组合物，本发明还涉及所述蛋白和多核苷酸及其药物组合物的应用。

背景技术

趋化因子是一类具有趋化特性的细胞因子蛋白样物质，在机体内通过激活趋化因子受体发挥对多种细胞的趋化作用，在炎症反应中起核心作用。他们不仅参与对白细胞招募，还可以通过上调整合素的表达，从而活化白细胞。另外，趋化因子还具有其他多效性功能，在肿瘤生长的调节，免疫、循环、及神经系统的发育方面起到了重要的作用。在机体的肿瘤转移、肿瘤发生、炎症反应、肥胖和胰岛素抵抗、动脉硬化、血管钙化、心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心衰、病毒感染、过敏疾病、移植排斥、脑部疾病、自身免疫病、免疫调节、干细胞增殖分化、骨质疏松症等疾病过程中也发挥重要作用。

现阶段世界范围内肿瘤的发病率和死亡率都有增加的趋势。绝大多数肿瘤患者无法根治，复发和转移称为肿瘤患者生存时间和生活质量提高的瓶颈。而趋化因子在肿瘤发生发展的过程中所起的双面性作用也越来越受到人们的重视，通过与其受体发生作用趋化因子在特定的为环境中可以通过影响免疫细胞从而增强免疫应答，对肿瘤血管生成、肿瘤细胞增殖、转移能力方面有抑制作用。但同时也可直接影响肿瘤细胞本身的生长、侵袭、和转移过程。特别是最近对CXCR4的研究表明，许多人类肿瘤表达其受体。而CXCR4本身在乳腺癌、胃癌、前列腺癌、结直肠癌、及肺癌中表达有所增强。其可通过介导信号活化、聚合肌动蛋白、诱导伪足形成等反应促进癌细胞的趋化和侵袭，从而与肿瘤的定向转移有着密切联系。另外，随着趋化因子在肿瘤免疫逃逸中的作用日渐受到重视，越来越多的研究证明趋化因子可以募集免疫细胞进入肿瘤组织调控机体免疫功能并调节肿瘤血管生成。这些都表明不仅对于肿瘤细胞本身，趋化因子在肿瘤微环境的形成于发展中也有着不可替代的作用。如CCL2、CCL5可趋化TAM；CXCL9、CXCL10对T细胞趋化，而CCL19、CCL20、CCL21可趋化DC。趋化因子已经成为国内外研究肿瘤炎症微环境的热点之一。

人类基因组框架图完成10周年，目前的任务是阐明数以万计的基因及其产物的功能，深入认识疾病发生发展的相关基因和分子机理，发现疾病易感基因、抗病基因、药物敏感基因，发现新的药物作用靶点和新的生物技术药物。这些工作将花费远比基因序列分析更多的时间、更大的投入和更繁重的工作量,也更加具有挑战性。

近年来，免疫疗法发生了变化，从基础向临床的转化到药物开发成为更为重要的途径。通过描述免疫系统相关趋化因子及其配体如何组织在生理和病理活动中发挥作用，暗示趋化因子有强大的临床应用前景，可以用作免疫疗法的治疗靶或辅助治疗剂或主要疗法。

本发明人利用人类功能基因组学数据库，生物信息学分析，分子生物学、细胞生物学及免疫学技术，从人类基因数据库中发掘具有重要生理、病理意义的新基因，为阐明疾病的发病机制、发现疾病标志物、基因组药物靶标（开发化合物、抗体、多肽药物）或基因工程药物提供基础。

基因表达及其编码产物蛋白质表达的检测方法包括反转录－聚合酶链式反应、蛋白质印迹、ELISA、FACS、免疫荧光、免疫组化、免疫细胞化学等检测方法。可以应用于实验研究以及临床生理和病理疾病（肿瘤转移、肿瘤发生、炎症反应、肥胖和胰岛素抵抗、动脉硬化、血管钙化、心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心衰、病毒感染、过敏疾病、移植排斥、脑部疾病、自身免疫病、免疫调节、干细胞增殖分化、骨质疏松症）中细胞和组织的基因表达及其编码产物蛋白质表达的检测。

具有重要生理、病理意义的基因及其编码产物蛋白质，可以作为药物靶标，开发靶向这一分子本身及其相互作用分子的化合物、抗体、多肽药物或基因工程药物和商品化试剂，应用于发病机制研究，疾病标志物的研究和临床检测，及研究和临床的药物的治疗。

发明内容

本发明通过筛选发现了新的具有趋化活性的细胞因子FAM3D。

因此，本发明提供了一种具有趋化活性的蛋白，编码所述蛋白的多核苷酸，含有所述多核苷酸的基因工程载体，含有所述蛋白、多核苷酸和/或载体的药物组合物；另外，本发明还提供了所述蛋白或多核苷酸在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用，检测在待测样品中所述蛋白或多核苷酸表达水平的方法，所述蛋白或多核苷酸在制备用于研究疾病的商品化试剂中的应用，以及所述蛋白或多核苷酸或本发明蛋白的相互作用分子作为靶开发化合物、抗体、多肽药物和商品化试剂的应用。

首先，本发明提供了一种具有趋化活性的蛋白，该蛋白包含：

（1）如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白1；或

（2）具有与(1)所述蛋白有至少80%同源性的氨基酸序列的蛋白，

该蛋白的功能与(1)所述蛋白的功能相同或相似或不同。

其中，如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白，为FAM3D蛋白的186个氨基酸序列（编码FAM3D蛋白的核酸序列在Gen-bank^TM的注册登记号为NM 138805.2）。在本发明中称为FAM3D分泌蛋白。

本发明蛋白还包括具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少80％，优选至少85％，更为优选至少90％，更进一步优选至少95％，特别优选至少98％，更为特别优选至少99％同源性（序列匹配）的序列。这些序列可以与本发明的SEQ ID NO:1所示的序列具有相同、相似或不同的生物学功能，优选具有相同或相似的功能。

优选地，本发明的蛋白包含：

(1)具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白；或

(2)具有与(1)所述蛋白至少90%同源性的氨基酸序列的蛋白，其功能与(1)所述蛋白的功能相同或相似或不同。

另一方面，本发明还提供了一种编码本发明的蛋白的多核苷酸，该多核苷酸包含：

(1)编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多核苷酸；或

(2)具有与(1)所述多核苷酸至少80%同源性的多核苷酸，其编码的蛋白与(1)所述多核苷酸编码的蛋白具有相同或相似或不同的生物学功能。

如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列为FAM3D分泌蛋白186个氨基酸序列。本发明的多核苷酸序列可以只编码FAM3D分泌蛋白，也可以在上述蛋白的编码序列的基础上，增加非编码序列，例如内含子、编码序列5'或3'端的非编码序列等。本发明的多核苷酸序列最好是以分离形式提供的。本发明的多核苷酸是“分离”形式的，其不仅已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开，而且已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来。

本发明的多核苷酸还包括具有与编码FAM3D分泌蛋白或其片段的多核苷酸至少70%、优选至少80%、更为优选至少85%，更进一步优选至少90%、特别优选至少95%，更为特别优选至少98%同源性的多核苷酸。优选地，本发明的多核苷酸为与编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多核苷酸序列或其片段具有至少80%同源性的多核苷酸，该多核苷酸编码的蛋白与SEQ ID NO:1所示的蛋白具有相同或相似或不同的生物学功能。

另一方面，本发明还提供了一种基因工程载体，该基因工程载体含有编码本发明的分泌蛋白的多核苷酸。所述基因工程载体可以是普通载体、表达载体等。

另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物含有本发明的蛋白、多核苷酸、载体和/或一种或多种药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂。

另一方面，本发明还提供了所述FAM3D分泌蛋白或编码所述蛋白的多核苷酸在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用，其中所述疾病包括肿瘤转移、肿瘤发生、炎症反应、肥胖和胰岛素抵抗、动脉硬化、血管钙化、心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心衰、病毒感染、过敏疾病、移植排斥、脑部疾病、自身免疫病、免疫调节、干细胞增殖分化、骨质疏松症。

本发明通过实验证明，本发明的FAM3D分泌蛋白具有与趋化因子相当的趋化活性，而其又来源于人类本身，所以FAM3D分泌蛋白在多种疾病的预防和/或治疗方面具有广阔的应用前景。

另一方面，本发明还提供了一种体外检测来自待测者的样品中本发明所述的蛋白或多核苷酸的表达水平的方法。该方法为反转录－聚合酶链式反应、蛋白质印迹或ELISA、FACS、免疫荧光、免疫组化、免疫细胞化学检测方法。

另一方面，本发明还提供了所述FAM3D分泌蛋白或编码所述蛋白的多核苷酸在制备用于研究疾病的商品化试剂中的应用。其中，所述疾病包括肿瘤转移、肿瘤发生、炎症反应、肥胖和胰岛素抵抗、动脉硬化、血管钙化、心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心衰、病毒感染、过敏疾病、移植排斥、脑部疾病、自身免疫病、免疫调节、干细胞增殖分化、骨质疏松症。

另一方面，本发明还提供了以本发明的蛋白或多核苷酸或本发明蛋白的相互作用分子作为靶开发化合物、抗体、多肽药物和商品化试剂的应用。

附图说明

图1显示利用Western Blot检查目的蛋白FAM3D的表达，箭头所指为表达的FAM3D蛋白，其大小约为34kD左右。A，FAM3D转染细胞裂解液；B，FAM3D转染细胞培养上清。

图2显示应用293T表达系统收获上清利用PBMC趋化筛选平台所得结果，红色箭头所指则为FAM3D表达上清对外周血单个核细胞(PBMC)具有明显的趋化活性。

图3A显示FAM3D真核表达上清经亲和层析纯化后利用SDS-PAGE分离并电转到PVDF膜上用于N端测序，箭头所指为FAM3D特异条带；B显示上海基康公司FAM3D分泌蛋白的N端测序结果的原始峰图；C显示上海基康公司FAM3D分泌蛋白的N端测序的正式报告。

图4A和4B显示FAM3D基因在16种肿瘤细胞系中的表达情况；4C显示FAM3D在16种肿瘤细胞系表达谱所对应的GAPDH内参。

图5显示应用正常人类组织文库定量PCR所得FAM3D基因表达谱。

图6显示FAM3D在TNFα及IL-1β刺激下在MGC803细胞系中不同时间点表达情况。

图7显示FAM3D在MGC803细胞系中表达可被NFκB抑制剂PDTC所抑制。

图8显示运用亲和层析对FAM3D在293T真核表达系统上清进行纯化，纯化所得FAM3D重组蛋白的SDS-PAGE电泳结果。

图9显示以CXCL12为阳性对照，利用趋化实验验证FAM3D真核表达重组蛋白对外周血单个核细胞(PBMC)的趋化作用。

图10显示以CXCL12为阳性对照，验证FAM3D真核表达重组蛋白对未经PHA刺激的外周血淋巴细胞(PBL)的趋化作用。

图11显示以CXCL12为阳性对照，验证FAM3D真核表达重组蛋白对PHA20μg/ml刺激过夜的外周血淋巴细胞(PBL)的趋化作用。

图12显示以CXCL8为阳性对照，验证FAM3D真核表达重组蛋白对外周血多形核细胞(PMN)的趋化作用。

具体实施方式

以下针对前述的发明主题就一些实施方式并结合附图进行较为详细的说明和描述。然而应该理解，这些说明和描述以及后面所列的具体实施例不是用来限制本发明权利要求的范围。

本发明构建了FAM3D(family with sequence similarity3,member D)真核表达质粒pCDNA3.1-FAM3D（NM138805.2）-MYC-HIS6以及293T真核表达系统，经表达、纯化，获得分泌表达的FAM3D重组蛋白。分泌表达的该蛋白上清对人外周血单核细胞细胞具有趋化作用。进一步通过亲和层析纯化分离上清中FAM3D蛋白，经过SDS-PAGE并将其电转至PVDF膜上获取特异条带，进行N端测序后确定信号肽切割位点。利用293T真核表达系统获取上清经过纯化得到重组FAM3D蛋白，重组FAM3D蛋白对外周血单个核细胞(PBMC)、外周血淋巴细胞(PBL)和外周血多形核细胞(PMN)具有趋化作用。

在本发明所提供的蛋白中，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白，为FAM3D蛋白的C末端186个氨基酸序列（FAM3D蛋白的核酸序列在Gen-bank^TM的注册登记号为NM 138805.2）；在本发明中称为FAM3D分泌蛋白。本发明蛋白还包括与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的同源性（序列匹配）超过80％，优选超过85％，更为优选超过90％，更进一步优选超过95％，特别优选超过98％，更为特别优选超过99％的序列。这些序列可以与本发明的SEQ ID NO:1所示的序列具有相同、相似或不同的生物学功能，优选具有相同或相似的功能。

本发明FAM3D分泌蛋白或其片段可以是天然的、合成的、半合成的、或者重组产生。本发明FAM3D分泌蛋白可按照Steward和Young(Steward,J.M.和Young,J.D.,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd Ed.,Pierce ChemicalCompany，Rockford,I11.,(1984))描述的方法用Applied Biosystem合成仪或Pioneer^TM肽合成仪按固相化学技术合成。一般，这些方法包括向成长的肽链上依次添加一个或多个氨基酸或适当保护的氨基酸。通常，第一个氨基酸的氨基或羧基用适当的保护基保护，然后将保护的氨基酸连在惰性固相载体上，随后在适于形成酰胺键的条件下加入相应氨基或羧基被适当保护的序列中的下一个氨基酸。然后从新加入的氨基酸残基上除去保护基，再加入必要时适当保护的下一个氨基酸，如此重复操作。当所有氨基酸以正确的顺序连接后，相继或同时除去任何剩余的保护基和固相支持物，得到最终的蛋白。通过简单修改此标准程序，可能一次向成长链添加一个以上的氨基酸。在本发明的一个优选实施方案中，使用自动合成仪制备本发明的蛋白。其中使用α氨基被酸或碱敏感性基团保护的氨基酸。这种保护基应该在肽键形成条件下稳定，又容易除去而不破坏成长的肽链、不会引起其中的任何手性中心外消旋。适当的保护基有9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基（Boc）、苄氧羰基(Cbz)、2-氰基叔丁氧羰基等。9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)是合成本发明肽特别优选的。也可按常规的生物工程方法由宿主细胞中的重组DNA序列编码产生本发明的蛋白(具体参见实施例1－4)。在实施例1－4中，申请人将FAM3D编码序列插入表达系统，经表达、纯化，获得分泌表达的FAM3D重组蛋白，进一步通过SDS-PAGE分离获得FAM3D蛋白条带，进行N端测序，得到本发明的蛋白。本领域技术人员已知，可以直接使用编码本发明的蛋白的多核苷酸序列产生本发明的FAM3D分泌蛋白，例如将编码本发明的蛋白的多核苷酸序列（如SEQ ID NO：1所述的序列或其片段）直接插入表达系统，经表达、纯化，获得本发明的蛋白。或者可使用衍生于本发明的DNA构建体的mRNA，在无细胞翻译系统中产生所需的蛋白。

本领域普通技术人员已知，本发明所述的蛋白或其片段可以同其它的蛋白或其片段形成融合蛋白。其它蛋白或其片段一般是已知的，有些可以以载体形式购买得到，或者可以按常规方法合成或从已知生物体中克隆得到。

如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列为FAM3D分泌蛋白186个氨基酸序列。本发明的多核苷酸序列可以只编码FAM3D分泌蛋白，也可以在上述蛋白的编码序列的基础上，增加非编码序列，例如内含子、编码序列5'或3'端的非编码序列等。本发明的多核苷酸序列最好是以分离形式提供的。本发明的多核苷酸是“分离”形式的，其不仅已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开，而且已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来。

本发明还包括与编码FAM3D分泌蛋白或其片段的多核苷酸至少70%、优选至少80%、更为优选至少85%，更进一步优选至少90%、特别优选至少95%，更为特别优选至少98%同源性的多核苷酸序列。特别涉及在严格条件下与FAM3D分泌蛋白的多核苷酸杂交的多核苷酸，所说的“严格条件”意指发生杂交的前提是序列间至少具备95%的同源性。这样的序列可以是天然存在或人工产生的，可以包括FAM3D分泌蛋白的多核苷酸序列的等位基因变异体、也可以包括FAM3D分泌蛋白多核苷酸序列中碱基的缺失、插入及置换。这样的序列编码的蛋白可以在功能上与本发明的FAM3D分泌蛋白相同、相似、或不同，但最好是编码与FAM3D分泌蛋白的生物学活性基本相同的蛋白。因此，优选与编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多核苷酸序列或其片段具有至少80%同源性的多核苷酸，该多核苷酸编码的蛋白与SEQ ID NO:1所示的蛋白具有相同或相似或不同的生物学功能。

本发明的多核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成的DNA，DNA可以是双链或是单链形式，单链DNA可以是编码链或是非编码链(反义链)。本发明所述的反义链可以为如SEQID NO:1所示的序列的互补序列。本领域普通技术人员已知，反义链或者其一部分(反义寡核苷酸)可用于抑制细胞内本发明FAM3D分泌蛋白的表达。本发明的FAM3D分泌蛋白的核苷酸序列可以来自任何物种，特别是哺乳动物，包括牛、羊、猪、鼠、马，优选人类。

如SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列为一种编码本发明蛋白的多核苷酸，其来自人类。所以，优选本发明的多核苷酸包含如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸或其互补序列。

本发明所涉及的基因工程载体含有编码本发明的分泌蛋白的多核苷酸。所述基因工程载体可以是普通载体、表达载体等。其中普通载体主要用于各种基因组文库和cDNA文库的建立，它们通常含有两个或两个以上的标记基因，其中一个基因用于选择转化体(transformant)，另一基因则是用于检查载体中是否有外源DNA插入。表达载体主要用于研究基因的表达或是用于大量生产一些有用的转录产物或蛋白质，有的也可用于cDNA文库的建立。这类载体除具有普通型载体的特征外，还应含有适当的启动子、核糖体结合位点、终止子等。为了便于表达产物在细胞中定位，在蛋白编码序列上游可加入适当的前导序列。

合适载体和启动子的选择为本领域普通技术人员周知。本领域普通技术人员周知用于构建含有本发明的多核苷酸以及合适的转录及翻译调控元件之载体的方法。具体地说，适用于原核细胞的市售表达载体一般均带有可选择标志和细胞复制原点，带有lacI、T7、λPL和trp等细菌启动子，以及已知克隆载体pBR322(ATCC 37017)的其他遗传元件。这样的市售载体包括pGEM(Promega)和pKK223-3(Pharmacia)。可根据所选用的适当启动子和待表达的结构基因序列来选择衍生于pBR322的适当载体。GST原核表达系统也可用于本发明。适用于真核细胞的载体带有真核细胞启动子如CMV、SV40等，这样的载体包括pMT-hIL-3(马大龙，狄春辉，庞健等(1991)高技术通讯11：26-29)、pQE-9(Qiagen)、pD10、pNH18A(Stratagene)、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)，以及pcDNA3、pCI、pWLNEO、pSG(Stratagene)、pSVL(Pharmacia)。在本发明的实施例1中FAM3D编码序列插入pCDNA3.1-myc-his6(Invitrogen公司)表达载体，构建pCDNA3.1-FAM3D-myc-his6表达质粒。

本发明所提供的药物组合物，可以包含本发明的蛋白、编码本发明蛋白的多核苷酸、含有所述多核苷酸的基因工程载体和/或宿主细胞，另外，除了上述活性成分之外，还可以包含一种或多种药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂。这些药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂的选用取决于，例如药物的施用途径。

本发明通过实验证明，本发明的FAM3D分泌蛋白能够用于制备预防和/或治疗瘤转移、肿瘤发生、炎症反应、肥胖和胰岛素抵抗、动脉硬化、血管钙化、心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心衰、病毒感染、过敏疾病、移植排斥、脑部疾病、自身免疫病、免疫调节、干细胞增殖分化、骨质疏松症等疾病的药物。

早期研究发现，趋化因子和趋化因子受体在介导急慢性验证过程中起重要作用。近期研究表明趋化因子和趋化因子受体在生长发育；稳态的维持；骨质疏松症、肥胖和胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、血管钙化、心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心衰等心血管疾病；病毒感染；免疫应答；骨髓主细胞的迁移以及自身免疫病等病理生理过程中发生重要的作用。晚近的研究也表明，趋化因子和趋化因子受体在肿瘤发生、发展以及转移的过程中扮演重要的角色。

瘤转移、肿瘤发生、炎症反应、肥胖和胰岛素抵抗、动脉硬化、血管钙化、心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心衰、病毒感染、过敏疾病、移植排斥、脑部疾病、自身免疫病、免疫调节、干细胞增殖分化、骨质疏松症等疾病与趋化因子及其受体密切相关，激动剂的脱敏作用，中和抗体等是针对药物靶标的主要治疗手段。本发明通过实验证明，本发明的FAM3D分泌蛋白具有与趋化因子相当的趋化活性，而其又来源于人类本身，所以FAM3D分泌蛋白在多种疾病的预防和/或治疗方面具有广阔的应用前景。

本发明还提供本发明的FAM3D分泌蛋白在制备商品化试剂研究瘤转移、肿瘤发生、炎症反应、肥胖和胰岛素抵抗、动脉硬化、血管钙化、心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心衰、病毒感染、过敏疾病、移植排斥、脑部疾病、自身免疫病、免疫调节、干细胞增殖分化、骨质疏松症等疾病的应用。

本发明还提供一种体外检测来自待测者的样品中本发明所述的蛋白或多核苷酸的表达水平的方法，该方法为反转录－聚合酶链式反应或蛋白质印迹检测方法。

可以采用本领域已知的任何方法检测本发明所述的蛋白或多核苷酸的表达水平。优选利用反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）检测所述多核苷酸在核酸水平的表达水平；或利用特异性单克隆或多克隆抗体检测所述多核苷酸在蛋白质水平的表达水平，例如或蛋白质印迹（Western blotting）检测方法。所述待测样品可以从来自受试者的细胞获得，如来自血液、尿、唾液、胃液、头发，活组织检查和尸体解剖材料的细胞。PT－PCR主要分以下步骤：提取总RNA，加入一个与mRNA3’端互补的引物，在反转录酶的作用下合成cDNA；第二步是以cDNA为模板，再加入与cDNA互补的另一引物（两引物位于不同的外显子上，以避免基因组DNA污染）进行PCR扩增。蛋白质印迹主要分三阶段：第一阶段为抗原等蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；第二阶段为电转移：将在凝胶中已分离的条带转移到硝酸纤维素膜上；第三阶段为显色检测：硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体），依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成显色物的酶反应底物，使条带染色。标记二抗的酶包括辣根过氧化物酶（horseradish Peroxidase,HRP）和碱性磷酸酶（alkalinephosphatease,AP）。也可以使用葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。在本发明的一个实施方式中，采用辣根过氧化物酶作为标记二抗的酶。本领域普通技术人员已知，针对不同的酶，可使用不同的底物，HRP作用的底物包括，但不限于临苯二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）和ABTS等。碱性磷酸酶的底物一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP)，AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮）。常用的酶标第二抗体已有市售。

本发明还提供本发明的FAM3D分泌蛋白在或多核苷酸或FAM3D的相互作用分子作为靶开发化合物、抗体、多肽药物和商品化试剂的应用。

实施例

实施例1、构建pcDNA3.1-FAM3D-myc-his6融合蛋白表达质粒

构建pcDNA3.1-FAM3D-myc-his6质粒，用于表达FAM3D-myc-his6融合蛋白。

一、方法：

将FAM3D编码序列(SEQ ID NO：2插入pcDNA3.1-myc-his6(Invitrogen公司)表达载体，构建pcDNA3.1-FAM3D-myc-his6表达质粒。测序验证质粒的正确性后，进行质粒扩增，用Axygen质粒大提试剂盒提取质粒，用于细胞转染。

二、结果：

经DNA测序编码区序列正确。

实施例2、质粒转染细胞获得FAM3D表达上清

一、方法：

HEK293T细胞调成6×10⁵细胞/2ml浓度在6孔板中37℃5%CO₂培养24小时进行转染，pCDNA3.1-FAM3D-myc-his6 DNA 2μg，vigofect(威格拉斯生物技术有限公司)2μl，混合液慢慢滴入准备好的细胞中，同时设pcDNA3.1-myc-his6空载体转染细胞对照，6小时后换无血清培养基HEKG，37℃培养48小时，收获转染后的上清。

利用Western Blotting检查目的蛋白的表达：

经12.5%SDS-PAGE电泳，用1XCaps电转液将蛋白转移至PVDF膜上，加入Anti-c-myc抗体（MBL公司）作用后，再加入IRDyeTM 800标记的抗鼠IgG（LICOR Bioscience），采用Odyssey Imaging System检测系统直接检测。

二、结果：

利用Western Blot检查目的蛋白的表达：

结果请参见图1所示。加入Anti-c-myc抗体作用后，再加入IRDyeTM800标记的抗鼠IgG二抗反应，经Odyssey Imaging System扫描，在图A（细胞裂解液）及图B（上清）34kD箭头所指处有一条清晰条带。

实施例3、人外周血单个核细胞的分离:

一、方法：

浓缩白细胞由北京市血液中心提供，采用淋巴细胞分离液（上海华精生物高科技有限公司）获得人外周血单个核细胞。用含10%热灭活的胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI 1640（LifeTechnologies,Inc.）培养。

二、结果：

获得人外周血单个核细胞，进行体外培养备用。

实施例4、FAM3D转染细胞培养上清的趋化功能

一、方法：

FAM3D转染细胞培养上清的趋化功能检测：趋化实验在48孔的趋化小室(Neutroprobe；Cabin John，MD，U.S.A.)里进行。用作趋化检测的加到小室的下孔里(28μl/孔)，然后用Hepes RPMI 1640稀释后同样的培养基重悬为1×10⁶个细胞/ml，加到小室的上孔中(55μl/孔)，上下孔用无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯滤膜相隔，使用滤膜孔径为3μm。将小室放入培养箱37℃，5%CO₂，孵育3h。趋化结束时吸取小室下孔的细胞使用luciferase-containing reagent Cell-Titer Glo（Promega）测量其化学发光值反应细胞计数值。转染pcDNA3.1空载体转染上清作为阴性对照。

趋化指数CI为迁移细胞数除以对照组细胞数。所有实验至少重复3次。CI>2有显著性意义。

二、结果：

如图2所示，FAM3D转染细胞培养上清(图中箭头所指198号)对PBMC具有趋化作用。

实施例5、FAM3D-myc-his6蛋白质的纯化与N端测序

一、方法：

将HEK293T细胞消化离心后调成1.5×10⁷细胞密度接种在直径为150mm平皿中，同时进行转染。pcDNA3.1-FAM3D-myc-his6 DNA12.5μg，PEI(威格拉斯生物技术有限公司)50μg，混合液慢慢滴入准备好的细胞中，同时设pcDNA3.1-myc-his6空载体转染细胞对照，16小时后换无血清培养基HEKG，37℃ 5%CO₂培养48小时，收获转染后的上清。2000rpm/min，10分钟，0.22μm滤膜过滤。取Ni Sepharose 6 FastFlow(GE healthcare)柱料，20倍体积水平衡，5mM咪唑500mM NaCl平衡液平衡，上清过柱后先用杂蛋白洗液洗柱，再用含1M咪唑的蛋白洗液洗脱。经过纯化，洗脱后样品经12.5%SDS-PAGE电泳转移至PVDF膜上，用考马斯亮兰染色，甲醇/冰乙酸脱色后裁下与Western blot检测阳性位置相同的带进行蛋白质的N端测序（委托上海基康生物技术有限公司测序）。

二、结果：

如图3A所示，纯化后的蛋白质样品经12.5%SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜（黑色箭头所示）。FAM3D-myc-his在34kd处有一条清晰条带；送至上海基康生物技术有限公司进行N端测序。图3B为报告，显示蛋白质的N端测序结果均为W-L-A-A-S-P-T-K-E-I。

实施例6、FAM3D在肿瘤细胞系的表达谱

一、方法：

利用TRIZOL(SIGMA公司)试剂完成在对数生长期的16种细胞中RNA提取，利用反转录试剂盒（Invitrogen）进行逆转录并以FAM3D上游F1(5’GCCCTCATCTTTGCCATAGTCA3’（SEQ ID NO：3）)，下游R1（5’AGAGTTTCCTGCTTTCATCGTTC3’（SEQ ID NO：4））为引物，扩增40轮PCR产物进行1%的琼脂糖胶电泳后EB染色通过UV拍摄。

二、结果：

如图4A所示：第1泳道为分子量标准；第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14泳道分别是人肿瘤细胞系分别是AGS、KYSE410、KYSE510、SGC7901、L02、MCG803、BGC823、HEPG2、U2OS、HT29、LNcap、DU145、JURKAT。如图4B所示：第一泳道为分子量标准；第2、3、4泳道分别是人肿瘤细胞系RAJI、K562、THP1以上16种人类肿瘤细胞系是以FAM3D(F1，R1)(图4A);G3PDH的F1(5’ACCACAGTCCATGCCATCAC3’(SEQ ID NO：5)),R2（5’TCCACCACCCTGTTGCTGTA3’(SEQ ID NO：6))(图4B)为引物进行的RT-PCR。结果显示：FAM3D在多种肿瘤细胞系中表达量较高，如MCG803、BGC823、SGC7901、HEPG2等，与后续试验中人类正常对应组织的表达量相比较可看出，FAM3D是一个肿瘤高表达基因，可能参与了肿瘤的发生发展。

实施例7、FAM3D在正常组织表达谱

一、方法：

人类各组织cDNA文库购自Clontech公司。利用ABI PCR扩增仪进行实时定量PCR检测。所有的cDNA模板均稀释100倍，在20μl的实时定量PCR扩增体系中，加入8μl稀释的cDNA模板及相应的引物，cDNA首先在95℃变性10分钟，然后按照95℃15秒，60℃1分钟的条件进行扩增。扩增β-actin作为系统内参。探针法扩增条件为50℃2分钟，95℃变性10分钟，然后按照95℃15秒，60℃1分钟，40轮，扩增GAPDH作为系统内参。实时定量PCR反应中所用引物序列为FAM3D F:5’GTAAAAGCCCCTTTGAGCAGT3’(SEQ ID NO：7)R:5’GGCCATCCCTCGTATTTGT3’(SEQ ID NO：8)。

二、结果：

如图5所示在正常组织中可见除扁桃体高表达、肺部、胰腺、淋巴结较高表达外，其余组织均低表达。

实施例8、在MGC803细胞上TNFα/IL-1刺激FAM3D表达上调

一、方法：

将TNFα/IL-1以10ng/ml的浓度在无菌条件下加入处于对数生长期的野生型MCG803细胞中，并与处理后的3、6、9、12小时分别利用TRIZOL(SIGMA公司)试剂完成细胞中RNA提取，利用反转录试剂盒（Invitrogen）进行逆转录并进行PCR。

二、结果：

如图5所示：第1泳道为分子量标准；第2、3、4、5泳道是分别以TNFα10ng/ml分别刺激12h、9h、6h、3h的逆转录cDNA为模板，第6道为未处理细胞逆转录cDNA为模板，第7、8、9、10是分别以IL-1 10ng/ml分别刺激3h、6h、9h、12h的逆转录cDNA为模板并以FAM3D F1(5’GCCCTCATCTTTGCCATAGTCA3’（SEQ ID NO：3）)，R1（5’AGAGTTTCCTGCTTTCATCGTTC3’(SEQ ID NO：4））;G3PDH的F1（5’ACCACAGTCCATGCCATCAC3’（SEQ ID NO：5））,R2（5’TCCACCACCCTGTTGCTGTA3’（SEQ ID NO：6）)为引物进行的RT-PCR，其中PCR轮数为35轮。RT-PCR结果显示：FAM3D在未刺激中细胞中没有检测到明显表达，而FAM3D在TNFα/IL-1刺激后表达增加，其中在刺激6小时表达达到高峰。

实施例9、MGC803细胞FAM3D表达受NFκB调控

一、方法：

将NF-κB抑制剂PDTC(Pyrrolidine dithiocarbamate，Sigma)以10μM或50μM的浓度于MGC803对数生长期时加入并设置未处理的对照组，24小时后收获细胞利用TRIZOL(SIGMA公司)试剂完成细胞中RNA提取，利用反转录试剂盒（Invitrogen）进行逆转录并进行PCR。

二、结果：

如图7显示与未处理组相比，PDTC导致的NFκB抑制可显著下调FAM3D的表达，与实施例9相印证提示FAM3D或为TNF-α或IL-1β激活的NFκB通路调控其表达。

实施例10、FAM3D-myc-his6真核蛋白质的纯化

一、方法：

将HEK293T细胞消化离心后调成1.5×10⁷细胞密度接种在直径为150mm平皿中，同时进行转染。pcDNA3.1-FAM3D-myc-his6 DNA12.5μg，PEI(威格拉斯生物技术有限公司)50μg，混合液慢慢滴入准备好的细胞中，同时设pcDNA3.1-myc-his6空载体转染细胞对照，16小时后换无血清培养基HEKG，37℃5%CO₂培养96小时，收获转染后的上清。2000rpm/min，10分钟，0.22μm滤膜过滤。取Ni Sepharose 6 FastFlow(GE healthcare)柱料，20倍体积水平衡，5mM咪唑500mM NaCl平衡液平衡，上清过柱后先用杂蛋白洗液洗柱，再分别用含10mM、20mM、50mM等梯度咪唑分别用5-10个柱体积的洗液洗杂蛋白。最后用500mM咪唑洗脱目的蛋白。

二、结果：

如图8所示，纯化后的蛋白质样品经12.5%SDS-PAGE电泳，直接考马斯亮蓝染色。图中用箭头指示的FAM3D-his6为目的蛋白条带。

实施例11、纯化真核蛋白FAM3D对PBMC的趋化作用

一、方法：

FAM3D真核蛋白的趋化功能检测：趋化实验在48孔的趋化小室(Neutroprobe；Cabin John，MD，U.S.A.)里进行。用作趋化检测的上清加到小室的下孔里(28μl/孔)，然后用Hepes RPMI 1640稀释后同样的培养基重悬为1×10⁶个细胞/ml，加到小室的上孔中(55μl/孔)，上下孔用无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯滤膜相隔，PBMC使用滤膜孔径为3μm。将小室放入培养箱37℃，5%CO₂，孵育4h及5h。趋化结束时吸取小室下孔的细胞使用luciferase-containing reagent Cell-Titer Glo（Promega）测量其化学发光值反应细胞计数值。以下孔加1640为阴性对照，CXCL12为阳性对照。PBMC由利用淋巴细胞分离液（上海华精生物高科技有限公司）获得。

二、结果：

如图9所示，FAM3D真核蛋白对PBMC具有趋化作用。其在200ng/ml的作用浓度下作用最为明显。

实施例12、纯化真核蛋白FAM3D对PBL的趋化作用

一、方法：

按实施例11所述方法进行趋化实验，收取4.5h及5h这两个时间点，并以CXCL12为阳性对照。PBL由利用淋巴细胞分离液（上海华精生物高科技有限公司）获得人外周血单个核细胞采用贴壁法分离而得，分为两组，其中一组加PHA20ug/ml处理过夜作为PBL细胞激活组，未处理组作为对照。第二天按上述方法进行趋化实验观察PBL对FAM3D引起的趋化运动能力的不同。

趋化指数CI为迁移细胞数除以对照组细胞数。CI>2有显著性意义。

二、结果：

如图10、11所示，FAM3D真核蛋白对PBL具有趋化作用。其在2000ng/ml的作用浓度下作用最为明显，与CXCL12活性浓度相似。其中PHA未处理PBL组（图10）PHA处理PBL组（图11）趋化指数与CXCL12相似。

实施例13、纯化真核蛋白FAM3D对PMN的趋化作用

一、方法：

按实施例11所述方法进行趋化实验，趋化时间为30min，以CXCL8为阳性对照。PMN由利用淋巴细胞分离液（上海华精生物高科技有限公司）及SIGMA公司的HISTOPAQUE-1119按说明书所示联合应用获得。

二、结果：

如图12所示，FAM3D真核蛋白对PMN具有趋化作用。其在200ng/ml的作用浓度下作用最为明显，与IL-8活性浓度相似。提示FAM3D可能在募集中性粒细胞至炎症部位的过程中发挥相应功能。

本文通过一些具体的实施方式对本发明进行了说明，而且为了描述的目的还针对许多细节进行了描述。对于本领域技术人员而言，本发明可以包括一些其它的具体实施方式，也可以在不偏离本发明主旨的情况下针对所披露的发明内容进行适当的调整和变化。

Claims (11)

1.一种具有趋化活性的蛋白，其包含：

（1）如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白；或

（2）具有与(1)所述蛋白有至少80%同源性的氨基酸序列的蛋白，其与（1）所述蛋白具有相同或相似或不同的生物学功能。

2.根据权利要求1所述的蛋白，其包含：

（1）具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白；或

（2）具有与(1)所述蛋白有至少90%同源性的氨基酸序列的蛋白，其与（1）所述蛋白具有相同或相似或不同的生物学功能。

3.一种多核苷酸，其包含：

（1）编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多核苷酸；或

（2）具有与(1)所述多核苷酸有至少80%同源性的多核苷酸，其编码的蛋白与(1)所述多核苷酸编码的蛋白具有相同或相似或不同的生物学功能。

4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其包含具有SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列或其互补序列。

5.一种基因工程载体，其含有根据权利要求3或4所述的多核苷酸。

6.一种药物组合物，其含有权利要求1或2所述的蛋白、编码所述蛋白的多核苷酸、含有所述多核苷酸的载体，和/或一种或多种药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂。

7.一种使用如权利要求1或2所述的蛋白或编码所述蛋白的多核苷酸在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的应用，所述疾病包括肿瘤转移、肿瘤发生、炎症反应、肥胖和胰岛素抵抗、动脉硬化、血管钙化、心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心衰、病毒感染、过敏疾病、移植排斥、脑部疾病、自身免疫病、免疫调节、干细胞增殖分化、骨质疏松症。

8.一种体外检测来自待测者的样品中权利要求1或2所述的蛋白或编码所述蛋白的多核苷酸表达水平的方法。

9.根据权利要求8所述的方法，所述方法为反转录－聚合酶链式反应或蛋白质印迹、ELISA、FACS、免疫荧光、免疫组化、免疫细胞化学检测方法。

10.一种根据权利要求1或2所述的蛋白或编码所述蛋白的多核苷酸在制备用于研究疾病的商品化试剂中的应用，其中所述疾病包括肿瘤转移、肿瘤发生、炎症反应、肥胖和胰岛素抵抗、动脉硬化、血管钙化、心肌缺血-再灌注损伤、高血压、心衰、病毒感染、过敏疾病、移植排斥、脑部疾病、自身免疫病、免疫调节、干细胞增殖分化、骨质疏松症。

11.一种根据权利要求1或2所述的蛋白及其相互作用分子，或/和编码所述蛋白多核苷酸作为靶开发化合物、抗体、多肽药物和商品化试剂的应用。

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