CN103267972A - 一种基于血清铁/血清铜的辐射生物剂量估算方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于辐射生物剂量计领域，具体涉及以血清铁和血清铜作为标记物的特征课题估算技术。首先采用2-(5-溴-2-毗啶偶氨)-5-二乙氨基苯酚(5-Br-PADAP)分光光度法分别测量辐照小鼠血清铁和血清铜的浓度，计算出血清铁与血清铜的比值；然后建立血清铁/血清铜与辐照剂量之间的剂量-效应曲线。根据已建立的剂量-效应曲线。本生物剂量估算技术剂量响应范围为0.5～7Gy，操作和指标分析简便，30分钟即可获得受照剂量信息，能够满足生物剂量重建的要求。本发明由于剂量响应好，检测简便和可大批量检测而具备在核辐射事故或职业受照人员的生物剂量估计中广泛使用的前景。

Description

一种基于血清铁/血清铜的辐射生物剂量估算方法

技术领域

本发明属于辐射生物剂量计领域，具体涉及以血清铁和血清铜作为标记物的特征课题估算技术。

背景技术

随着核技术在军事和民用领域的广泛应用，人们对辐射安全越来越重视。生物剂量估算技术是利用生物体内辐射敏感的标志物来刻度生物体受照剂量的方法，它是核事故发生周围人群准确分流的依据，更是疑似被照人群能否获得正确诊断，继而得到及时合理治疗的关键。生物剂量估算因其忠实性，可重复获得和可预测辐射损伤预后的特点而具有物理剂量估算不可替代的优势。经过前人四十多年的不懈努力，研发了基于染色体、基因和蛋白质等不同层面的生物剂量估测技术。其中又以染色体畸变（双着丝粒+着丝粒环）剂量估算技术应用最为普遍。

核辐射事故的偶然性和不可预测性使得其无法及时获得基于物理方法的人员受照剂量信息。在核辐射事故情况下，利用基于染色体畸变的生物剂量估算技术所获得的剂量信息对事故周边地区人员进行分流，并为受照人员临床治疗方案的制定提供依据，也为辐照远期效应评价提供剂量信息。

染色体畸变分析（双着丝粒+着丝粒环）作为生物剂量估计，首先要在离体条件下，采用不同剂量的电离辐射辐照健康人血，根据畸变率与照射剂量的关系制作剂量-效应曲线。

发生事故时，取受照者的血，分离外周血淋巴细胞，在标准条件下进行培养和制片，然后在显微镜下观察染色体的形态和数目，记录双着丝粒和着丝粒环畸变数量，计算畸变率。由0Gy组结果计算出自发畸变率，求出辐射诱导的染色体双着丝粒+着丝粒环的畸变率，根据所得的畸变率，从相应射线所建立的曲线回归方程估算人员所受的剂量。(冯嘉林，卲松生，刘红珍，邹美君，林雅萍.应用染色体畸变估算一例事故受照者受到的生物剂量.核技术，1990,13（4）：254-256.)

染色体畸变分析的特异性较强、本底值较低、影响因素较少且经济、准确，是生物剂量估算技术中的“金标准”。但采用染色体畸变作为生物剂量估算方法也有一定的缺陷。染色体畸变是细胞分裂中期才能观察到的指标，这就使得染色体畸变剂量效应曲线能估计的辐照剂量上限值较低（γ射线5Gy）。其原因在于在高剂量全身照射情况下，外周血淋巴细胞急剧减少或分裂能力受抑制不能到达分裂中期；或者即使到达有丝分裂中期，细胞还有发生死亡或凋亡的可能。此外，染色体畸变分析方法操作繁琐，通常需要2～3天左右才能获得剂量信息，这些缺点使得染色体畸变分析方法无法满足核辐射事故发生时需要大批量检测并及时获得剂量信息从而对大批人员进行分流和治疗的要求。最后，染色体畸变分析对于实验技术人员的分析能力要求较高。这些缺陷限制了染色体畸变剂量估算技术的广泛应用。

发明内容

本发明针对现有的生物剂量估算技术剂量响应范围窄、操作繁琐、实验时间长和对实验技术人员要求高等问题，发展基于血清铁/血清铜这一剂量响应范围宽、快速、操作简便的生物剂量估算技术。本发明采用的技术方案是：

本技术以γ射线辐照小鼠的血清铁和血清铜浓度比值作为生物剂量计估算小鼠的γ射线受照剂量。首先采用2-(5-溴-2-毗啶偶氨)-5-二乙氨基苯酚(5-Br-PADAP)分光光度法分别测量辐照小鼠血清铁和血清铜的浓度，计算出血清铁与血清铜的比值；然后建立血清铁/血清铜与辐照剂量之间的剂量-效应曲线。根据已建立的剂量-效应曲线，采用“双盲法”估算未知剂量辐照小鼠的受照剂量。

一种基于血清铁/血清铜的辐射生物剂量估算方法，包括如下步骤：

S1：使用不同剂量水平的γ射线对小鼠进行照射，作为辐照小鼠；

S2：对辐照小鼠取血，测定辐照小鼠的血清铁和血清铜的浓度，计算血清铁与血清铜的浓度比值，作为效应值；

S3：根据效应值与γ射线照射剂量进行拟合，得到照射剂量和效应值之间的关系曲线；

S4：对待测小鼠取血，测定血清铁和血清铜的浓度，通过所述的关系曲线计算出γ射线照射量。

本方法的原理是：生物体中可利用的铁元素价态为二价和三价，其中可吸收和生物利用的铁元素为二价，通过血液转运至生物利用部位过程中铁元素价态则被氧化为三价，通常称为血清铁。血清铜占生物体内铜元素含量的90%，它作为铜蓝蛋白的活性部位参与铜蓝蛋白的活性调节，其价态为二价。电离辐射作用于生物体可产生大量的自由基（羟基自由基、氢自由基以及水合电子等等），这些自由基作用于血清中铁、铜元素，通过得失电子的过程使这些元素的价态发生改变。其价态改变的结果为血清铁随着照射量的增大而增大、血清铜随着照射量的增大而减小。除了自由基的作用之外，铜蓝蛋白的氧化作用也可以使血清中三价铁增多，而作为铜蓝蛋白的金属活性中心的二价铜离子则被还原为一价，因而血清铁和血清铜的含量变化存在一定的关系。由于在现实状态下由于血清铁或血清铜变化的影响因素较多，这些影响因素主要为贫血、肿瘤形成、饮食、铁，铜代谢失调和女性怀孕及经期等多个方面，而血清铁/血清铜更能全面的反映辐照条件下自由基对血清中铁和铜元素价态的作用情况，因此我们采用血清铁/血清铜这个比值来刻度生物体的受照剂量，以提高生物剂量刻度的准确性。

步骤S1中，采用不同剂量的γ射线对小鼠进行照射后，小鼠体内的血清铁和血清铜的浓度会发生变化，γ射线的照射剂量可以根据实际情况进行选取，用于适应所要测量的范围或者使拟合计算时测定结果误差最小。

步骤S2中，通过常规方法对血清铁和血清铜的浓度进行测定，可以采用现有技术中准确性、重复性、检测限都较好的测定方法进行检测，最好采用2-(5-溴-2-毗啶偶氨)-5-二乙氨基苯酚(5-Br-PADAP)分光光度法进行检测。

具体的说，对血清铁的检测方法是：

以盐酸羟胺作还原剂，以2-(5-溴-2-毗啶偶氨)-5-二乙氨基苯酚(5-Br-PADAP)为显色剂，使用紫外分光光度计读取待测样品吸光度，根据公式，血清铁浓度=待测样品吸光度/铁标准溶液吸光度×铁标准溶液浓度，计算出血清铁浓度；

具体地说，对血清铜的检测方法是：

使用5-Br-PADAP为显色剂，使用紫外分光光度计读取待测样品吸光度，根据血清铜浓度=待测样品吸光度/铜标准溶液吸光度×铜标准溶液浓度，计算出血清铜浓度；

步骤S3中，可以采用常见的拟合函数进行，目的是使拟合结果的偏差较小，最好是采用二次多项式拟合。

步骤S4中，将需要检测的受到γ射线照射后的小鼠进行血清铁和血清铜浓度的检测，代入上述的拟合公式中，即可估算得到待测小鼠的受辐射的剂量。

技术效果

相较于染色体畸变剂量估算方法的不足（对高剂量响应不佳、对技术和技术人员要求高、操作繁琐、耗时），本技术剂量响应范围宽，为0.5～7Gy，对高剂量（7Gy）亦能够比较准确地估算出生物的受照剂量；同时大大节省了估算时间，染色体畸变剂量估算2天左右可获得受照剂量信息，而本技术30分钟内即可得到估算结果，这就为事故周边人员在短时间内获得准确分流提供了可能，也可为需要进行医疗干预的受照人员赢得了宝贵的治疗时间；不仅如此，本技术操作方法十分简单、方便，对技术人员要求不高，普通工作人员经过学习培训即可操作。

基因层面的生物剂量估算技术（如DNA损伤、基因表达异常和体细胞基因突变等）对实验要求条件的高要求以及其剂量相应范围狭窄、受年龄等因素影响较大。而本技术在普通实验条件下即可进行，剂量响应范围宽，且由于本技术综合了血清铁、血清铜两个指标的变化因素，估算结果受到其他因素影响的变化不大。

最新研发的一些基于电子自旋共振谱仪的牙齿、头发生物剂量估算技术，由于电子自选共振谱仪价格昂贵，难于得到推广应用。相反地，本技术所用的测试试剂普通、价廉，操作简便，还可在自动及半自动生化仪上进行大批量检测，具备可实际应用于辐射事故大批量人群分流的可能。

附图说明

图1是不同剂量γ射线辐照小鼠的血清铁紫外吸收光谱（538nm）；

图2是不同剂量γ射线辐照小鼠的血清铜紫外吸收光谱（625nm）；

图3是小鼠血清铁与血清铜的比值和γ射线辐照剂量之间的线性平方关系；

图4是小鼠血清铁和γ射线辐照剂量之间的线性关系；

图5是小鼠血清铜和γ射线辐照剂量之间的线性关系。

具体实施方式

基于小鼠血清铁/血清铜的γ射线生物剂量估算方法

1、小鼠辐照：

雄性昆明小鼠（18～22g）60只，每组10只，分别以0，0.5，1，3，5和7Gy(单位：戈瑞)的钴60γ射线进行辐照。以Famar绝对剂量仪进行辐照剂量校正。

2、辐照小鼠血清样本制备：

a)麻醉：小鼠腹腔注射1%（40mg/kg）浓度的戊巴比妥钠；

b)眼球摘除法取血：食指和拇指固定住小鼠头部，用镊子摘取小鼠眼球，使用经过10%HCl溶液浸泡、蒸馏水充分淋洗过的一次性EP管收集外周血；

c)静置：收集好的外周血室温下静置30min；

d)离心：30min静置后，将EP管置于水平离心机中离心（3000rpm）15min，收集血清；将收集的血清再次离心后待测。

3、辐照小鼠血清铁测定：

每组取5只小鼠检测血清铁。

血清铁检测方法：

以盐酸羟胺作还原剂，以2-(5-溴-2-毗啶偶氨)-5-二乙氨基苯酚(5-Br-PADAP)为显色剂，使用紫外分光光度计在538nm处读取待测样品吸光度，根据血清铁（μmol／L）=待测样品吸光度/铁标准溶液吸光度×17.9的公式计算出血清铁浓度。

其中重要的溶液配制：

a)铁标准溶液（17.9μmol／L）；

b)醋酸-醋酸钠缓冲液（0.25mol/L，pH4.6）：取醋酸钠5.4g，加水50ml使溶解，用冰醋酸调节pH值至4.6，再加水稀释至100ml；

c)还原剂:硫脲0.5g溶于100ml醋酸-醋酸钠缓冲液（0.25mol/L，pH4.6）后；加入0.4ml聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100），继续加入盐酸羟胺13.3g，直至完全溶解；

d)显色剂:5-Br-PADAP0.1g溶于100ml无水乙醇，取该液5ml和0.5ml TritonX-100，加水定容至100ml。

操作步骤：

a)测定管（U）、标准管（S）、空白管（B）分别加血清、铁标准溶液（17.9μmol/L）、去离子水0.2mL；

b)各管均加还原剂1.0mL，混匀置37℃水浴10min；

c)各加显色剂0.8mL，混匀静置8min；

d)使用紫外分光光度计在538nm处以空白管调零，读取各管吸光度（图1）；

e)计算血清铁浓度：血清铁（μmol／L）=待测样品吸光度/铁标准溶液吸光度×17.9（表1）。

4、辐照小鼠血清铜测定：

每组取5只小鼠检测血清铜

血清铜检测方法：

同样使用5-Br-PADAP为显色剂,使用紫外分光光度计在625nm处读取待测样品吸光度，根据血清铜（μmol／L）=待测样品吸光度/铜标准溶液吸光度×15.74公式计算出血清铜的浓度。

其中重要的溶液配制：

a)铜标准溶液（15.74μmol／L）；

b)醋酸-醋酸钠缓冲液（0.5mol/L，pH4.0）；取醋酸钠10.8g，加水50ml使溶解，用冰醋酸调节pH值至4.0，再加水稀释至100ml；

c)显色剂5-Br-PADAP0.1g溶于100ml无水乙醇，取该液5ml、TritonX-1000.5ml，加水定容至100ml；

操作步骤：

a)测定管（U）、标准管（S）、空白管（B）分别加血清、铜标准溶液（15.74μmol/L）、去离子水0.3mL；

b)各管均加双氧水0.1mL，醋酸-醋酸钠缓冲液2.0mL，静置5min；

c)各加显色剂1.0mL，混匀置37℃水浴10min；

d)使用紫外分光光度计在625nm处以空白管调零，读取各管吸光度(图2)；

e)血清铜浓度：血清铜（μmol／L）=待测样品吸光度/铜标准溶液吸光度×15.74（表1）。

5、血清铁与血清铜比值：

辐照小鼠血清铁、血清铜的浓度及其浓度比值见表1.

表1.不同剂量γ射线辐照小鼠的血清铁、血清铜浓度及其比值

备注：浓度单位为微摩尔/升。

6、剂量效应曲线的建立：

我们将血清铁/血清铜与辐照剂量采用二次多项式进行数学拟合，建立相应的剂量效应关系（图3），其相关系数R平方是0.96。而分别单独对血清铁和血清铜进行线性拟合后，相关系数R平方分别是0.94和0.93，可以看出。采用血清铁/血清铜作为剂量效应关系的相关系数明显高于血清铁或血清铜的辐照剂量效应关系的相关系数（图4，图5）。

7、辐照小鼠生物剂量重建：

根据所建立的小鼠血清铁/血清铜和γ射线辐照剂量之间的线性平方关系，采用双盲法估计未知剂量的γ射线辐照小鼠的受照剂量。

所谓“双盲法”即小鼠的辐照和样品的血清铁和血清铜检测及其比值计算由不同的实验人员完成，实验人员只了解自己负责的实验内容，不允许了解其它部分实验的具体内容。估算剂量的实验步骤是首先一名实验人员进行小鼠的辐照实验，然后另一实验人员检测辐照小鼠的血清铁和血清铜浓度，并计算出其比值。根据血清铁/血清铜的剂量效应关系，估算辐照小鼠的受照剂量。

表2为根据血清铁/血清铜剂量效应关系对4只“双盲”辐照小鼠的剂量重建。

表2.基于血清铁/血清铜剂量效应关系的γ射线辐照小鼠剂量重建

结论：基于血清铁/血清铜剂量效应关系的辐照小鼠生物剂量估算与“双盲”剂量接近，血清铁/血清铜可用于辐照小鼠的生物剂量估算，此种生物剂量的剂量估算范围宽，剂量估算精度高（95%可信限窄），操作简便，获得剂量信息所用时间短，成本低，可大批量检测，适用于辐射事故发生后短时间内大批人群的分流和为受照人员提供准确的剂量信息，从而制定相应的治疗计划。

Claims (7)

1.一种基于血清铁/血清铜的辐射生物剂量估算方法，包括如下步骤：

S1：使用不同剂量水平的γ射线对小鼠进行照射，作为辐照小鼠；

S2：对辐照小鼠取血，测定辐照小鼠的血清铁和血清铜的浓度，计算血清铁与血清铜的浓度比值，作为效应值；

S3：根据效应值与γ射线照射剂量进行拟合，得到照射剂量和效应值之间的关系曲线；

S4：对待测小鼠取血，测定血清铁和血清铜的浓度，通过所述的关系曲线计算出γ射线照射量。

2.根据权利要求1所述的基于血清铁/血清铜的辐射生物剂量估算方法，其特征在于：所述的步骤S2中，通过2-(5-溴-2-毗啶偶氨)-5-二乙氨基苯酚分光光度法对血清铁和血清铜的浓度进行检测。

3.根据权利要求2所述的基于血清铁/血清铜的辐射生物剂量估算方法，其特征在于，所述的2-(5-溴-2-毗啶偶氨)-5-二乙氨基苯酚分光光度法对血清铁的浓度进行检测的步骤是：以盐酸羟胺作还原剂，以2-(5-溴-2-毗啶偶氨)-5-二乙氨基苯酚为显色剂，使用紫外分光光度计读取待测样品吸光度，根据血清铁浓度=待测样品吸光度/铁标准溶液吸光度×铁标准溶液浓度，计算出血清铁浓度。

4.根据权利要求3所述的基于血清铁/血清铜的辐射生物剂量估算方法，其特征在于：紫外分光光度计在538nm波长处进行检测；所述的铁标准溶液的浓度是17.9μmol/L。

5.根据权利要求2所述的基于血清铁/血清铜的辐射生物剂量估算方法，其特征在于，使用2-(5-溴-2-毗啶偶氨)-5-二乙氨基苯酚为显色剂，使用紫外分光光度计读取待测样品吸光度，根据血清铜浓度=待测样品吸光度/铜标准溶液吸光度×铜标准溶液浓度，计算出血清铜浓度。

6.根据权利要求5所述的基于血清铁/血清铜的辐射生物剂量估算方法，其特征在于：紫外分光光度计在625nm波长处进行检测；所述的铁标准溶液的浓度是15.74μmol/L。

7.根据权利要求1所述的基于血清铁/血清铜的辐射生物剂量估算方法，其特征在于：所述的步骤S3中，是通过二次多项式函数对血清铁/血清铜和γ射线照射剂量进行拟合。

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