CN102071184A - 牛虻抗血栓酶tablysin及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种牛虻抗血栓酶tablysin及其基因和应用，属于生物医学领域。本发明利用生物化学方法分离到天然的抗血栓酶，并扩增到其编码基因，并利用大肠杆菌表达体系获得了与天然蛋白活性相当的基因工程产物。本发明的牛虻蛋白酶tablysin，是从牛虻唾液腺中分离得到的一种活性蛋白质，分子量27KDa，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。本发明的牛虻蛋白酶tablysin基因由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列组成。本发明的牛虻蛋白酶tablysin能水解纤维蛋白原和抑制血小板聚集，能抑制抑制角叉菜胶诱导的鼠尾静脉血栓形成，且无出血活性，能作为制备治疗血栓性疾病药物的应用。

Description

牛虻抗血栓酶tablysin及其基因和应用

技术领域：

本发明提供一种牛虻抗血栓酶tablysin及其基因和应用，属于生物医学技术领域。

背景技术：

血栓栓塞性疾病严重影响人类的健康，是导致死亡率最高的病因之一。在过去的几十年中，已经开发的抗栓药物主要包括溶栓药、抗凝药和抗血小板药。但是许多抗血栓药物经常被包括低血压、出血等系统性的副作用所限制，因此，需要开发新型的更具潜力和特异性的抗血栓药物。

中医药研究表明，许多来源于动植物的天然组分具有确切的抗血栓作用，《本草纲目》、《金匮要略》等古籍医书就记载有许多活血化瘀的药方。中药是祖国医药学的重要组成部分，其功效已为几千年的历史和现代临床疗效所肯定。虻科昆虫俗称牛虻(horsefly)，隶属于节肢动物门双翅目短角亚目虻科，是重要的医学和兽医学昆虫。其成虫是一种中药材，俗称虻虫，具有活血化瘀，破积通经的功效，其药用历史悠久，能为开发现代新药提供靶标和启示。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种牛虻抗血栓酶及其基因和应用。

本发明的技术方案包括牛虻抗血栓酶tablysin的制备和氨基酸序列测定，牛虻抗血栓酶tablysin基因的克隆，Tablysin的体外重组表达和牛虻抗血栓酶tablysin的药理实验四部分内容。

牛虻抗血栓酶tablysin是我们首次从牛虻唾液腺中分离得到的一种活性蛋白质，分子量约27KDa。其全序列一级结构为(氨基酸序列为SEQ ID NO：1)：MTSIPVSSFSLATLVLQYATIDAVDYCRLPCRGNNYHVGCREPAYAQECGQSPRTRELLKEHRNEILSKIIDVRDHVAKGSWALPVAAGMKVVVWDAELAGLAKRHTKACVGETLECRNTERLFAPGYLNFKYSGDKLPRIMELIDAAVKKGHLQRHNITREIIESYRDNGPDGTVKELALAISERVTAVGCGLTTWQDGAKARALLTCNFSSQNTRGRPVYKVGNSPGDFCIEKDETYTNLCSATEPIDPNKSN

牛虻抗血栓酶tablysin基因的克隆包括：牛虻唾液腺总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选编码基因。基因测序结果表明编码唾液腺牛虻抗血栓酶tablysin基因由768个核苷酸(SEQ ID NO：2)组成，自5’端至3’端序列为：

atgacttccataccggtgtccagcttttcacttgcgaccttagtactacaatacgcaact   60

atcgacgcagttgactactgtagattaccttgtcgagggaataattaccatgtggggtgt  120

cgtgagccagcgtatgcccaggaatgtggccaaagtccaagaactcgcgagttattgaag  180

gagcatagaaatgagatattgtcgaagataatcgatgtgcgagatcatgtggccaaggga  240

tcatgggcactaccagtggcagccggaatgaaagttgttgtatgggatgcggagctcgct  300

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gcaaaggctcgcgcacttcttacgtgtaacttctcctcgcagaacactcggggtcgtcct 660

gtctacaaagtcggcaatagtcctggcgatttttgcatcgagaaggatgaaacgtataca  720

aacttgtgctctgctactgaacctatcgaccctaataaatctaactag              768

本发明的天然来源和重组表达的牛虻抗血栓酶tablysin具有显著的水解纤维蛋白原和抑制血小板聚集的作用，并且能明显抑制角叉菜胶诱导的鼠尾静脉血栓的形成。能作为制备治疗血栓性疾病药物的被应用。

附图说明：

图1为牛虻唾液腺匀浆物(SGE)的Sephadex G-75凝胶过滤层析，其中：图中箭头所示为活性峰。

图2为牛虻唾液腺匀浆物(SGE)的Sephadex G-75凝胶过滤层析后得到的蛋白活性峰进一步过FPLC Resource S离子交换层析，最后得到纯化的目的蛋白，其中：图中箭头所示为纯化的目的蛋白。

图3为纯化的天然目的蛋白的还原和非还原SDS-PAGE电泳图

图4为本发明中天然蛋白的水解纤维蛋白原作用SDS-PAGE分析图。

图5为本发明中重组蛋白的水解纤维蛋白原作用SDS-PAGE分析图。

图6为tablysin对ADP诱导的人血小板聚集的影响。

图7为tablysin对角叉菜胶诱导的鼠尾血栓形成的影响。

具体实施方式：

实施例一：牛虻抗血栓酶tablysin的制备和氨基酸序列测定

一、牛虻唾液腺的解剖，匀浆与处理

牛虻(中国陕西省，学名Tabanusyao Macquart))解剖的方法如下：用小剪刀将虫体沿背中线剪开，放入预冷的生理盐水(含0.9％NaCl的缓冲液)中浸泡3-5min，用镊子挑出唾液腺，放入pH7.2的Tris-HCl缓冲液中，-20℃保存。所有牛虻样品解剖完毕后用玻璃匀浆器在冰上充分匀浆后，10000rpm离心10min，将上清低温冷冻干燥后-20℃保存。

二、牛虻抗血栓酶tablysin的分离纯化

以上述收集的冻干粉为原料，按照下述程序纯化Tablysin，分离纯化的每一个步骤都进行水解纤维蛋白原活性跟踪检测，具体检测方法见下述。

A.Sephadex G-75凝胶过滤层析。牛虻唾液腺匀浆液冻干粉溶解于pH 7.2，含有0.1mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液，12000rpm离心10min，上样于Sephadex G-75(GE Health产品)凝胶过滤柱(1000mm×26mm)，用相同缓冲液洗脱，自动部分收集器收集，流速为3.0ml/10min，如图1所示。

B.FPLC Resource S离子交换层析。Sephadex G-75凝胶过滤得到的活性峰，冻干溶解于双蒸水，于pH 8.3的20mmol/L Tris-HCl缓冲液透析12hr；上样于Resource S柱(GE Health产品)，该步操作在

Purifier系统中进行，

用一个0-0.5mol/L NaCl的线性梯度进行洗脱，得到纯化的牛虻抗血栓酶，命名为tablysin。如图2、图3所示

C.牛虻抗血栓酶tablysin的氨基酸序列测定：取经FPLC分离后的牛虻抗血栓酶tablysin跑SDS-PAGE，用考马斯亮蓝R-250染色，切割蛋白条带进行Q-TOF质谱测序(军事医学科学院国家生物医学分析中心)。获取了其中3个肽链的氨基酸序列。肽段1：YSGDKLPR；肽段2：VVVWDAELAGLAK；肽段3：ALLTCNFS SQNTR。

实施例二：牛虻抗血栓酶tablysin基因的克隆

一、牛虻唾液腺总RNA提取

A.活体解剖牛虻(出自中国陕西省，学名T.yao Macquart)，取约1mg唾液腺组织，加入已预冷的1mLTrizol提取缓冲液(美国Invitrogen公司产品)，置于冰上匀浆15分钟。

B.加入Trizol 1/5体积的氯仿，剧烈混匀约15秒，室温放置5分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，取上清。

C.上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为牛虻唾液腺总RNA。

二、牛虻唾液腺mRNA的纯化

牛虻唾液腺mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的

mRNAIsolation Systems试剂盒。

A.取牛虻唾液腺总RNA 500μg溶于500μLDEPC水中，65℃水浴10分钟，加人3μL的Oligo(dT)探针和13μL 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。

B.磁珠(SA-PMP)的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC 300μL，至磁力架吸附30秒，最后加100μL 0.5×SSC悬浮，称之为B液。

C.将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加100μL DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入150μL DEPC水重悬，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，即为纯化的牛虻唾液腺mRNA。

D.加入1/10体积的pH5.2，3M的乙酸钠溶液，等体积异丙醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μL DEPC水中。

三、牛虻唾液腺cDNA文库构建

采用CLONTECH公司Creator^TM  SMART^TM cDNA Library Construction Kit构建牛虻唾液腺cDNA文库。

A.cDNA第一链合成

于无菌PCR管加入2μl姚虻唾液腺mRNA、1μl SMART IV引物、1μl CDS III/3’PCR引物、1μl RNA-free水，使总体积达到5μl，混匀并短暂离心。

1.72℃保温2min，冰上孵育2min。

2.在上述PCR管中加入2μl 5×第一链buffer、1μl 20mmol/L DTT、1μl 10mmol/L dNTP混合物、1μl PowerScript逆转录酶，混匀并短暂离心。

3.置于PCR仪中42℃保温1hr后，冰浴终止第一链的合成。

B.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增cDNA第二链

1.将1μl cDNA第一链、40μl去离子水、5μl10×Advantage 2PCR缓冲液、1μl 50×dNTP混合物、1μl 5’PCR引物、1μl CDS III/3’PCR引物以及1μl聚合酶于PCR管中混匀。

2.在PCR仪中按以下程序扩增：95℃，20sec；22个循环：95℃，5sec；68℃，6min。

3.扩增结束后，将合成的双链cDNA置于-70℃保存。

C.酶切、连接以及连接产物的转化：

1.在微量离心管中加入1μLpMD19-T载体(购自日本Takara公司)、4μL牛虻唾液腺cDNA双链溶液，全量为5μL。

2.加入5μL(等量)的连接酶缓冲混合物。

3.16℃反应2小时。

4.全量(10μL)加入至100μLDH5α感受态细胞(购自北京天根生化科技有限公司)中，冰浴30分钟。

5.42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。

6.加入37℃温浴过的LB培养基900μL，37℃缓慢振荡培养60分钟。

7.取200μL涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上37℃培养16小时，形成单菌落。

8.每个LB平皿用5mL LB液体培养基洗涤菌落，加30％甘油冻存。构建的cDNA大约含2×10⁶个单独克隆。

四、牛虻抗血栓酶tablysin基因序列扩增和测定：

根据实施例一中分离纯化所得牛虻抗栓酶tablysin的氨基酸序列和双翅目昆虫密码子的偏嗜性，我们设计了一条简并引物NT3-R，与构建牛虻唾液腺cDNA文库时所使用的接头引物5’primer配对，正反向引物序列为：

5’primer：5’-aag cag tgg tat caa cgc aga gt-3’

NT3-R：5’-cgg(t/c)ag ctt gtc(g/c)cc gga gta-3’

其中，括号内的两个碱基表示简并引物。

以NT3-R和5’primer为引物，以牛虻唾液腺cDNA为模板，进行PCR。其反应条件为：95℃预变性4min，接着在如下条件进行35轮循环，94℃30sec，55℃30sec，72℃40sec，然后72℃10min。PCR产物经序列测定，筛选到插入了包括信号肽编码基因在内的tablysin的编码序列的上游部分。

再根据上述获得的核苷酸序列设计正向信号肽引物NT3-F，与所构建的cDNA文库使用的3’端保守引物CDSIII-primer配对，正反向引物序列分别为：

NT3-F：5’-atg act tcc ata ccg gtg tcc agc-3’；

CDSIII-primer：5’-att cta gag gcc gag gcg gcc atg-3’

以NT3-F和CDSIII-primer为引物，以构建的牛虻唾液腺cDNA为模板，进行PCR。其反应条件为：95℃预变性4min，接着在如下条件进行35轮循环，94℃30sec，58℃30sec，72℃40sec，然后72℃10min。PCR产物经序列测定，获得的核苷酸序列翻译后能与实施例一中获得的3段氨基酸序列完全匹配，由此筛选到了编码tablysin的完整cDNA序列，结果表明编码tablysin的cDNA序列由768个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为：

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其中，加框的部分是能与分离纯化获得的tablysin进行氨基酸测序获得的序列相匹配的序列。

实施例三：Tablysin的体外重组表达

A.重组质粒pET-Tablysin的构建

第一步：用带酶切位点的引物对目的基因进行基因扩增

利用含有BamHI酶切位点和保护碱基的引物NT3BD-F：

5’-TAGGATCCGTT AACTACTGTAGATTACCCTGCCG-3’和含有HindIII酶切位点和保护碱基的引物NT3BD-R：5’-GGAAGCTTAGTTAGATTTATTAGGGTCGATAG G-3’扩增，PCR反应条件为：95℃预变性4min，接着在如下条件进行30轮循环，94℃30sec，57℃30sec，72℃60sec。然后72℃10min。

将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带，利用凝胶DNA回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司)回收目的基因。

第二步：质粒DNA的制备

挑取含有pET-32a⁺质粒的DH1α单菌落(美国Novagen公司)，接种于含有氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)的LB培养基中，37℃培养过夜。用质粒DNA小量提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取质粒DNA并测定其核酸序列，确认该序列与唾液腺牛虻抗血栓酶tablysin基因序列(SEQ IDNO：2)一致。

第三步：双酶切质粒DNA和目的基因

在37℃同时双酶切(BamHI和HindIII，Takara)pET-32a⁺质粒和带上酶切位点的目的基因，双酶切体系为20μl。酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切取目的条带，利用凝胶DNA回收试剂盒(北京百泰克生物科技有限公司)回收双酶切产物，置-20℃保存备用。

第四步：酶切产物的连接

将回收到的双酶切产物线性pET-32a⁺质粒和目的基因T4DNA连接酶(T4DNA Ligase，Takara)作用下连接，16℃连接过夜。

B.重组质粒的转化

将连接产物转化至用CaCl₂-MgCl₂法制备的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，取适量转化产物涂布至含100μg/ml Amp的LB培养基平板上，经37℃培养16hr，用PCR检测，将阳性克隆送生物公司进行测序并确认包含有唾液腺牛虻抗血栓酶tablysin基因序列(SEQ ID NO：2)，且含有接头和重组的肠激酶酶切位点序列。

C.重组蛋白诱导表达

挑取重组阳性克隆接种至含有100μg/ml Amp的液体LB培养基，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100接种至1000ml新鲜LB培养基中，37℃振荡培养约3hr，使OD₆₀₀达到0.6，加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，28℃继续培养诱导3hr。

D.重组表达产物(rTablysin，recombinated Tablysin)的分离纯化

第一步：含rTablysin的His-Tag融合蛋白分离

每升诱导产物于8000rpm，离心10min收获菌体。将菌体用100mlBinding Buffer(pH 8.0，0.1mol/L PBS)重悬后，超声裂解(超3sec，停3sec，共10min)，5000g离心10min，弃上清，将收集到的诱导沉淀物重悬于Binding Buffer中(每升发酵产物加50ml Binding Buffer)，超声、离心同前。超声裂解沉淀用含有6mol/L尿素的Binding Buffer重悬，冰浴60min，4℃，16000rpm离心30min，经0.45μm滤膜过滤，上样于已经用变性Binding Buffer平衡好的His Bind Resin(Merck)亲和层析柱，收集His-Tag融合蛋白。

第二步：包涵体的复性

用梯度稀释的方法对包涵体进行复性，透析缓冲液依次为含6mol/L尿素的20mmol/L的Tris-HCl，pH 6.0；含4mol/L尿素的20mmol/L的Tris-HCl，pH 6.5；含3mol/L尿素的20mmol/L的Tris-HCl，pH 6.8；含2mol/L尿素的20mmol/L的Tris-HCl，pH 7.2；含1mol/L尿素的20mmol/L的Tris-HCl，pH 7.4；不含尿素的20mmol/L的Tris-HCl，pH7.4，每次透析约换两次缓冲液，每次时间间隔约5hr。

第三步：肠激酶切割释放rTablysin

酶切在pH7.4的20mmol/L的Tris-HCL缓冲液中进行。肠激酶和目标蛋白的比例为1∶250(w/w)，23℃孵育8hr。

第四步：rTablysin的分离纯化

将酶切产物于20mmol/L Tris-HCl pH 8.3缓冲液透析12hr后，上样于FPLC Resource S柱，用0-0.5mol/L NaCl的线性梯度进行洗脱，除去肠激酶和融合蛋白，获得重组表达的rTablysin，并检测其具有水解纤维蛋白原的活性。

实施例四：牛虻抗血栓酶tablysin的药理实验

取分离纯化获得的牛虻抗血栓酶tablysin(下称样品)进行如下药理活性检测。

一、纤维蛋白原水解活性检测

取10μL浓度为2mg/mL的纤维蛋白原(购自美国Sigma公司，溶于含有150mM NaCl的50mM Tris-HCl，pH7.4缓冲液)与样品于37℃保温24hr后，进行12％SDS-PAGE还原电泳分析，如图4、5所示。实验结果发现此酶能明显地水解纤维蛋白原的α-链，而对β-链的水解活性低，不能水解γ链。

二、血小板聚集抑制实验

富血浆小板聚集(PRP)抑制实验：健康人血小板用血浆稀释至2.5×10⁸个/mL。取富血浆血小板300μL，加入适量样品保温5min后，添加ADP诱导聚集，记录5min血小板聚集情况。

聚集抑制率(I)的计算：

I＝B/A×100％

A＝激动剂所能达到的最大聚集(本文为透光率，％)；

B＝样品作用后加入激动剂所能达到的最大聚集。

结果表明，Tablysin能够明显的抑制ADP诱导的血小板聚集，且抑制率随抑制剂浓度的增大而升高(如图6所示)。

三、出血活性检测

将样品溶解到生理盐水中，使其浓度为0.6mg/mL。取30μL对昆明小鼠(体重18-22g，昆明医学院实验动物中心提供)进行皮下注射，24小时后，剥离小鼠皮肤，观察内皮出血斑的大小。以生理盐水做对照。结果表明高达18μg/只的剂量的Tablysin都不引起小鼠皮下出血。

四、动物模型抗血栓功能检测

角叉菜胶致鼠尾血栓模型来检测牛虻抗栓酶tablysin的抗血栓功能。取30只昆明种雄性小鼠(体重18-22g，昆明医学院实验动物中心提供)随机分成3组(n＝10)，第1组为生理盐水对照组，第2、3组分别给予300μg/kg和500μg/kg样品，处理30min后，以300μg/kg的剂量从小鼠腹腔注射角叉菜胶(Carrageenan，typeI，Sigma，用生理盐水溶解为0.2％的浓度)。根据尾部皮肤颜色变化来判定血栓形成的出现率和平均长度。结果表明，tablysin可以明显抑制所选用动物模型中鼠尾血栓形成(如图7所示)。

牛虻抗血栓酶的药理实验表明：牛虻抗血栓酶tablysin具有显著的水解纤维蛋白原和抑制血小板聚集的作用，并能明显地抑制角叉菜胶诱导的小鼠尾静脉血栓的形成。牛虻抗血栓酶tablysin能作为制备治疗血栓性疾病药物的被应用。

Claims (3)

1.牛虻蛋白酶tablysin，其特征在于是从牛虻唾液腺中分离得到的一种活性蛋白质，分子量27KDa，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。

2.牛虻蛋白酶tablysin基因，其特征在于该基因由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列组成。

3.权利要求1所述牛虻蛋白酶tablysin的应用，其特征在于牛虻蛋白酶tablysin能水解纤维蛋白原和抑制血小板聚集，能抑制抑制角叉菜胶诱导的鼠尾静脉血栓形成，且无出血活性，能作为制备治疗血栓性疾病药物的应用。

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