CN112877289A - 一种基于ccl20与cxcl8促进肠癌细胞的增殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于CCL20与CXCL8促进肠癌细胞的增殖方法，包括以下步骤：步骤一：选择合适实验材料；步骤二：对主要试剂进行配制以及配制后试剂的储存；步骤三：使细胞增殖，并对增殖后的细胞进行不同实验测试；步骤四：对细胞进行台盼蓝排染实验，并计算细胞存活率；步骤五：对细胞进行免疫组织化学染色，本发明通过采用多组实验对比，能够通过分别设置不同浓度的CCL20与CXCL8的贮备液对肠癌细胞进行增殖培养，一方面确定相同趋化因子情况下，趋化因子浓度对于肠癌细胞增殖率的影响，另一方面能够确定相同趋化因子浓度条件下，单一趋化因子和两个趋化因子分别对肠癌细胞增殖率的影响，能够了解趋化因子浓度和趋化因子数量分别对肠癌细胞增殖的影响。
Description
技术领域
本发明属于肠癌细胞增殖技术领域，具体涉及一种基于CCL20与CXCL8促进肠癌细胞的增殖方法。
背景技术
结直肠癌容易发生肝转移。如何预测及防治结直肠癌肝转移是一大世界性难题。趋化因子作为肿瘤微环境的重要成份之一，在CLM中发挥重要作用。现有的研究表明，巨噬细胞炎性蛋白3α和白介素-8与CLM最为密切。然而，相关分子机制尚未完全明了。上皮间质转化是一个由上皮细胞向间质细胞转变的暂时性和可逆性过程。这个过程被广泛定义为从上皮形态向间质形态转变时不同标志物表达的改变，以及细胞获得迁移及侵袭力增强的功能性改变。本研究旨在明确趋化因子CCL20和 CXCL8与 EMT之间的关系，深入探讨CCL20 与CXCL8联合诱导肠癌细胞发生EMT的分子机制。检测临床CRC组织标本，寻找支持CCL20与CXCL8联合诱发EMT 的临床证据，分析CCL20 与CXCL8共表达与CRC患者临床病理指标及预后的相关性。
现在针对于目前市面上大多数的肠癌细胞增殖技术提出以下问题：
1、现有的技术很少有针对趋化因此对肠癌细胞增殖进行分析，从而无法了解到CCL20与CXCL8对肠癌细胞增殖过程造成的影响，以及无法掌握单个趋化因子与多个趋化因子造成的影响是否相同；2、现有的技术很少有对CCL20与CXCL8受体表达位置进行检测，从而无法了解到CCL20与CXCL8对于肠癌细胞确切的影响位置。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种基于CCL20与CXCL8促进肠癌细胞的增殖方法，以解决上述背景技术中提出的很少分析趋化因子对肠癌细胞增影响的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于CCL20与CXCL8促进肠癌细胞的增殖方法，包括以下步骤：
步骤一：选择合适实验材料； 步骤二：对主要试剂进行配制以及配制后试剂的储存； 步骤三：使细胞增殖，并对增殖后的细胞进行不同实验测试； 步骤四：对细胞进行台盼蓝排染实验，并计算细胞存活率； 步骤五：对细胞进行免疫组织化学染色； 步骤六：选取合适细胞，对细胞进行MTT实验测试，并计算细胞增殖率；
步骤七：对实验数据结果进行分析，并使用统计学对数据进行处理。
优选的，所述步骤一中，从中国科学院上海细胞生物研究所细胞库内选择合适人结肠腺癌细胞系，并将细胞进行复苏。
优选的，所述步骤二中，室温下提前分别配制好DMEM及RPMI1640基础培养基、DMEM完全培养基、PBS溶液、台盼蓝染液，并将CCL20、CXCL8 均溶于无菌PBS溶液，并制成100μg/μL浓度的贮备液，并将贮备液分为只加入CCL20、CXCL8以及混合加入CCL20和CXCL8三种不同的贮备液，将不同贮备液采用DMEM或RPMI1640基础培养基稀释至不同实验浓度，将贮备液贮存于-80℃冰箱内。
优选的，所述步骤三中，在基础培养基90mL中加入10mL解冻的灭活胎牛血清，并加入100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，配成含10%胎牛血清的完全培养基，使用三种不同贮备液对细胞进行增殖。
优选的，所述步骤三中，将细胞移入含有5 mL DMEM或者RPMI 1640基础培养基的离心管中，低速离心10min，并洗涤一次，离心后弃上清，加入2-4 mLDMEM或者RPMI1640完全培养基转移到普通细胞培养6孔板中，置于孵箱内培养。
优选的，所述步骤四中，按细胞消化分散成单细胞，取细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液各50µL于Ependoff试管中，混匀，3min内用血细胞计数板分别计数活细胞和死细胞，镜下死细胞被染成淡蓝色，活细胞拒染，通过显微镜观察染色情况，并计算出细胞存活百分率。
优选的，所述步骤五中，用过硫酸洗液浸泡玻片过夜，以清水和ddH2O冲洗干净，无水乙醇浸泡过夜，取出晾干后浸入多聚赖氨酸中10min，转至140℃烤箱2h，准备6孔板，将玻片放于孔内，培养24h，取出玻片，并使用预冷0.01mol/LPBS浸洗2次，之后置于l0%中性甲醛固定30min，4℃保存备用，将细胞爬片置于烧杯中，加入50%体积的0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液，在微波炉中用中低火加热8min，间隔5min后再用中低火加热8min，自然冷却到室温。
优选的，所述步骤五中，用趋化因子及相应受体抗体分别对细胞爬片进行免疫化学染色，先用正常非免疫动物血清封闭，之后用第一抗体和辣根过氧化物酶标记的第二抗体结合。
优选的，所述步骤六中，对活细胞进行计数，置入孵箱，待细胞贴壁后加入药物，加药后分别培养24、48h，按照20μL/孔的量加入MTT，孵箱中培4h后，分别按照150μL/孔的量加入DMSO溶解结晶沉淀，用酶标仪在490nm波长下测定各孔吸光度OD值，并计算出细胞增值率。
优选的，所述步骤七中，对细胞采用细胞免疫组化检测，对CCL20和CXCL8受体表达位置进行检测，并受体表达位置结果进行汇总。
与现有技术相比，本发明提供了一种基于CCL20与CXCL8促进肠癌细胞的增殖方法，具备以下有益效果：
1、本发明通过采用多组实验对比，能够通过分别设置不同浓度的CCL20与CXCL8的贮备液对肠癌细胞进行增殖培养，一方面确定相同趋化因子情况下，趋化因子浓度对于肠癌细胞增殖率的影响，另一方面能够确定相同趋化因子浓度条件下，单一趋化因子和两个趋化因子分别对肠癌细胞增殖率的影响，通过这种方式能够了解到趋化因子浓度和趋化因子数量分别对肠癌细胞增殖造成的影响；
2、本发明通过采用台盼蓝排染实验，能够通过观察显微镜下细胞染色情况，能够确定增殖细胞的存活情况，从而能够便于计算出细胞存活百分率，便于后续挑选出活力较好的细胞进行后续实验，增加了实验的准确性，通过采用免疫组织化学染色，通过采用趋化因子及相应受体抗体分别对细胞爬片进行免疫化学染色，能够确定趋化因子在肠癌细胞内表达位置，从而确定趋化因子对肠癌细胞的具体影响位置；
3、本发明通过采用MTT实验，能够通过在孔板内加入DMSO溶解结晶沉淀，用酶标仪在490nm波长下测定各孔吸光度OD值，并通过对照组实验计算出加药组和对照组吸收的OD值，从而能够便于计算出细胞增殖率，从而能够通过增值率作为实验结果来观察出不同浓度趋化因子和趋化因子数量对肠癌细胞增殖过程造成的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种基于CCL20与CXCL8促进肠癌细胞的增殖方法技术方案：一种基于CCL20与CXCL8促进肠癌细胞的增殖方法，包括以下步骤：
步骤一：选择合适实验材料； 步骤二：对主要试剂进行配制以及配制后试剂的储存； 步骤三：使细胞增殖，并对增殖后的细胞进行不同实验测试； 步骤四：对细胞进行台盼蓝排染实验，并计算细胞存活率； 步骤五：对细胞进行免疫组织化学染色； 步骤六：选取合适细胞，对细胞进行MTT实验测试，并计算细胞增殖率；
步骤七：对实验数据结果进行分析，并使用统计学对数据进行处理。
本发明中，优选的，步骤一中，从中国科学院上海细胞生物研究所细胞库内选择合适人结肠腺癌细胞系，并将细胞进行复苏。
本发明中，优选的，步骤二中，室温下提前分别配制好DMEM及RPMI1640基础培养基、DMEM完全培养基、PBS溶液、台盼蓝染液，并将CCL20、CXCL8 均溶于无菌PBS溶液，并制成100μg/μL浓度的贮备液，并将贮备液分为只加入CCL20、CXCL8以及混合加入CCL20和CXCL8三种不同的贮备液，将不同贮备液采用DMEM或RPMI1640基础培养基稀释至不同实验浓度，将贮备液贮存于-80℃冰箱内。
本发明中，优选的，步骤三中，在基础培养基90mL中加入10mL解冻的灭活胎牛血清，并加入100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，配成含10%胎牛血清的完全培养基，使用三种不同贮备液对细胞进行增殖。
本发明中，优选的，步骤三中，将细胞移入含有5 mL DMEM或者RPMI 1640基础培养基的离心管中，低速离心10min，并洗涤一次，离心后弃上清，加入2-4 mLDMEM或者RPMI1640完全培养基转移到普通细胞培养6孔板中，置于孵箱内培养。
本发明中，优选的，步骤四中，按细胞消化分散成单细胞，取细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液各50µL于Ependoff试管中，混匀，3min内用血细胞计数板分别计数活细胞和死细胞，镜下死细胞被染成淡蓝色，活细胞拒染，通过显微镜观察染色情况，并计算出细胞存活百分率。
本发明中，优选的，步骤五中，用过硫酸洗液浸泡玻片过夜，以清水和ddH2O冲洗干净，无水乙醇浸泡过夜，取出晾干后浸入多聚赖氨酸中10min，转至140℃烤箱2h，准备6孔板，将玻片放于孔内，培养24h，取出玻片，并使用预冷0.01mol/LPBS浸洗2次，之后置于l0%中性甲醛固定30min，4℃保存备用，将细胞爬片置于烧杯中，加入50%体积的0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液，在微波炉中用中低火加热8min，间隔5min后再用中低火加热8min，自然冷却到室温。
本发明中，优选的，步骤五中，用趋化因子及相应受体抗体分别对细胞爬片进行免疫化学染色，先用正常非免疫动物血清封闭，之后用第一抗体和辣根过氧化物酶标记的第二抗体结合。
本发明中，优选的，步骤六中，对活细胞进行计数，置入孵箱，待细胞贴壁后加入药物，加药后分别培养24、48h，按照20μL/孔的量加入MTT，孵箱中培4h后，分别按照150μL/孔的量加入DMSO溶解结晶沉淀，用酶标仪在490nm波长下测定各孔吸光度OD值，并计算出细胞增值率。
本发明中，优选的，步骤七中，对细胞采用细胞免疫组化检测，对CCL20和CXCL8受体表达位置进行检测，并受体表达位置结果进行汇总。
实施例一
一种基于CCL20与CXCL8促进肠癌细胞的增殖方法，包括以下步骤：
步骤一：选择合适实验材料； 步骤二：对主要试剂进行配制以及配制后试剂的储存； 步骤三：使细胞增殖，并对增殖后的细胞进行不同实验测试； 步骤四：对细胞进行台盼蓝排染实验，并计算细胞存活率； 步骤五：对细胞进行免疫组织化学染色； 步骤六：选取合适细胞，对细胞进行MTT实验测试，并计算细胞增殖率；
步骤七：对实验数据结果进行分析，并使用统计学对数据进行处理。
本发明中，优选的，步骤一中，从中国科学院上海细胞生物研究所细胞库内选择合适人结肠腺癌细胞系，并将细胞进行复苏。
本发明中，优选的，步骤二中，室温下提前分别配制好DMEM及RPMI1640基础培养基、DMEM完全培养基、PBS溶液、台盼蓝染液，并将CCL20、CXCL8 均溶于无菌PBS溶液，并制成100μg/μL浓度的贮备液，并将贮备液分为只加入CCL20、CXCL8以及混合加入CCL20和CXCL8三种不同的贮备液，两组贮备液内分别加入10ng/mLCCL20和10ng/mLCXCL8，第三组贮备液内加入10ng/mLCCL20、CXCL8，将不同贮备液采用DMEM或RPMI1640基础培养基稀释至不同实验浓度，将贮备液贮存于-80℃冰箱内。
本发明中，优选的，步骤三中，在基础培养基90mL中加入10mL解冻的灭活胎牛血清，并加入100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，配成含10%胎牛血清的完全培养基，使用三种不同贮备液对细胞进行增殖。
本发明中，优选的，步骤三中，将细胞移入含有5 mL DMEM或者RPMI 1640基础培养基的离心管中，低速离心10min，并洗涤一次，离心后弃上清，加入2-4 mLDMEM或者RPMI1640完全培养基转移到普通细胞培养6孔板中，置于孵箱内培养。
本发明中，优选的，步骤四中，按细胞消化分散成单细胞，取细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液各50µL于Ependoff试管中，混匀，3min内用血细胞计数板分别计数活细胞和死细胞，镜下死细胞被染成淡蓝色，活细胞拒染，通过显微镜观察染色情况，并计算出细胞存活百分率。
本发明中，优选的，步骤五中，用过硫酸洗液浸泡玻片过夜，以清水和ddH2O冲洗干净，无水乙醇浸泡过夜，取出晾干后浸入多聚赖氨酸中10min，转至140℃烤箱2h，准备6孔板，将玻片放于孔内，培养24h，取出玻片，并使用预冷0.01mol/LPBS浸洗2次，之后置于l0%中性甲醛固定30min，4℃保存备用，将细胞爬片置于烧杯中，加入50%体积的0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液，在微波炉中用中低火加热8min，间隔5min后再用中低火加热8min，自然冷却到室温。
本发明中，优选的，步骤五中，用趋化因子及相应受体抗体分别对细胞爬片进行免疫化学染色，先用正常非免疫动物血清封闭，之后用第一抗体和辣根过氧化物酶标记的第二抗体结合。
本发明中，优选的，步骤六中，对活细胞进行计数，置入孵箱，待细胞贴壁后加入药物，加药后分别培养24、48h，按照20μL/孔的量加入MTT，孵箱中培4h后，分别按照150μL/孔的量加入DMSO溶解结晶沉淀，用酶标仪在490nm波长下测定各孔吸光度OD值，并计算出细胞增值率。
本发明中，优选的，步骤七中，对细胞采用细胞免疫组化检测，对CCL20和CXCL8受体表达位置进行检测，并受体表达位置结果进行汇总。
实施例二
一种基于CCL20与CXCL8促进肠癌细胞的增殖方法，包括以下步骤：
步骤一：选择合适实验材料； 步骤二：对主要试剂进行配制以及配制后试剂的储存； 步骤三：使细胞增殖，并对增殖后的细胞进行不同实验测试； 步骤四：对细胞进行台盼蓝排染实验，并计算细胞存活率； 步骤五：对细胞进行免疫组织化学染色； 步骤六：选取合适细胞，对细胞进行MTT实验测试，并计算细胞增殖率；
步骤七：对实验数据结果进行分析，并使用统计学对数据进行处理。
本发明中，优选的，步骤一中，从中国科学院上海细胞生物研究所细胞库内选择合适人结肠腺癌细胞系，并将细胞进行复苏。
本发明中，优选的，步骤二中，室温下提前分别配制好DMEM及RPMI1640基础培养基、DMEM完全培养基、PBS溶液、台盼蓝染液，并将CCL20、CXCL8 均溶于无菌PBS溶液，并制成100μg/μL浓度的贮备液，并将贮备液分为只加入CCL20、CXCL8以及混合加入CCL20和CXCL8三种不同的贮备液，两组贮备液内分别加入50ng/mLCCL20和50ng/mLCXCL8，第三组贮备液内加入50ng/mLCCL20、CXCL8，将不同贮备液采用DMEM或RPMI1640基础培养基稀释至不同实验浓度，将贮备液贮存于-80℃冰箱内。
本发明中，优选的，步骤三中，在基础培养基90mL中加入10mL解冻的灭活胎牛血清，并加入100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，配成含10%胎牛血清的完全培养基，使用三种不同贮备液对细胞进行增殖。
本发明中，优选的，步骤三中，将细胞移入含有5 mL DMEM或者RPMI 1640基础培养基的离心管中，低速离心10min，并洗涤一次，离心后弃上清，加入2-4 mLDMEM或者RPMI1640完全培养基转移到普通细胞培养6孔板中，置于孵箱内培养。
本发明中，优选的，步骤四中，按细胞消化分散成单细胞，取细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液各50µL于Ependoff试管中，混匀，3min内用血细胞计数板分别计数活细胞和死细胞，镜下死细胞被染成淡蓝色，活细胞拒染，通过显微镜观察染色情况，并计算出细胞存活百分率。
本发明中，优选的，步骤五中，用过硫酸洗液浸泡玻片过夜，以清水和ddH2O冲洗干净，无水乙醇浸泡过夜，取出晾干后浸入多聚赖氨酸中10min，转至140℃烤箱2h，准备6孔板，将玻片放于孔内，培养24h，取出玻片，并使用预冷0.01mol/LPBS浸洗2次，之后置于l0%中性甲醛固定30min，4℃保存备用，将细胞爬片置于烧杯中，加入50%体积的0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液，在微波炉中用中低火加热8min，间隔5min后再用中低火加热8min，自然冷却到室温。
本发明中，优选的，步骤五中，用趋化因子及相应受体抗体分别对细胞爬片进行免疫化学染色，先用正常非免疫动物血清封闭，之后用第一抗体和辣根过氧化物酶标记的第二抗体结合。
本发明中，优选的，步骤六中，对活细胞进行计数，置入孵箱，待细胞贴壁后加入药物，加药后分别培养24、48h，按照20μL/孔的量加入MTT，孵箱中培4h后，分别按照150μL/孔的量加入DMSO溶解结晶沉淀，用酶标仪在490nm波长下测定各孔吸光度OD值，并计算出细胞增值率。
本发明中，优选的，步骤七中，对细胞采用细胞免疫组化检测，对CCL20和CXCL8受体表达位置进行检测，并受体表达位置结果进行汇总。
实施例三
一种基于CCL20与CXCL8促进肠癌细胞的增殖方法，包括以下步骤：
步骤一：选择合适实验材料； 步骤二：对主要试剂进行配制以及配制后试剂的储存； 步骤三：使细胞增殖，并对增殖后的细胞进行不同实验测试； 步骤四：对细胞进行台盼蓝排染实验，并计算细胞存活率； 步骤五：对细胞进行免疫组织化学染色； 步骤六：选取合适细胞，对细胞进行MTT实验测试，并计算细胞增殖率；
步骤七：对实验数据结果进行分析，并使用统计学对数据进行处理。
本发明中，优选的，步骤一中，从中国科学院上海细胞生物研究所细胞库内选择合适人结肠腺癌细胞系，并将细胞进行复苏。
本发明中，优选的，步骤二中，室温下提前分别配制好DMEM及RPMI1640基础培养基、DMEM完全培养基、PBS溶液、台盼蓝染液，并将CCL20、CXCL8 均溶于无菌PBS溶液，并制成100μg/μL浓度的贮备液，并将贮备液分为只加入CCL20、CXCL8以及混合加入CCL20和CXCL8三种不同的贮备液，两组贮备液内分别加入100ng/mLCCL20和100ng/mLCXCL8，第三组贮备液内加入100ng/mLCCL20、CXCL8，将不同贮备液采用DMEM或RPMI1640基础培养基稀释至不同实验浓度，将贮备液贮存于-80℃冰箱内。
本发明中，优选的，步骤三中，在基础培养基90mL中加入10mL解冻的灭活胎牛血清，并加入100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，配成含10%胎牛血清的完全培养基，使用三种不同贮备液对细胞进行增殖。
本发明中，优选的，步骤三中，将细胞移入含有5 mL DMEM或者RPMI 1640基础培养基的离心管中，低速离心10min，并洗涤一次，离心后弃上清，加入2-4 mLDMEM或者RPMI1640完全培养基转移到普通细胞培养6孔板中，置于孵箱内培养。
本发明中，优选的，步骤四中，按细胞消化分散成单细胞，取细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液各50µL于Ependoff试管中，混匀，3min内用血细胞计数板分别计数活细胞和死细胞，镜下死细胞被染成淡蓝色，活细胞拒染，通过显微镜观察染色情况，并计算出细胞存活百分率。
本发明中，优选的，步骤五中，用过硫酸洗液浸泡玻片过夜，以清水和ddH2O冲洗干净，无水乙醇浸泡过夜，取出晾干后浸入多聚赖氨酸中10min，转至140℃烤箱2h，准备6孔板，将玻片放于孔内，培养24h，取出玻片，并使用预冷0.01mol/LPBS浸洗2次，之后置于l0%中性甲醛固定30min，4℃保存备用，将细胞爬片置于烧杯中，加入50%体积的0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液，在微波炉中用中低火加热8min，间隔5min后再用中低火加热8min，自然冷却到室温。
本发明中，优选的，步骤五中，用趋化因子及相应受体抗体分别对细胞爬片进行免疫化学染色，先用正常非免疫动物血清封闭，之后用第一抗体和辣根过氧化物酶标记的第二抗体结合。
本发明中，优选的，步骤六中，对活细胞进行计数，置入孵箱，待细胞贴壁后加入药物，加药后分别培养24、48h，按照20μL/孔的量加入MTT，孵箱中培4h后，分别按照150μL/孔的量加入DMSO溶解结晶沉淀，用酶标仪在490nm波长下测定各孔吸光度OD值，并计算出细胞增值率。
本发明中，优选的，步骤七中，对细胞采用细胞免疫组化检测，对CCL20和CXCL8受体表达位置进行检测，并受体表达位置结果进行汇总。
| 组别 | 浓度（ng/mL） | 增长率（％） | 增长率（％） | 增长率（％） |
| 实施例一 | 10 | 119.1±8.0 | 123.8±4.1 | 137.0±6.9 |
| 实施例二 | 50 | 119.4±11.5 | 129.5±9.8 | 121.1±1.4 |
| 实施例三 | 100 | 114.6±1.7 | 122.6±5.0 | 114.4±10.5 |
| 趋化因子 | \ | CCL20 | CXCL8 | CCL20、CXCL8 |
综合上述实施例，增殖率并无浓度依赖性，在低浓度组合中（即10ng/mLCCL20+10ng/mLCXCL8），细胞增殖率较10ng/mlCCL20或10ng/ml CXCL8 单因子作用组更明显，而在高浓度组合中并未发现类似的现象。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种基于CCL20与CXCL8促进肠癌细胞的增殖方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：选择合适实验材料； 步骤二：对主要试剂进行配制以及配制后试剂的储存；步骤三：使细胞增殖，并对增殖后的细胞进行不同实验测试； 步骤四：对细胞进行台盼蓝排染实验，并计算细胞存活率； 步骤五：对细胞进行免疫组织化学染色； 步骤六：选取合适细胞，对细胞进行MTT实验测试，并计算细胞增殖率；
步骤七：对实验数据结果进行分析，并使用统计学对数据进行处理。
2.根据权利要求1所述的一种基于CCL20与CXCL8促进肠癌细胞的增殖方法，其特征在于：所述步骤一中，从中国科学院上海细胞生物研究所细胞库内选择合适人结肠腺癌细胞系，并将细胞进行复苏。
3.根据权利要求1所述的一种基于CCL20与CXCL8促进肠癌细胞的增殖方法，其特征在于：所述步骤二中，室温下提前分别配制好DMEM及RPMI1640基础培养基、DMEM完全培养基、PBS溶液、台盼蓝染液，并将CCL20、CXCL8 均溶于无菌PBS溶液，并制成100μg/μL浓度的贮备液，并将贮备液分为只加入CCL20、CXCL8以及混合加入CCL20和CXCL8三种不同的贮备液，将不同贮备液采用DMEM或RPMI1640基础培养基稀释至不同实验浓度，将贮备液贮存于-80℃冰箱内。
4.根据权利要求1所述的一种基于CCL20与CXCL8促进肠癌细胞的增殖方法，其特征在于：所述步骤三中，在基础培养基90mL中加入10mL解冻的灭活胎牛血清，并加入100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，配成含10%胎牛血清的完全培养基，使用三种不同贮备液对细胞进行增殖。
5.根据权利要求1所述的一种基于CCL20与CXCL8促进肠癌细胞的增殖方法，其特征在于：所述步骤三中，将细胞移入含有5 mL DMEM或者RPMI 1640基础培养基的离心管中，低速离心10min，并洗涤一次，离心后弃上清，加入2-4 mLDMEM或者RPMI1640完全培养基转移到普通细胞培养6孔板中，置于孵箱内培养。
6.根据权利要求1所述的一种基于CCL20与CXCL8促进肠癌细胞的增殖方法，其特征在于：所述步骤四中，按细胞消化分散成单细胞，取细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液各50µL于Ependoff试管中，混匀，3min内用血细胞计数板分别计数活细胞和死细胞，镜下死细胞被染成淡蓝色，活细胞拒染，通过显微镜观察染色情况，并计算出细胞存活百分率。
7.根据权利要求1所述的一种基于CCL20与CXCL8促进肠癌细胞的增殖方法，其特征在于：所述步骤五中，用过硫酸洗液浸泡玻片过夜，以清水和ddH2O冲洗干净，无水乙醇浸泡过夜，取出晾干后浸入多聚赖氨酸中10min，转至140℃烤箱2h，准备6孔板，将玻片放于孔内，培养24h，取出玻片，并使用预冷0.01mol/LPBS浸洗2次，之后置于l0%中性甲醛固定30min，4℃保存备用，将细胞爬片置于烧杯中，加入50%体积的0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液，在微波炉中用中低火加热8min，间隔5min后再用中低火加热8min，自然冷却到室温。
8.根据权利要求1所述的一种基于CCL20与CXCL8促进肠癌细胞的增殖方法，其特征在于：所述步骤五中，用趋化因子及相应受体抗体分别对细胞爬片进行免疫化学染色，先用正常非免疫动物血清封闭，之后用第一抗体和辣根过氧化物酶标记的第二抗体结合。
9.根据权利要求1所述的一种基于CCL20与CXCL8促进肠癌细胞的增殖方法，其特征在于：所述步骤六中，对活细胞进行计数，置入孵箱，待细胞贴壁后加入药物，加药后分别培养24、48h，按照20μL/孔的量加入MTT，孵箱中培4h后，分别按照150μL/孔的量加入DMSO溶解结晶沉淀，用酶标仪在490nm波长下测定各孔吸光度OD值，并计算出细胞增值率。
10.根据权利要求1所述的一种基于CCL20与CXCL8促进肠癌细胞的增殖方法，其特征在于：所述步骤七中，对细胞采用细胞免疫组化检测，对CCL20和CXCL8受体表达位置进行检测，对受体表达位置和细胞增值率进行汇总。
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2021
- 2021-02-24 CN CN202110206258.7A patent/CN112877289A/zh active Pending
Patent Citations (8)
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