CN115290774B - 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸在制备用于检测肝癌试剂中的应用 - Google Patents

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸在制备用于检测肝癌试剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种尿苷二磷酸葡萄糖醛酸在制备用于检测高转移肝细胞癌样品试剂中的应用。包括以下步骤：S1：测定待检测样品中的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸水平；S2：比较待检样品和质控品中的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸水平，获得作为中间结果的信息；S3：根据比较结果确定待检样品是否有可能是高转移肝细胞癌样品。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸在肝细胞癌转移和预后监测中具有灵敏度高、特异性强的特点。

Description

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸在制备用于检测肝癌试剂中的应用
技术领域
本发明涉及分子检测技术领域，尤其涉及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸在制备用于检测肝癌试剂中的应用。
背景技术
原发性肝癌占我国恶性肿瘤发病率的第四位，致死率高居第二位，严重威胁我国人民的生命和健康。肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)(以下简称肝癌)是最常见的成人肝癌，临床上约占原发性肝癌的75％-85％。肝脏血运丰富，早期转移和术后复发是肝癌预后不良的最主要因素。据统计，肝癌切除术后5年肿瘤复发转移率高达70％。造成肝癌预后不良的根本原因是肝癌早期发病隐匿，缺乏有效的早期诊断方法、精准预测转移的血清标志物以及早期治疗干预手段。
目前甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、甲胎蛋白异质体(Lensculinarisagglutinin-reactive fractionofAFP，AFP-L3)和异常凝血酶原(ProteininducedbyvitaminKabsence/antagonist-Ⅱ,PIVKAⅡ；Des-γ-carboxy-prothrombin,DCP)是临床广泛应用于肝癌筛查的血清学指标，但因其灵敏度不高，对于早期肝癌尤其是小肝癌的诊断效果并不理想。因此，寻找灵敏度高、特异性强的肝癌新型血清学生物标志物，对于提高肝癌早期诊断率和及早预测转移复发具有重要的意义。
尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-glucuronicacid,UDP-GlcUA)是糖醛酸代谢的活性供体，由尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucose,UDP-Glc)经限速酶-尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(UDP-glucosedehydrogenase，UGDH)氧化生成，是糖胺聚糖(如透明质酸、硫酸软骨素、肝素等)和蛋白聚糖(由糖胺聚糖和核心蛋白共价连接组成)等细胞外基质的前体，参与细胞粘附和迁移、生长发育、组织损伤修复及信号转导过程。有研究报道在肺癌伴远处转移组织中尿苷二磷酸葡萄糖的含量降低，其具有抑制肺癌转移的作用。上述研究提示糖醛酸代谢与肿瘤侵袭和转移密切相关，而目前有关尿苷二磷酸葡萄糖醛酸与肝癌转移和预后判断的关系尚未见报道。
发明内容
针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了尿苷二磷酸葡萄糖醛酸在制备用于检测肝癌试剂中的应用，其解决了现有技术中对于肝癌转移复发诊断特异性差、灵敏度低的问题。
本发明一方面，提供尿苷二磷酸葡萄糖醛酸在制备用于检测高转移肝细胞癌样品试剂中的应用。
进一步地，包括以下步骤：
S1：测定待检测样品中的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸水平；
S2：比较待检样品和质控品中的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸水平，获得作为中间结果的信息；
S3：根据比较结果确定待检样品是否有可能是高转移肝细胞癌样品。
进一步地，所述待检样品为血液样品或肝组织样品，优选地，所述肝组织样品为高转移肝组织样品；所述质控品为未转移人肝癌组织样品或未转移人肝癌患者血清样品。
进一步地，步骤S1中，将待检样品溶于甲醇乙腈水溶液中，利用LC-MS方法检测尿苷二磷酸葡萄糖醛酸水平。
进一步地，步骤S3中，如果待检样品中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸水平高于质控品中的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸水平，则确定待检样品为高转移肝细胞癌样品。
本发明另一方面，提供一种肝细胞癌检测试剂盒，包括用于检测尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的试剂。
进一步地，所述试剂包括标准品、稀释液、内标物和质控品，其中，所述标准品为尿苷二磷酸葡萄糖醛酸；所述稀释液为甲醇水溶液；所述内标物为L-2-氯苯丙氨酸；所述质控品为未转移人肝癌组织样品或未转移人肝癌患者血清样品。
进一步地，所述内标物通过甲醇水溶液制备成混合内标液体，其中，所述内标物浓度为5μg/ml，按质量比计，甲醇:水为1:1。
进一步地，所述标准品通过甲醇水溶液制备成标准品母液，其中，所述标准品母液中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的浓度为50μM/L。
本发明再一方面，提供一种肝细胞癌检测试剂盒在检测尿苷二磷酸葡萄糖醛酸中的应用。
本发明的技术原理为：发明人通过考察尿苷二磷酸葡萄糖醛酸在肝癌转移和预后判断中的应用价值，结果发现：代谢酶UGDH在肝癌伴转移组织中呈异常高表达，由此发明人推测其调控的相关代谢物水平可能会发生改变。为验证上述猜测，发明人进一步对肝癌组织样本进行了靶标代谢组学检测，发现UGDH的高表达可导致高转移人肝癌组织和血清样本中代谢物尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcUA)的含量显著增加，并显著促进肝癌细胞侵袭和转移能力，提示尿苷二磷酸葡萄糖醛酸能够用于肝癌转移的监测，具有推向临床诊疗的潜力。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)发明人首次发现在高转移性肝细胞癌患者中，肝细胞癌组织和血液中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的含量明显增加，而其上游代谢物尿苷二磷酸葡萄糖却没有明显的改变，因此发明人将尿苷二磷酸葡萄糖醛酸作为靶点，用于检测高转移性肝细胞癌的试剂，并且在高转移性肝细胞癌转移和预后监测中具有灵敏度高、特异性强的特点。
(2)发明人首次发现尿苷二磷酸葡萄糖醛酸可促进肝癌细胞迁移和侵袭，进一步证实了尿苷二磷酸葡萄糖醛酸可作为靶点，用于制备检测高转移性肝细胞癌试剂。
附图说明
图1为本发明实施例1中人原发性肝癌伴转移组织中UGDH表达的westernblot'图。
图2为本发明实施例1中人肝癌组织芯片中检测UGDH的表达及其与肝癌转移的关系图，其中，A为免疫组化检测人肝癌组织芯片中UGDH的表达，染色强度(Score)为0到3(0，阴性；1，弱染色；2，中度染色；3，强染色)；B为百分比柱状图分析原发性肝癌和伴转移肝癌组织中UGDH的表达与肝癌转移的关系；C为组织化学评分(H-Score)分析UGDH表达与肝癌转移的关系。H-Score＝1×X1+2×X2+3×X3，范围为0-300，其中X表示阳性染色细胞百分数：X3表示强染色，X2表示中等强度染色，X1表示弱染色。
图3为本发明实施例2中靶标代谢组学技术检测UDP-GlcUA的含量，其中，A为人原发性肝癌/伴转移肝癌组织，B为血清样本。
图4为本发明实施例2中靶标代谢组学技术检测UDP-Glc的含量，其中，A为人原发性肝癌/伴转移肝癌组织，B为血清样本。
图5为本发明实施例3中UDP-GlcUA促进肝癌细胞的迁移和侵袭的效果图，其中，A为划痕实验结果图，B为Transwell实验结果图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明中的技术方案进一步说明。
实施例1原发性肝癌伴转移组织中代谢酶UGDH的表达情况
1、样本采集：收集10例原发性肝癌患者的肝癌组织(伴转移肝癌组织)和癌旁组织；样本来自2018-2020年在重庆医科大学附属第二医院住院的原发性肝癌患者。
2、样本处理：采用westernblot方法和免疫组化技术分别检测原发性肝癌组织(伴转移肝癌组织)和癌旁组织中代谢酶UGDH的表达情况。
3、具体步骤：(1)脱蜡与水化：脱蜡前将组织切片放在57℃烤箱中烘烤2h；将切片置二甲苯I液中浸泡20min，转二甲苯II液中浸泡20min；置无水乙醇中浸泡10min，95％乙醇浸泡10min，85％乙醇浸泡5min，75％乙醇浸泡5min；PBS洗2次，5min/次。(2)抗原修复(柠檬酸盐缓冲液)：将组织切片置于含柠檬酸盐缓冲液的抗原修复盒中；微波炉修复加热沸腾后中火维持10min，关火；自然冷却置至室温(约1h)，ddH2O洗两次，PBS洗5min；加0.5％Triton-X-100(溶液配制：10ml消毒PBS+50μlTritonX-100母液)；PBS洗三次，3min/次。(3)免疫组化染色：A：一抗孵育3％H2O2，室温孵育10min；PBS洗3次，3min/次；滴加一滴进口山羊血清工作液室温封闭1h，封闭完弃去，不洗；滴加50μl提前配好的一抗稀释液(GeneTex,GTX104993；1:500)，4℃，湿盒孵育过夜。B：二抗孵育和染色，取出过夜孵育的湿盒，置室温复温20min；PBS洗3次，3min/次，提前将酶标抗鼠/兔聚合物试剂盒取出平衡至室温；每张切片加1滴聚合物增强剂A，室温20min；PBS洗3次，3min/次，除去多余的PBS；滴加酶标抗鼠/兔聚合物(B)，室温30min；PBS洗3次，3min/次(洗最后一次时提前配DAB显色液，溶液配制：950μlA液+50μlB液，DAB液置于1.5mlEP管中用锡箔纸避光保存，13,000g，RT，2min离心以去除杂质)；DAB液显色，避光，显微镜下观察显色程度，避免非特异性染色；苏木素染色5s；自来水冲洗切片2次(反蓝)；1％盐酸酒精分化组织2-3s；立即用自来水终止分化，并用流水冲洗5min；(4)酒精脱水：70％—85％—95％—无水乙醇分别浸泡2min；二甲苯10min，置通风橱风干；中性树脂封片镜检。
4、H-Score评分：根据阳性细胞数百分比和染色强度对组织切片进行评分。H-Score(组织化学评分)＝(1×X1+2×X2+3×X3)×100，数值在0-300之间。染色强度范围为0到3(0,阴性；1,弱染色；2,阳性；3,强染色)；X代表阳性细胞数百分比，X3强阳性，X2中阳性，X1弱阳性。具体参考软件CaseViewer2.2(QuantCenter2.2UserGuide)。
结果图1、2所示。由图1可知，与癌旁组织相比，高转移肝癌组织中糖醛酸途径关键酶UGDH呈高表达，由图2可知，与原发性肝癌组织相比，伴转移肝癌组织中UGDH呈异常高表达，提示UGDH的异常表达与肝癌转移和预后不良密切相关。
实施例2原发性肝癌伴转移组织中代谢酶调控相关代谢物的表达情况
1、样本采集：采用实施例1中的肝癌组织样本和采取实施例1中患者的血液作为血清标本。
2、样本处理：采用靶标代谢组学检测代谢酶调控相关代谢物UDP-GlcUA和UDP-Glc的表达情况。
3、具体步骤：(1)肝组织：将组织匀浆块置于-80℃预冷；2mlEP管中依次加入预冷的钢珠–50mg肝组织–钢珠；向每个样品加入500μl预冷的甲醇:乙腈:水混合物＝2:2:1(含内标L-2-氯苯丙氨酸，5μg/ml)；使用组织研磨仪将组织样本以60Hz频率匀浆2min；匀浆结束后，将样品放回冰上；旋涡样品，4℃，12,000g，离心10min；吸上清至EP管，30℃真空干燥1-2h，加入等体积的甲醇(不含内标)充分混匀代谢物或保存在-80℃，后进行LC-MS分析。
(2)血清：向100μl血清样品中加入400μl预冷的1:1甲醇:乙腈混合物(含内标5μg/ml)；旋涡样品，4℃，12,000g，离心10min；吸上清至新的EP管，30℃真空干燥1-2h，加入等体积的甲醇(不含内标)充分混匀代谢物，进行LC-MS检测分析。
(3)标准品制备：用于质控和绝对定量。标准品稀释液为1:1甲醇:水混合物(含内标5μg/ml)；根据样品含量稀释标准品，确保样品值落在标准曲线内，该方法稀释的标准品可直接上机检测。
结果如图3、图4所示。由结果可知，UGDH的高表达可导致高转移肝癌组织和血清样本中代谢物UDP-GlcUA的异常累积，提示代谢酶异常引起的代谢物异常累积参与肝癌的恶性进程，与肿瘤转移密切相关。而上游代谢物尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)的含量在高转移肝癌组织和血清样本中未见明显变化(图4)。
实施例3UDP-GlcUA促进肝癌细胞迁移和侵袭的体外检测
1、细胞培养：分别培养Huh7、SK-Hep1、SNU449细胞
2、细胞处理：在三种细胞中分别加入浓度为0.1mM/L、0.5mM/L、1mM/L、5mM/L的代谢物UDP-GlcUA处理，采用划痕和Transwell实验检测肝癌细胞的迁移和侵袭能力。
3、具体步骤：将处于对数生长期的人肝癌细胞系Huh7、SK-Hep1、SNU449细胞以70％密度铺6cm培养皿，24h后弃去培养基，加入500μl胰酶，置37℃孵箱中消化1min，待细胞漂浮后，加入1ml培养基终止消化，移入15ml离心管中，室温条件下700rpm/min离心3分钟，弃上清液，细胞沉淀加入2ml正常培养基重悬，取10μl细胞悬液与10μl台酚蓝混匀计数细胞；取96孔板，每孔加入2×104个肝癌细胞(100μl体积)，分为Vehicle组(未加UDP-GlcUA)和UDP-GlcUA组，待细胞长满后，使用ESSENBIOSCIENCE公司划痕器划痕，更换培养基(含1％FBS)，之后UDP-GlcUA组加入不同浓度的UDP-GlcUA处理，将96孔板放入IncucyteZOOM活细胞成像系统，连续培养2天，分别于0h、36h拍照，观察划痕愈合情况。
细胞分组为Vehicle组(未加UDP-GlcUA)和UDP-GlcUA组，将处于对数生长期的人肝癌细胞系Huh7、SK-Hep1、SNU449细胞经胰酶消化、细胞计数，后重悬适量细胞(Huh74×104/小室，SK-Hep1铺2×104/小室，SNU-449铺2×104/小室)于无血清的培养基中(总体积200μl)并加入小室，将小室置于含800μl完全培养基的24孔板中，置于37℃细胞敷箱中继续培养；24小时后取出小室，PBS洗小室2次，置于4％多聚甲醛中固定20min；PBS清洗3次，将小室置于结晶紫(CrystalViolet)溶液中染色5min；PBS清洗后用棉签拭去小室内部未迁移细胞，风干后置于倒置显微镜观察。200倍镜下随机选取5个视野进行计数，每组迁移细胞数为5个视野的平均值。
结果如图5所示。由结果可知：与Vehicle组相比，UDP-GlcUA处理组迁移和侵袭能力显著增强。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.尿苷二磷酸葡萄糖醛酸在制备用于检测肝癌试剂中的应用，所述肝癌为高转移肝细胞癌。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：
S1：测定待检测样品中的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸水平；
S2：比较待检样品和质控品中的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸水平，获得作为中间结果的信息；
S3：根据比较结果确定待检样品是否有可能是高转移肝细胞癌样品。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述待检样品为血液样品或肝组织样品；所述质控品为未转移人肝癌组织样品或未转移人肝癌患者血清样品。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述肝组织样品为高转移肝细胞癌组织样品。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤S1中，将待检样品溶于甲醇乙腈水溶液中，利用LC-MS方法检测尿苷二磷酸葡萄糖醛酸水平。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤S3中，如果待检样品中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸水平高于质控品中的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸水平，则确定待检样品为高转移肝细胞癌样品。
7.一种肝细胞癌检测试剂盒，包括用于检测尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的试剂。
8.如权利要求7所述的一种肝细胞癌检测试剂盒，其特征在于：所述试剂包括标准品、稀释液、内标物和质控品，其中，所述标准品为尿苷二磷酸葡萄糖醛酸；所述稀释液为甲醇水溶液；所述内标物为L-2-氯苯丙氨酸；所述质控品为未转移人肝癌组织样品或未转移人肝癌患者血清样品。
9.如权利要求8所述的一种肝细胞癌检测试剂盒，其特征在于：所述内标物通过甲醇水溶液制备成混合内标液体，其中，所述内标物浓度为5μg/ml，按质量比计，甲醇:水为1:1。
10.如权利要求8所述的一种肝细胞癌检测试剂盒，其特征在于：所述标准品通过甲醇水溶液制备成标准品母液，其中，所述标准品母液中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的浓度为50μM/L。
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