CN101975964A

CN101975964A - 高迁移率族蛋白b1作为电离辐射生物剂量计的应用

Info

Publication number: CN101975964A
Application number: CN 201010259292
Authority: CN
Inventors: 焦旸; 樊赛军
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2010-08-23
Filing date: 2010-08-23
Publication date: 2011-02-16

Abstract

本发明属于电离辐射生物剂量计，具体涉及高迁移率族蛋白B1(High mobility group box 1，HMGB1)作为电离辐射生物剂量计的应用，由于离体细胞辐照后，尤其是血液在辐照后，其中HMGB1含量的增加与受到的电离辐射剂量成正比，存在一定的剂量-效应关系，且于照射后24h即可采用ELISA法等简便易行的方法进行快速检测，因此，HMGB1可作为辐射生物剂量计；并且可以采用HMGB1测量人体和动物受到电离辐射辐照后的生物辐射剂量。

Description

高迁移率族蛋白B1作为电离辐射生物剂量计的应用

技术领域

本发明属于电离辐射生物剂量计，具体涉及高迁移率族蛋白B1(High mobility group box 1，HMGB1)作为电离辐射生物剂量计的应用。

背景技术

核能的和平应用以及放射性核素在医学、工业和农业等各领域的广泛应用给人类带来了巨大的利益。核技术在造福人类的同时，也对公共安全与公众健康构成了潜在的威胁。因此，正确估算辐射事故受照者及肿瘤放疗病人的受照剂量，有利于改进辐射防护措施、指导临床治疗、预测病情发展。多年来辐射生物剂量估算领域已开展了大量工作，虽然已建立了多种辐射生物剂量计，然而在实际应用中均不同程度存在耗时、费力、费用昂贵等问题，仍不十分理想。因此，近来国内外相关实验室进行了一些新生物剂量计的研究，如GADD45(growth arrest and DNA damage gene 45)基因表达测定、线粒体DNA基因突变分析等，迄今这些研究也还处于探索、尝试阶段，因而有必要寻找新型、快速、可靠的电离辐射生物剂量指标。

高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1，HMGB1)是上世纪70年代发现的存在于真核细胞核内的非组蛋白染色体结合蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中迁移速度快而得名。HMGB1普遍存在于哺乳动物组织细胞中，而在胸腺、淋巴组织等组织中呈高表达。以前人们较关注HMGB1的核蛋白功能，1999年Wang等首次报道HMGB1作为新的、潜在的晚期炎症介质参与了脓毒症的发病过程，是内毒素致死效应的晚期重要炎症介质。近年还发现细胞外的HMGB1可通过多种机制促进肿瘤的存活、生长和转移，参与肿瘤的发生和发展。

发明内容

本发明目的是提供高迁移率族蛋白B1(High mobility group box 1，HMGB1)作为电离辐射生物剂量计的应用。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：高迁移率族蛋白B1(High mobility group box 1，HMGB1)作为电离辐射生物剂量计的应用。

一种检测离体细胞所受的辐照剂量的方法，包括以下步骤：

(1)按照常规方法培养离体细胞，将离体细胞置于已知辐射强度的环境中接受辐照，然后在两个以上时间点采集辐射照射后的离体细胞，测定其中的高迁移率族蛋白B1的表达水平，获得该离体细胞的接受的辐照剂量和高迁移率族蛋白B1表达水平的关系的标准曲线；

(2)收集接受了待测剂量的辐射照射的离体细胞，测定其中的高迁移率族蛋白B1的表达水平，根据步骤(1)获得的标准曲线计算得到该离体细胞所受的辐照剂量。

上述技术方案中，所述离体细胞选自：小鼠成纤维细胞、人外周抗凝全血细胞、人宫颈癌细胞-HeLa、乳腺癌细胞-MCF-7、人肺癌细胞-A549或正常人成纤维母细胞株GM细胞以及其它组织器官细胞样品。

上述技术方案中，测定离体细胞中的高迁移率族蛋白B1的表达水平的方法为：采用Western blot方法和HMGB1检测试剂盒测定离体细胞中的HMGB1的蛋白表达水平。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

由于离体细胞辐照后，尤其是血液在辐照后，其中HMGB1含量的增加与受到的电离辐射剂量成正比，存在一定的剂量-效应关系，且于照射后24h即可采用ELISA法等简便易行的方法进行快速检测，因此，HMGB1可作为辐射生物剂量计；并且可以采用HMGB1测量人体和动物受到电离辐射辐照后的生物辐射剂量。

附图说明

图1为实施例一中指数生长的L929细胞经不同剂量的χ-线照射后24小时后完成Western Blot法测定HMGB1蛋白含量；

图2为实施例二中人抗凝外周血经不同量χ射线照射4小时候HMGB1蛋白表达量的变化图；

图3为实施例二中人抗凝外周血经不同量χ射线照射24小时候HMGB1蛋白表达量的变化图；

图4为实施例三中不同剂量⁶⁰Coγ线引起GM细胞中HMGB1释放的剂量-效应曲线。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：

不同剂量电离辐射体外培养的小鼠成纤维细胞培养液中HMGB1蛋白释放的剂量-效应关系

(1)材料：小鼠成纤维细胞株L929购于美国细胞收藏中心(ATCC)，并由本实验室保存和培养；RPMI 1640培养基干粉，小牛血清，胰酶购自Gibco公司；amicon超滤离心管购自美国Millipore公司。标准蛋白质分子量、SDS-PAGE上样缓冲液、RIPA蛋白裂解液、TE电泳缓冲液、10×转膜液、30％Acry-Bis、Tris-Hcl、过硫酸铵(AP)、SDS、四甲基乙二胺(TEMED)购自江苏碧云天生物技术研究所；二甲基亚砜(DMSO)、琼脂糖和Tween-20来自上海高科技生物工程有限公司；抗HMGB1等抗体购自美国Santa Cruzs生物技术公司。人类HMGB1蛋白ELISA检测试剂盒购自上海西悦生物科技有限公司。

(2)细胞培养：L929细胞培养于含10％小牛血清，谷氨酸胺及100万U/L青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基。细胞置于5％CO₂，37℃培养箱内培养，每2-3天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

(3)照射：将步骤(2)所得细胞置于直线加速器下，射线性质为高能6兆伏χ-线，照射野为10cm×10cm，源皮距为100cm，剂量率为200cGy/min。照射时培养皿面上覆盖1.5cm厚等效蜡板以调整照射剂量。

(4)Western Blot法测定小鼠成纤维细胞培养液中HMGB1蛋白的量：收集等量细胞培养液并转至15ml的amicon超滤离心管中离心(4000Rcf/m)20分钟进行样品浓集，采用分光光度计检测样品蛋白含量。各取等量样品加入蛋白上样缓冲液(5×)混匀，于100℃加热5分钟，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至醋酸纤维膜上。膜采用封闭液(5％脱脂奶粉，1×T-BST缓冲液)封闭1小时。T-BST缓冲液洗涤3次，并加入一抗HMGB1(1∶500稀释)，室温孵育1小时。T-BST缓冲液洗膜3次，加入二抗(1∶1000稀释)孵育1小时。T-BST缓冲液洗膜3次，最后加ECL发光剂，显影、定影，胶片洗涤和干燥后，对所得结果进行扫描分析。

结果如图1所示，指数生长的L929细胞经0，3，6Gy的χ-线照射后24小时采用超滤离心法收集细胞培养液上清，采用Western Blot法检测其中HMGB1蛋白的含量，结果显示与未受电离辐射对照组相比，经3Gyχ-线照射后培养液中HMGB1含量增加了11％，6Gyχ-线照射后HMGB1含量增加了37％。实验结果说明电离辐射后体外培养细胞释放至胞外的HMGB1蛋白量随照射剂量的增加相应增加，与照射剂量正相关，呈现出一定的剂量-效应关系。

实施例二

不同剂量电离辐射人外周抗凝全血中HMGB1蛋白释放的剂量-效应关系

(1)人外周血采集，实验用人抗凝外周静脉血来自3例健康献血员，1男2女，年龄为30岁左右，要求：不吸烟，不饮酒，身体健康，无慢性病史，半年内无受照和炎症疾病。每人各采血20ml，分装于6个小瓶，在室温分别接受χ-射线照射0，3，6Gy，照后于37℃静置4h、24h收集血浆样本。

(2)ELISA法测定步骤(1)所得人外周抗凝全血样本中HMGB1蛋白的量：操作步骤参见试剂盒使用说明，主要过程为：各取100μl样品加入酶标板加样孔，混匀后于37℃条件下作用2小时，弃去样品液，充分洗涤4-6次。各孔加入一抗溶液100μl，37℃作用1小时，洗涤加样孔4-6次。加入酶标抗体100μl，37℃作用30分钟，充分洗涤4-6次。各孔加入100μl底物反应液，37℃作用15分钟，加入终止液各100μl，于酶标仪上读取450nm波长吸光值，并对所得结果进行分析。

(3)人抗凝外周血经0，3，6Gyχ-线照射后于37℃静置4小时，离心获取血浆，采用ELISA法测定HMGB1蛋白表达，其结果如图2所示，与未受照射的对照组血液样品相比，经3Gyχ-线照射后4h人抗凝外周静脉血中HMGB1含量已出现不同程度的增加(增幅分别为17.6％，5.4％，10.9％)，6Gyχ-线照射后HMGB1含量增加则更明显(增幅分别为25.2％，63.4％，52.7％)。

人抗凝外周血经0，3，6Gyχ-线照射后于37℃静置24小时，离心获取血浆，采用ELISA法测定HMGB1蛋白表达，其结果如图3所示，χ-线照射后24h人抗凝外周静脉血中HMGB1含量仍检测到不同程度的增加：3Gy照射组增幅分别为23％，7％，1％，6Gy照射组增幅分别为50％，28％，25％。

这些实验结果说明受到的电离辐射后早期即可检测到人抗凝外周静脉血中HMGB1蛋白的释放量的增加，且与照射剂量成正比；随着照射后时间的延长，HMGB1依赖于照射剂量的释放量的增加仍稳定存在；并且上述HMGB1在血液中的含量变化可采用简便易行的ELISA方法进行检测。

实施例三：

(1)GM细胞培养在含10％小牛血清，谷氨酸胺及100万U/L青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基。

(2)采用不同剂量水平的⁶⁰Coγ线照射步骤(1)所得GM细胞培养液，按照实施例二的方法，采用ELISA法检测辐照后细胞培养液中HMGB1蛋白含量的变化：照后24h直接收集细胞培养液上清，按照实施例二的方法，采用ELISA法对其中HMGB1含量进行检测，结果如表1、图4所示。

如表1所示，培养液中HMGB1含量随照射剂量的增加而逐渐增加：与未受照射对照组相比，各照射剂量组HMGB1含量均显著增加(0.5Gy，1Gy，2Gy和4Gy照射组P＜0.05，8Gy照射组P＜0.01)。

表1不同剂量60Coγ线照射后GM细胞培养液中HMGB1蛋白释放量

注：与对照组比较，^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01。

如图4所示，将照射剂量与HMGB1蛋白ELISA测定值拟合剂量-效应曲线方程为：Y＝0.5655+0.0358X，r＝0.9339。其中Y为HMGB1 ELISA测定吸光值的绝对值(＝450nm处OD值平均值-本底OD值)，X为照射剂量(Gy)。

以上实施例中的统计学处理：所有实验均重复3-5次，取平均值，结果用

表示。采用SAS统计软件对相关数据进行t检验，以P＜0.05为有显著性差异。

Claims

1.高迁移率族蛋白B1作为电离辐射生物剂量计的应用。

2.一种检测离体细胞所受的辐照剂量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述检测离体细胞所受的辐照剂量的方法，其特征在于，所述离体细胞选自：小鼠成纤维细胞、人外周抗凝全血细胞、人宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、人肺癌细胞或正常人成纤维母细胞。