CN109134638A - 一种屋尘螨过敏原Der p 22基因重组蛋白及其应用 - Google Patents

一种屋尘螨过敏原Der p 22基因重组蛋白及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109134638A
CN109134638A CN201811178358.8A CN201811178358A CN109134638A CN 109134638 A CN109134638 A CN 109134638A CN 201811178358 A CN201811178358 A CN 201811178358A CN 109134638 A CN109134638 A CN 109134638A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
recombinant protein
dust mite
house dust
der
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811178358.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109134638B (zh
Inventor
崔玉宝
郁志伟
钱俊
杜晓燕
陈越新
吴国荣
周鹰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuxi Peoples Hospital
Original Assignee
Wuxi Peoples Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuxi Peoples Hospital filed Critical Wuxi Peoples Hospital
Priority to CN201811178358.8A priority Critical patent/CN109134638B/zh
Publication of CN109134638A publication Critical patent/CN109134638A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109134638B publication Critical patent/CN109134638B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
    • C07K14/43531—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种屋尘螨过敏原Der p 22基因重组蛋白及其应用。本发明屋尘螨过敏原Der p 22基因如SEQ ID NO：2所示，该重组蛋白由屋尘螨过敏原Der p 22基因经表达、纯化后得到，序列如SEQ ID NO：1所示。该重组蛋白用于制备精准医学检测屋尘螨引起的过敏性疾病的诊断试剂或生物制品方面。本发明首次发现屋尘螨Der p 22基因序列全长，并通过基因克隆、表达、纯化获得其重组蛋白，该重组蛋白用于Western blotting实验精准医学检测16例屋尘螨引起的过敏性哮喘患儿，阳性率93.75％，而对照组无阳性。

Description

一种屋尘螨过敏原Der p 22基因重组蛋白及其应用
技术领域
本发明属于变态反应学领域，尤其涉及一种屋尘螨过敏原Der p 22基因重组蛋白及其在制备精准医学检测屋尘螨引起的过敏性疾病的诊断试剂或生物制品方面的应用。
背景技术
尘螨(house dust mites)指孳生于居室地毯、床、纺织品和家具等处积尘中的螨类，文献报道多达100种以上。世界卫生组织(World Health Organization,WHO)和国际免疫学会联盟(International Union of Immunological Societies，IUIS)授权的过敏原命名委员会网站(http://www.allergen.org/)已公布了粗脚粉螨(Acarus siro)、热带无爪螨(Blomia tropicalis)、粉尘螨(Dermatophagoides farinae)、微角尘螨(Dermatophagoides microceras)、屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)、梅氏嗜霉螨(Euroglyphus maynei)、家食甜螨(Glycyphagus domesticus)、害嗜鳞螨(Lepidoglyphus destructor)、腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae)。因此，引起过敏反应的螨种很多。
2006年2月至2007年3月，采用皮肤点刺试验对我国西部、东部、西南和南部沿海17座城市6304例哮喘或/和鼻炎门诊患者的大规模调查表明，粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)阳性率为59.0％、屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)阳性率为57.6％。说明粉尘螨和屋尘螨是中国大陆重要的致敏螨种，排第1、2位。
每种螨均可以产生上千种蛋白，有的是过敏原，有的不是。能够引起尘螨过敏性疾病患者机体内产生特异性IgE抗体、并与过敏性疾病患者血清在体内发生结合的螨虫成份称为过敏原组分(Groups)。迄今，临床诊断均采用粉尘螨和/或屋尘螨粗提物为抗原建立免疫学检验方法。由于螨体粗提物中含有多种过敏原组分，同一组分在不同批次产品中含量不一致，很难实现产品的标准化。因此，了解每种螨的过敏原组分，制备过敏原单组分生物制品，基于单组分建立检验方法，精准检测过敏性疾病患者是因某种组分或是某些组分致敏，为临床制订精准脱敏治疗方案提供依据。
因此，系统地鉴定、表征屋尘螨和粉尘螨过敏原组分，对这两种螨的临床应用具有重要的价值。国际过敏原命名委员会已经命名了粉尘螨过敏原第22组分Der f 22，但是没有公布屋尘螨第22组分Der p 22及其编码基因。粉尘螨过敏原却无法替代屋尘螨过敏原，这是因为：即便只是相差1个氨基酸也会引起临床误诊，不同物种之间具有相似序列的蛋白质更是如此。
发明内容
本发明的目的在于提供一种屋尘螨过敏原第22组分Der p 22基因重组蛋白，用于精准医学检测屋尘螨引起的过敏性疾病的诊断试剂或生物制品方面的应用，旨在解决现有尘螨引起的过敏性疾病无法得到精准医学检测的问题。。
本发明是这样实现的，一种屋尘螨过敏原Der p 22基因重组蛋白，该蛋白序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明进一步公开了上述屋尘螨过敏原Der p 22基因重组蛋白在精准医学检测屋尘螨引起过敏性疾病的诊断试剂或生物制品方面的应用。
优选地，所述诊断试剂或生物制品为屋尘螨过敏原Der p 22基因经表达、纯化后的重组蛋白，或者所述诊断试剂或生物制品包括屋尘螨过敏原Der p 22基因经表达、纯化后的重组蛋白。
本发明提供一种屋尘螨过敏原Der p 22基因重组蛋白及其应用。本发明通过转录组测序后，进行序列比对，得到一个片段与粉尘螨第22组分Der f22高度同源的序列，将该片段扩出来，然后通过cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)获得编码基因全长，然后进行基因克隆表达纯化，将纯化的蛋白质与屋尘螨过敏患者血清进行Western blotting，发现该基因编码的蛋白质具有高度的活性，并最终确定该序列为屋尘螨过敏原第22组分编码基因，如SEQ ID NO：2所示，通过该基因克隆到Der p 22基因重组蛋白，如SEQ ID NO：1所示。
相比现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明首次发现屋尘螨Der p 22基因序列全长，并通过基因克隆、表达、纯化获得其重组蛋白，该重组蛋白用于Western blotting实验精准医学检测16例屋尘螨引起的过敏性哮喘患儿，阳性率93.75％，而对照组无阳性。
附图说明
图1是屋尘螨Total RNA电泳图(1％琼脂糖)；其中，泳道M1为DL2,000DNA Marker，泳道1为CTG575Total RNA；
图2是Der p 22全长基因克隆PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道M1为DL2,000DNA Marker，泳道1为CTG0578的PCR产物；
图3是质粒pET28(a)经BamH I/Not I双酶切电泳图；其中，泳道M2为λ-Hind Ⅲdigest(Code No.3403)，泳道1为pET28(a)质粒，泳道2为pET28(a)-BamHI/NotI；
图4是Der p 22活性部分PCR扩增结果；其中，泳道M1为DL2,000DNA Marker，泳道1为PCR产物；
图5是空质粒pET28a经BamH I/Not I双酶切的电泳图；其中，泳道M1为λ-Hind IIIdigest，泳道1为pET28a-BamH I/Not I，泳道M2为DL2,000DNA Marker；
图6是SDS-PAGE鉴定pET-28a(+)-Der p 22活性部位在大肠杆菌中表达情况；其中，泳道M1为Protein MW marker(Broad)，泳道1为pET-28a(+)全细胞，泳道2为pET-28a(+)上清，泳道3为pET-28a(+)沉淀，泳道4为质粒pET-28a(+)-Der p 22转化大肠杆菌后诱导表达的全细胞，泳道5为为质粒pET-28a(+)-Der p 22转化大肠杆菌后诱导表达的上清，泳道6为为质粒pET-28a(+)-Der p 22转化大肠杆菌后诱导表达的沉淀；
图7是SDS-PAGE鉴定pET-28a(+)-Der p 22活性部位在大肠杆菌中大量表达情况；其中，泳道M为Protein MW marker(Broad)，泳道1为pET28a(+)全细胞，泳道2为pET28a(+)上清，泳道3为pET28a(+)沉淀，泳道4为质粒pET-28a(+)-Der p 22转化大肠杆菌后诱导表达的全细胞，泳道5为质粒pET-28a(+)-Der p 22转化大肠杆菌后诱导表达的上清，泳道6为质粒pET-28a(+)-Der p 22转化大肠杆菌后诱导表达的沉淀，泳道7为BSA(200ng)，泳道8为BSA(500ng)，泳道9为BSA(1000ng)，泳道10为BSA(1500ng)，泳道11为BSA(2000ng)；
图8是Western Blotting鉴定重组蛋白rDer p 22；其中，Penta-His Antibody为一抗，HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG为二抗；泳道M1为Precision Plus ProteinStandards，泳道1为2μL重组蛋白上样，泳道M2为Perfectprotein marker；
图9是应用重组蛋白rDer p 22建立Western-blotting检测屋尘螨过敏性哮喘患儿血清IgE阳性反应率；其中，泳道1～16为屋尘螨过敏性哮喘/鼻炎患儿，泳道17～20为健康正常人。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、Total RNA提取和消化
使用RNAiso Plus(Code No.9108)进行屋尘螨的Total RNA(编号为CTG575)提取，取1μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。使用Recombinant DNase I(RNase Free)(Code No.2270A)对屋尘螨Total RNA进行DNaseI消化。
二、目的基因获取
1、引物设计与合成
名称 序列(5'-3') 长度(mers)
F1 AAACCAGATCAAGTGGCAATCAATC 25
F2 GGCAATCAATCCATCCTGGTACAC 24
R1 TTTTTTTGATCAGAAAGAAAGGGG 24
三、目的基因获取
1、反转录
使用TaKaRa PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Code No.RR014A)合成cDNA，同时设立正负对照。1μL Total RNA、1μL Random 6mers(20μM)、1μL Oligo dT Primer(2.5μM)、1μLdNTP Mixture(10mM each)，加RNase Free dH2O至10μL。反应条件：65℃置5min，然后冰上静置2min。
然后加入下列组分：4μL 5×PrimeScript RT Buffer、0.5μL RNase Inhibitor(40U/μL)、0.5μL PrimeScript RTase(for 2Step)，总反应体积20μL。反应条件：30℃10min、45℃30min、70℃15min。
2、第1次PCR扩增
以上述反转录的cDNA为模板，使用TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase(CodeNo.R060A)进行PCR扩增，分别以F1/R1为引物。
反应体系：1μL反转录cDNA、25μL 2×Gflex PCR Buffer(Mg2+，dNTP plus)、1μLTksGflex DNA Polymerase(1.25units/ul)、1μL Primer*1(20μM)(F1)、1μL Primer*2(20uM)(R1))、21dH2O，总反应体积50μL。反应条件：94℃1min，然后置98℃10sec、55℃15sec、68℃60sec进行35个循环。
3、第2次PCR扩增
以第1次PCR产物扩增为模板，使用TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase(CodeNo.R060A)进行PCR扩增，分别以F2/R1为引物进行第2次PCR扩增。
反应体系：1μL反转录cDNA、25μL 2×Gflex PCR Buffer(Mg2+，dNTP plus)、1μLTksGflex DNA Polymerase(1.25units/μL)、1μLPrimer*1(20μM)(F2)、1μL Primer*2(20μM)(R1)、21μL dH2O，总反应体积50μL。反应条件：94℃1min，然后置98℃10sec、55℃15sec、68℃60sec进行30个循环。
4、PCR产物纯化
使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(CodeNo.9762)分别切胶回收PCR产物约0.5kbp的目的扩增产物条带。
5、测序分析
上述PCR扩增产物使用引物F2、R1进行测序，测序结果与参考序列比对多出65bp的碱基，并有一处碱基差异。将目的基因Der p 22(414bp)分别In-Fusion克隆至pET-28a(+)载体质粒中。
四、全长基因克隆
PCR扩增目的基因(Der p 22，414bp)，分别In-Fusion克隆至pET-28a(+)质粒中，分别提取2个质粒测序。
1、引物设计与合成
2、PCR扩增
使用TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase(Code No.R060A)进行PCR扩增。反应体系：1μL上述PCR产物、25μL 2×Gflex PCR Buffer(Mg2+，dNTP plus)、1μL Tks Gflex DNAPolymerase(1.25units/μL)、1μLPrimer*1(20μM)(InF)、1μL Primer*2(20μM)(InR)、21μLdH2O，总反应体积50μL。反应条件：94℃1min，然后置98℃10sec、55℃15sec、68℃60sec进行35个循环。取5μLPCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。
3、PCR产物纯化
使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(CodeNo.9762)分别切胶回收PCR产物约0.4kbp的扩增产物条带，为目的基因。
4、载体制备
将质粒pET28a(+)使用BamH I/Not I进行酶切。反应体系：10μL pET28a(+)(50ng/μL)、5μL 10×Quick Cut Buffer、1μL BamH I(10U/μL)、1μL Not I(10U/μl)，加dH2O至50μL。反应条件：37℃2小时。取10μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。使用TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(Code No.9762)切胶回收约5.3kbp的DNA片段，命名为Vector DNA。
5、In-Fusion克隆、转化、阳性克隆筛选及质粒测序
使用HD Cloning Kit(Clontech Code No.639650)，分别将目的基因与Vector DNA连接。反应体系如下：3μL Vector DNA(约50ng/μL)、3μL CTG0578-Insert(约50ng/μL)、2μL 5×In-Fusion HD Enzyme Premix，加dH2O至10μL。反应条件：50℃15min。
分别取上述In-Fusion连接产物各2.5μL热转化至E.coli Competent CellsJM109(Code No.9052)中，涂布平板，37℃过夜培养。挑选阳性菌落植菌，分别提取质粒命名为CTG0578-3、4；使用引物T7(T7序列为“5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3”)。对质粒进行测序，序列测通。测序结果与PCR产物测序均一致。
五、去信号肽后进行基因克隆
以上述质粒为模板，PCR扩增Der p 22基因序列333bp(不含信号肽序列)，两端添加BamH I/Not I酶切位点，In-Fusion克隆至pET28a(+)载体中。
1、目的基因DNA的制备
1.1、引物设计和合成
1.2、PCR扩增
使用HS(Premix)(Code No.R040)扩增。
反应体系：1μL Der p 22全长基因(50倍稀释)、0.5μL F01(20pmol/μL)、0.5μLR01(20pmol/μL)、25μL PrimeSTAR HS(Premix)，加dH2O至50μL。反应条件：置98℃10sec、55℃15sec、72℃2min进行30个循环，然后置72℃延伸2min。取5μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示。
1.3、目的片段回收
使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(CodeNo.9762)切胶回收约333bp目的片段，命名为Insert DNA。
1.4、Vector DNA的制备
酶切反应反应体系：3μL pET28a(+)、5μL 10×QuickCut Buffer、2μL BamH I(15U/μL)、2μL Not I(10U/μL)，加dH2O至50μL。反应条件：37℃4h。取5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果见图5所示。
2.2、载体回收
使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(CodeNo.9762)切胶回收约5.3kbp的载体片段，命名为Vector DNA。
3、克隆测序
使用HD Cloning Kit(Clontech Code No.639633)，将Insert DNA与CTC0418 Vector DNA连接。
连接反应体系：1μL Vector DNA(约50ng/μL)、1μL Insert DNA(约80ng/μL)、2μL5×In-Fusion HD Enzyme Premix，加dH2O至10μL。反应条件：50℃15min。
将连接产物取1μL热转化至E.coli Competent Cell JM109(Code No.9052)中，涂布平板，37℃过夜培养。挑取阳性克隆，提取质粒。使用引物T7对质粒进行测序。
六、去信号肽后进行基因表达
将质粒转入Rosetta2(DE3)pLysS感受态细胞中,对阳性克隆进行诱导表达，同时进行pET-28a(+)空载体对照。
1、转化
取质粒1μL转入Competent cellRosetta2(DE3)pLysS中；使用LB抗生素Kana(50μg/mL)+Cm(34μg/mL)平板，50μL转化液涂布，37℃O/N培养。pET-28a(+)进行同样操作。
2、种培养
2.1、种培养
挑取单菌落分别至2mL LB/Kana(50μg/mL)+Cm(34μg/mL)培养基中，37℃O/N培养。
2.2、主培养诱导
在Glass tube中添加5mL LB/Kana(50ug/mL)+Cm(34μg/mL)培养基，添加种培养菌液100μL。37℃培养至OD600nm值约为0.6。添加150mM IPTG 34μL(final 1mM IPTG)进行诱导，37℃培养4小时。吸光度测定值：pET-28a(+)诱导前吸光度值为0.60，集菌前吸光度值为1.55；pET-28a(+)-Der p 22转化大肠杆菌诱导前吸光度值为0.60，集菌前吸光度值为1.75。
2.3、蛋白质抽提
集菌后2.0OD相当的菌体加入320μL PBS悬浊后进行超声波破碎，对菌体破碎液进行离心分离(12,000xrpm、5min)。
2.4、抽提液电泳
取各抽提液(全蛋白、上清、沉淀)8μL(0.05OD相当)，加入2μL 4×SDS LoadingBuffer，95℃加热10分钟，进行SDS-PAGE电泳。电泳条件；(c.c.)25mA/枚、约65分。使用gel；15％polyacrylamide gel，电泳结束后，CBB-R250染色，使用脱色液脱色。SDS-PAGE/CBB染色结果如图6所示。
七、去信号肽后目的蛋白大量培养
使用质粒pET-28a(+)-Der p 22甘油菌保进行500mL培养，以从菌体中进行目的蛋白纯化。
1、种培养
将甘油菌保样品分别取50μL植入10mL LB/Kana(50μg/mL)+Cm(34μg/mL)培养基中，37℃O/N培养。
2、主培养及诱导
将10mL种培养菌液植入500mL LB/2L Flask中，37℃、200rpm培养至OD600≈0.6时，添加100mM IPTG 5mL(final 1mM IPTG)进行诱导，继续培养4小时。培养后离心，收集菌体。使用PBS清洗菌体后离心，称量菌体湿重。吸光度测定值：诱导前吸光度值为0.60，集菌前吸光度值为2.4，菌体湿重1.39g。
3、SDS-PAGE电泳
3.1、蛋白质抽提
取2.0OD相当的菌体加入320uL PBS悬浊后进行超声波破碎，对菌体破碎液进行离心分离(12,000×rpm、5min)。
3.2、抽提液电泳
取各抽提液(全蛋白、上清、沉淀)8μL(0.05OD相当)，加入2μL 5×SDS LoadingBuffer，95℃加热10分钟，进行SDS-PAGE电泳。
电泳条件；(c.c.)25mA/枚、约80分，使用gel；12.5％polyacrylamide gel，电泳结束后，CBB-R250染色，使用脱色液脱色。SDS-PAGE/CBB染色结果如图7所示。
八、去信号肽后目的蛋白纯化(EXP0337)
1、缓冲液配制
BufferA pH8.0(4℃)：50mM Sodium phosphate(pH8.0)、300mMNaCl、5mMImidazole。
Sonication buffer/Wash buffer/4M Urea Buffer A：4M Urea、50mM Sodiumphosphate(pH8.0)、300mM NaCl、5mM Imidazole。
4M Urea Buffer B pH8.0(4℃)：4M Urea、50mM Sodium phosphate(pH8.0)、300mM NaCl、300mM Imidazole。
透析Buffer：TaKaRa PBS(Code No.T900)、1M Urea。
2、菌体破碎
(1)培养后菌体湿重1.39g
(2)加入Buffer A 28mL。
(3)4℃充分悬浊，Sonication 180w，10min，破碎液8mL。
(4)S18,000rpm，30min，4℃离心，得到上清28mL，沉淀0.59g。
(5)使用40mL 4M Urea Buffer A重新悬浊S1沉淀，得到40mL。
(6)S28,000rpm，30min，4℃离心，得到上清40mL，沉淀0.39g。
(7)S3使用0.45um 1000mL Vacuum filter/Storage bottle system进行过滤，得到样品40mL。
3、柱层析纯化
(1)使用GE HiTrap TALON crude，5mL TALON Superflow(Code No.28-9537-66)柱层析操作；
(2)树脂的平衡化
使用10倍柱体积的灭菌MilliQ H2O 50mL和10倍柱体积的4M Urea BufferA 50mL平衡树脂，流速1mL/min；
(3)上样
4M Urea Buffer A平衡化后上样，流速0.5mL/min；
(4)树脂wash及蛋白溶出
①树脂wash
蛋白吸附后，使用20倍柱体积的4M Urea Buffer A 100mL清洗树脂。
流速2mL/min，W1:30mL、W2:30mL、W3:40mL；
②蛋白溶出
Elution:4M Urea Buffer A:50mL、4M Urea Buffer B:50mL梯度溶出，流速2mL/min，Fraction 1.1mL/tube×90tubes。
4、各阶段SDS-PAGE电泳及AKTA出峰图
纯化各阶段SDS-PAGE电泳，全细胞W、上清S、不溶性沉淀P 0.05OD600电泳；原液1μL电泳；BSA标准品：500ng上样。protein marker：Broad Weight Marker TaKaRa Code：3452Q，5μL/well。电泳胶：12.5％SDS PAGE/考马斯亮蓝染色液染。
5、收集
收集目的蛋白Fraction No.43～58共计约17mL。
6、透析
使用透析Buffer进行透析，反复进行3次，透析后样品23.4mL。
·透析Buffer：1M Urea PBS；
·置换率：1：1000；
透析膜：SnakeSkin Dialysis Tubing 10000MWCO(Cat No.68035LotNo.MH160055)；
电泳胶：12.5％SDS PAGE/考马斯亮蓝染色液染色；
取透析后样品进行SDS-PAGE电泳。
使用ImageMaster 1D version 3.0解析soft对浓缩后样品进行定量分析：
7、Western Blotting
将PVDF膜、滤纸分别剪切成与凝胶相同大小，使用转膜缓冲液处理后，按滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸的顺序依次放在转膜仪电极板之间，开始转膜，设置转膜仪参数如下：
EXP0337
电流(mA) 25
转印时间(min) 80
将PVDF膜置于含1.5％BSA的10mL Blocking buffer中，37℃平放1小时。使用稀释后的Penta-His Antibody溶液5mL，进行一次抗体反应1小时。TBST缓冲液(20mL)洗涤2次；洗涤TBS缓冲液冲洗3次。使用稀释后的HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG抗体溶液5mL，进行二次抗体反应1小时。TBST缓冲液(20mL)洗涤2次；洗涤TBS缓冲液冲洗3次。1mL TrueBluePeroxidase Substrate显色1min。显色后PVDF膜、对照如图8所示。
九、Western blotting检测纯化后的重组蛋白与血清特异性结合
获得重组蛋白，即屋尘螨过敏原单组分，目的是为了用于临床诊断屋尘螨过敏。于是，本申请进一步建立了Western blotting方法，用获得的重组蛋白检测屋尘螨过敏。
1、Western blotting样品电泳对照
取纯化后的蛋白样品约1μg，加入PBS Buffer将体积补足至16μL，加入4μL 4×SDSLoading Buffer，95℃加热10分钟，进行SDS-PAGE电泳。电泳条件；(c.c.)25mA/枚、约70分；使用gel；12.5％polyacrylamide gel；SDS-PAGE电泳结束后，CBB-R250染色，使用脱色液脱色。
2、Western Blotting
将PVDF膜、滤纸分别剪切成与凝胶相同大小，使用转膜缓冲液处理后，按滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸的顺序依次放在转膜仪电极板之间，设置转膜仪参数如下：电流42mA，转印时间70min。将PVDF膜置于含1.5％BSA的12mL Blocking buffer中，37℃平放1小时封闭。使用1:10稀释后的血清溶液6mL，进行一次抗体反应1小时。TBST缓冲液(25mL)洗涤1次；洗涤TBS缓冲液冲洗2次。使用1：4000稀释后的Ms mAb to Hu IgE(HRP)抗体溶液6mL，进行二次抗体反应1小时。TBST缓冲液(25mL)洗涤1次；洗涤TBS缓冲液冲洗2次。1mL TrueBluePeroxidase Substrate显色1min。显色后PVDF膜如图9和表1所示。该重组蛋白阳性率为93.75％(15/16)。
表1应用重组蛋白rDer p 22检测屋尘螨过敏性哮喘患儿血清IgE阳性反应率
注：a01-16为屋尘螨过敏性哮喘/鼻炎患儿，UniCAP检测对尘螨过敏；b01-04为健康正常人，UniCAP检测其对尘螨不过敏；“+”对重组蛋白rDer p 22阳性，“—”对重组蛋白rDer p 22阴性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 无锡市人民医院
<120> 一种屋尘螨过敏原Der p 22基因重组蛋白及其应用
<141> 2018-09-30
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 137
<212> PRT
<213> Dermatophagoides pteronyssinus
<400> 1
Met Phe Cys Phe Leu Lys Met Asn Gln His Thr Ala Cys Leu Ala Leu
1 5 10 15
Phe Cys Leu Ile Met Met Val Ala Val Gln Ala Asn Asp Glu Thr Asn
20 25 30
Val Gln Tyr Lys Asp Cys Gly His Asn Glu Ile Lys Ser Leu Tyr Leu
35 40 45
Ser Gly Cys Asn Val His Gln Lys Ser Cys Ile Leu His Arg His Asn
50 55 60
Lys Asn Gln Leu Arg Leu Gly Phe Val Ala Asn Glu Asn Thr Gly Lys
65 70 75 80
Thr Ile Lys Thr Arg Phe Ile Cys Asn Leu Ala Gly Leu Glu Val Gly
85 90 95
Trp Pro Gly Ile Asp Gly Thr Asp Ala Cys Gln Gly His Gly Leu Ser
100 105 110
Cys Pro Leu Thr Lys Gly Gln Ser Tyr Asn Tyr Asn Leu Asp Phe Ser
115 120 125
Leu Gly Asp Asp Val Pro Leu Val Ser
130 135
<210> 2
<211> 428
<212> DNA
<213> Dermatophagoides pteronyssinus
<400> 2
ggatccatgt tttgcttttt gaaaatgaat caacacaccg cttgtctagc tttgttctgt 60
ttgatcatga tggtggcagt gcaggctaat gacgaaacca atgtccagta taaagattgt 120
ggccataatg aaatcaaatc gctatatcta agtggatgta atgttcacca aaaatcctgc 180
atccttcacc gacataacaa aaatcaattg cgactcggtt ttgtggccaa cgaaaacact 240
ggcaaaacga ttaaaacacg ttttatttgc aatctggccg gtttggaagt tggctggcct 300
ggcatcgacg gtactgatgc ttgccaagga catggtcttt catgtccgct taccaaaggc 360
caatcatata actataatct ggatttcagt ttgggcgatg acgttccatt ggtaagttaa 420
gcggccgc 428
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
aaaccagatc aagtggcaat caatc 25
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ggcaatcaat ccatcctggt acac 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
tttttttgat cagaaagaaa gggg 24
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
aatgggtcgc ggatccatgt tttgcttttt gaaaatg 37
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tgctcgagtg cggccgctta acttaccaat ggaacgtc 38
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
aatgggtcgc ggatccaatg acgaaaccaa tgtcca 36
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
tgctcgagtg cggccgctta acttaccaat ggaacgt 37

Claims (3)

1.一种屋尘螨过敏原Derp 22基因重组蛋白，其特征在于，该蛋白序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述的屋尘螨过敏原Derp 22基因重组蛋白在制备精准医学检测屋尘螨引起的过敏性疾病的诊断试剂或生物制品方面的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述诊断试剂或生物制品为屋尘螨过敏原Derp 22基因经表达、纯化后的重组蛋白，或者所述诊断试剂或生物制品包括屋尘螨过敏原Derp 22基因经表达、纯化后的重组蛋白。
CN201811178358.8A 2018-10-10 2018-10-10 一种屋尘螨过敏原Der p 22基因重组蛋白及其应用 Active CN109134638B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811178358.8A CN109134638B (zh) 2018-10-10 2018-10-10 一种屋尘螨过敏原Der p 22基因重组蛋白及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811178358.8A CN109134638B (zh) 2018-10-10 2018-10-10 一种屋尘螨过敏原Der p 22基因重组蛋白及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109134638A true CN109134638A (zh) 2019-01-04
CN109134638B CN109134638B (zh) 2021-08-13

Family

ID=64811265

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811178358.8A Active CN109134638B (zh) 2018-10-10 2018-10-10 一种屋尘螨过敏原Der p 22基因重组蛋白及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109134638B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109970854A (zh) * 2019-04-09 2019-07-05 江苏省农业科学院 杂交瘤细胞株AntiTput-13及其分泌的AntiTput-DP10单克隆抗体
CN112225816A (zh) * 2020-09-30 2021-01-15 四川携光生物技术有限公司 一种新型的吸入性过敏原融合蛋白及其构建方法、应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104894089A (zh) * 2015-03-27 2015-09-09 深圳大学 尘螨变应原及其应用
WO2018121637A1 (zh) * 2016-12-31 2018-07-05 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 一种重组户尘螨1类变应原蛋白及其制备方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104894089A (zh) * 2015-03-27 2015-09-09 深圳大学 尘螨变应原及其应用
WO2018121637A1 (zh) * 2016-12-31 2018-07-05 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 一种重组户尘螨1类变应原蛋白及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK: AUX14775.1: "Der f 22-like protein [Dermatophagoides pteronyssinus]", 《NCBI-NUCLEOTIDE》 *
KAVITA REGINALD ET AL.: "Characterization of Der f 22 - a paralogue of the major allergen Der f 2", 《SCI REP》 *
VÉRONIQUE BORDAS-LE FLOCH ET AL.: "A combined transcriptome and proteome analysis extends the allergome of house dust mite Dermatophagoides species", 《PLOS ONE》 *
XIAO-YU LIU ET AL.: "High-quality assembly of Dermatophagoides pteronyssinus genome and transcriptome reveals a wide range of novel allergens", 《J ALLERGY CLIN IMMUNOL》 *
YUBAO CUI ET AL.: "Consideration of methods for identifying mite allergens", 《CLIN TRANSL ALLERGY》 *
YU-BAO CUI ET AL.: "Expression, cloning, and IgE-binding of the full-length dust mite allergen Der f 8", 《IMMUNOL RES》 *
周鹰 等: "粉尘螨变应原第10组分基因克隆表达及生物信息学分析", 《中国免疫学杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109970854A (zh) * 2019-04-09 2019-07-05 江苏省农业科学院 杂交瘤细胞株AntiTput-13及其分泌的AntiTput-DP10单克隆抗体
CN112225816A (zh) * 2020-09-30 2021-01-15 四川携光生物技术有限公司 一种新型的吸入性过敏原融合蛋白及其构建方法、应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN109134638B (zh) 2021-08-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dowell et al. α-Conotoxin PIA is selective for α6 subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors
AU624077B2 (en) Cloning of mite allergens
Riek et al. The HET-S/s prion motif in the control of programmed cell death
JPH08504179A (ja) Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ（室内塵ダニ）アレルゲンのクローニング及び配列決定
HU220462B1 (hu) A Dermatophagoides nemzetség allergénjéből származó peptidek, ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények és eljárás házi poratka-érzékenység kimutatására
CN109134638A (zh) 一种屋尘螨过敏原Der p 22基因重组蛋白及其应用
Mora et al. Cloning and expression of Blo t 1, a novel allergen from the dust mite Blomia tropicalis, homologous to cysteine proteases
CN109627344A (zh) cAMP荧光探针及其应用
CN101935354A (zh) 人心肌肌钙蛋白t/人心肌肌钙蛋白i融合蛋白
Takai et al. Determination of the N-and C-terminal sequences required to bind human IgE of the major house dust mite allergen Der f 2 and epitope mapping for monoclonal antibodies
CN106350522A (zh) 腐食酪螨新发现过敏原基因克隆表达纯化及其应用
Caraballo et al. Cloning and expression of complementary DNA coding for an allergen with common antibody-binding specificities with three allergens of the house dust mite Blomia tropicalis
CN102307894B (zh) 螨过敏原之变体及其用途
CN102279271B (zh) 重组蛔虫ALAg蛋白抗原检测抗蛔虫抗体间接ELISA方法
CN102071184B (zh) 牛虻抗血栓酶tablysin及其基因和应用
CN101619313B (zh) 靶向结核分枝杆菌Ag85B的寡核苷酸适配子及其制备方法和应用
CN109265529A (zh) 一种屋尘螨过敏原Der p 33基因重组蛋白及其应用
CN101477125B (zh) 诊断结核病的基于结核杆菌抗原性多肽的组合物
CN104531715A (zh) 人降钙素原重组表达、单、多克隆抗体的制备及elisa检测方法
CN106279394A (zh) G蛋白偶联受体融合表达蛋白
CN109265530A (zh) 一种屋尘螨过敏原Der p 29基因重组蛋白及其应用
CN102127168A (zh) 一种髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白及其应用
CN108864269A (zh) 屋尘螨变应原Der p 26及其制备方法和应用
CN109734790A (zh) 人Agrin抗原、人Agrin抗体检测试剂盒及其制备方法与应用
CN104119434B (zh) 黑眶蟾蜍抗菌肽及其基因和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant