CN105061582A - 树鼩cxcl8-cxcr1在类风湿关节炎治疗的应用 - Google Patents

Abstract

本发明鉴定了树鼩的1个趋化因子(CXCL8)和1个趋化因子受体(CXCR1)基因及这两个基因编码的蛋白；确定了CXCL8和CXCR1构成的信号通路在功能上参与了外周血淋巴细胞迁移的调节。在树鼩诱导关节炎(CIA)动物模型中，减少外周血中CXCL8的浓度或者抑制CXCR1受体的功能能有效减弱免疫淋巴细胞向外周骨关节的迁移，从而达到治疗类风湿关节炎的效果。本发明为临床类风湿关节炎病人提供了治疗性的分子靶标。

Description

树鼩CXCL8-CXCR1在类风湿关节炎治疗的应用

技术领域

本发明涉及树鼩(Treeshrew)CXCL8和CXCR1蛋白在树鼩免疫系统的表达水平、分布和生理功能；涉及树鼩CXCL8-CXCR1信号途径对外周淋巴细胞迁移活动的调节及其在树鼩胶原诱导关节炎(collageninducedarthritis,CIA)模型和在类风湿关节炎(Rheumatoidarthritis，RA)治疗中的应用。

背景技术

树鼩(Treeshrew)属攀鼩目树鼩科，是一种体型类似于松鼠的小型哺乳动物，主要分布于南亚、东南亚及我国南部地区(Fanetal.2013)。我国现有树鼩1个属1个种和6个亚种，1个种为中缅树鼩(Tupaiabelangeri)，该种树鼩体长14-23cm，体重80-200g。树鼩的系统分类地位一直受到争议，不同研究发现其分类地位差别很大(Schmitzetal.2000)。从解剖学分析，树鼩主要的免疫器官、内分泌器官组织形态特征和神经系统的发育方面与灵长类高度相似。匡德宣等通过解剖树鼩肾上腺、甲状腺、甲状旁腺及脑垂体，并进行HE染色分析其内分泌组织学特征，建立树鼩正常的内分泌器官组织学图谱，也发现其在组织形态学上更接近于灵长类(匡德宣等.2014)。王颖君等通过解剖成年及幼年树鼩，观察其胸腺、脾和淋巴结的形态，并取这三种免疫器官进行HE染色组织学特征分析，发现树鼩免疫器官在形态学上与人较为接近，为免疫系统疾病树鼩模型的研究提供组织学参考(王颖君等.2013)。另外，树鼩具有一些适合作为实验动物的特点，如体形尺寸较小，脑体质量比较高，饲养和驯化成本低以及生长繁殖快等特点(Xuetal.2013)。树鼩的免疫系统与灵长类相似，它能够自然感染常见的病毒，其应激系统与猴和人类也非常类似。药物代谢和全基因组分析表明，树鼩药物代谢的酶与人类相似，而猕猴则缺失这一类酶(Zhaoetal.2014)，因此利用树鼩模型进行药物安全性测试使结果更加可靠，树鼩被认为有望替代灵长类动物的一种新型实验动物。

胶原诱导型关节炎(collagen-inducedarthritis,CIA)模型是1977年由Trentham等人采用异种动物的II型胶原蛋白(collagentypeII，CII)注射于大鼠的背部和尾根部诱导大鼠实验性关节炎症而建立起来的(Trentetal.1977)。后面的研究进行了改进，加入完全弗氏佐剂作为诱导剂，联合CII，发现关节炎发病率显著提高(Brandetal.2007)。大鼠在第14天出现多发性外周关节炎体征，关节局部红肿，21天左右发病最厉害，关节肿胀至少持续5周。发病过程中，实验动物的毛色失去光泽，体重下降。病理变化表现为滑膜炎、软骨破坏，关节腔内有大量炎症细胞浸润(陈程等.2013)。对类风湿关节炎和胶原诱导关节炎的对比研究发现，类风湿关节炎和胶原诱导关节炎有许多相似之处：如关节滑模增厚、血管翳生成及随之出现的软骨破坏。这些临床表现和指标与类风湿关节炎患者联系紧密，该模型是用于研究和筛选治疗类风湿关节炎药物的理想模型，该模型已经在各种临床前期研究获得了广泛的应用，胶原诱导关节炎模型已被认为是目前研究类风湿关节炎的最好模型。

类风湿关节炎(RA)是一种以关节炎为主要临床表现的慢性、系统性自身免疫疾病，其主要特征是滑膜关节的炎症，导致进行性的软骨和软骨下骨的破坏，在关节内可以看到滑膜组织的异常增生、大量炎症细胞的浸润。类风湿关节炎在全世界的患病率为0.42-0.54%，北美洲和非洲可达2%(Pedersenetal.2009)，在我国25个省的疾病流行病学调查中显示我国的患病率为0.32-0.36%(Zengetal.2008)，类风湿关节炎是引起青壮年劳动力丧失最主要的原因之一。类风湿关节炎具有易复发、难治愈的特点，在关节炎中它是致残率较高的疾病。许多研究已表明多种炎症细胞(淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、滑膜细胞等)介导的异常细胞免疫、体液免疫，可导致关节局部和全身的免疫功能紊乱(Grespanetal.2008)，但类风湿关节炎病理机制目前还不完全清楚，缺乏有效的临床治疗手段。目前临床上治疗类风湿关节炎的常用药物分为四大类，即非甾体抗炎药(nonsteroidalanti-inflammatorydrugs，NSAIDs)、免疫抑制剂、糖皮质激素和植物药(中华医学会风湿病学会.2004)，如甲氨蝶呤(MTX)、硫唑嘌呤、环磷酰胺等，但长时间使用这些药会使较多患者出现不良反应，导致不能耐受而停用。

CXCL8又名Interluekin-8(IL-8，白细胞介素8)，属CXC家族，是一个典型的含保守的Glu-Leu-Arg“ELR”N端序列的炎性趋化性因子(Matsushimaetal.1998)。CXCL8主要由单核-巨噬细胞和中性粒细胞产生，其他细胞，如淋巴细胞、滑膜成纤维细胞、血管内皮细胞等也能分泌CXCL8。CXCL8有两个受体CXCR1和CXCR2，两者均为高度保守的七次跨膜的G蛋白偶联受体，人CXCR1和CXCR2的开放阅读框长度分别为1053bp和1083bp，两者同源性高达77%(Sandeepetal.2012)。CXCR1与CXCL8高度特异性结合，但CXCR2与CXCL8亲和力则较低(Bertinietal.2012)，CXCR2可以与所有含“ELR”的趋化因子配体结合(Bizzarrietal.2006)。CXCR1和CXCR2主要表达于中性粒细胞、单核细胞、Th1细胞、CD8+T等细胞表面。CXCL8与受体CXCR1和CXCR2结合后激活G蛋白偶联受体启动下游信号通路，产生多种生物学功能，包括促炎性细胞趋化、促血管生成、促有丝分裂和诱导细胞增殖等(Campbelletal.2013)。SB225002是一种CXCL8受体选择性非肽类抑制剂，对CXCR2的抑制效果比CXCR1强，约为150倍(Godaetal.2013)。在体内它能够抑制兔CXCL8诱导的中性粒细胞的迁移(Whiteetal.1998)。Reparixin(DF1681Y，丙酰基-甲磺酰胺)是CXCR1和CXCR2的受体激活的抑制剂，能减低多种损伤模型中的炎症反应(Gorioetal.2007)。

CXCL8-CXCR1/CXCR2与炎症的发生发展密切相关，特异性地作用于CXCL8或者CXCR1/CXCR2有望成为炎症疾病的潜在治疗策略。类风湿关节炎是一种慢性的滑膜关节的炎症，研究也表明类风湿关节炎患者的血清和关节液中CXCL8水平显著升高，提示类风湿关节炎患者的CXCL8参与免疫过程(Blaschkeetal.2009)。本发明在体外利用人重组CXCL8蛋白诱导树鼩淋巴细胞的迁移，且特异的受体抑制剂Reparixin、SB225002和SB265610均阻断其迁移作用，暗示CXCL8及CXCR1/CXCR2构成的信号通路可能参与了外周淋巴细胞介导的细胞迁移。另外，在树鼩胶原诱导关节炎模型中发现树鼩的外周血CXCL8浓度和表达CXCR1+淋巴细胞的比例均升高，Reparixin治疗树鼩胶原诱导关节炎后降低了树鼩的髓过氧化酶(MPO)活性，减少外周血中CXCL8的浓度和表达CXCR1的阳性淋巴细胞比例，而树鼩的关节炎发病情况得到较好的改善，说明CXCL8-CXCR1信号通路在参与了类风湿关节炎病理过程中起着重要作用，特别是对外周血淋巴细胞迁移的抑制而控制类风湿关节炎病情的发展，说明CXCL8-CXCR1对类风湿关节炎的治疗具有潜在的价值。

发明内容

本发明主要研究趋化因子CXCL8及其受体CXCR1在类风湿关节炎发病和治疗过程中所起的作用，主要分析自然生长状态下树鼩的CXCL8-CXCR1的功能和树鼩胶原诱导关节炎模型中CXCL8-CXCR1在关节炎治疗中的作用，目的是提供CXCL8及其受体CXCR1在治疗类风湿关节炎中的应用。

首先，对树鼩的趋化因子CXCL8及其受体CXCR1进行基因克隆，得到开放阅读框长度为306bp编码101个氨基酸的CXCL8基因全长和1050bp编码349个氨基酸的CXCR1基因，并提交到GenBank获取基因登录号tsCXCL8:KJ126716和tsCXCR1:KJ631621，蛋白登录号分别是AHN49722.1和AIC76461.1。分析发现树鼩与灵长类(人和猕猴)的CXCL8蛋白序列同源性分别为76%、74%，树鼩CXCR1与人和猕猴的CXCR1蛋白序列同源性分别为84%、81%。蛋白结构和分子进化分析发现树鼩与人的这两个蛋白在结构上高度保守，系统进化分析也显示其与人和猕猴分群较近，提示树鼩与灵长类亲缘关系更接近，说明树鼩可以作为更好的人类疾病动物模型。CXCL8和CXCR1在树鼩不同组织的表达具有广普性，且在免疫相关组织中表达含量高于非免疫相关组织，说明这两个基因在树鼩的机体免疫调节中起着重要的作用。

其次，对树鼩CXCL8及CXCR1的功能进行分析，CXCR1在主要免疫细胞中，如T细胞、B细胞和中性粒细胞中均有表达，CXCR1表达的T细胞、B细胞的比例约为29%和34%，中性粒细胞中表达CXCR1的量相对较高达到37%。在体外实验用人趋化因子CXCL8能诱导树鼩淋巴细胞迁移的功能，且这种诱导作用能够被特异的受体抑制剂阻断，如Reparixin、SB225002和SB265610。说明CXCL8-CXCR1信号通路在树鼩的外周血淋巴细胞迁移的免疫调节中起着重要作用。

再次，利用牛二型胶原蛋白与完全弗氏佐剂混合物采用尾根部注射法免疫树鼩，构建树鼩胶原诱导关节炎模型，注射后每周两次对树鼩关节炎指数进行评价，采用组织化学切片的方法和影像学分析树鼩关节的病理特征以判断建模是否成功。免疫结果显示利用牛二型胶原蛋白与完全弗氏佐剂混合物免疫树鼩，树鼩表现出典型的类风湿关节炎相关临床特征。如：免疫开始至第14天为免疫激活阶段，关节炎指数上升较快；第14天至第26天为免疫峰值阶段，即发病最严重且可持续12天；第26天以后为恢复阶段，关节炎指数缓慢下降，病情逐渐缓解。观察树鼩胶原诱导关节炎模型的症状表现，与大小鼠和猴胶原诱导关节炎模型较类似，出现足趾部位红肿，毛色暗淡；免疫组化分析发现树鼩胶原诱导关节炎的关节组织中有大量炎性细胞浸润和软骨破坏。X线影像观察到树鼩胶原诱导关节炎的趾骨关节远端受累，关节末端膨大、边缘毛糙。说明树鼩胶原诱导关节炎模型可以作为更好的研究类风湿关节炎的动物模型，且与小鼠胶原诱导关节炎相比，树鼩表现为对外来抗原的易感性。

最后，分析CXCL8-CXCR1信号通路在树鼩类风湿关节炎治疗中的作用，揭示CXCL8-CXCR1表达的改变与树鼩类风湿关节炎发病的相关性。结果显示在树鼩类风湿关节炎病理过程中，外周血中CXCL8的浓度呈升高趋势，表达CXCR1+的淋巴细胞比例也相对上调。建模后第14天时树鼩类风湿关节炎的CXCL8浓度约为对照组的1.2倍，第21天时树鼩类风湿关节炎的CXCR1表达淋巴细胞的阳性比例约为对照组的2.5倍，说明CXCL8及CXCR1参与了树鼩类风湿关节炎病理的发生和发展。但是树鼩类风湿关节炎经过Reparixin治疗后，MPO活性下调，外周血中CXCL8的浓度相对下降，表达CXCR1+淋巴细胞的比例也相对下调，树鼩类风湿关节炎的炎症反应得到缓解，说明Reparixin对树鼩类风湿关节炎具有一定的治疗作用，说明阻断CXCL8与CXCR1之间的信号传递能够抑制树鼩类风湿关节炎的发展，这对类风湿关节炎的治疗具有重要的意义。

附图说明

图1.树鼩与人和猕猴CXCL8蛋白序列的比对，“*”表示完全相同的氨基酸，“：”和“.”分别表示保守的和半保守的氨基酸残基，20个氨基酸的信号肽序列用下划线标出，半胱氨酸残基用方框标出，第34位和36位两个半胱氨酸残基构成典型的“CXC”结构。树鼩信号肽序列有4个氨基酸与人和猴不同外，其他氨基酸均相同，使用NCBI/Blast进行同源性比较发现树鼩与人和猕猴CXCL8蛋白同源性分别为76%和74%，说明树鼩与灵长类亲缘关系较近。

图2.树鼩与人、猕猴、小鼠、大鼠CXCR1蛋白序列的比对，“*”表示完全相同的氨基酸，“：”和“.”分别表示保守的和半保守的氨基酸残基。G蛋白受体CXCR1的七个跨膜区用方框标出，三个胞外环1，2，3用阴影部分和加黑标出。使用NCBI/Blast进行同源性比较发现树鼩与人、猕猴、小鼠、大鼠CXCR1蛋白同源性分别为84%、81%、70%、71%，与啮齿类相比，树鼩与灵长类亲缘关系更近。

图3.树鼩CXCL8和CXCR1基因组织表达分析，选取树鼩主要的15个器官，提取RNA逆转录后，采用荧光定量PCR检测各器官中CXCL8(图3A)和CXCR1(图3B)的mRNA表达水平。发现两个基因在所选的15个器官中均有表达，在免疫相关组织如胸腺、脾、血液中两个基因的表达含量相对其他非免疫相关组织如膀胱、小脑、甲状腺的表达量较高，说明树鼩的CXCL8及其受体CXCR1可能参与免疫调节。

图4.树鼩外周血淋巴细胞中CXCR1的mRNA表达水平和外周血血清中CXCL8的浓度。CXCR1在T细胞、B细胞和中性粒细胞中均有表达，且在中性粒细胞中表达量相对较高(图4A)。采用人的CXCL8ELISA试剂盒检测树鼩外周血血清CXCL8的浓度，检测到人血清CXCL8的浓度为16pg/ml，树鼩血清CXCL8浓度约为11.5pg/ml(图4B)。说明树鼩中检测到的CXCL8浓度比人的略低，约为0.7倍，树鼩与人的CXCL8浓度范围相差不大。

图5.树鼩外周血淋巴细胞表面CXCR1的阳性表达率，以人的外周血淋巴细胞为对照，使用PE标记的人CXCR1流式抗体检测到人的淋巴细胞CXCR1阳性表达为43.8%，树鼩淋巴细胞CXCR1阳性表达为25%，因此可以借助人CXCR1流式抗体研究树鼩CXCR1的功能。

图6.人重组CXCL8蛋白诱导淋巴细胞迁移的功能，选用了4个不同人重组CXCL8蛋白浓度梯度，探究其对树鼩淋巴细胞的体外迁移的作用。从低浓度10ng/ml到10000ng/ml人重组CXCL8蛋白均能诱导树鼩淋巴细胞的迁移，随浓度升高至100ng/ml，迁移的淋巴细胞的数量逐渐增加，高浓度范围内，随浓度增加，迁移的细胞数目反而减少。所以100ng/ml时迁移的细胞数量达到最大值，为人重组CXCL8蛋白诱导树鼩淋巴细胞迁移的最适浓度。

图7.Reparixin、SB225002和SB265610对淋巴细胞迁移和存活的影响，三种特异的抑制剂均能阻断或抑制树鼩CXCL8与CXCR1的结合，从而抑制或减少淋巴细胞的迁移。Reparixin在高浓度范围(100nM)抑制作用较为明显(图7A)，SB225002(图7C)和SB265610(图7E)则主要在低浓度范围(0.1nM)抑制淋巴细胞的迁移，MTS试验显示这三种抑制剂对淋巴细胞的存活基本无影响(图7B,7D,7F)。说明树鼩CXCL8能够诱导淋巴细胞的迁移功能，该功能是通过树鼩趋化因子CXCL8-CXCR1信号通路实现的。

图8.树鼩胶原诱导关节炎指数评分及体重变化，采用弗氏佐剂和牛II型胶原蛋白乳化混合物免疫树鼩后，第3天至第14天为免疫激活阶段，评分迅速升高；第21天至第26天为炎症反应峰值阶段，第24天上升至最大值，即发病最厉害；第26天以后为恢复阶段，即关节炎指数逐渐下降。只注射生理盐水的对照组评分在第3天和第7天有略微改变，但整体上基本趋于一致(图8A)。从该组曲线可以看出，树鼩的胶原诱导关节炎模型符合免疫疾病发生和发展的三个阶段，即免疫激活或免疫应答阶段、峰值阶段以及恢复阶段。为了排除生理状况或其他因素的影响，进行树鼩体重变化统计，造模期间，胶原诱导关节炎组和对照组中树鼩的体重值基本无变化(图8B)。树鼩关节炎指数与临床类风湿关节炎的发病情况类似，树鼩胶原诱导关节炎模型具有对外来抗原的易感性，免疫激活所需时间更短，但恢复阶段慢性过程表现不明显，可以确定该模型建立的方法是可行的。

图9.树鼩踝关节剖面及免疫组织化学HE染色、后肢趾骨X线显影及胶原诱导关节炎树鼩脚关节水肿情况。HE染色显示对照组的骨髓腔内炎症细胞极少，而软骨部分较多。胶原诱导关节炎组的骨髓腔中则充满大量的炎症细胞、软骨细胞聚集呈絮状，软骨部分炎症细胞较少(图9A)。符合类风湿关节炎发病时大量炎症细胞被趋化并聚集于关节腔和骨髓腔。X线观察远端趾骨相关关节的影像学显示胶原诱导关节炎树鼩关节远端(主要是趾骨)受累，一方面表现为相连关节接触较紧密，如图上方箭头所指部分，另一方面表现为关节末端膨大、粗糙、边缘不清晰，与小鼠、大鼠以及猴胶原诱导关节炎模型的特征基本一致(图9B)。造模期间，胶原诱导关节炎组树鼩与对照组相比，被毛颜色变暗淡，食欲略有下降但不明显；第3天时胶原诱导关节炎树鼩的后肢足趾部出现轻微的红肿，第7天时后肢足趾部红肿较明显并充满积液，第14天时才观察到前肢红肿但不如后肢严重，约第14天胶原诱导关节炎树鼩尾根部有少部分毛脱落，裸露的部分可以观察到有少许的关节炎小结；第21天时足趾红肿和脱毛症状开始缓解(图9C)。这些症状表现与大鼠、小鼠以及猴胶原诱导关节炎模型较为类似，说明树鼩胶原诱导关节炎模型是成功的。

图10.胶原诱导关节炎树鼩外周血CXCL8浓度变化和CXCR1+(阳性)细胞表达比例，使用人CXCL8ELISA试剂盒检测树鼩血清中CXCL8的浓度。采用弗氏佐剂和牛II型胶原蛋白乳化混合物免疫前树鼩胶原诱导关节炎组的CXCL8浓度低于对照组，免疫后第7天时，CXCL8浓度上升，第14天时胶原诱导关节炎组明显高于对照组，约为1.2倍，说明注射的胶原蛋白和完全弗氏佐剂诱导了炎症的产生，第28天时胶原诱导关节炎也高于对照组(图10A)。这些结果表明类风湿关节炎的发病过程中，树鼩趋化因子CXCL8表达上调，暗示CXCL8可能参与了类风湿关节炎病理的发生和发展。流式细胞术显示CXCR1的蛋白在第7天、21天和28天时胶原诱导关节炎组表达淋巴细胞的阳性比例高于对照组(图10B)，与关节炎指数变化基本一致。总体上看，树鼩胶原诱导关节炎发病期间，CXCL8和CXCR1的表达上调，说明CXCL8和CXCR1可能参与了类风湿关节炎病理的发生和发展。

图11.Reparixin给药后胶原诱导关节炎树鼩外周血MPO浓度变化，选用小鼠MPOELISA试剂盒检测树鼩的MPO活性，以小鼠为对照，检测到树鼩与小鼠的MPO活性值很接近，说明树鼩与小鼠的MPO分子结构同源性较高(图11A)。树鼩胶原诱导关节炎发病过程中，Reparixin治疗胶原诱导关节炎组的MPO值在第7天和第14天均持续下降，特别第14天时Reparixin治疗胶原诱导关节炎组的MPO值迅速下降，之后基本保持不变(图11B)。表明Reparixin能够降低MPO的活性，缓解树鼩类风湿关节炎的炎症反应，对树鼩类风湿关节炎具有一定的治疗作用。

图12.胶原诱导关节炎树鼩和Reparixin给药后胶原诱导关节炎树鼩外周血CXCL8浓度变化和CXCR1+细胞表达比例，ELISA检测到采用弗氏佐剂和牛II型胶原蛋白乳化混合物免疫后第7天胶原诱导关节炎树鼩和Reparixin给药后胶原诱导关节炎树鼩的CXCL8浓度高达到最高，但是使用Reparixin给药后，胶原诱导关节炎树鼩的CXCL8浓度持续下降(图12A)，表明Reparixin在一定程度上能够降低CXCL8浓度。流式细胞术检测采用弗氏佐剂和牛II型胶原蛋白乳化混合物免疫前胶原诱导关节炎树鼩和Reparixin给药后胶原诱导关节炎树鼩的CXCR1+比列差别不大，但免疫后两组值均迅速上升且表达比例非常接近，说明已成功诱导树鼩炎症的发生。使用Reparixin后胶原诱导关节炎树鼩的CXCR1表达升高速度得到明显抑制(图12B)，说明Reparixin可以降低CXCR1表达淋巴细胞的阳性比例降低类风湿关节炎的发生和发展。

具体实施方式

实施例1：树鼩CXCL8和CXCR1基因的克隆及分析。

1.将正常饲养的健康树鼩经乙醚麻醉至昏睡时断颈处死，无菌超净台内取其15种组织(胃、肺、肾、肝脏、胸腺、脾脏、大脑、心脏、肾上腺、膀胱、甲状腺、胰腺、淋巴结、骨、全血)分装于无菌的1.5ml离心管中，提取组织的RNA并使用Takara公司的PrimeScriptRTreagentKitwithcDNAEraser(PerfectRealTime)将提取的RNA反转录为cDNA。选择预测的树鼩CXCL8(XM_006142918.1)和CXCR1(XM_006157465.1)基因设计引物如下：

tsCXCL8:Forward:5'-TCTCGTGTAAACATGACTTCCAAGC-3'；

Reverse:5'-TTATGCATCTTGCTTCTCAGCTTTC-3'；

tsCXCR1:Forward:5'-ATGTGGAACATCACTGATCTGTGGA-3'；

Reverse:5'-TCAAAGGTTTGAAGAGGTATTGATA-3'。

以脾脏组织的cDNA为模板扩增树鼩CXCL8和CXCR1这两个基因的完整编码框，扩增程序为94℃预变性3min;94℃30s、60℃(CXCR1)45s、72℃2min、36个循环;72℃延伸10min。再将所得到的PCR片段回收测序，测序结果比对正确后提交到GenBank获取基因登录号tsCXCL8:KJ126716和tsCXCR1:KJ631621(表2和表4)，蛋白登录号为tsCXCL8：AHN49722.1和tsCXCR1：AIC76461.1(表1和表3)。

2.将测序正确的CXCL8和CXCR1的序列提交到ORFFinder，找到其完整的编码序列CDS及翻译出的相应的氨基酸序列。运用ClustalX软件对其他四个物种的CXCL8和CXCR1氨基酸序列(CXCL8：人NP_001003200.1；猕猴NP_001028137.1；CXCR1：人NP_000625.1；猕猴NP_001035510.1；小鼠NP_839972.1；大鼠NP_062183.1.)进行同源序列比对，信号肽预测软件SignalIP4.0用于预测树鼩CXCL8和CXCR1蛋白信号肽序列(图1和图2)。

3.设计树鼩CXCL8、CXCR1和人18SrRNA的荧光定量PCR引物检测CXCL8和CXCR1在树鼩各组织中的表达，设计引物序列如下：

tsCXCL8：Forward:5'-GCTGGCTATTGCTCTGTTGG-3'；

Reverse:5'-GCATTGGCATCGAAGTTCTG-3'；

tsCXCR1：Forward:5'-CGTCTACGCCCTGGTGTTC-3'；

Revserse:5'-AAATCCAGCCCTTCTCCCT-3'；

h18SrRNA：Forward:5'-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3'；

Reverse:5'-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3'。

以树鼩各组织的cDNA为模板，扩增程序为94℃预变性2min；94℃30s、58℃40s、40个循环；溶解曲线为95℃15s；60℃1min；95℃15s。每个基因平行检测3组，以人的18SrRNA为内参对树鼩CXCL8和CXCR1进行校准。使用溶解曲线分析产物是否具备单一性，ABI7300Real-TimePCR仪收集数据，经ΔΔCt计算对每个基因的转录水平进行定量(图3)。

实施例2：树鼩趋化因子CXCL8及CXCR1的功能分析。

1.分别取正常饲养的4只健康雄性树鼩(体重130±20g，4-6月龄)肝素抗凝外周血4ml于15ml离心管中，采用小鼠淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque(P8620,北京索莱宝生物技术公司)分离树鼩全血总淋巴细胞。采用免疫磁珠分选法分选CD3+T细胞、CD19+B细胞和CD11b+中性粒细胞(MiltenyiBiotec,German)，并提取RNA，反转录合成cDNA，分析CXCR1在淋巴细胞，CD3+T细胞、CD19+B细胞和CD11b+中性粒细胞中的表达(图4A)。

2.分别取3只树鼩外周血700ul于1.5ml洁净的离心管中，4℃12000rpm离心5min，分两层(上层为血清，下层为红细胞)，将上层清液转移至另一新的1.5ml离心管中，于-20℃保存备用。使用人CXCL8ELISA试剂盒(EIA-0114，上海艾莱萨生物科技公司)检测树鼩外周血血清中CXCL8的浓度(见图4B)。

3.分别取3只树鼩外周血700ul并分离总淋巴细胞，用900ulPBS重悬细胞沉淀，均匀分装于9个1.5ml洁净的离心管中，每管100ul细胞悬液。设置1个空白管、1个同型对照和3个平行的抗体管。除空白管外，对应管中加入10ul同型或抗体(PE标记的小鼠抗人CXCR1流式抗体Anti-CD181,555940及同型对照mouseIgG2βIsotypecontrol,555743，美国BD公司)，室温避光孵育30min。然后，每管加1mlPBS重悬洗涤细胞，300g离心5min；弃上清，用500ulPBS重悬后用流式细胞仪检测(BectonDickinson,USA)(见图5)。

4.分离树鼩外周血总淋巴细胞，稀释至2000个/50ul，用800ulRPMI-1640完全培养液重悬备用，然后使用AP48-wellBodyenChamber(NeuroScience,USA)进行细胞迁移实验。具体为在下室各加入70ul不同浓度的趋化因子的重组蛋白CXCL8(10ng/ml,100ng/ml,1000ng/ml,10000ng/ml，CXCL8溶解于0.1%BSA配成存储液，使用RPMI-1640完全培养液稀释至所需浓度，实验组)和0.1%BSA(对照组)。每个样品及对照设置三个平行，注意不能产生气泡和样品溢出至其他孔。然后铺上聚碳酸酯膜并在上层小室加入淋巴细胞悬液50ul/孔，置于37℃，5%CO2孵育4h后轻轻拆开Chamber上层小室，用镊子小心揭下趋化小室聚碳酸酯膜，刮去上层沉积的淋巴细胞、PFA室温固定30min、Hoechst33342(1:1000，Thermo,USA)室温避光孵育5min后置于荧光显微镜下检测淋巴细胞的迁移率(图6)。

5.三种抑制剂Reparixin、SB225002、SB265610分别用DMSO溶解为最大储存浓度，用RPMI-1640完全培养液逐级稀释至对应浓度(200nM，20nM，2nM，0.2nM)，取同体积的DMSO同样稀释至上述对应浓度，作为阳性对照组。分离树鼩血总淋巴细胞并计数，用RPMI-1640完全培养液重悬细胞沉淀4000个/100ul。取96孔细胞培养板，每孔加入100ul稀释好的药物和100ul细胞悬液(即最终浓度为100nM，10nM，1nM，0.1nM)混匀，重复三次，于37℃，5%CO2培养箱孵育。阴性对照采用100ul的细胞悬液加100ul的RPMI-1640完全培养液，即不含药物或DMSO。给药当天计为第0天,设置第0，1，3，5，7，9天这6个不同检测时间点，加入20μl/孔MTS(Promega,USA)37℃，5%CO2培养箱孵育4h后，酶标仪(BeckmanDU650,USA)490nm波长检测各样品的OD值，计算各抑制剂对树鼩淋巴细胞存活的影响(图7B、D、F)。

6.采用细胞迁移实验方法，在AP48-wellBodyenChamber的下室各加入100ng/ml人重组蛋白CXCL870μl，上部小室依次加入50ul混合液(药物或DMSO：细胞悬液=1:1)，终浓度为100nM，10nM，1nM，0.1nM，每个样品均做三个平行，检测三种抑制剂对淋巴细胞迁移的影响(图7A、C、E)。

实施例3：树鼩类风湿关节炎模型的建立。

1.挑选体重(130±20)g，4-6月龄的健康雄性树鼩共20只，按体重均等原则平均分组，即10只对照组和10只胶原诱导关节炎组。然后将冻干的II胶原蛋白溶解于0.1mol/L冰乙酸溶液中，浓度为2mg/ml，搅拌4℃过夜。将II胶原溶液与等体积的完全弗氏佐剂CFA于冰浴至完全乳化，用振荡仪涡旋至匀浆。

2.胶原诱导关节炎组树鼩从第一天(标记为day0)，每只树鼩从尾根部注射0.25mlCII/CFA乳化剂，浓度为1mg/ml，对照组为注射同体积的生理盐水，另外在第7天(day7)，每只树鼩采用同样的方法再次免疫注射。注射后，对树鼩关节炎指数进行评分并统计树鼩的体重以排除是树鼩生理状况或其他不利因素引起的干扰(图8)。

3.树鼩关节炎指数的评分：固定人员使用游标卡尺测量树鼩四肢足掌的宽度和厚度，每次测量时间固定于下午13:00至15:00，每隔一天测一次并统计测量结果。按照大小鼠国际公认评分标准对树鼩四肢关节肿胀程度(每周两次)进行评分，即0分：正常；1分：一个足爪肿胀或发红；2分：2个相关关节肿胀或发红；3分：大于2个相关关节肿胀或发红；4分：整个足爪严重炎症；每只树鼩关节炎指数为每只4足爪得分之和，肿胀严重性根据器官充满度的容积改变来测定。并采用组织化学法(图9A)以及影像分析法(图9B)验证树鼩胶原诱导关节炎模型的构建是否成功。

4.选取一只固定的胶原诱导关节炎组树鼩和对照组树鼩抽取心脏外周血700ul，每周检测一次，分别设置第0，7，14，21，28天五个时间点，重复3次，用ELISA试剂盒检测CXCL8浓度的变化情况(图10A)。同样另外选取一只固定的胶原诱导关节炎组树鼩和对照组树鼩取心脏外周血600ul/只，分离得到总淋巴细胞后，使用PE标记的人CXCR1流式抗体检测淋巴细胞CXCR1+的细胞比列(图10B)，同样是每周一次，与CXCL8浓度变化检测在同一天。

实施例4：CXCL8-CXCR1信号通路在治疗树鼩类风湿关节炎研究。

1.将健康雄性树鼩16只随机分成胶原诱导关节炎和胶原诱导关节炎+Reparixin两个组，胶原诱导关节炎组采用实施例3的方法构建树鼩胶原诱导关节炎模型，胶原诱导关节炎+Reparixin组在第二次免疫，即第8天进行再次免疫的同时给予15mg/kg剂量的Reparixin治疗，第11天再次给药一次。

2.同样按照实施例3的方法每组挑取两只固定抽取心脏外周血700ul/只，一只用ELISA试剂盒(EIA-2268，上海艾莱萨生物科技公司)检测MPO活性(图11)，另一只用ELISA试剂盒(EIA-0114，上海艾莱萨生物科技公司)检测CXCL8浓度的变化情况(图12A)，每周检测一次，重复3次。另外每组挑取一只固定用于抽取心脏外周血600ul，分离总淋巴细胞，用于流式细胞术检测CXCR1+细胞的表达率(图12B)，且CXCR1、CXCL8和MPO检测为同一天。

参考文献

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Claims (5)

1.树鼩CXCL8和CXCR1蛋白质，如序列表的表1(CXCL8)和表3(CXCR1)所示，GenBank数据库中的蛋白质登录号分别是AHN49722.1和AIC76461.1。

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因，其特征在于所述基因为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：

(1).如序列表2(CXCL8)和表4(CXCR1)所示，GenBank数据库中的基因登录号为tsCXCL8:KJ126716和tsCXCR1:KJ631621所示的DNA分子；

(2).在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有在治疗类风湿关节炎中应用的蛋白质的DNA分子；

(3).与(1)限定的DNA序列至少具有90%以上同一性且编码具有在治疗类风湿关节炎中应用的蛋白质的DNA分子。

3.如权利要求1所述树鼩CXCL8和CXCR1蛋白质在治疗类风湿关节炎中的应用，其特征在于以权利要求1和2中的基因、蛋白质作为特异的分子作用靶点。

4.如权利要求3所述的树鼩CXCL8和CXCR1蛋白质在治疗类风湿关节炎中的应用，其特征在于与治疗类风湿关节炎相关的树鼩(Tupaiachinensis)胶原诱导关节炎(CIA)疾病模型的应用。

5.如权利要求3所述树鼩CXCL8和CXCR1蛋白质在治疗类风湿关节炎中的应用，其特征在于特异抑制权利要求1和2中的分子作用靶点以减少免疫淋巴细胞向外周关节组织的迁移。