CN113842451B - Fam3d蛋白及编码其的多核苷酸的医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了FAM3D蛋白及编码其的多核苷酸的医药用途。FAM3D蛋白具有维持肠道稳态、调控肠道炎症的作用，FAM3D蛋白、相关多肽或编码它们的多核苷酸、包含该多核苷酸的基因工程载体、工程细胞以及相应的药物组合物能够应用于制备调控肠道免疫、肠道粘膜屏障和/或肠道微生物的制剂，以及诊断、预防和/或治疗包括炎症性肠病、肠易激综合征、精神压力引起的肠道疾病、肠道癌症等肠道疾病的药物。FAM3D蛋白或编码其的多核苷酸还可以用作生物标记物，作为靶标开发化合物、抗体、多肽或寡核苷酸等药物或/和商品化试剂，用于调控肠道免疫、肠道粘膜屏障和/或肠道微生物，或者诊断、预防、治疗和/或研究相关肠道疾病。

Description

FAM3D蛋白及编码其的多核苷酸的医药用途
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别地，本发明涉及FAM3D蛋白及编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的基因工程载体、工程细胞和相应的药物组合物，以及它们的医药用途。
背景技术
机体的胃肠道粘膜持续暴露于大量的实物抗原和复杂多样的肠道微生物的刺激之下，因此完整有效的肠道粘膜系统对于维持机体的健康非常重要。肠道粘膜系统根据结构和定位大体分为以下三个部分：
第一部分是位于肠腔内的共生微生物群，包括细菌、真菌、病毒和寄生虫等，它们通过代谢不能吸收的食物组分及产生维生素、短链脂肪酸等物质促进机体生长。同时阻止致病菌的定植，保护机体不被疾病困扰(Ley R,E.et al.,2008,Science 320,1647-51)。肠道菌群的破坏能引发肠道疾病，例如炎症性肠病，包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。一些降解肠道黏液素的微生物，如Clostridium perfringens，以及条件致病菌Peptostreptococcus，在溃疡性结肠炎和结肠癌患者的肠腔中显著富集，显示微生物失衡与肠道疾病的发生发展息息相关(Tsoi,H.et al.,2017,Gastroenterology 152,1419-1433；Machiels,K.et al.,2017,Gut 66,79-88)。临床上补充益生菌制剂作为一种有效的治疗手段，可以缓解肠道疾病症状。
第二部分是肠上皮及其分泌的黏液层所构成的上皮屏障。黏液层主要是由肠上皮内的杯状细胞分泌的粘液素构成。它将大量的肠道细菌与肠上皮隔离开(Johansson,M.etal.,2008,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America 105,15064-9)。黏液层下方则是紧密连接在一起的肠上皮各群细胞，包括杯状细胞、潘氏细胞、吸收性肠细胞和肠内分泌细胞。肠细胞行使消化功能，肠内分泌细胞分泌激素调节消化功能。这些上皮细胞通过紧密连接排列，与黏液层一起构成理化屏障将肠腔内的细菌与宿主隔离开，防止其损伤上皮细胞或激活免疫细胞。除了屏障功能，肠上皮还可以通过感知细菌信号和介导免疫调节功能，维持肠道粘膜稳态(Yang,Z.,et al.,2007,Gastroenterology 133,1510-1521；Kim,H.S.et al.,2013,Gastroenterology 145,1392-1403)。上皮屏障完整性被破坏能导致炎症性肠病，包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。例如，在溃疡性结肠炎病人中，杯状细胞和黏液素的缺失是非常常见的病理特征(GersemannM.et al.,2009,Differentiation 77,84-94)。针对溃疡性结肠炎病人结肠样品检测结果也发现了内质网应激和黏液素前体的累积(Heazlewood C.K.et al.,2008,Plos Medicine5,440-60)。此外，在克罗恩氏病的患者中检测到α和β防御素的下调(Wehkamp J.et al.,2005,Proc Natl Acad Sci U S A 102,18129-34)。临床上，迁延不愈的炎症可导致结肠癌的发生和发展。
第三部分为粘膜固有层内的各群固有免疫细胞和适应性免疫细胞以及肠上皮内淋巴细胞。这些免疫细胞通过精确调节免疫反应，保持对肠道共生菌和食物抗原的耐受状态，同时针对病原微生物仍能产生快速有效的应答。其中固有免疫细胞包括固有淋巴细胞、中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞。这些细胞可以通过分泌炎性细胞因子和炎性趋化因子介导炎症反应清除入侵的微生物(Farache,J.et al.,2013,Immunity 38,581-95；Coombes,J.et al.,2008,Nature Review Immunology 8,435-46；Zheng,Y.et al.,2008,Nature Medicine 14,282-9；Qiu,J.et al.,2012,Immunity 36,92-104)。
上述三个部分相互调节，互相调控以维持肠道稳态，其中肠道上皮屏障是关键组分。当上皮屏障完整性被破坏，肠道菌群可以从肠腔入侵到肠道组织，上皮细胞可以分泌大量促炎介质和募集免疫细胞。此时，肠道功能失调，导致营养物质和水的吸收功能减弱，产生黏膜炎症，最后导致疾病发生。如果这种炎症状态持续发生，可导致损伤修复功能失调，最后引发炎症性肠病甚至癌症。
综上所述，肠道共生菌通过肠上皮细胞直接或间接调节黏膜免疫反应，黏膜免疫系统通过肠上皮细胞调节菌群稳态，因此，在肠道黏膜系统的三个组分中，肠上皮是关键(Pott,J.et al.,2012,Embo Rep 13:684-98)。
炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)是一组特定的肠道慢性疾病的统称，主要包括克罗恩氏病(Crohn’s disease,CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)两种。IBD的发病原因目前基本达到以下共识：IBD的发生是具有遗传易感性的个体在环境、微生物和肠道免疫等因素共同作用下的结果。目前病因学研究结果包括：1.环境和遗传因素：IBD的发病与饮食、药物、地域和社会地位、精神压力等环境因素有关。近年来，相继有240余个基因被证实与IBD的易感性相关(Liu J,Z.et al.,2015,Nature Genetics 47,979-86；Stoll,M.et al.,2004,Nature Genetics 36,476-80；Peltekova,V.D.et al.,2004,Nature Genetics 36,471-5)等。这些易感基因不仅影响IBD患病风险，也与临床分型诊断、药物治疗效果相关。2.微生物因素：包括致病原和肠道共生菌(Henke M.T.et al.,2019,P Natl Acad Sci USA 116,12672-7；Tsoi,H.et al.,2017,Gastroenterology 152,1419-1433；Machiels,K.et al.,2017,Gut 66,79-88)。基于动物模型的研究表明，肠道发生炎症需要肠道共生菌群的参与。3.免疫机制：包括上皮屏障和免疫系统的参与。IBD患者肠道上皮来源潘氏细胞所分泌的防御素减少，以及杯状细胞分泌黏液素阻滞，导致炎症的发生和发展(Yang,Z.,et al.,2007,Gastroenterology 133,1510-1521；Kim,H.S.et al.,2013,Gastroenterology 145,1392-1403)。有报道表明参与IBD炎症反应的免疫细胞有单核巨噬细胞、中性粒细胞和T细胞等。此外，促炎细胞因子增加，以及抗炎细胞因子减少也是导致肠道黏膜慢性炎症的主要原因(Ekbom A.et al.,1990,New England Journal ofMedicine 323,1228-33)。
炎症相关结直肠癌(colitis-associated colorectal cancer,CAC)是IBD患者最严重的并发症。研究表明，在IBD发生20、25和30年，患者继发CAC的风险为5％-7％、7％-14％，和7.5％-18％(S.et al.,2009,Gastroenterology 136,1561–157)。CAC好发于活动性炎性肠道，能导致10％-15％炎性肠病患者的死亡(Malik TA.et al.,2015,Surg Clin North Am 95,1105-1122)。结肠癌主要为腺癌、黏液腺癌、未分化癌。在致病因素研究中，已阐明包括氧化应激、白细胞介素(interleukin，IL)-6、多种炎症介质、染色体不稳定、炎症相关免疫细胞、细胞炎症因子以及多种信号通路，如核因子κB(nuclearactorkappa B,NF-κB)信号通路及IL-6/信号转导及转录激活因子3和细胞因子信号转导抑制因子3，在IBD发展至CAC过程中发挥一定作用(Eaden JA.et al.,2001,Gut 48,526-535；Risques RA.et al.,2011,Cancer Research 71，71,1669-1679)。
肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是指在排除器质性病变的前提下，以慢性腹痛、腹胀、排便性状及习惯改变为特点的消化道功能紊乱性疾病。IBS病因尚不明确，目前发现肠道微生物失衡、肠道渗透性增高、肠道黏膜免疫功能激活等因素为IBS的主要致病机制。1.肠道菌群：肠道微生物组成及多样性在IBS及正常对照组之间存在明显区别，而IBS不同亚型之间其肠道微生物组成亦有差异。肠道菌群中，厚壁菌门(Firmicutes)比例的升高，被部分学者认为是IBS发生的重要病因，其代谢产物等也可直接影响肠道舒缩功能及肠道神经丛功能状态(Hod K.et al.,2016,Best Pract Res Clin Gastroenterol30,89-97)。2.肠道渗透性增高：肠道黏膜是人体内外环境之间的重要屏障。肠道渗透性增高可使肠腔有害内容物更易通过黏膜保护屏障向肠道内膜下组织转移，从而进入血液循环，激活体内免疫系统及局部的肠道炎症反应，这也被认为是IBS重要的发病机制(AdrianiA.et al.,2018,Panminerva Med 60,213-22)。3.肠道黏膜免疫系统的激活：研究发现，部分人群在细菌、病毒或寄生虫感染肠道后，会逐步出现IBS临床表现，从而提出慢性弱炎症反应是IBS发生、发展的重要病因。血清学检查也发现，患者的淋巴细胞、肥大细胞、细胞因子等炎症因子水平高于正常人群。近年来通过对肠道黏膜样本进行检测发现，IBS患者炎症细胞水平升高，进一步佐证肠道自身炎症系统的激活是重要发病机制之一(LazaridisN.et al.,2018,Ann Gastroenterol 31,171-187)。此外，精神压力等中枢神经系统和社会心理因素主要涉及内脏高敏感、脑肠轴互动异常和社会心理功能障碍等也被认为是IBS的病因(Saha L.et al.,2014,World J Gastroenterol 20,6759–6773)。
细胞因子是由机体各种细胞合成分泌的具有多种生理活性和参与病理反应的小分子可溶性蛋白质。细胞因子为细胞提供相互沟通的能力，并介导复杂的多细胞行为。大量的细胞因子已经被证明参与结肠稳态维持和炎症调控，其中包括白介素-6(IL-6)超家族、白介素-17(IL-17)、白介素-18(IL-18)和白介素-23(IL-23)等(Weigmann,B.et al.,2008,Journal of Experimental Medicine 205,2099-2110；Reynolds,J.et al.,2015,Immunity 42,692-703；Roni,N.et al.,2015,Cell 163,1444-1456；Sivakumar,P.et al.,2001,Gastroenterology 120,A692-A693；Yen,D.et al.,2006,Journal of ClinicalInvestigation 116,1310-1316)。
具有重要生理、病理意义的基因及其编码产物蛋白质可以作为药物靶标，开发靶向这一分子本身及其相互作用分子的重组蛋白、化合物、抗体、多肽药物或基因工程药物和商品化试剂，应用于发病机制研究、疾病标志物的研究和临床检测，及临床的药物的治疗。
发明内容
本发明首次成功地发现一种新的具有维持肠道稳态、调控肠道炎症的蛋白，即分泌蛋白FAM3D(Family with sequence similarity 3,member D)。人FAM3D蛋白的全长序列包括224个氨基酸残基，如序列表中SEQ ID No：2所示；其分泌型包括186个氨基酸残基，如序列表中SEQ ID No：3所示。FAM3D在消化道高表达，经构建Fam3D敲除小鼠并建立葡聚糖硫酸钠(Dextran-sulfate sodium，DSS)诱导的结肠炎模型，本发明的研究发现并证明FAM3D的缺失导致结肠杯状细胞分泌阻滞，减少酸性黏蛋白的分泌，从而导致黏液层变薄，黏膜屏障功能减弱，肠道菌群失调，产生自发炎症，进而提高DSS诱导的结肠炎易感性以及结肠癌发生。通过构建FAM3D腺病毒表达系统Adenovirus-FAM3D(Adv-FAM3D)，经结肠灌注的方式在小鼠结肠过表达FAM3D，可以减轻DSS诱导的结肠炎，起到治疗DSS诱导的结肠炎的作用。
本发明提供了FAM3D蛋白、相关多肽或编码它们的多核苷酸、包含该多核苷酸的基因工程载体、工程细胞以及相应的药物组合物在制备诊断、预防和/或治疗肠道疾病的药物或研究肠道疾病的商品化试剂中的应用，其中所述应用包括对肠道免疫、肠道粘膜屏障和/或肠道微生物的调控；其中所述肠道疾病包括炎症性肠病、肠易激综合征、精神压力引起的肠道疾病、肠道癌症等。
本发明在一方面提供了一种调控肠道免疫、肠道粘膜屏障和/或肠道微生物，诊断、预防和/或治疗炎症性肠病、肠易激综合征、精神压力引起的肠道疾病、肠道癌症发生发展的蛋白，所述蛋白是：
(1)具有序列表中SEQ ID No：2或SEQ ID No：3所示氨基酸序列的蛋白；或
(2)与(1)所述蛋白有至少80％氨基酸序列同源性的蛋白，且具有与(1)所述蛋白相同或相似的生物学功能。
序列表中SEQ ID No：2所示为人FAM3D蛋白的全长氨基酸序列，SEQ ID No：3所示为人FAM3D分泌蛋白，保留了全长FAM3D蛋白C端的186个氨基酸，是全长FAM3D蛋白可分泌到胞外的功能形式。具有与SEQ ID No：2或SEQ ID No：3所示氨基酸序列至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更进一步优选至少95％，特别优选至少98％，更为特别优选至少99％同源性(序列匹配)的序列，且与SEQ ID No：2或SEQ ID No：3所示的氨基酸序列具有相同或相似生物学功能的蛋白也属于本发明维持肠道稳态、调控肠道炎症的蛋白范畴。
本发明在另一方面提供了一种能够调控肠道免疫、肠道粘膜屏障和/或肠道微生物，诊断、预防和/或治疗炎症性肠病、肠易激综合征、精神压力引起的肠道疾病、肠道癌症发生发展的编码本发明蛋白的多核苷酸。所述多核苷酸是：
(i)编码序列表中SEQ ID No：2或SEQ ID No：3所示氨基酸序列的多核苷酸；或
(ii)具有与(i)所述多核苷酸至少80％序列同源性的多核苷酸，其编码的蛋白与(i)所述多核苷酸编码的蛋白具有相同或相似的生物学功能。
序列表中SEQ ID No：1给出了编码全长FAM3D蛋白的一种多核苷酸序列，基于密码子的简并性，本领域技术人员应该了解，FAM3D蛋白的编码基因不止SEQ ID No：1。此外，本发明提供的多核苷酸可以是在蛋白编码序列的基础上，增加非编码序列，例如内含子、编码序列5’端或3’端的非编码序列、标签序列等。因此，本发明所述多核苷酸的还包括具有与FAM3D蛋白的编码多核苷酸序列至少80％、优选至少85％、更优选至少90％同源性的多核苷酸，且该多核苷酸编码的蛋白与FAM3D具有相同或相似生物学功能。本发明的多核苷酸序列最好是以“分离”形式提供的。所述“分离”形式，是指不仅已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开，而且已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来。
本发明在另一方面提供了一种基因工程载体，该基因工程载体含有编码本发明FAM3D或其同源蛋白的多核苷酸。所述基因工程载体可以是普通载体、表达载体、质粒载体、病毒载体等。优选的，本发明的基因工程载体为腺病毒基因工程载体。
本发明在另一方面提供了一种工程细胞，该工程细胞含有上述基因工程载体，或者在其基因组中整合有编码本发明FAM3D或其同源蛋白的多核苷酸序列。所述工程细胞可以是细菌、真菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等，优选的，所述工程细胞为肠道益生菌。
本发明在另一方面提供了一种药物组合物，该药物组合物含有本发明的蛋白或其多肽片段、多核苷酸、基因工程载体和/或工程细胞，以及一种或多种药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明在另一方面提供了一种本发明蛋白或其多肽片段、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的基因工程载体、工程细胞以及相应的药物组合物的实施方法。
本发明的蛋白或其多肽片段、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的基因工程载体、工程细胞以及相应的药物组合物不仅可应用于制备调控肠道免疫、肠道粘膜屏障和/或肠道微生物的制剂，以及诊断、预防和/或治疗炎症性肠病、肠易激综合征、精神压力引起的肠道疾病、肠道癌症发生发展的药物，还可应用于制备用于研究肠道疾病的商品化试剂。所述商品化试剂可以包含本发明的蛋白或其多肽片段或编码它们的多核苷酸。
本发明在另一方面提供了一种靶标，本发明的蛋白、多肽或编码其的多核苷酸可以用作生物标记物，作为靶标开发化合物、抗体、多肽或寡核苷酸等药物或商品化试剂。以本发明的蛋白、多肽或多核苷酸作为靶标开发化合物、抗体、多肽药物或寡核苷酸药物或商品化试剂的应用也在本发明的保护范围内。例如，用来制备调控肠道免疫、肠道粘膜屏障和/或肠道微生物的制剂，以及诊断、预防和/或治疗炎症性肠病、肠易激综合征、精神压力引起的肠道疾病、肠道癌症发生发展的药物；或者用来检测Fam3D基因的mRNA表达水平或其蛋白质表达量的试剂，可用于诊断炎症性肠病、肠易激综合征、精神压力引起的肠道疾病、肠道癌症发生发展。这种制剂可包括，例如，具有与FAM3D mRNA互补的序列的寡核苷酸，与FAM3D mRNA特异性结合的引物或核酸探针，以及FAM3D蛋白质的特异性抗体。
另外，本发明还提供一种体外检测来自待测者的样品中本发明所述的FAM3D蛋白或多核苷酸的表达水平的方法，该方法为反转录－聚合酶链式反应、蛋白质印迹、免疫微球、免疫组织化学检测或免疫细胞化学检测。
本发明首次证明了FAM3D蛋白对维持肠道稳态、调控肠道炎症具有重要作用，由此获得针对炎症性肠病、肠易激综合征、精神压力引起的肠道疾病、肠道癌症发生发展等肠道疾病的预防和治疗手段。FAM3D蛋白或编码其的多核苷酸还可以用作生物标记物，作为靶标开发化合物、抗体、多肽或寡核苷酸等药物和商品化试剂，用于诊断、治疗、预防或研究相关肠道疾病。
附图说明
图1显示real-time PCR检测FAM3D在小鼠各组织的表达谱。结果显示：FAM3D在消化道高表达，包括结肠、盲肠、胃和小肠，在肠系膜淋巴结、肺、胸腺和脾中可见表达，其余组织未见明显表达。
图2显示real-time PCR检测FAM3D在小鼠消化道中各部分的表达谱。结果显示：FAM3D的表达从胃，经十二指肠、空肠和回肠表达依次下调，FAM3D的表达从盲肠至结肠升高，在结肠中，中段结肠比近端结肠和远端结肠的FAM3D表达高。
图3显示Western印迹法检测FAM3D在小鼠各组织的表达谱。结果显示：FAM3D在小鼠消化道中表达较高，其余组织表达较低。
图4显示Western印迹法检测FAM3D在小鼠结肠表达水平的相对定量。其中：第1泳道为结肠组织匀浆，上样量为30μg总蛋白，第2泳道为200ng小鼠重组FAM3D蛋白；采用商品化羊多抗检测FAM3D在结肠中的表达水平，采用Image J，重组蛋白为标准，通过光密度分析，计算得到FAM3D表达量约为90ng/30μg结肠组织。
图5显示羊抗小鼠FAM3D的多克隆抗体识别结肠、小肠和盲肠中FAM3D的免疫组织化学结果。可见，FAM3D在消化道上皮细胞高表达。
图6显示实施例5的RNA Seq检测结果，代表机体防御差异基因热图。结果显示：机体防御差异基因在Fam3D-/-小鼠结肠上皮表达下调。
图7显示实施例6采用real-time PCR检测WT和Fam3D-/-小鼠结肠上皮抗菌肽表达。结果显示：部分抗菌肽在Fam3D-/-小鼠结肠上皮表达下调。
图8显示实施例7采用组织免疫荧光检测小鼠结肠Reg3γ表达。结果显示：Reg3γ在Fam3D-/-小鼠结肠上皮表达下调。
图9显示实施例8通过GSEA分析杯状细胞特征基因在Fam3D-/-小鼠变化基因组中的富集情况。结果显示：杯状细胞特征基因在Fam3D-/-小鼠变化基因组显著富集，提示Fam3D的缺失可导致杯状细胞异常。
图10显示实施例9中FAM3D与MUC2免疫荧光共染结果。结果提示：FAM3D与杯状细胞标志物MUC2有共表达，提示FAM3D可由杯状细胞产生。
图11显示实施例10中Fam3D-/-小鼠结肠组织PAS(periodic acid-Schiff’sreagent)/AB(Alcian blue)染色结果。结果显示：杯状细胞数量增加，酸性黏液素分泌减少。
图12显示实施例10中Fam3D-/-小鼠结肠组织HID(high iron diamine)/AB(Alcianblue)染色结果。结果显示：Fam3D-/-小鼠结肠中所缺失的酸性黏液素，主要成分为唾液酸化的酸性黏液素。
图13展示了实施例11中Fam3D-/-小鼠结肠黏液层染色。通过对小鼠含便结肠进行AB染色，结肠黏膜与肠内容物之间的蓝色带状物质即为黏液层。结果显示：Fam3D-/-小鼠结肠中黏液层变薄。
图14显示实施例12中Fam3D-/-小鼠结肠组织H&E染色。结果显示：Fam3D-/-小鼠结肠隐窝变长，提示增殖异常。
图15显示实施例13中Fam3D-/-小鼠结肠组织Ki67免疫组化染色。结果显示：Fam3D-/-小鼠结肠隐窝Ki67阳性细胞数增加，提示其与增殖异常有关。
图16显示实施例14中Fam3D-/-小鼠结肠组织F4/80、CD3和B220免疫荧光染色结果。结果显示：Fam3D-/-小鼠结肠CD3+T细胞和B220+B细胞浸润增多，F4/80+巨噬细胞数量有上调趋势。提示Fam3D-/-小鼠结肠有低程度炎症发生。
图17显示实施例15中real-time PCR检测Fam3D-/-小鼠结肠组织炎性细胞因子表达。结果显示：Fam3D-/-小鼠结肠Il-1和Cxcl1表达上调，提示Fam3D-/-小鼠结肠有低程度炎症发生。
图18显示实施例16中52周龄小鼠结肠组织H&E染色。结果显示：Fam3D-/-小鼠结肠发生明显地增生。A图展示了Fam3D-/-小鼠结肠有中性粒细胞的浸润。B图展示了Fam3D-/-小鼠结肠有入侵性腺腔的产生。提示Fam3D-/-小鼠结肠在低程度的炎症长期浸润下有发生癌变的趋势。
图19显示实施例16中52周龄Fam3D-/-小鼠结肠组织PAS/AB染色结果。结果显示：Fam3D-/-小鼠结肠成熟上皮细胞缺失，提示有癌变的趋势。
图20和图21分别显示实施例17中52周小鼠结肠长度和重量统计。结果显示：Fam3D-/-鼠的结肠重量增加，反映了其结肠组织增生。
图22显示实施例17中52周小鼠的脾脏比较。结果显示：52周Fam3D-/-小鼠的脾体积大于WT小鼠的脾，提示Fam3D-/-小鼠体内存在炎症，使其脾脏增大。
图23和图24分别显示实施例18中小鼠粪便微生物16S rRNA扩增结果。结果显示：Fam3D-/-小鼠的肠道微生物组成与WT小鼠有差异，反映了Fam3D-/-小鼠的肠道菌群失调。
图25展示了实施例19的小鼠慢性束缚应激模型(CRS)和慢性强迫游泳应激模型(CFSS)中结肠组织Fam3D转录表达结果，提示在慢性应激抑郁模型中Fam3D的转录水平下调。
图26展示了实施例19的小鼠社会挫败模型(CSDS)中结肠组织Fam3D转录表达结果，提示在抑郁模型中Fam3D的转录水平下调。
图27展示了实施例20DSS诱导的急性结肠炎的模式图。
图28显示实施例20DSS诱导的急性结肠炎模型中各组小鼠的体重变化曲线。结果显示：与WT小鼠相比，Fam3D-/-小鼠模型第4天体重即发生下降，模型第7天体重下降约70％，比WT小鼠体重下降更明显，提示Fam3D的缺失导致小鼠对DSS处理的易感性增加。
图29显示实施例20DSS诱导的急性结肠炎模型第5天，Fam3D-/-小鼠结肠长度即发生缩短，模型第7天，较WT小鼠，Fam3D-/-小鼠的结肠缩短更为显著。
图30显示实施例20DSS诱导的急性结肠炎模型中各时间点小鼠的结肠组织的H&E染色。结果显示：DSS模型第5天，Fam3D-/-小鼠结肠即出现表现为炎性细胞浸润、隐窝结构被破坏的中等程度的炎症反应；模型第7天，Fam3D-/-小鼠结肠黏膜损伤严重，已完全失去完整的腺腔结构，表现为结缔组织和免疫细胞散在分布。该结果表明Fam3D的缺失导致DSS处理下结肠黏膜更易被破坏。
图31展示了实施例21DSS诱导的慢性结肠炎模型的模式图。将DSS溶于小鼠正常饮用水中，配成2.5％DSS(w/v)或1.5％DSS(w/v)溶液。首先给予小鼠2.5％DSS饲喂4天，接着撤去DSS，更换正常饮用水饲喂2周，此为1个循环。之后给予小鼠1.5％DSS饲喂4天，接着撤去DSS，更换正常饮用水饲喂2周，此为第2个循环。依照第2个循环饲喂模式，接着给予小鼠3个循环的处理，在最后一个循环结束后，处死小鼠，收取结肠组织，统计肠壁肿瘤数量，以及进行病理学和分子生物学检测。模型中每日测量并记录小鼠体重。
图32显示实施例21中纵向剖开结肠后，肠壁肿瘤数量的统计。结果显示：Fam3D-/-小鼠结肠荷瘤数目和大小较WT小鼠有明显增加。这个结果提示Fam3D的缺失导致小鼠对DSS诱导的慢性结肠炎易感性增加。
图33展示了实施例22AOM(azoxymethane)/DSS诱导的结肠癌模型的模式图。模型中给予小鼠腹腔注射12.5mg/kg AOM，AOM注射7天后给予小鼠1.5％DSS(w/v)饲喂4天，接着撤去DSS，给予小鼠正常饮用水饲喂20天，此为1个循环。共给予小鼠3个循环的1.5％DSS和正常饮用水处理。在最后一个循环结束后，处死小鼠，收取结肠组织，统计肠壁肿瘤数量，以及进行病理学和分子生物学检测。模型中每日测量并记录小鼠体重。
图34显示实施例22AOM/DSS诱导的结肠癌模型小鼠结肠组织的荷瘤数量和大小。结果显示：通过统计和测量结肠肠壁肿瘤数量和大小，Fam3D-/-小鼠肿瘤发生和发展都较WT小鼠有明显提高。
图35显示实施例22AOM/DSS诱导的结肠癌模型小鼠结肠组织H&E染色。结果提示：Fam3D-/-小鼠结肠上皮出现过度增生，黏膜显著增厚，出现大量增生腺腔，并向黏膜下基层入侵，呈现恶性黏液腺癌的表型。
图36显示实施例23 Western印迹法检测Fam3D-/-小鼠结肠灌注Adv-FAM3D后结肠组织FAM3D的表达。结果显示：Fam3D-/-小鼠结肠灌注Adv-FAM3D可在结肠过表达FAM3D。
图37显示实施例23 Fam3D-/-小鼠结肠灌注Adv-FAM3D后，结肠组织免疫荧光染色。结果显示：Fam3D-/-小鼠结肠灌注腺病毒Adv-FAM3D可使FAM3D表达在结肠上皮。
图38显示实施例24结肠灌注Adv-FAM3D治疗DSS诱导的急性结肠炎示意图。在首次灌注前小鼠饥饿处理16小时，在灌注前采用无菌PBS灌注结肠3次，每次1ml以促进小鼠排出剩余粪便。小鼠粪便排净后，麻醉小鼠，给予小鼠结肠灌注腺病毒Adv-FAM3D 100μl，剂量为109/PFU，PBS稀释。注射完成后，小鼠头朝下倒置5分钟，防止病毒流出。待病毒完全吸收后，将小鼠放回笼子内，恢复其正常饮食。第1次灌注24小时后，对小鼠进行第2次灌注，方法与计量与第1次相同。共进行3次灌注。第3次灌注24小时后，给予小鼠饲喂2.5％DSS(w/v)5天，之后撤去DSS，更换正常饮用水饲喂2天。于模型第7天处死小鼠，收取结肠组织进行病理学和分子生物学检测。模型中每日测量并记录小鼠体重。
图39显示实施例24结肠灌注腺病毒后各组小鼠的体重变化。结果显示：通过结肠灌注腺病毒Adv-FAM3D的方式过表达FAM3D，可减轻WT小鼠的体重下降；同时也可以减轻Fam3D-/-小鼠体重的下降。
图40显示实施例24结肠灌注腺病毒后各组小鼠的模型终点时的结肠长度。结果显示：通过结肠灌注腺病毒Adv-FAM3D的方式过表达FAM3D，可减轻WT小鼠的结肠缩短；同时也可以减轻Fam3D-/-小鼠结肠的缩短。
图41显示实施例24结肠灌注腺病毒后各组小鼠结肠组织的H&E染色。结果显示：过表达FAM3D可显著降低WT小鼠的上皮损伤，可部分挽救Fam3D-/-小鼠炎症表型，相比于Adv-null组的上皮完全破坏，结缔组织散在分布，过表达FAM3D组隐窝结构得到部分恢复，出现了部分完整的腺腔结构。上述结果提示，过表达腺病毒Adv-FAM3D可以减轻WT和Fam3D-/-小鼠的肠炎表型。
具体实施方式
以下通过一些具体实施方式和实施例对本发明进行较为详细的说明。然而应该理解，这些说明以及后面所列的实施例不是用来限制本发明权利要求的范围。
根据本发明的具体实施例，FAM3D在脊椎动物的消化道上皮细胞特异性高表达。通过构建FAM3D腺病毒表达系统，通过对小鼠进行结肠灌注腺病毒Adv-FAM3D在小鼠结肠过表达FAM3D蛋白，可减轻DSS诱导的小鼠结肠炎表型，从而可知FAM3D为肠道的重要保护因子。因此，本发明提供用于调节肠道免疫、肠道粘膜屏障和肠道微生物的组合物，该组合物包含可作为调节免疫细胞移动数量的调节剂的Adv-FAM3D或其他表达FAM3D的载体。
根据本发明的另一具体实施例，FAM3D在消化道中特异性高表达。FAM3D在消化道中的结肠分布最多，由结肠上皮细胞分泌。FAM3D蛋白可通过其存在与否来调控杯状细胞的功能，影响黏液层厚度和黏膜完整性，从而影响肠道微生物组成。亦即，由于可通过恢复表达FAM3D来增加降低结肠对炎症的易感性，从而可知FAM3D蛋白为维持肠道稳态系统的重要保护因子，可作为针对消化道疾病的治疗手段。
本发明的用于维持肠道稳态和炎症调控的组合物可包含天然或重组FAM3D、与之具有实质上等同的生理活性的FAM3D蛋白质、过度表达所述天然或重组FAM3D的转基因消化道上皮细胞。所述具有实质上等同的生理活性的FAM3D蛋白质包含天然/重组FAM3D、其功能性等同物和功能性衍生物。
所述术语“功能性等同物”是指部分或全部的天然蛋白质的氨基酸被置换或部分氨基酸被删除或添加的氨基酸序列变异体，而且与天然FAM3D具有实质上等同的生物活性。
所述术语“功能性衍生物”是指经修饰的蛋白质，其能增强或降低所述FAM3D蛋白质的物理和化学性质，而且与天然FAM3D具有实质上等同的生物活性。
此外，根据本发明的另一具体实施例，在小鼠结肠炎模型中，FAM3D随着肠炎的发生发展而下调，而Fam3D的缺失即造成小鼠自发肠炎，因此可预期，从长远来看，在体内Fam3D对肠道屏障的完整性维持具有重要作用。因此，FAM3D可用作生物标记，用来诊断由结肠黏膜受到刺激引起的肠易激综合征、炎症性肠病等消化系统疾病。
本说明书中使用的术语“结肠黏膜受到刺激”包括能够引起炎症的所有种类的结肠黏膜刺激。例如，肠道菌群失调，焦虑、紧张、抑郁神经等心理异常，感染，药物或治疗方式所带来的上皮损伤等，但所述损伤不限于此。
所述术语“肠易激综合征、炎症性肠病等消化系统疾病”是指缺乏胃肠道结构和生化异常的肠道功能紊乱性疾病，和累及回肠、直肠、结肠的一种特发性肠道炎症性疾病，以及由此进一步发展成的结肠癌，但该疾病不限于任何具体的疾病种类。
所述术语“诊断”是指病理状态的确定。鉴于本发明的目的，所述诊断是指测定FAM3D表达作为结肠黏膜受到刺激、肠易激综合征、炎症性肠病等消化系统疾病的诊断标记，以确认肠易激综合征、炎症性肠病等消化系统疾病的发病、进展及缓解。
本发明的用于诊断结肠黏膜受到刺激、肠易激综合征、炎症性肠病等消化系统疾病的组合物，包含用来测量FAM3D基因的mRNA表达水平或其蛋白质表达量的制剂。这种制剂可包括，例如，具有与FAM3D mRNA互补的序列的寡核苷酸，与FAM3D mRNA特异性结合的引物或核酸探针，以及FAM3D蛋白质特异性抗体。
用于制备多克隆抗体的方法对本领域的技术人员来说是熟知的。多克隆抗体可通过向哺乳动物注射一次或多次免疫剂来制备的，而且根据需要，同时可注射免疫佐剂。通常，向哺乳动物的皮下或腹膜内注射多次免疫剂和/或免疫佐剂。所述免疫剂可以为本发明的蛋白质或其融合蛋白。当向哺乳动物一同注射已知有免疫原性的蛋白质和免疫剂来进行免疫化时，可能会有效。
本发明的用于诊断结肠黏膜受到刺激、肠易激综合征、炎症性肠病等消化系统疾病的组合物可以为包含于试剂盒的形式。
所述试剂盒可包含用来测量FAM3D基因的表达水平或蛋白质的量的所述引物、探针或抗体。对其的定义与如上所述的内容相同。
此外，本发明提供用于诊断结肠黏膜受到刺激、肠易激综合征、炎症性肠病等消化系统疾病的方法，该方法利用了测量所述FAM3D基因或蛋白质的表达水平的方法，更为具体地，所述方法包括：(a)从疑似患有结肠黏膜受到刺激、肠易激综合征、炎症性肠病等消化系统疾病的患者的生物样品中测量FAM3D基因的表达水平或所表达的蛋白质的量；及(b)从正常对照组样品中测量基因的表达水平或所表达的蛋白质的量，并将其结果与(a)测量结果进行对比。
如上所述的用于测量基因的表达水平或所表达的蛋白质的量的方法为公知技术，其包括从生物样品中分离出mRNA或蛋白质的已知过程。
所述生物样品是指，从结肠黏膜受到刺激、肠易激综合征、炎症性肠病等消化系统疾病的发病或进展程度与正常对照组进行对比时具有不同的基因或蛋白质表达水平的生物体中收集的样品。所述样品的例子可包括组织、细胞、血液、血清、血浆、唾液和尿，但不限于此。
当测量所述基因的表达水平时，优选会测量mRNA的水平。作为测量mRNA的水平的方法可使用RT-PCR、real-time PCR、核糖核酸酶保护分析法、Northern印迹法、DNA芯片等，但不限于此。
当测量所述蛋白质水平时，可使用抗体。此时，生物样品中的FAM3D蛋白质和其特异性抗体可形成结合物(conjugate)，即抗原-抗体复合物。所形成的抗原-抗体复合物的量可通过由检测标记产生的信号的大小进行定量测定。此检测标记可选自酶、荧光物配体、发光物质、微粒、氧化还原分子或放射性同位素，但不限于此。用于测定蛋白质水平的分析方法包括Western印迹法、ELISA、放射免疫分析法、放射免疫扩散法、Ouchterlony免疫扩散法、火箭免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、FACS、蛋白质芯片等，但不限于此。
因此，通过利用所述检测方法，本发明可确定对照组中表达的mRNA或蛋白质的量、以及疑似患有结肠黏膜受到刺激、肠易激综合征、炎症性肠病等消化系统疾病的患者中表达的mRNA或蛋白质的量。然后，可互相对比所述结果，以诊断结肠黏膜受到刺激、肠易激综合征、炎症性肠病等消化系统疾病的发病、进展程度等。
此外，在本发明的用于诊断结肠黏膜受到刺激、肠易激综合征、炎症性肠病等消化系统疾病的方法中，当本发明的FAM3D基因的表达水平或所表达的蛋白质的量与所述正常对照组样品相比有区别时，可判断结肠黏膜受到刺激、肠易激综合征、炎症性肠病等消化系统疾病的存在。
本发明还提供一种用于肠道疾病的预防性或治疗性药物的筛选方法，该方法包括：在体外使FAM3D基因与候选物质进行接触，并且判断所述候选物质能否促进或抑制所述基因的表达。
本发明还提供另一种用于肠道疾病的预防性或治疗性药物的筛选方法，该方法包括：在体外使FAM3D蛋白质与候选物质进行接触，并且判断所述候选物质能否提高或抑制所述蛋白质的功能或活性。
根据本发明的筛选方法，首先，将待分析的候选物质与包含所述基因或蛋白质的肠道疾病的细胞进行接触。
根据传统的选取方法，所述候选物质可包含，能够促进或抑制在FAM3D基因序列中转录成mRNA和翻译成蛋白质的物质、被推测具有能够促进或抑制FAM3D蛋白质的功能或活性的医学上应用的可能性的物质、或随机选取的单个的核酸、蛋白质、肽、其它提取物、天然产物、化合物等。
然后，在处理候选物质的细胞中可测量基因表达的量、蛋白质的量或蛋白质的活性。在所测结果中，当测到基因表达的量、蛋白质的量或蛋白质的活性有增加或降低时，可判断所述候选物质为能够治疗或预防肠道疾病的物质。
如上所述，可通过各种本领域内公知的方法对所述基因表达的量、蛋白质的量或蛋白质的活性进行测量，如RT-PCR、实时聚合酶链反应、Western印迹法、Northern印迹法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、放射免疫扩散法、免疫沉淀法等，但不限于此。
通过本发明的筛选方法，可获得展示出能够促进基因表达或促进蛋白质功能的候选物质、以及反之展示出能够抑制基因表达或抑制蛋白质功能的候选物质。
用于肠道疾病的治疗制剂候选物质可用于肠易激综合征、炎症性肠病等消化系统疾病的治疗制剂的研发过程中起到主导化合物的作用。当对所述主导化合物的结构进行变形和最优化以促进FAM3D基因或其编码的蛋白质表达时，可研发出一种新型的用于调控肠道免疫、肠道粘膜屏障和肠道微生物；预防或治疗炎症性肠病、肠易激综合征、精神压力引起的肠道疾病、肠道癌症发生发展等消化系统疾病的治疗制剂。
本发明还提供所述FAM3D分泌蛋白在制备商品化试剂用于研究肠道免疫、肠道粘膜屏障和肠道微生物中的调控，诊断、预防或治疗炎症性肠病、肠易激综合征、精神压力引起的肠道疾病、肠道癌症发生发展的应用。
在本发明中，与基因工程技术有关的内容可从Sambrook(Sambrook,etal.Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001))and Frederick(Frederick M.Ausubel et al.,Current protocols in molecular biology volume1,2,3,John Wiley&Sons,Inc.(1994))一书所公开的内容中得到清晰的理解。
实施例1、FAM3D在小鼠各组织的表达谱
一、方法：
从北京大学医学部实验动物部购买6周龄黑色雄性小鼠(C57BL/6，小鼠)。购买的小鼠在鼠笼里进行饲养，在该鼠笼内有供应适当的食物和水，温度维持在20～24℃，湿度保持在40～70％。此外，在12/12光暗周期(上午八点开灯，下午八点关灯)内保管这些野生型的小鼠。所有实验被设计成均使用最少数量的小鼠，根据动物实验伦理，实施了麻醉方法，以最大程度降低实验中所用的小鼠的痛苦。小鼠麻醉后心脏灌注，取小鼠各器官。新鲜小鼠组织或细胞浸没于RNAlater(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)里，4℃固定过夜后，使用RNeasy Mini Kit(Qiagen，Germantown，MD)依照说明书提取组织RNA。经定量后取相同总量RNA(2μg)使用All-in-One RT MaterMix(Applied Biological Materials Inc.，Richmond，Canada)反转录成互补DNA(cDNA)。以Fam3D上游F(5'GCAGTTGGCTGGGTTAAAGAC3'，SEQ ID No：4)和下游R(5'GGATCAGACCTGCCACTCT 3'，SEQ ID No：5)为引物，GAPDH基因上游F(5'ATCAAGAAGGTGGTGAAGCA 3'，SEQ ID No：6)和下游R(5'AGACAACCTGGTCCTCAGTGT3'，SEQ ID No：7)为引物，进行实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)扩增40轮。
二、结果：
如图1显示，FAM3D在消化道高表达，包括结肠、盲肠、胃和小肠，在肠系膜淋巴结、肺、胸腺和脾中可见表达，其余组织未见明显表达。
实施例2、FAM3D基因在小鼠消化道部各部分的表达
一、方法：
用与上述方法相同的方式管理小鼠。小鼠麻醉后心脏灌注，取小鼠胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠提取每个对应组织中总RNA，从然后通过使用与上述相同的方法制备互补DNA(cDNA)。随后，通过利用相应的引物进行real-time PCR检测各分区FAM3D的表达。Real-time PCR中所用的引物与实施例1中的引物一致。
二、结果：
real-time PCR检测Fam3D在消化道中各部分的表达谱的结果如图2显示：FAM3D的表达从胃，经十二指肠、空肠和回肠表达依次下调，FAM3D的表达从盲肠至结肠升高，在结肠中，中段结肠比近端结肠和远端结肠的FAM3D表达高。
实施例3、FAM3D蛋白在小鼠各组织的表达
另取小鼠各个器官分开匀浆后取上清，利用免疫蛋白印记(Western Blot)检测组织器官FAM3D蛋白的表达。
一、方法：
组织或细胞使用含蛋白酶抑制剂(磷酸化检测还需加入磷酸酶抑制剂，Sigma-Aldrich，MA)的RIPA lysis buffer(Invitrogen，San Diego，CA)冰上裂解30分钟，超声后离心取上清液。蛋白经BCA定量后，取相同量，加入NovexTMTricine SDS Sample Buffer(Invitrogen，San Diego，CA，含50mM DTT)，补齐体积后99℃煮样10分钟。上样至10％SDS-PAGE(Invitrogen，San Diego，CA)，120V，90分钟电泳。PVDF膜预先用甲醇活化，正确组装转膜装置，170mA，90分钟转膜，冰浴。转膜完成后，PVDF膜用5％BSA(w/v，TBST配制)室温封闭1小时。识别小鼠FAM3D一抗(200ng/ml，AF3027，R&D，封闭液配制)4℃过夜。TBST清洗3次，每次5分钟，二抗(TBST配制)室温孵育1小时。使用ECL显影液Super SignalChemiluminescent Substrate(Pierce，Rockford，IL)和膜孵育3分钟，在G:Box gel docsystem(Syngene,Frederick,MD)显影。光密度分析使用Image J analysis program(NIH，Besthesda，USA)。
二、结果：
如图3所示，FAM3D在小鼠消化道中表达较高，其余组织表达较低。图4显示Western印迹法检测Fam3D在小鼠结肠表达水平的相对定量：第1泳道为结肠组织匀浆，上样量为30μg总蛋白，第2泳道为200ng小鼠重组FAM3D蛋白，采用商品化羊多抗检测FAM3D在结肠中的表达水平；采用Image J，重组蛋白为标准，通过光密度分析，计算得到FAM3D表达量约为90ng/30μg结肠组织。
实施例4、利用免疫组织化学检测肠道组织FAM3D的表达
一、方法：
这里使用免疫组织化学法，以确认翻译后的FAM3D蛋白表达的组织细胞分布。用与上述方法相同的方式管理小鼠。处死小鼠取得消化道组织。在含有4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲液中固定(后固定)24～48小时，梯度酒精逐级脱水后包埋、3μm切片，用于后续免疫组织化学实验。
免疫组织化学染色方法如下：取动物组织固定于4％多聚甲醛(PFA)固定24小时，依次浸入50％、60％、70％、80％、90％和100％乙醇脱水，2次二甲苯透明，石蜡包埋，制4μm切片。60℃烤片后，石蜡切片依次经过2次二甲苯，每次15分钟脱蜡，依次经过2次100％和70％乙醇复水，蒸馏水浸洗2次。切片水化后置于磷酸盐缓冲液中。使用酸性抗原修复液(10mM枸橼酸钠，pH 6.0)进行高压修复。使修复液自然冷却至室温后磷酸盐缓冲液洗涤3次，各5分钟。3％过氧化氢甲醇溶液室温避光10分钟，去除内源性过氧化氢酶。磷酸盐缓冲液洗3次，每次5分钟。使用10％兔血清室温封闭1小时。将识别小鼠FAM3D的羊多抗(2μg/ml，AF3027，R&D)稀释于封闭液中，4℃封闭过夜。切片室温复温30分钟，磷酸盐缓冲液洗3次，每次5分钟。二抗稀释于封闭液中，室温孵育1小时，磷酸盐缓冲液洗3次，每次5分钟。加DABSubstrate Kit(Pierce，Rockford，IL)于镜下显色，显色时间视显色情况而定，最终浸于蒸馏水中终止显色。苏木素室温染色6分钟，流水洗去浮色。1％盐酸酒精分色3秒，置于自来水中，流水返蓝5分钟。依次经过2次70％、100％乙醇脱水，经过2次二甲苯透明，中性树脂封片。镜检。
二、结果：
图5显示羊抗FAM3D的多克隆抗体识别结肠、小肠和盲肠中FAM3D的免疫组织化学结果，可见FAM3D在肠道上皮细胞高表达。
实施例5、Fam3D缺失导致小鼠结肠上皮防御素和抗菌肽基因表达降低
一、方法：
小鼠CO2安乐死后将其结肠取出置于冰上，预冷磷酸盐缓冲液冲洗结肠内容物；洁净结肠置于HBSS中，将结肠纵向剖开，剪成0.5厘米小段，充分涮洗后，将结肠移至新的HBSS中；将组织加入10ml结肠上皮消化液(1640+5％FBS+5mM EDTA+1mM DTT+10mM HEPES)，37℃摇床200rpm孵育30分钟。待组织自然沉降，弃去上皮消化液，加入预冷磷酸盐缓冲液后剧烈震荡，用100目筛网过滤，过滤后上皮细胞在上清里，重复剧烈震荡1次，收集上清离心得到上皮细胞。新鲜分离的结肠上皮细胞保存在TrizolTM中，交由美吉公司进行RNA提取和建库及测序。在Illumina HiSeq 2000上获得读数，使用TopHat2与GRCm38小鼠基因组装配对齐并使用htseq计数。使用edgeR进行差异表达基因分析。使用edgeR表达差异基因分析(>1log2FC和<-1log 2FC，调整的P值＝0.05)。
二、结果：
图6显示RNA Seq检测结果，代表机体防御差异基因热图。结果显示：机体防御素和抗菌肽差异基因在Fam3D-/-小鼠结肠上皮表达下调。
实施例6、Real-time PCR检测小鼠结肠上皮防御素和抗菌肽表达
一、方法：
新鲜分离的结肠上皮细胞保存在TrizolTM中，提取RNA和获得cDNA方法同上。以Reg3b上游F(5'AATGGAGGTGGATGGGAATG 3'，SEQ ID No：8)，下游R(5'CCACAGAAAGCACGGTCTAA 3'，SEQ ID No：9)；Reg3g上游F(5'CTTCCTGTCCTCCATGATCAAA 3'，SEQ ID No：10)，下游R(5'CCACCTCTGTTGGGTTCATAG 3'，SEQ ID No：11)；Saa1上游F(5'ACACTGACATGAAGGAAGCTAAC 3'，SEQ ID No：12)，下游R(5'CCTCTGCCGAAGAATTCCTGA 3'，SEQID No：13)；Saa3上游F(5'AGCCAAAGATGGGTCCAGTT 3'，SEQ ID No：14)，下游R(5'TCAGAGTAGGCTCGCCACAT 3'，SEQ ID No：15)；Defb1上游F(5'TCATCTGTCAGCCCAACTACC 3'，SEQ ID No：16)，下游R(5'CGGAGACAGAATCCTCCATGT 3'，SEQ ID No：17)；Defa2上游F(5'GGCTCCTGCTCACCAATTCT 3'，SEQ ID No：18)，下游R(5'GATCAGCCTGGACCTGGAAG3'，SEQ IDNo：19)；Defa3上游F(5'TCGCTGAACATGGAGACCAC 3'，SEQ ID No：20)，下游R(5'CGAGGTAGTCATCAGGCACC 3'，SEQ ID No：21)；Defa21上游F(5'CGCTGAGAGTGCAGATGACA 3'，SEQ ID No：22)，下游R(5'GAAGTGTTCATCAGGCCCCA 3'，SEQ ID No：23)；Defa24上游F(5'ACACTGAGCTGCTACTCACC 3'，SEQ ID No：24)，下游R(5'AGACACAGCCTGGTCCTCTT 3'，SEQ IDNo：25)；Cramp上游F(5'CTTCAAGGAACAGGGGGTGG 3'，SEQ ID No：26)，下游R(5'ACCTTTGCGGAGAAGTCCAG 3'，SEQ ID No：27)为引物，进行实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)扩增40轮。
二、结果：
图7显示real-time PCR检测WT和Fam3D-/-小鼠结肠上皮防御素和抗菌肽表达。结果显示：防御素和抗菌肽在Fam3D-/-小鼠结肠上皮表达下调。
实施例7、组织免疫荧光检测显示Fam3D缺失导致小鼠结肠抗菌肽Reg3γ明显下调
一、方法：
取动物组织固定于4％多聚甲醛(PFA)固定24小时，依次浸入50％、60％、70％、80％、90％和100％乙醇脱水，2次二甲苯透明，石蜡包埋，制4μm切片。60℃烤片后，石蜡切片依次经过2次二甲苯，每次15分钟脱蜡，依次经过2次100％和70％乙醇复水，蒸馏水浸洗2次。切片水化后置于磷酸盐缓冲液中。使用酸性抗原修复液(10mM枸橼酸钠，pH 6.0)进行高压修复。使修复液自然冷却至室温后磷酸盐缓冲液洗涤3次，各5分钟。使用5％牛血清白蛋白(BSA)室温封闭1小时。将识别小鼠FAM3D(200ng/ml，AF3027，R&D)和MUC2(1：50，sc-15334，Santa Cruz)的抗体稀释于封闭液中，4℃封闭过夜。切片室温复温30分钟，磷酸盐缓冲液洗3次，每次5分钟。相应二抗(1:1000，抗山羊IgG-Alexa Fluor 568，A-11079，Invitrogen；1:1000，抗兔IgG-Alexa Fluor 488，A-32731，Invitrogen)稀释于封闭液中，避光室温孵育1小时，磷酸盐缓冲液洗3次，每次5分钟。使用Fluorescence MountingMedium(Dako，Glostrup，Denmark)封片。镜检。
二、结果：
图8显示组织免疫荧光检测小鼠结肠Reg3γ表达。结果显示：Reg3γ在Fam3D-/-小鼠结肠上皮表达下调。
实施例8、Fam3D-/-小鼠结肠上皮基因组中差异基因的集富型分析(GSEA)
一、方法：
RAN Seq结果来源于实施例6。对Fam3D-/-vs WT EBSeq log2FC表达数据进行基因集富型分析(GSEA)(http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)。基因集包括干细胞，转运扩增细胞，肠细胞，杯状细胞，潘氏细胞，簇绒细胞和肠内分泌细胞的特征基因。每种类型的肠道上皮细胞基因集来源于(Yan K.S.,et al.,2017,Nature 545)。
二、结果：
图9显示GSEA分析杯状细胞特征基因在Fam3D-/-小鼠变化基因组中的富集情况。结果显示：杯状细胞特征基因在Fam3D-/-小鼠变化基因组显著富集，提示Fam3D的缺失可导致杯状细胞异常。
实施例9、FAM3D与MUC2免疫荧光共染
一、方法：
取动物组织固定于4％多聚甲醛(PFA)固定24小时，依次浸入50％、60％、70％、80％、90％和100％乙醇脱水，2次二甲苯透明，石蜡包埋，制4μm切片。60℃烤片后，石蜡切片依次经过2次二甲苯，每次15分钟脱蜡，依次经过2次100％和70％乙醇复水，蒸馏水浸洗2次。切片水化后置于磷酸盐缓冲液中。使用酸性抗原修复液(10mM枸橼酸钠，pH 6.0)进行高压修复。使修复液自然冷却至室温后磷酸盐缓冲液洗涤3次，各5分钟。使用5％牛血清白蛋白(BSA)室温封闭1小时。将识别小鼠Fam3D(1：100，PA5-50450，Invitrogen)的抗体稀释于封闭液中，4℃封闭过夜。切片室温复温30分钟，磷酸盐缓冲液洗3次，每次5分钟。相应二抗(1：1000，抗兔IgG-Alexa Fluor 568，A-11011，Invitrogen)稀释于封闭液中，避光室温孵育1小时，磷酸盐缓冲液洗3次，每次5分钟。使用Fluorescence Mounting Medium(Dako，Glostrup，Denmark)封片。镜检。
二、结果：
图10显示FAM3D与MUC2免疫荧光共染结果。结果提示：FAM3D与杯状细胞标志物MUC2有共表达，提示FAM3D可由杯状细胞产生。
实施例10、Fam3D-/-小鼠杯状细胞功能异常
一、方法：
阿利新蓝/过碘酸-西弗试剂(Alcian blue/periodic acid-Schiff’s reagent，AB/PAS)染色：石蜡切片经脱蜡和复水，蒸馏水清洗3次，每次5分钟。阿利新蓝(alcianblue)室温染色20分钟，蒸馏水流水洗去浮色。过碘酸溶液室温氧化10分钟，蒸馏水流水洗去浮色。Schiff reagent溶液室温染色20分钟，避光，流水清洗10分钟。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。每只小鼠至少统计20个隐窝，取平均值。染色结果分析：紫红色：糖原、中性黏蛋白、各种糖蛋白；蓝色：酸性黏蛋白(硫化黏蛋白和唾液酸化黏蛋白)；蓝色：蛋白多糖和透明质酸。
高铁二胺/阿利新蓝(high iron diamine/Alcian blue，HID/AB)染色：采用下述配方配制HID溶液：120mg N,N-dimethyl-m-phenylenediamine dihydrochloride(Sigma-Aldrich，MA)；20mg N,N-dimethyl-p-phenylenediamine monohydrochloride(Sigma-Aldrich，MA)；1.4ml 10％FeCl3溶液(w/v，Sigma-Aldrich，MA)；加50ml蒸馏水配制成HID溶液，现配现用。石蜡切片复水至蒸馏水中。加HID溶液，室温染色18小时。蒸馏水清洗3次，pH2.5Alcian blue室温染色20分钟。蒸馏水清洗3次。0.5％中性红溶液染核1-2分钟。蒸馏水清洗3次。梯度酒精、二甲苯脱水后封片。染色结果分析：浅蓝色：羧基化酸性黏液物质(唾液酸化黏蛋白)；棕紫色至棕黑色：酸性黏蛋白(硫酸化黏蛋白)；红色：细胞核。
二、结果：
图11显示Fam3D-/-小鼠结肠组织AB/PAS染色结果。结果显示：杯状细胞数量增加，酸性黏液素分泌减少。图12显示Fam3D-/-小鼠结肠组织HID/AB染色结果。结果显示：Fam3D-/-小鼠结肠中所缺失的酸性黏液素，主要成分为唾液酸化的酸性黏液素。
实施例11、Fam3D缺失导致小鼠结肠黏液层厚度变薄
一、方法：
取含便结肠固定于Carnoy’s固定液(60％甲醇+10％冰醋酸+30％氯仿)4℃固定2小时，甲醇除酸2次，每次30分钟。乙醇置换甲醇2次，每次30分钟。二甲苯透明后石蜡包埋，制4μm切片。石蜡切片经脱蜡和复水，蒸馏水清洗3次，每次5分钟。阿利新蓝(alcian blue)室温染色20分钟，蒸馏水流水洗去浮色。苏木素室温染色6分钟，流水洗去浮色。1％盐酸酒精分色3秒，置于自来水中，流水返蓝5分钟。依次经过2次70％、100％乙醇脱水，经过2次二甲苯透明，中性树脂封片。镜检。
二、结果：
图13展示了Fam3D-/-小鼠结肠黏液层染色。通过对小鼠含便结肠进行阿利新蓝染色，结肠黏膜与肠内容物之间的蓝色带状物质即为黏液层。结果显示：Fam3D-/-小鼠结肠中黏液层变薄。
实施例12、通过H&E染色检测Fam3D-/-小鼠结肠病理形态
一、方法：
取动物组织固定于4％多聚甲醛(PFA)固定24小时，依次浸入50％、60％、70％、80％、90％和100％乙醇脱水，2次二甲苯透明，石蜡包埋，制4μm切片。60℃烤片后，石蜡切片依次经过2次二甲苯，每次15分钟脱蜡，依次经过2次100％和70％乙醇复水，蒸馏水浸洗2次。苏木素室温染色6分钟，流水洗去浮色。1％盐酸酒精分色3秒，置于自来水中，流水返蓝5分钟。伊红染色3分钟，依次经过2次70％、100％乙醇脱水，经过2次二甲苯透明，中性树脂封片。镜检。
二、结果：
图14显示Fam3D-/-小鼠结肠组织H&E染色。结果显示：Fam3D-/-小鼠结肠隐窝变长，提示增殖异常。
实施例13、通过Ki67免疫组织化学染色检测Fam3D-/-小鼠结肠增殖情况
一、方法：
取动物组织固定于4％多聚甲醛(PFA)固定24小时，依次浸入50％、60％、70％、80％、90％和100％乙醇脱水，2次二甲苯透明，石蜡包埋，制4μm切片。60℃烤片后，石蜡切片依次经过2次二甲苯，每次15分钟脱蜡，依次经过2次100％和70％乙醇复水，蒸馏水浸洗2次。切片水化后置于磷酸盐缓冲液中。使用碱性抗原修复液(1mM EDTA，pH 9.0)进行高压修复。使修复液自然冷却至室温后磷酸盐缓冲液洗涤3次，各5分钟。3％过氧化氢甲醇溶液室温避光10分钟，去除内源性过氧化氢酶。磷酸盐缓冲液洗3次，每次5分钟。使用10％羊血清室温封闭1小时。将识别Ki67的兔多抗(2μg/ml，ab16667，Abcam)稀释于封闭液中，4℃封闭过夜。切片室温复温30分钟，磷酸盐缓冲液洗3次，每次5分钟。二抗稀释于封闭液中，室温孵育1小时，磷酸盐缓冲液洗3次，每次5分钟。加DAB Substrate Kit(Pierce，Rockford，IL)于镜下显色，显色时间视显色情况而定，最终浸于蒸馏水中终止显色。苏木素室温染色6分钟，流水洗去浮色。1％盐酸酒精分色3秒，置于自来水中，流水返蓝5分钟。依次经过2次70％、100％乙醇脱水，经过2次二甲苯透明，中性树脂封片。镜检。
二、结果：
图15显示Fam3D-/-小鼠结肠组织Ki67免疫组化染色。结果显示：Fam3D-/-小鼠结肠隐窝Ki67阳性细胞数增加，提示其与增殖异常有关。
实施例14、组织免疫荧光染色检测Fam3D-/-小鼠结肠免疫细胞浸润
一、方法：
取动物组织固定于4％多聚甲醛(PFA)固定24小时，依次浸入50％、60％、70％、80％、90％和100％乙醇脱水，2次二甲苯透明，石蜡包埋，制4μm切片。60℃烤片后，石蜡切片依次经过2次二甲苯，每次15分钟脱蜡，依次经过2次100％和70％乙醇复水，蒸馏水浸洗2次。切片水化后置于磷酸盐缓冲液中。使用酸性抗原修复液(10mM枸橼酸钠，pH 6.0)进行高压修复。使修复液自然冷却至室温后磷酸盐缓冲液洗涤3次，各5分钟。3％过氧化氢甲醇溶液室温避光10分钟，去除内源性过氧化氢酶。磷酸盐缓冲液洗3次，每次5分钟。使用5％牛血清白蛋白(BSA)室温封闭1小时。将识别小鼠F4/80(1：100，MA5-16630，Invitrogen)、Ly6G(1：100，ab25377，Abcam)、CD3(1：100，ab11089，Abcam)和B220(1：100，ab64100，Abcam)的抗体稀释于封闭液中，4℃封闭过夜。切片室温复温30分钟，磷酸盐缓冲液洗3次，每次5分钟。相应二抗(1：1000，驴抗大鼠IgG-Alexa Fluor 488，Invitrogen)稀释于封闭液中，避光室温孵育1小时，磷酸盐缓冲液洗3次，每次5分钟。使用Fluorescence Mounting Medium(Dako，Glostrup，Denmark)封片。镜检。
二、结果：
图16显示Fam3D-/-小鼠结肠组织F4/80、CD3和B220免疫荧光染色结果。结果显示：Fam3D-/-小鼠结肠CD3+T细胞和B220+B细胞浸润增多，F4/80+巨噬细胞数量有上调趋势。提示Fam3D-/-小鼠结肠有低程度炎症发生。
实施例15、实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测Fam3D-/-小鼠结肠炎性细胞因子表达水平
一、方法：
用与上述方法相同的方式管理小鼠。小鼠麻醉后心脏灌注，取小鼠结肠提取总RNA，从然后通过使用与上述相同的方法制备互补DNA(cDNA)。随后，通过利用相应的引物进行real-time PCR检测各个细胞因子的表达。以real-time PCR中所用的引物：IL-1上游F(5'GGGCTGGACTGTTTCTAATGC 3'，SEQ ID No：28)，下游R(5'CTTGTGACCCTGAGCGACC3'，SEQID No：29)。CXCL1上游F(5'CACCCAAACCGAAGTCATAGC 3'，SEQ ID No：30)，下游R(5'GAAGCCAGCGTTCACCAGA 3'，SEQ ID No：31)，CXCL2上游F(5'GACAGAAGTCATAGCCACTCTC 3'，SEQ ID No：32)，下游R(5'GCCTTGCCTTTGTTCAGTATC 3'，SEQ ID No：33)，TNFα上游F(5'CTACCTTGTTGCCTCCTCTTT 3'，SEQ ID No：34)，下游R(5'GAGCAGAGGTTCAGTGATGTAG 3'，SEQID No：35)，CCL2上游F(5'TGTGCTGACCCCAAGAAGG 3'，SEQ ID No：36)，下游R(5'GGTGGTTGTGGAAAAGGTAGTG 3'，SEQ ID No：37)，进行实时定量聚合酶链反应(real-timePCR)扩增40轮。
二、结果：
图17显示real-time PCR检测Fam3D-/-小鼠结肠组织炎性细胞因子表达。结果显示：Fam3D-/-小鼠结肠Il-1和Cxcl1表达上调，提示Fam3D-/-小鼠结肠有低程度炎症发生。
实施例16、52周龄小鼠结肠组织病理学检测
一、方法：
取52周WT和Fam3D-/-小鼠结肠组织固定于4％多聚甲醛(PFA)固定24小时，同上述方法制作石蜡切片。石蜡切片经脱蜡和复水，蒸馏水清洗3次，每次5分钟。H&E染色：苏木素室温染色6分钟，流水洗去浮色。1％盐酸酒精分色3秒，置于自来水中，流水返蓝5分钟。伊红染色3分钟，依次经过2次70％、100％乙醇脱水，经过2次二甲苯透明，中性树脂封片。镜检。AB/PAS染色：阿利新蓝(alcian blue)室温染色20分钟，蒸馏水流水洗去浮色。过碘酸溶液室温氧化10分钟，蒸馏水流水洗去浮色。Schiff reagent溶液室温染色20分钟，避光，流水清洗10分钟。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。
二、结果：
图18显示52周龄小鼠结肠组织H&E染色。结果显示：Fam3D-/-小鼠结肠发生明显地增生。A图展示了Fam3D-/-小鼠结肠有中性粒细胞的浸润。B图展示了Fam3D-/-小鼠结肠有入侵性腺腔的产生。提示Fam3D-/-小鼠结肠在低程度的炎症长期浸润下有发生癌变的趋势。图19显示52周龄Fam3D-/-小鼠结肠组织PAS/AB染色结果。结果显示：Fam3D-/-小鼠结肠成熟上皮细胞缺失，提示有癌变的趋势。
实施例17、52周龄小鼠结肠长度和重量统计
一、方法：
取52周WT和Fam3D-/-小鼠结肠或脾平铺于实验台，用直尺测量长度和脾的大小。将肠腔内容物轻轻挤压排出，称量结肠重量。
二、结果：
图20和图21显示52周小鼠结肠长度和重量统计。结果显示：Fam3D-/-鼠的结肠重量增加，反映了其结肠组织增生。图22显示52周小鼠的脾脏比较。结果显示：52周Fam3D-/-小鼠的脾体积大于WT小鼠的脾，提示Fam3D-/-小鼠体内存在炎症，使其脾脏增大。
实施例18、Fam3D-/-小鼠的肠道菌群失调
一、方法：
小鼠饲养与无特定病原物(SPF)级环境下。将小鼠单独放入洁净的鼠笼内，用洁净镊子收集粪便。使用DNA Stool Kit(Qiagen，Germantown，MD)依照说明书提取粪便细菌DNA。随后，通过利用物种特异性的引物进行real-time PCR检测各种微生物的丰度。以real-time PCR中所用的引物：Lactobacillus/Lactococcus上游F(5'AGCAGTAGGGAATCTTCCA 3'，SEQ ID No：38)，下游R(5'CACCGCTACACATGGAG 3'，SEQ ID No：39)。Clostridium perfringens上游F(5'CGCATAACGTTGAAAGATGG 3'，SEQ ID No：40)，下游R(5'CCTTGGTAGGCCGTTACCC 3'，SEQ ID No：41)，All bacteria上游F(5'ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT 3'，SEQ ID No：42)，下游R(5'ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT 3'，SEQID No：43)，进行实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)扩增40轮。
二、结果：
图23和图24显示小鼠粪便微生物16S rRNA扩增结果。结果显示：Fam3D-/-小鼠的肠道微生物组成与WT小鼠有差异，反映了Fam3D-/-小鼠的肠道菌群失调。
实施例19、慢性应激引起小鼠结肠FAM3D的表达明显降低
一、方法：
慢性应激可以导致人类的精神疾病抑郁症。为了探索在慢性应激状态下FAM3D的表达是否发生变化，我们将野生型小鼠分别置于慢性束缚应激(Chronic restraintstress，CRS)、慢性强迫游泳应激(Chronic forced swimming stress，CFSS)和慢性社会挫败应激(Chronic social defeat stress，CSDS)三种经过动物行为学验证的应激模型下来探索FAM3D的表达变化。
慢性束缚应激(Chronic restraint stress，CRS)：将2-3个月龄的雄性C57BL/6小鼠置于带三个通气口的50mL离心管中，允许其伸展四肢，但不让其在管内移动。连续21天，每天施加2-3小时的慢性束缚应激。年龄匹配的非应激动物作为对照。
慢性强迫游泳应激(Chronic forced swimming stress，CFSS)：将2-3个月龄的雄性C57BL/6小鼠置于40厘米高的透明丙烯酸圆筒中，连续5天，每天施加5分钟的慢性强迫游泳应激。年龄匹配的非应激动物作为对照。
慢性社会挫败应激(Chronic social defeat stress，CSDS)：将6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠直接置于4-6月龄的雄性CD-1退役鼠的笼里，每天进行5-10分钟的社会挫败应激，持续10天。与CD-1攻击小鼠直接接触后，C57BL/6小鼠被转移到笼子的另一侧，中间用有孔的隔离板隔开使两者不能产生身体接触，置于分隔的笼内24小时。对照组将C57BL/6对小鼠置于同样的笼子中。对照组小鼠每天都在对照组的笼子里进行轮换。在最后一次社交挫败应激24小时后，进行了社交互动测试。在社交互动试验前1小时使C57BL/6J小鼠习惯社交互动试验装置。在前2.5分钟的实验中(“无目标”)，将C57BL/6社会挫败小鼠放入社交互动装置，让其自由探索一个开放场地(40×40cm)，场地内放有一个空的金属丝网箱(10×6cm)，没有“目标”CD-1小鼠。在第二次2.5分钟的试验(“有目标”)中，在“目标”CD-1鼠标在金属丝网箱内的情况下，小鼠被重新放入这个装置，使其自由移动。使用Smart 3.0视频跟踪系统记录和分析在“角落区域”(9×9cm)和“互动区域”(12×25cm)的时间。社会互动比例是指在“互动区域”花费的时间与在“角落区域”花费的时间之比。恢复型指社会互动比率≥1，易感型指社会互动比率<1。
二、结果：
在CRS和CFSS模型中，在最后一次束缚或强迫游泳以后，收取模型小鼠及对照小鼠的结肠。采用Real-time PCR检测FAM3D的表达水平。结果显示，经慢性束缚应激(CRS)或慢性强迫游泳应激(CFSS)诱导的模型小鼠的结肠中FAM3D的mRNA水平均显著下调(图25)。在CSDS模型中，在社会交互测试后检测模型小鼠结肠中FAM3D的水平。与对照组小鼠相比，易感型和恢复型小鼠结肠中FAM3D的水平均有降低(图26)。上述结果表明，在慢性应激条件下，FAM3D在结肠的水平显著降低。
实施例20、急性溃疡性结肠炎模型中，Fam3D-/-小鼠结肠炎症更显著
一、方法：
小鼠饲养与无特定病原物(SPF)级环境下。将Dextran-sulfate sodium(DSS，4,000kDa，MP Biomedicals)溶于水中配成2.5％(w/v)溶液给小鼠饲喂5天，之后撤去DSS，换成普通饮用水饲喂小鼠2天。模型中每日测量并记录小鼠体重。模型终点对小鼠进行CO2安乐死，收取结肠进行长度测量。之后收取结肠组织进行相应分子生物学和病理学检测。FAM3D免疫组化染色方法同上。Fam3D real-time PCR方法同上。
二、结果：
图27展示了DSS诱导的急性结肠炎的模式图。图28显示DSS诱导的急性结肠炎模型中各组小鼠的体重变化曲线。结果显示：与WT小鼠相比，Fam3D-/-小鼠模型第4天体重即发生下降，模型第7天体重下降约70％，比WT小鼠体重下降更明显，提示Fam3D的缺失导致小鼠对DSS处理的易感性增加。图29显示DSS诱导的急性结肠炎模型第5天，Fam3D-/-小鼠结肠长度即发生缩短，模型第7天，较WT小鼠，Fam3D-/-小鼠的结肠缩短更为显著。图30显示DSS诱导的急性结肠炎模型中各时间点小鼠的结肠组织的H&E染色。结果显示：较WT小鼠，DSS模型第5天，Fam3D-/-小鼠结肠即出现表现为炎性细胞浸润、隐窝结构被破坏的中等程度的炎症反应；模型第7天，Fam3D-/-小鼠结肠黏膜损伤严重，已完全失去完整的腺腔结构，表现为结缔组织和免疫细胞散在分布。该结果表明Fam3D的缺失导致DSS处理下结肠黏膜更易被破坏。
实施例21、小鼠慢性结肠炎模型中，Fam3D-/-小鼠肠壁肿瘤数量明显增加
一、方法：
无特定病原物(SPF)级环境下。将DSS溶于小鼠正常饮用水中，配成2.5％DSS(w/v)或1.5％DSS(w/v)溶液。首先给予小鼠2.5％DSS饲喂4天，接着撤去DSS，更换正常饮用水饲喂2周，此为1个循环。之后给予小鼠1.5％DSS饲喂4天，接着撤去DSS，更换正常饮用水饲喂2周，此为第2个循环。依照第2个循环饲喂模式，接着给予小鼠3个循环的处理，在最后一个循环结束后，处死小鼠，收取结肠组织，统计肠壁肿瘤数量。模型中每日测量并记录小鼠体重。收取结肠组织进行相应的病理学检测。H&E染色方法同上。
二、结果：
图31展示了DSS诱导的慢性结肠炎模型的模式图。图32显示纵向剖开结肠后，肠壁肿瘤数量的统计。结果显示：Fam3D-/-小鼠结肠荷瘤数目和大小较WT小鼠有明显增加。这个结果提示Fam3D的缺失导致小鼠对DSS诱导的慢性结肠炎易感性增加。
实施例22、小鼠结肠癌模型中，Fam3D-/-小鼠呈现更显著的恶性黏液腺癌的表型
一、方法：
给小鼠单次腹腔注射azoxymethane(AOM，12.5mg/kg；Sigma-Aldrich)。AOM注射7天后给予小鼠1.5％DSS(w/v)饲喂4天，接着撤去DSS，给予小鼠正常饮用水饲喂20天，此为1个循环。共给予小鼠3个循环的1.5％DSS和正常饮用水处理。在最后一个循环结束后，处死小鼠，收取结肠组织，统计肠壁肿瘤数量，以及进行病理学和分子生物学检测。模型中每日测量并记录小鼠体重。
二、结果：
图33展示了AOM(azoxymethane)/DSS诱导的结肠癌模型的模式图。图34显示AOM/DSS诱导的结肠癌模型小鼠结肠组织的荷瘤数量和大小。结果显示：通过统计和测量结肠肠壁肿瘤数量和大小，Fam3D-/-小鼠肿瘤发生和发展都较WT小鼠有明显提高。图35显示AOM/DSS诱导的结肠癌模型小鼠结肠组织H&E染色。结果提示：Fam3D-/-小鼠结肠上皮出现过度增生，黏膜显著增厚，出现大量增生腺腔，并向黏膜下基层入侵，呈现恶性黏液腺癌的表型。
实施例23、细胞免疫荧光和免疫蛋白印迹检测表达FAM3D腺病毒(Adv-FAM3D)通过结肠灌注、在小鼠结肠的表达效率
一、方法：
表达人FAM3D(携带信号肽)的腺病毒adenovirus-FAM3D(Adv-FAM3D)和对照腺病毒adenovirus-null(Adv-null)由公司合成和纯化。注射前Fam3D-/-小鼠饥饿16小时，使小鼠排空粪便。麻醉小鼠，用1 ml注射器连接3.5F catheter(Instech Laboratories Inc.，PA，USA)吸取无菌磷酸盐缓冲液清洗灌注结肠3次，每次100μl，促进小鼠粪便排出。吸取Adv-FAM3D或Adv-null(109 PFU/小鼠，磷酸盐缓冲液稀释，100μl/小鼠)。将catheter轻轻完全从肛门进入结肠。缓慢地将病毒注射进入结肠。将小鼠头朝下放置5分钟，保证所有病毒都注射入肠腔中。24小时后收取小鼠结肠组织进行分子生物学和病理学检测。
二、结果：
图36显示Western印迹法检测Fam3D-/-小鼠结肠灌注Adv-FAM3D后结肠组织FAM3D的表达。结果显示：结肠灌注Adv-FAM3D可在结肠过表达FAM3D。图37显示结肠灌注Adv-FAM3D后，结肠组织免疫荧光染色。结果显示：结肠灌注腺病毒Adv-FAM3D可使FAM3D表达在结肠上皮。
实施例24、结肠灌注腺病毒Adv-FAM3D可以挽救DSS诱导的结肠炎的表型
一、方法：
在首次灌注前小鼠饥饿处理16小时，在灌注前采用无菌磷酸盐缓冲液灌注结肠3次，每次1ml以促进小鼠排出剩余粪便。小鼠粪便排净后，麻醉小鼠，给予小鼠结肠灌注腺病毒Adv-FAM3D 100μl，剂量为109/PFU，磷酸盐缓冲液稀释。注射完成后，小鼠头朝下倒置5分钟，防止病毒流出。待病毒完全吸收后，将小鼠放回笼子内，恢复其正常饮食。第1次灌注24小时后，对小鼠进行第2次灌注，方法与计量与第1次相同。共进行3次灌注。第3次灌注24小时后，给予小鼠饲喂2.5％DSS(w/v)5天，之后撤去DSS，更换正常饮用水饲喂2天。于模型第7天处死小鼠，收取结肠组织进行病理学和分子生物学检测。模型中每日测量并记录小鼠体重。
二、结果：
图38显示结肠灌注Adv-FAM3D治疗DSS诱导的急性结肠炎示意图。图39显示结肠灌注腺病毒后各组小鼠的体重变化。结果显示：通过结肠灌注腺病毒Adv-FAM3D的方式过表达FAM3D，可减轻WT小鼠的体重下降；同时也可以减轻Fam3D-/-小鼠体重的下降。图40显示结肠灌注腺病毒后各组小鼠的模型终点时的结肠长度。结果显示：通过结肠灌注腺病毒Adv-FAM3D的方式过表达FAM3D，可减轻WT小鼠的结肠缩短；同时也可以减轻Fam3D-/-小鼠结肠的缩短。图41显示结肠灌注腺病毒后各组小鼠结肠组织的H&E染色。结果显示：过表达FAM3D可显著降低WT小鼠的上皮损伤，可部分挽救Fam3D-/-小鼠炎症表型，相比于Adv-null组的上皮完全破坏，结缔组织散在分布，过表达FAM3D组隐窝结构得到部分恢复，出现了部分完整的腺腔结构。上述结果提示，过表达腺病毒Adv-FAM3D可以减轻WT和Fam3D-/-小鼠的肠炎表型。
工业应用性
本发明的FAM3D或其腺病毒等过表达基因工程载体可用作调控肠道免疫、肠道粘膜屏障和肠道微生物，维持结肠稳态的制剂，以及诊断、预防或治疗炎症性肠病、肠易激综合征、精神压力引起的肠道疾病、肠道癌症发生发展等疾病的药物。
本文通过一些实施方式和具体的实施例对本发明进行了说明，而且为了描述的目的还针对许多细节进行了描述。对于本领域技术人员而言，本发明可以通过采用一些其它的具体实施方式来实现，也可以在不偏离本发明主旨的情况下针对所披露的内容进行调整和变化。本发明的内容应当包括针对本文所披露内容的调整或变化，或者说应当包括由所附权利要求书所定义的以及与之等同的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京大学
<120> FAM3D蛋白及编码其的多核苷酸的医药用途
<130> WX2020-BY-006
<160> 43
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 675
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgagagtgt caggtgtgct tcgcctcctg gccctcatct ttgccatagt cacgacatgg 60
atgtttattc gaagctacat gagcttcagc atgaaaacca tccgtctgcc acgctggctg 120
gcagcctcgc ccaccaagga gatccaggtt aaaaagtaca agtgtggcct catcaagccc 180
tgcccagcca actactttgc gtttaaaatc tgcagtgggg ccgccaacgt cgtgggccct 240
actatgtgct ttgaagaccg catgatcatg agtcctgtga aaaacaatgt gggcagaggc 300
ctaaacatcg ccctggtgaa tggaaccacg ggagctgtgc tgggacagaa ggcatttgac 360
atgtactctg gagatgttat gcacctagtg aaattcctta aagaaattcc ggggggtgca 420
ctggtgctgg tggcctccta cgacgatcca gggaccaaaa tgaacgatga aagcaggaaa 480
ctcttctctg acttggggag ttcctacgca aaacaactgg gcttccggga cagctgggtc 540
ttcataggag ccaaagacct caggggtaaa agcccctttg agcagttctt aaagaacagc 600
ccagacacaa acaaatacga gggatggcca gagctgctgg agatggaggg ctgcatgccc 660
ccgaagccat tttag 675
<210> 2
<211> 224
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Arg Val Ser Gly Val Leu Arg Leu Leu Ala Leu Ile Phe Ala Ile
1 5 10 15
Val Thr Thr Trp Met Phe Ile Arg Ser Tyr Met Ser Phe Ser Met Lys
20 25 30
Thr Ile Arg Leu Pro Arg Trp Leu Ala Ala Ser Pro Thr Lys Glu Ile
35 40 45
Gln Val Lys Lys Tyr Lys Cys Gly Leu Ile Lys Pro Cys Pro Ala Asn
50 55 60
Tyr Phe Ala Phe Lys Ile Cys Ser Gly Ala Ala Asn Val Val Gly Pro
65 70 75 80
Thr Met Cys Phe Glu Asp Arg Met Ile Met Ser Pro Val Lys Asn Asn
85 90 95
Val Gly Arg Gly Leu Asn Ile Ala Leu Val Asn Gly Thr Thr Gly Ala
100 105 110
Val Leu Gly Gln Lys Ala Phe Asp Met Tyr Ser Gly Asp Val Met His
115 120 125
Leu Val Lys Phe Leu Lys Glu Ile Pro Gly Gly Ala Leu Val Leu Val
130 135 140
Ala Ser Tyr Asp Asp Pro Gly Thr Lys Met Asn Asp Glu Ser Arg Lys
145 150 155 160
Leu Phe Ser Asp Leu Gly Ser Ser Tyr Ala Lys Gln Leu Gly Phe Arg
165 170 175
Asp Ser Trp Val Phe Ile Gly Ala Lys Asp Leu Arg Gly Lys Ser Pro
180 185 190
Phe Glu Gln Phe Leu Lys Asn Ser Pro Asp Thr Asn Lys Tyr Glu Gly
195 200 205
Trp Pro Glu Leu Leu Glu Met Glu Gly Cys Met Pro Pro Lys Pro Phe
210 215 220
<210> 3
<211> 186
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Trp Leu Ala Ala Ser Pro Thr Lys Glu Ile Gln Val Lys Lys Tyr Lys
1 5 10 15
Cys Gly Leu Ile Lys Pro Cys Pro Ala Asn Tyr Phe Ala Phe Lys Ile
20 25 30
Cys Ser Gly Ala Ala Asn Val Val Gly Pro Thr Met Cys Phe Glu Asp
35 40 45
Arg Met Ile Met Ser Pro Val Lys Asn Asn Val Gly Arg Gly Leu Asn
50 55 60
Ile Ala Leu Val Asn Gly Thr Thr Gly Ala Val Leu Gly Gln Lys Ala
65 70 75 80
Phe Asp Met Tyr Ser Gly Asp Val Met His Leu Val Lys Phe Leu Lys
85 90 95
Glu Ile Pro Gly Gly Ala Leu Val Leu Val Ala Ser Tyr Asp Asp Pro
100 105 110
Gly Thr Lys Met Asn Asp Glu Ser Arg Lys Leu Phe Ser Asp Leu Gly
115 120 125
Ser Ser Tyr Ala Lys Gln Leu Gly Phe Arg Asp Ser Trp Val Phe Ile
130 135 140
Gly Ala Lys Asp Leu Arg Gly Lys Ser Pro Phe Glu Gln Phe Leu Lys
145 150 155 160
Asn Ser Pro Asp Thr Asn Lys Tyr Glu Gly Trp Pro Glu Leu Leu Glu
165 170 175
Met Glu Gly Cys Met Pro Pro Lys Pro Phe
180 185
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcagttggct gggttaaaga c 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggatcagacc tgccactct 19
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atcaagaagg tggtgaagca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agacaacctg gtcctcagtg t 21
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aatggaggtg gatgggaatg 20
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<400> 9
ccacagaaag cacggtctaa 20
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<212> DNA
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cttcctgtcc tccatgatca aa 22
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ccacctctgt tgggttcata g 21
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<400> 12
acactgacat gaaggaagct aac 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cctctgccga agaattcctg a 21
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agccaaagat gggtccagtt 20
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<211> 20
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<213> 人工序列
<400> 15
tcagagtagg ctcgccacat 20
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<213> 人工序列
<400> 16
tcatctgtca gcccaactac c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cggagacaga atcctccatg t 21
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<212> DNA
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ggctcctgct caccaattct 20
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<212> DNA
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gatcagcctg gacctggaag 20
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<212> DNA
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tcgctgaaca tggagaccac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cgaggtagtc atcaggcacc 20
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 22
cgctgagagt gcagatgaca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gaagtgttca tcaggcccca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
acactgagct gctactcacc 20
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<400> 25
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cttcaaggaa cagggggtgg 20
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<400> 27
acctttgcgg agaagtccag 20
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cttgtgaccc tgagcgacc 19
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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gccttgcctt tgttcagtat c 21
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ctaccttgtt gcctcctctt t 21
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<212> DNA
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<400> 39
caccgctaca catggag 17
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<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
actcctacgg gaggcagcag t 21

Claims (5)

1.FAM3D蛋白在制备治疗肠道疾病的药物中的应用，其中，所述肠道疾病为结肠炎，所述FAM3D蛋白是序列表中SEQ ID No：2或SEQ ID No：3所示氨基酸序列的蛋白。
2.编码FAM3D蛋白的多核苷酸在制备治疗肠道疾病的药物中的应用，其中，所述肠道疾病为结肠炎，所述多核苷酸是编码序列表中SEQ ID No：2或SEQ ID No：3所示氨基酸序列的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述多核苷酸的序列如序列表中SEQ ID No：1所示。
4.包含权利要求2或3中所述多核苷酸的基因工程载体或工程细胞在制备治疗肠道疾病的药物中的应用，其中，所述肠道疾病为结肠炎，所述工程细胞不是动物或植物品种。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因工程载体为腺病毒基因工程载体。
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