CN104711283A - 一种新型抗凝剂白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP的表达制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型抗凝剂白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP的表达制备方法，步骤如下：(1)优化合成ALP成熟肽DNA；(2)重组质粒pPICZαA-ALP的构建；(3)重组蛋白ALP的表达和纯化。本发明方法利用pPICZαA载体的毕赤酵母表达系统(pPICZαA-ALP X33)表达的ALP蛋白能够正确分泌表达，经纯化后具有抗凝血活性，在体外能够显著延长凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)，可作为一种新型抗凝剂使用，为进一步研究其作为预防和治疗血栓栓塞性等血管性疾病的新型抗凝剂的可行性奠定了研究基础，因此，本发明方法如果被广泛证明并运用于临床将具备积极的社会效益和可观的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及ALP基因的优化合成、重组表达质粒pPICZαA-ALP的构建、重组表达菌株pPICZαA-ALP X33的构建、目的蛋白ALP的诱导表达及纯化、ALP蛋白在体外抗凝血中的应用，尤其是一种新型抗凝剂白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP的表达制备方法和应用。
背景技术
ALP蛋白即白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白(Aedes albopictus aegyptin-like protein，alALP)，以下简称ALP。
1、血栓栓塞性疾病等血管性疾病的治疗与预防需要新型的抗凝剂
抗凝药物被广泛用于血栓栓塞性疾病的预防和治疗，如脑卒中、房颤(AF)、急性冠脉综合征(ACS)、弥散性血管内凝血、肺栓塞(PE)、外科手术后静脉血栓栓塞症(VTE)等。这些疾病均需用抗凝药物来防治血栓栓塞形成和/或复发。目前常用的抗凝剂包括肝素(UFH)、低分子肝素(LMWH)和华法林(warfarin)，它们预防和治疗血栓栓塞性疾病的效果已被众多的临床试验所证明且广泛用于临床实践。然而，这些药物或多或少具有明显的缺点：如药效学或药动学存在不可预测性，容易导致出血；需要实验室监测以调整剂量(如肝素、华法林)；肝素诱导血小板减少症及骨质疏松症；非胃肠道给药(如肝素、低分子肝素)等。这些缺点限制了上述药物的临床应用，因此研发新的抗凝药物，既能更有效抗凝，又能克服现有药物的缺点一直是该领域的重点和难点。近年来随着对凝血的潜在分子机制的更多了解、重组DNA技术的进步、药物化学合成技术的提高等，已经加速了抗凝新药的研究步伐。
因此，血栓栓塞性疾病等血管性疾病的治疗与预防仍需要不断研发有效安全的新型抗凝剂。
2、蚊唾液腺某些功能蛋白具有抗凝血的作用
蚊为重要的吸血昆虫，已有研究表明其唾液具有重要的生物学活性，尤其对脊椎动物宿主具有抗凝血、抗炎和调节宿主免疫功能的作用。脊椎动物凝血系统是一个高度复杂、精细、高效的体系，当蚊叮咬时，宿主立即启动凝血过程，主要包括3种方式：缩血管反应、血小板凝集和血液级联凝集形成血凝块。这几种方式相互协同，防止组织破损处进一步失血。研究发现，为了克服这些障碍，蚊吸血时其唾液腺分泌一组抗凝血活性物质，这些物质可干扰宿主的凝血反应和炎症反应以促进吸血的完成，更是一组具有潜在药理活性的物质,它将为新型心血管疾病治疗药物的研发提供依据，进而为制备安全可靠的抗凝药物提供可能。
3、白纹伊蚊唾液腺蛋白alALP有开发成新型抗凝剂的潜力
Aegyptin是埃及伊蚊雌蚊唾液腺特异性分泌蛋白，属于30KDa的唾液腺变应原家族，它是一种新发现的抗凝剂。该蛋白能特异性识别血小板糖蛋白VI因子、整合素α2β1和血管性假血友病因子(vWf)的特定位置，从而阻止胶原蛋白和这三种主要配体的作用。Calvo等进一步研究了Aegyptin的作用机制，他们通过表面等离子体共振技术鉴定了血管性假血友病因子与胶原蛋白结合位点的氨基酸序列：RGQOGVMGF(其中O代表羟脯氨酸)，该序列作为胶原蛋白的高亲和位点介导胶原蛋白与血管性假血友病因子(vWF)的相互作用。另外，Aegyptin能与线性多肽RGQPGVMGF和热变性胶原蛋白发生相互作用。但是，Aegyptin与不规则的RGQPGVMGF多肽不发生作用。Aegyptin也能识别多肽(GPO)和GFOGER，并具有较弱的亲和力，他们分别是糖蛋白VI和整合素α2β1在胶原蛋白上的绑定部位。在Aegyptin的解离短肽中，它的羧基端片段具有和胶原蛋白结合的能力，还能减弱血小板的聚集。此外，在活体中有玫瑰红存在的情况下，Aegyptin阻止了激光诱导的小鼠颈动脉血栓的形成。这些结果说明，Aegytpin能与胶原蛋白上的特定部位结合，抑制血小板和胶原蛋白在体内和体外的相互作用，是一种研究血栓特点和分子形成机制的分子工具。
Arca等完成了白纹伊蚊唾液腺转录组和蛋白质组的分析，其中报道了另一种30000Mr的唾液腺变应原家族蛋白的cDNA和蛋白序列(gi：56417504)。本申请人前期对该蛋白和aegyptin蛋白序列进行生物信息学分析发现它们具有很高的同源性，并命名为白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白(Aedes albopictus aegyptin-like protein，alALP)。生物信息分析结果显示，它们的保守氨基酸C(半胱氨酸)和P(脯氨酸)的数量和位置都是一致的，较保守氨基酸G(甘氨酸)的数量和位置也几乎一致，其羧基端最末的35个氨基酸高度保守，只有3个氨基酸不同。同时，用singalP 4.0预测到它们的信号肽剪切位点是相同的。因此，认为这两种蛋白可能具有相似的功能。
同时，现有研究报道只认为ALP蛋白是蚊叮咬时引起人免疫反应的免疫原之一，而且，现有的ALP原核表达系统存在无法表达，或者表达的ALP蛋白融合有分子量与ALP自身相当的GST标签，同时原核表达无法将ALP进行分泌表达，意味着原先在蚊唾液腺中进行分泌表达的ALP蛋白在原核中表达时其无法进行正确的加工、折叠和翻译后修饰。这些因素都影响了ALP蛋白的生物学活性，特别是原核表达的ALP蛋白不具备抗凝血活性。
另外，现有的毕赤酵母表达系统尚未见对ALP蛋白的表达。
通过检索，与本发明专利申请接近的现有技术有如下两种：
1、ALP蛋白的原核表达技术：
ALP蛋白最先由赵郭存等报道它是一种蚊唾液腺的主要免疫原蛋白并尝试将其克隆转入pET-28a原核载体中表达，但并没有报道其表达的结果。本申请人成功利用pGEX-6P-1原核表达载体表达并纯化到了ALP重组融合蛋白，经分析发现该蛋白具有较强的免疫原性和免疫反应性。
2、利用pPICZαA载体的毕赤酵母表达技术：
主要是Invitrogen公司的pPICZ系列载体表达说明手册《EasySelectTMPichia ExpressionKit》(Cat.no.K1740-01)，pPICZαA特别适合表达分泌型蛋白，同时具备酵母表达的基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
3、《按毕赤酵母偏爱密码子优化的木聚糖酶cxyI1基因及其表达》，专利申请号：200910200673.0，该发明涉及一种按毕赤酵母偏爱密码子优化的木聚糖酶cxyI1基因及其表达，所述优化的木聚糖酶cxyI1基因采用连续延伸PCR方法合成，所述基因全长489bp，编码162个氨基酸，通过将该基因序列构建到毕赤酵母表达载体并转化入毕赤酵母中表达，可用于木聚糖酶的生产。
通过对比，本发明专利申请与上述相关的公开文献存在本质的不同。
发明内容
本发明的目的在于克服原有技术的不足之处，提供一种新型抗凝剂白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP的表达制备方法，该方法克服了原核表达中ALP蛋白无法现实分泌表达，无法进行正确的加工、折叠和翻译后修饰，不具备抗凝血活性等缺陷，该方法利用pPICZαA载体的毕赤酵母表达系统(pPICZαA-ALP X33)表达的ALP蛋白能够正确分泌表达表达上清中，经纯化后具有抗凝血活性，在体外能够显著延长凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)，该方法制备得到的ALP蛋白可作为一种新型抗凝剂使用。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一种新型抗凝剂白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP的表达制备方法，步骤如下：
⑴优化合成ALP成熟肽DNA
按毕赤酵母密码子偏好性优化合成，优化合成的ALP成熟肽基因序列为：序列1；
序列2、序列3分别为EcoR I、Xba I的酶切位点；
⑵重组质粒pPICZαA-ALP的构建
①双酶切
优化合成的ALP成熟肽DNA和质粒pPICZαA经EcoR I和Xba I双酶切，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收酶切产物，酶切后得目的基因ALP；
优化合成的ALP成熟肽DNA的酶切体系和条件如下：
补充ddH2O至20μl体系，22-37℃水浴反应5min-4h，60-80℃灭活5-10min；
质粒pPICZαA的酶切体系同以上体系，反应条件相同，得酶切后pPICZαA质粒；
酶切产物经l％琼脂糖凝胶电泳鉴定，琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化目的片段，得目的基因ALP；
②连接
目的基因ALP与酶切后质粒pPICZαA按10：1摩尔比混合于反应体系中，16-25℃水浴连接5min-4h，得连接产物；
20μl的反应体系如下：
③转化和阳性克隆的鉴定
于冰上，取连接产物2μl加入100μl E.coli DH5α感受态细胞中，冰浴30min后，42℃热激转化90sec，冰浴1-3min，加入LB液体培养基700μl；37℃振荡培养1-2h，取菌液涂于含博来霉素50-150μg/ml的LB低盐平板上；37℃过夜培养，挑取阳性克隆接种于含博来霉素50-150μg/ml的LB低盐培养液中；37℃振荡培养10-16h，提取质粒，用EcoR I和XbaI进行双酶切鉴定，结果经1％琼脂糖凝胶电泳分析；
④线性化
取PCR和双酶切均鉴定为阳性克隆的菌液，用含博来霉素50-150μg/ml的LB低盐培养液扩大培养后，提取全部质粒；取纯化的单拷贝质粒，用SacI完全酶切，琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化DNA片段，溶解于10-30μl的无菌去离子水，得线性化的单拷贝质粒；
SacI线性化酶切体系如下：
10×FastDigest buffer 5μl；
纯化的单拷贝质粒 8-10μg；
SacI 2-6μl；
补充ddH2O至50μl体系，22-37℃水浴反应1-4h，60-80℃灭活5-10min；
⑤毕赤酵母X-33感受态细胞的制备
挑取YPD平板上X-33菌株接种接入20ml YPD培养基，29℃，250rpm培养至OD600＝1.3-1.5，4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用10ml冰浴的无菌去离子水重新悬浮细胞；4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用5ml冰冷的无菌去离子水悬浮重新悬浮细胞；4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用2ml冰冷的无菌1M山梨醇悬浮重新悬浮细胞；4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用200ul冰冷的无菌1M山梨醇悬浮，得X-33感受态细胞；
⑥电转化
按线性化的单拷贝质粒：X-33感受态细胞的体积比为1：8的比例，分别取线性化的单拷贝质粒加入X-33感受态细胞并轻轻混匀，转入预冷电转杯，冰上放置5min，放入电转仪，电击转化，电压：1500V，电击时间：分别为5.4ms 5.6ms，电击完成后，立即加入1ml、1M冰浴的山梨醇，混匀后转移到离心管中，28-30℃，静止1h，涂含博来霉素50-150μg/ml的YPDS平板；28-30℃，培养2-4d，得转化子；
⑦提取酵母基因组
挑取转化子于含100ug/ml博来霉素的YPD液体培养基中，30度，220rpm/min过夜培养，次日提取转化子酵母基因组；
⑧PPICZαA-ALP X33阳性菌株的PCR鉴定
提取的酵母基因组利用通用引物5’AOX1和3’AOX1进行PCR鉴定，引物序列如下：
5’AOX1：序列4；
3’AOX1：序列5；
PCR反应体系为：条件为：PCR参数：55℃退火30s，30个循环；
PCR反应体系为：
PCR反应条件为：
共设定25-30个循环，最后于72℃条件下延伸5-10min。
PCR产物经l％琼脂糖凝胶电泳鉴定，得阳性克隆子；
⑶重组蛋白ALP的表达和纯化
①诱导表达和优化条件
划线阳性克隆子于YPD平板，2天后挑取单菌落接种于BMGY培养基中，生长40h-48h，4℃8000rpm离心5-10min，将沉淀换至含体积分数0.5-1.0％甲醇的培养基BMMY，28-30℃，220-250rpm/min诱导表达；
②大量表达和纯化
甲醇诱导24-72h后，全部取样，经冻干20倍浓缩，过滤，按照Ni-NTA Agarose试剂盒说明书纯化目的蛋白，然后将目的蛋白经1％(质量百分数)PBS、pH＝7.0透析过夜，超滤器浓缩于Tris-HCl缓冲液pH 8.0中，-20℃冻存，即得白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP。
而且，所述培养基的组成及配制方法如下：
LB低盐培养基(1L)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g；
YPD液体培养基：l％酵母浸出粉，2％蛋白胨，2％D-葡萄糖，加双蒸水定容后，高温高压灭菌后，置4℃保存；
YPD固体培养基：1％酵母浸出粉，2％蛋白胨，2％D-葡萄糖，2％琼脂粉，加双蒸水定容后，高温高压灭菌后，置4℃保存；
YPDS培养基：1％酵母浸出粉，2％蛋白胨，2％D-葡萄糖，1M山梨醇，2％琼脂粉，加双蒸水定容后，高温高压灭菌后，置4℃保存；
BMGY：1％酵母浸出粉，2％蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液pH 6.0，1.34％酵母基础氮源，4×10-5％生物素，1％甘油；
BMMY：1％酵母浸出粉，2％蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液pH 6.0，1.34％酵母基础氮源，4×10-5％生物素，1％甲醇。
而且，所述步骤⑶③中过滤使用0.45μm滤嘴过滤；所述超滤器为10KD。
而且，所述步骤⑶重组蛋白ALP的表达和纯化的具体步骤为：
①诱导表达和优化条件
划线阳性克隆子于YPD平板，2天后挑取单菌落接种于BMGY培养基中，生长40h-48h，4℃8000rpm离心5-10min，将沉淀换至含体积分数0.5-1.0％甲醇的培养基BMMY，28-30℃，220-250rpm/min诱导表达；每隔24取样1ml，补上甲醇至终浓度0.5-1.0％，连取5天样品；将菌液在4℃条件下，10000rpm离心5-10min，收集上清，经冻干10倍浓缩，保存于-80℃备用；
②SDS-PAGE检测和Western Blot鉴定
取每天收集的样本各10μl分别跑10％的SDS-PAGE，结合考马斯亮蓝染色初步检测目的蛋白的表达情况；依据SDS-PAGE的结果，取相应时期的样本进行Western Blot鉴定；WesternBlot条件：一抗为小鼠源性的Anti-6X Hisantibody，按1:10000稀释，二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠，按1:50000稀释，用DAB显色；
③大量表达和纯化
甲醇诱导24-72h后，全部取样，经冻干20倍浓缩，过滤，按照Ni-NTA Agarose试剂盒说明书纯化目的蛋白；随后，所有洗脱于500mM咪唑中的目的蛋白，经1％(质量百分数)PBS(pH＝7.0)透析过夜，超滤器浓缩于Tris-HCl缓冲液pH 8.0中，-20℃冻存，即得白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP。
如上所述的新型抗凝剂白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP的表达制备方法制得的蛋白ALP在作为抗凝剂方面的应用。
本发明取得的优点和积极效果是：
1、本发明方法利用pPICZαA载体的毕赤酵母表达系统(pPICZαA-ALP X33)表达的ALP蛋白能够正确分泌表达表达上清中，经纯化后具有抗凝血活性，在体外能够显著延长凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)，可作为一种新型抗凝剂使用，为进一步研究其作为预防和治疗血栓栓塞性等血管性疾病的新型抗凝剂的可行性奠定了研究基础，因此，本发明方法如果被广泛证明并运用于临床将具备积极的社会效益和可观的经济效益。
2、本发明利用毕赤酵母表达制备的ALP蛋白具有抗凝血活性，能在体外能够显著延长凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)，具备成为防治血栓栓塞性等血管性疾病的新型抗凝剂的潜力。
3、本发明方法建立了一种具有抗凝血生物学活性的ALP表达制备方法，并将制备的蛋白初步作为一种体外抗凝剂使用，克服原核表达中ALP蛋白无法现实分泌表达，无法进行正确的加工、折叠和翻译后修饰，不具备抗凝血活性等缺陷。
4、本发明方法首次利用毕赤酵母X33表达ALP蛋白并获得具备抗凝血活性的纯化蛋白，可用于该新型抗凝剂的生产；该方法首次报道ALP具有aegyptin相似的抗凝血活性，并初步作为一种体外新型抗凝剂使用。
附图说明
图1为本发明中所使用的毕赤酵母的最佳制备感受态细胞时期形态图；其中，图1-1为放大100倍的形态图；图1-2为放大400倍的形态图；
图2为本发明中重组质粒pPICZαA-alALP的构建和阳性克隆的筛选图；
其中，图A为重组质粒pPICZαA-alALP图；ALP成熟肽通过XbaI和EcoR I酶切位点插入在α信号肽的下游，紧接着一个6xhis标签；图B为pPICZαA-alALP的EcoRI和XbaI双酶切验证；在750-1000bp处能看到目的条带；图C为pPICZαA–alALP的SacI线性化检测；线性化的pPICZαA–alALP质粒(p–alALP)条带在4000bp处；图D为PCR检测alALP的毕赤酵母阳性克隆(X-33alALP)，泳道2、3、4、6有出现约1300bp的目的条带为阳性克隆；
图3为本发明中ALP的表达和纯化图；其中，A为SDS-PAGE结合考马斯亮蓝染色分析阳性转化子X-33alALP的上清目的蛋白表达情况图，泳道ct为亲本质粒对照，泳道1-8为不同的转化子，在泳道1、2、4、5、7中检测到目的蛋白(35KD处)，随后由Western blot进一步鉴定，鉴定图为图B；图C为SDS-PAGE结合银染分析rALP的纯化情况图，泳道1-2为两个重复孔，随后由Western blot进一步鉴定，鉴定图为图D；
图4为本发明的ALP的抗凝血活性分析图；其中，图A为活化部分凝血活酶时间(APTT)的检测图，重复测量次数为5次，ALP组(3.8ug)和肝素组(1.034x10-2ug)分别与空白对照组的T检验结果显示，两组间差异显著(P≤0.001)，具有统计学意义；图B为凝血酶时间(TT)的检测图，重复测量次数为5次，ALP组(34ug)和肝素组(1.034ug)分别与空白对照组的T检验结果显示，两组间差异显著(P≤0.001)，具有统计学意义；图C为凝血酶原时间(PT)的检测图，重复测量次数为5次，ALP组(340ug)和肝素组(1.034ug)分别与空白对照组的T检验结果显示，两组间差异显著(P≤0.001)，具有统计学意义；图D为不同浓度梯度ALP的APTT、TT和PT的检测图，重复测量次数为5次，随着着ALP浓度的不断增加，APTT、TT和PT值逐渐延长。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。需要说明的是，本实施例是描述性的，不是限定性的，不能由此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的试剂，如无特殊规定，均为本领域的常规试剂；本发明中所使用的方法，如无特殊规定，均为本领域的常规方法。
本发明方法利用pGEX-6P-1载体对ALP的原核表达，其方法整体思路为：运用生物信息学方法分析alALP与aegyptin氨基酸序列(GenBank登录号为ABF18122.1)的同源性、二级结构和抗原肽段；提取白纹伊蚊唾液腺总RNA，根据alALP的基因编码序列(GenBank登录号为AY826121)设计引物，RT-PCR扩增目的基因，亚克隆至pGEX-6P-1质粒，转化大肠埃希菌(E.coli)BL21，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白表达情况；重组aegyptin相似蛋白(GST-alALP)经还原型谷胱甘肽(Glutathione Sepharose 4B)亲和层析法纯化后，皮下注射免疫BALB/c小鼠，每次免疫剂量60μg，共免疫3次，每次间隔2周，制备小鼠抗GST-alALP血清；分别以小鼠抗GST-alALP血清和白纹伊蚊叮咬后小鼠血清为一抗，Western blotting分析GST-alALP蛋白的抗原性。结论为：alALP成熟肽基因能在原核表达系统中高效表达，且具有抗原性。
本发明中所使用的材料与方法可以如下：
材料：
质粒和菌种：
酵母表达质粒pPICZαA购自美国Invitrogen公司，毕赤酵母(pichia pastoris)X-33菌株，例如可以由温州医科大学寄生虫教研室获得。
检测时使用的血清：正常人现取血清。
主要培养基的配制：
LB低盐培养基(1L)：Tryptone(胰蛋白胨)10g，Yeast Extract(酵母提取物)5g，NaCl(氯化钠)5g。
酵母培养的配制(培养基中的百分数为质量体积比，g/ml，未详细描述部分为本领域的常规技术)：
(1)YPD液体培养基：l％酵母浸出粉，2％蛋白胨，2％D-葡萄糖，加双蒸水定容后，高温高压灭菌后，置4℃保存。
(2)YPD固体培养基：1％酵母浸出粉，2％蛋白胨，2％D-葡萄糖，2％琼脂粉，加双蒸水定容后，高温高压灭菌后，置4℃保存。
(3)YPDS培养基：1％酵母浸出粉，2％蛋白胨，2％D-葡萄糖，1M山梨醇，2％琼脂粉，加双蒸水定容后，高温高压灭菌后，置4℃保存。
(6)BMGY：1％酵母浸出粉，2％蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液pH 6.0，1.34％酵母基础氮源(Yeast Nitrogen Base)，4×10-5％生物素(biotin)，1％甘油(glycerol)。
(7)BMMY：1％酵母浸出粉，2％蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液pH 6.0，1.34％酵母基础氮源(Yeast Nitrogen Base),4×10-5％生物素(biotin)，1％甲醇(methanol)。
实施例1
本实施中所使用的材料与方法可以如下：
材料：
质粒和菌种：
酵母表达质粒pPICZαA购自美国Invitrogen公司，毕赤酵母(pichia pastoris)X-33菌株，例如可以由温州医科大学寄生虫教研室获得。
主要试剂：
博来霉素(Zeocin)(货号：R25001)购自美国Invitrogen公司；Ni-NTA Agarose(货号：30210)和相应的纯化柱，Anti-6X Hisantibody(货号：ab5000)和相应的二抗购自美国QIAGEN公司；酵母基因组提取试剂盒(货号：DP307)购自天根生物技术有限公司；APTT、PT、TT试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司)；EcoR I、Xba I和ScaⅠ酶均购自Fermantas公司，肝素片：上海信谊九福药业有限公司生产。其他试剂为分析纯。
主要实验仪器：
pHS-3C型pH计：上海雷磁仪器厂；
电击转化仪：美国Bio-Rad公司；
电转杯：美国Bio-Rad公司；
冻干机：宁波化学仪器制造厂；
计时器：国产。
一种新型抗凝剂白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP的表达制备方法，步骤如下：
⑴优化合成alALP成熟肽DNA
按毕赤酵母密码子偏好性由华大基因优化合成，优化合成的alALP成熟肽基因序列为(序列1)：
gaattcAGGCCAATGCCAGAGGGTGAAGAGGGTGAAGGCGAGGAAGAATCCCCAGATGATGCCTCTGGAGACGAAACGGAAGGCGGAGAGGAAAAGACGGATGATGGTGCCAGTGAGGACGGTGGAGAAGAAGAATCCAAAGCAGACGAGGAAGATGGTGGTGAGAATGCTGATGGCGAAGACGCCGGGGGAGATGACGCCGGTGGCGAAAATGCAGATGGAGAAAACACCGATGGGGAAAACACTGACGGTGAGAACACCGACGGGGAGAACGCTGATGGAGAAGACGCCGAGGGTTCTAAGGACGAGGGAGACGATTCCGAAGGGGATGGAAGTAAGGAGGAATCCACAGGCGGTGATGAAGGAGGAGATAATGCCGGTGGCGGTGAAGGTGGGGGGGAAAATGACCCAGTTAATACTTACCACAAAGTAGTGGCTATTCTgGACAAAGATACAAAGGTTGATAACATTCAATCCGAGTATCTGAGATCTGCACTGAACAATGATTTACAGTCCGAAGTACGAAATCCAGTTGTGGAGGCTATTAGTCGATTGGGGTCCTTCAGTAAGATTGAAGGCTGTTTCAAGTCTATGGGATCTGATGTAAAAAAAGTTATTGACGAAGAACAAAAAGCATTCAAAGATTGTATGACTAAAAAAAAGTCTGAGTACGAATGTTCCGAAGACTCATTCGCTAGTGCAAAAGGTAAGTTGTCTCCAATCACGTCAAAAATTAAAAGTTGCGTGTCTTCCAAAGGTCAGtttctaga，下划线为EcoR I和Xba I酶切位点。
⑵重组质粒pPICZαA-alALP的构建
①双酶切
优化合成的alALP成熟肽DNA和质粒pPICZαA经EcoR I和Xba I双酶切，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收酶切产物，酶切后得目的基因ALP。
优化合成的ALP成熟肽DNA和质粒pPICZαA经EcoR I和Xba I双酶切，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收酶切产物，酶切后得目的基因ALP；
优化合成的ALP成熟肽DNA的酶切体系和条件如下：
补充ddH2O至20μl体系，22℃水浴反应5min，60℃灭活5min；
质粒pPICZαA的酶切体系参考以上体系，反应条件相同，得酶切后pPICZαA质粒。
酶切产物经l％琼脂糖凝胶电泳鉴定，琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化目的片段，得目的基因ALP。
②连接
目的基因ALP与酶切后质粒pPICZαA按10：1摩尔比混合于反应体系中，16℃水浴连接5minh，得连接产物；
20μl的反应体系如下：
③转化和阳性克隆的鉴定
于冰上，取连接产物2μl加入100μl E.coli DH5α感受态细胞中，冰浴30min后，42℃热激转化90sec，冰浴1min，加入LB液体培养基700μl。37℃振荡培养1h，取菌液50ul涂于含博来霉素50μg/ml的LB低盐平板上。37℃过夜培养，挑取阳性克隆接种于10ml含博来霉素50μg/ml的LB低盐培养液中。37℃振荡培养10h，参照质粒提取说明书提取质粒，用BamH I和Not I进行双酶切鉴定(转化条件参考前面的双酶切)，结果经1％琼脂糖凝胶电泳分析。
④线性化
取PCR和双酶切都鉴定为阳性克隆的菌液，用含博来霉素50μg/ml的LB低盐培养液扩大培养100ml，参考质粒提取试剂盒说明书全部提取质粒。取纯化的单拷贝质粒8μg，用SacI完全酶切，琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化DNA片段，溶解于10μl的无菌去离子水，得线性化的单拷贝质粒。
SacI线性化酶切体系如下：
10×FastDigest buffer 5μl；
纯化的单拷贝质粒 8μg；
SacI 2μl；
补充ddH2O至50μl体系，22℃水浴反应1h，60℃灭活5min。
⑤毕赤酵母X-33感受态细胞的制备
挑取YPD平板上X-33菌株接种进入20ml YPD培养基，29℃，250rpm培养至OD600＝1.3-1.5，此时，毕赤酵母细胞形态饱满，多数细胞处于出芽状态(如图1所示)。4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用10ml冰浴(冰浴的水0摄氏度左右)的无菌去离子水重新悬浮细胞。4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用5ml冰冷(冰冷的水0摄氏度左右)的无菌去离子水悬浮重新悬浮细胞。4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用2ml冰冷的无菌1M山梨醇悬浮重新悬浮细胞。4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用200ul冰冷的无菌1M山梨醇悬浮，得X-33感受态细胞。分装，80μl每管，备用。
⑥电转化
分别取10μl线性化的单拷贝质粒(pPICZαA-ALP)和线性化的对照质粒(pPICZαA)加入80μl X-33感受态细胞并轻轻混匀，转入2mm预冷电转杯，冰上放置5min，放入电转仪，电击转化。电压：1500V，电击时间：分别为5.4ms 5.6ms，电击完成后，立即加入1ml、1M冰浴的山梨醇，混匀后转移到1.5ml离心管中，28℃，静止1h，每200μl涂一块含博来霉素100μg/ml的YPDS平板。28℃，培养2d，形成分散、饱满的单克隆，得转化子。同时电转化pPICZαA空质粒作为亲本对照，得对照组转化子。
⑦提取酵母基因组
挑取转化子、对照组转化子于3ml YPD(含100ug/ml zeocin)液体培养基中，30度，220rpm/min过夜培养，次日取1ml提取转化子酵母基因组。具体操作参见酵母基因组提取试剂盒(天根生物技术有限公司)。
⑧PPICZαA-ALP X33阳性菌株的PCR鉴定
提取的酵母基因组利用通用引物5’AOX1和3’AOX1进行PCR鉴定，引物序列如下：
5’AOX1(序列4)：5’-GAGTGGTTCCAATTGACAAGC-3’；
3’AOX1(序列5)：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’；
PCR反应体系为：条件为：PCR参数：55℃退火30s，30个循环
PCR反应体系为：
PCR反应条件为：
共设定25-30个循环，最后于72℃条件下延伸5-10min。
PCR产物经l％琼脂糖凝胶电泳鉴定，得阳性克隆子。
⑶重组蛋白ALP的表达和纯化
①诱导表达和优化条件
划线阳性克隆子和对照菌株(电转pPICZαA空质粒)于YPD平板，2天后各自挑取单菌落(阳性克隆子不少于10，对照克隆子1个)接种于15ml的BMGY培养基中，生长约40h,4℃8000rpm离心5min，将沉淀换至含体积分数(1.0％的甲醇的BMMY，28℃，220rpm/min诱导表达。每隔24取样1ml，补上甲醇至终浓度1.0％(体积分数)，连取5天样品。将菌液在4℃条件下，10000rpm离心，收集上清，经冻干10倍浓缩，保存于-80℃备用。
②SDS-PAGE检测和Western Blot鉴定
取每天收集的样本各10μl分别跑10％的SDS-PAGE，结合考马斯亮蓝染色初步检测目的蛋白的表达情况。依据SDS-PAGE的结果，取适当时期的样本进行Western Blot鉴定。WesternBlot条件：一抗为小鼠源性的Anti-6X Hisantibody，按1:10000稀释，二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠，按1:50000稀释，用DAB显色。SDS-PAGE和Western Blot的具体操作为本领域内的常规操作。
③大量表达和纯化
总共诱导表达1L的菌液，于最佳的时间点(甲醇诱导24h后)全部取样。经冻干约20倍浓缩，滤嘴过滤(0.45μm,Millipore)，按照Ni-NTA Agarose试剂盒说明书纯化目的蛋白。取15ul洗脱于500mM咪唑中的目的蛋白用于SDS-PAGE结合银染分析目的蛋白的洗脱情况，另取15ul进行Western Blot鉴定。随后，所有洗脱于500mM咪唑中的目的蛋白，经1％(质量百分数)PBS(pH＝7.0)透析过夜，超滤器(millipore,10KD)浓缩于2ml Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中。考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒检测目的蛋白含量后分装，-20℃冻存，即得白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP。
实施例2
一种新型抗凝剂白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP的表达制备方法，步骤如下：
⑴优化合成ALP成熟肽DNA
按毕赤酵母密码子偏好性优化合成，优化合成的ALP成熟肽基因序列为：
gaattcAGGCCAATGCCAGAGGGTGAAGAGGGTGAAGGCGAGGAAGAATCCCCAGATGATGCCTCTGGAGACGAAACGGAAGGCGGAGAGGAAAAGACGGATGATGGTGCCAGTGAGGACGGTGGAGAAGAAGAATCCAAAGCAGACGAGGAAGATGGTGGTGAGAATGCTGATGGCGAAGACGCCGGGGGAGATGACGCCGGTGGCGAAAATGCAGATGGAGAAAACACCGATGGGGAAAACACTGACGGTGAGAACACCGACGGGGAGAACGCTGATGGAGAAGACGCCGAGGGTTCTAAGGACGAGGGAGACGATTCCGAAGGGGATGGAAGTAAGGAGGAATCCACAGGCGGTGATGAAGGAGGAGATAATGCCGGTGGCGGTGAAGGTGGGGGGGAAAATGACCCAGTTAATACTTACCACAAAGTAGTGGCTATTCTgGACAAAGATACAAAGGTTGATAACATTCAATCCGAGTATCTGAGATCTGCACTGAACAATGATTTACAGTCCGAAGTACGAAATCCAGTTGTGGAGGCTATTAGTCGATTGGGGTCCTTCAGTAAGATTGAAGGCTGTTTCAAGTCTATGGGATCTGATGTAAAAAAAGTTATTGACGAAGAACAAAAAGCATTCAAAGATTGTATGACTAAAAAAAAGTCTGAGTACGAATGTTCCGAAGACTCATTCGCTAGTGCAAAAGGTAAGTTGTCTCCAATCACGTCAAAAATTAAAAGTTGCGTGTCTTCCAAAGGTCAGtttctaga，下划线为EcoR I和Xba I酶切位点；
⑵重组质粒pPICZαA-ALP的构建
①双酶切
优化合成的ALP成熟肽DNA和质粒pPICZαA经EcoR I和Xba I双酶切，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收酶切产物，酶切后得目的基因ALP；
优化合成的ALP成熟肽DNA的酶切体系和条件如下：
补充ddH2O至20μl体系，22-37℃水浴反应1h，70℃灭活8min；
质粒pPICZαA的酶切体系同以上体系，反应条件相同，得酶切后pPICZαA质粒；
酶切产物经l％琼脂糖凝胶电泳鉴定，琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化目的片段，得目的基因ALP；
②连接
目的基因ALP与酶切后质粒pPICZαA按10：1摩尔比混合于20μl反应体系中，20℃水浴连接1h，得连接产物；
20μl的反应体系如下：
③转化和阳性克隆的鉴定
于冰上，取连接产物2μl加入100μl E.coli DH5α感受态细胞中，冰浴30min后，42℃热激转化90sec，冰浴2min，加入LB液体培养基700μl；37℃振荡培养1.52h，取100ul菌液涂于含博来霉素100μg/ml的LB低盐平板上；37℃过夜培养，挑取阳性克隆接种于10ml含博来霉素100μg/ml的LB低盐培养液中；37℃振荡培养12h，参照质粒提取说明书提取质粒，用EcoR I和XbaI进行双酶切鉴定，结果经1％琼脂糖凝胶电泳分析；
④线性化
取PCR和双酶切都鉴定为阳性克隆的菌液，用含博来霉素100μg/ml的LB低盐培养液扩大培养100ml，按照质粒提取试剂盒说明书全部提取质粒；取纯化的单拷贝质粒8μg，用SacI完全酶切，琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化DNA片段，溶解于20μl的无菌去离子水，得线性化的单拷贝质粒；
SacI线性化酶切体系如下：
10×FastDigest buffer 5μl；
纯化的单拷贝质粒(ALP基因片段) 9μg；
SacI 4μl；
补充ddH2O至50μl体系，22-37℃水浴反应2h，70℃灭活8min；
⑤毕赤酵母X-33感受态细胞的制备
挑取YPD平板上X-33菌株接种进入20ml YPD培养基，29℃，250rpm培养至OD600＝1.3-1.5，4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用10ml冰浴的无菌去离子水重新悬浮细胞；4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用5ml冰冷的无菌去离子水悬浮重新悬浮细胞；4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用2ml冰冷的无菌1M山梨醇悬浮重新悬浮细胞；4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用200ul冰冷的无菌1M山梨醇悬浮，得X-33感受态细胞；分装，80μl每管，备用；
⑥电转化
分别取10μl线性化的单拷贝质粒加入80μl X-33感受态细胞并轻轻混匀，转入2mm预冷电转杯，冰上放置5min，放入电转仪，电击转化，电压：1500V，电击时间：分别为5.4ms 5.6ms，电击完成后，立即加入1ml、1M冰浴的山梨醇，混匀后转移到1.5ml离心管中，29℃，静止1h，涂含博来霉素100μg/ml的YPDS平板；29℃，培养2-4d，形成分散、饱满的单克隆，得转化子；
⑦提取酵母基因组
挑取转化子于含100ug/ml zeocin的YPD液体培养基中，30度，220rpm/min过夜培养，次日取1ml提取转化子酵母基因组；具体操作参见酵母基因组提取试剂盒(天根生物技术有限公司)。
⑧PPICZαA-ALP X33阳性菌株的PCR鉴定
提取的酵母基因组利用通用引物5’AOX1和3’AOX1进行PCR鉴定，引物序列如下：
5’AOX1：5’-GAGTGGTTCCAATTGACAAGC-3’；
3’AOX1：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’；
PCR反应体系为：条件为：PCR参数：55℃退火30s，30个循环
PCR反应体系为：
PCR反应条件为：
共设定25-30个循环，最后于72℃条件下延伸8min。
PCR产物经l％琼脂糖凝胶电泳鉴定，得阳性克隆子；
⑶重组蛋白ALP的表达和纯化
①诱导表达和优化条件
划线阳性克隆子于YPD平板，2天后各自挑取单菌落接种于15ml的BMGY培养基中，生长40h-48h，4℃8000rpm离心5-10min换含体积分数0.8％甲醇的培养基BMMY，29℃，240rpm/min诱导表达；每隔24取样1ml，补上甲醇至终浓度0.5-1.0％，连取5天样品；将菌液在4℃条件下，10000rpm离心8min，收集上清，经冻干10倍浓缩，保存于-80℃备用；
②SDS-PAGE检测和Western Blot鉴定
取每天收集的样本各10μl分别跑10％的SDS-PAGE，结合考马斯亮蓝染色初步检测目的蛋白的表达情况；依据SDS-PAGE的结果，取相应时期的样本进行Western Blot鉴定；WesternBlot条件：一抗为小鼠源性的Anti-6X Hisantibody，按1:10000稀释，二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠，按1:50000稀释，用DAB显色；
③大量表达和纯化
于甲醇诱导50h后，全部取样，经冻干约20倍浓缩，过滤，按照Ni-NTA Agarose试剂盒说明书纯化目的蛋白；随后，所有洗脱于500mM咪唑中的目的蛋白，经1％(质量百分数)PBS(pH＝7.0)透析过夜，超滤器(millipore,10KD)浓缩于2ml Tris-HCl缓冲液pH 8.0中，-20℃冻存，即得白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP。
实施例3
一种新型抗凝剂白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP的表达制备方法，其特征在于：步骤如下：
⑴优化合成ALP成熟肽DNA
按毕赤酵母密码子偏好性优化合成，优化合成的ALP成熟肽基因序列为：
gaattcAGGCCAATGCCAGAGGGTGAAGAGGGTGAAGGCGAGGAAGAATCCCCAGATGATGCCTCTGGAGACGAAACGGAAGGCGGAGAGGAAAAGACGGATGATGGTGCCAGTGAGGACGGTGGAGAAGAAGAATCCAAAGCAGACGAGGAAGATGGTGGTGAGAATGCTGATGGCGAAGACGCCGGGGGAGATGACGCCGGTGGCGAAAATGCAGATGGAGAAAACACCGATGGGGAAAACACTGACGGTGAGAACACCGACGGGGAGAACGCTGATGGAGAAGACGCCGAGGGTTCTAAGGACGAGGGAGACGATTCCGAAGGGGATGGAAGTAAGGAGGAATCCACAGGCGGTGATGAAGGAGGAGATAATGCCGGTGGCGGTGAAGGTGGGGGGGAAAATGACCCAGTTAATACTTACCACAAAGTAGTGGCTATTCTgGACAAAGATACAAAGGTTGATAACATTCAATCCGAGTATCTGAGATCTGCACTGAACAATGATTTACAGTCCGAAGTACGAAATCCAGTTGTGGAGGCTATTAGTCGATTGGGGTCCTTCAGTAAGATTGAAGGCTGTTTCAAGTCTATGGGATCTGATGTAAAAAAAGTTATTGACGAAGAACAAAAAGCATTCAAAGATTGTATGACTAAAAAAAAGTCTGAGTACGAATGTTCCGAAGACTCATTCGCTAGTGCAAAAGGTAAGTTGTCTCCAATCACGTCAAAAATTAAAAGTTGCGTGTCTTCCAAAGGTCAGtttctaga，下划线为EcoR I和Xba I酶切位点；
⑵重组质粒pPICZαA-ALP的构建
①双酶切
优化合成的ALP成熟肽DNA和质粒pPICZαA经EcoR I和Xba I双酶切，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收酶切产物，酶切后得目的基因ALP；
优化合成的ALP成熟肽DNA的酶切体系和条件如下：
补充ddH2O至20μl体系，37℃水浴反应4h，80℃灭活10min；
质粒pPICZαA的酶切体系同以上体系，反应条件相同，得酶切后pPICZαA质粒；
酶切产物经l％琼脂糖凝胶电泳鉴定，琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化目的片段，得目的基因ALP；
②连接
目的基因ALP与酶切后质粒pPICZαA按10：1摩尔比混合于20μl反应体系中，25℃水浴连接4h，得连接产物；
20μl的反应体系如下：
③转化和阳性克隆的鉴定
于冰上，取连接产物2μl加入100μl E.coli DH5α感受态细胞中，冰浴30min后，42℃热激转化90sec，冰浴3min，加入LB液体培养基700μl；37℃振荡培养2h，取200ul菌液涂于含博来霉素150μg/ml的LB低盐平板上；37℃过夜培养，挑取阳性克隆接种于10ml含博来霉素150μg/ml的LB低盐培养液中；37℃振荡培养16h，参照质粒提取说明书提取质粒，用EcoR I和XbaI进行双酶切鉴定，结果经1％琼脂糖凝胶电泳分析；
④线性化
取PCR和双酶切都鉴定为阳性克隆的菌液，用含博来霉素150μg/ml的LB低盐培养液扩大培养100ml，按照质粒提取试剂盒说明书全部提取质粒；取纯化的单拷贝质粒8μg，用SacI完全酶切，琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化DNA片段，溶解于30μl的无菌去离子水，得线性化的单拷贝质粒；
SacI线性化酶切体系如下：
10×FastDigest buffer 5μl；
纯化的单拷贝质粒(ALP基因片段) 10μg；
SacI 6μl；
补充ddH2O至50μl体系，22-37℃水浴反应4h，80℃灭活10min；
⑤毕赤酵母X-33感受态细胞的制备
挑取YPD平板上X-33菌株接种进入20ml YPD培养基，29℃，250rpm培养至OD600＝1.3-1.5，4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用10ml冰浴的无菌去离子水重新悬浮细胞；4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用5ml冰冷的无菌去离子水悬浮重新悬浮细胞；4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用2ml冰冷的无菌1M山梨醇悬浮重新悬浮细胞；4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用200ul冰冷的无菌1M山梨醇悬浮，得X-33感受态细胞；分装，80μl每管，备用；
⑥电转化
分别取10μl线性化的单拷贝质粒加入80μl X-33感受态细胞并轻轻混匀，转入2mm预冷电转杯，冰上放置5min，放入电转仪，电击转化，电压：1500V，电击时间：分别为5.4ms 5.6ms，电击完成后，立即加入1ml、1M冰浴的山梨醇，混匀后转移到1.5ml离心管中，30℃，静止1h，涂含博来霉素150μg/ml的YPDS平板；30℃，培养2-4d，形成分散、饱满的单克隆，得转化子；
⑦提取酵母基因组
挑取转化子于含100ug/ml zeocin的YPD液体培养基中，30度，220rpm/min过夜培养，次日取1ml提取转化子酵母基因组；具体操作参见酵母基因组提取试剂盒(天根生物技术有限公司)。
⑧PPICZαA-ALP X33阳性菌株的PCR鉴定
提取的酵母基因组利用通用引物5’AOX1和3’AOX1进行PCR鉴定，引物序列如下：
5’AOX1：5’-GAGTGGTTCCAATTGACAAGC-3’；
3’AOX1：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’；
PCR反应体系为：条件为：PCR参数：55℃退火30s，30个循环
PCR反应体系为：
PCR反应条件为：
共设定25-30个循环，最后于72℃条件下延伸10min。
PCR产物经l％琼脂糖凝胶电泳鉴定，得阳性克隆子；
⑶重组蛋白ALP的表达和纯化
①诱导表达和优化条件
划线阳性克隆子于YPD平板，2天后各自挑取单菌落接种于15ml的BMGY培养基中，生长40h-48h，4℃8000rpm离心5-10min，将沉淀换至含体积分数1.0％甲醇的培养基BMMY，30℃，220-250rpm/min诱导表达；每隔24取样1ml，补上甲醇至终浓度0.5-1.0％，连取5天样品；将菌液在4℃条件下，10000rpm离心10min，收集上清，经冻干10倍浓缩，保存于-80℃备用；
②SDS-PAGE检测和Western Blot鉴定
取每天收集的样本各10μl分别跑10％的SDS-PAGE，结合考马斯亮蓝染色初步检测目的蛋白的表达情况；依据SDS-PAGE的结果，取相应时期的样本进行Western Blot鉴定；WesternBlot条件：一抗为小鼠源性的Anti-6X Hisantibody，按1:10000稀释，二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠，按1:50 000稀释，用DAB显色；
③大量表达和纯化
于甲醇诱导72h后，全部取样，经冻干约20倍浓缩，过滤，按照Ni-NTA Agarose试剂盒说明书纯化目的蛋白；随后，所有洗脱于500mM咪唑中的目的蛋白，经1％(质量百分数)PBS(pH＝7.0)透析过夜，超滤器(millipore,10KD)浓缩于2ml Tris-HCl缓冲液pH 8.0中，-20℃冻存，即得白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP。
本发明白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP的相关检测结果：
1、体外检测ALP的抗凝血活性
主要参考试剂盒说明书，手动法检测ALP对凝血酶时间(TT),凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)。设阳性对照肝素和空白对照，每个样本重复测量5次，对实验组和阳性对照分别与空白对照组进行T检验。具体测量方法如下：
(1)正常人血清采集
用“2ml枸橼酸钠真空采血管9:1”静脉采血1.8ml，马上轻轻颠倒混匀5-8次。(注意：止血带不易过紧，采血时长不超过5min，以免激活凝血反应。)4°，3000rpm或2500g离心15min，收集上层液(血浆，黄色)。保存，2-8℃不超过6h，22-24℃不超过2h。
(2)药品处理
将肝素粉剂用适量(见后面浓度)溶解剂溶解混匀成1.034ug/ul后于-20℃保存备用。
(3)PT
室温，在透明EP管中加入加待测血浆100μl，加入一定量(详见表1)的ALP或肝素溶液，轻轻颠倒混匀5-8次，37℃孵育3min(不宜超过5min)，加入37℃孵育好的PT试剂(即该PT试剂盒里的试剂)200μl，马上启动计时器，终点以出现浑浊的初期为准，或用一个针尖不断挑动血浆以挑到第一根血丝为终点。
(4)TT
室温，在透明EP管中加入加待测血浆200μl，加入一定量(详见表3)的ALP或肝素溶液，轻轻颠倒混匀5-8次，37℃孵育3min(不宜超过5min)，加入20-25℃平衡好的TT试剂(即该TT试剂盒里的试剂)200μl，马上启动计时器，终点以出现浑浊的初期为准，或用一个针尖不断挑动血浆以挑到第一根血丝为终点。
(5)APTT
室温，在透明EP管中加入加待测血浆100μl，加入一定量(详见表2)的ALP或肝素溶液，轻轻颠倒混匀5-8次，37℃孵育5min(不少于5min)，加入37℃孵育好的APTT试剂(即该APTT试剂盒里的试剂)100μl和0.025M CaCl2100μl，马上启动计时器，终点以出现浑浊的初期为准，或用一个针尖不断挑动血浆以挑到第一根血丝为终点。。
相关结果如下：
1、重组质粒pPICZαA-alALP的构建
EcoRI和XbaI的双酶切结果显示，根据酵母密码子偏好性优化合成的alALP成熟肽基因被克隆在pPICZαA载体的α信号肽的末端和6×his标签之间(图2A和B)，重组质粒大小为4307bp。pPICZαA-alALP质粒经SacⅠ成功线性化(图2C)，电转化到毕赤酵母X-33中，用含博来霉素筛的YPD平板选，经PCR鉴定到泳道2、3、4、6为阳性克隆(图2D)。
2、重组蛋白ALP的表达和纯化
SDS-PAGE结果(图3A)显示，有5个克隆泳道在约35KD处出现目的蛋白条带，该位置的条带进一步被Western bloting所验证(图3B)。随后，本申请人从1L培养菌液中纯化到了2mg ALP蛋白，纯化的蛋白再次用SDS-PAGE(图3C)和Western blot分析验证(图3D)。
3、重组蛋白ALP抗凝血活性的体外检测
抗凝血活性检测试验结果显示，ALP能够显著延长凝血酶原时间(PT)，凝血酶时间(TT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)(表1-3和图4)。肝素ALP组和肝素组分别与空白对照组的T检验结果显示，两组间差异显著(P≤0.001)，具有统计学意义，结果如表1、表2、表3和图4所示，图4中，图A为活化部分凝血活酶时间(APTT)的检测图，重复测量次数为5次，ALP组(3.8ug)和肝素组(1.034x10-2ug)分别与空白对照组的T检验结果显示，两组间差异显著(P≤0.001)，具有统计学意义；图B为凝血酶时间(TT)的检测图，重复测量次数为5次，ALP组(34ug)和肝素组(1.034ug)分别与空白对照组的T检验结果显示，两组间差异显著(P≤0.001)，具有统计学意义；图C为凝血酶原时间(PT)的检测图，重复测量次数为5次，ALP组(340ug)和肝素组(1.034ug)分别与空白对照组的T检验结果显示，两组间差异显著(P≤0.001)，具有统计学意义；图D为不同浓度梯度ALP的APTT、TT和PT的检测图，重复测量次数为5次，随着着ALP浓度的不断增加，APTT、TT和PT值逐渐延长。
本发明方法利用pPICZαA载体的毕赤酵母表达系统(pPICZαA-ALP X33)表达的ALP蛋白能够正确分泌表达表达上清中，经纯化后具有抗凝血活性，在体外能够显著延长凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)，可作为一种新型抗凝剂使用，更为进一步研究其作为预防和治疗血栓栓塞性等血管性疾病的新型抗凝剂的可行性奠定了研究基础。因此，如果本发明被广泛证明并运用于临床将具备积极的社会效益和可观的经济效益。
表1 PT值检测表
表2 APTT值检测表
表3 TT值检测表
由此可以看出，本发明方法新型抗凝剂白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP的表达制备方法制得的蛋白ALP可以应用在抗凝剂方面，可作为体外抗凝聚，能显著延迟APTT、PT和TT值。
Claims (5)
1.一种新型抗凝剂白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP的表达制备方法，其特征在于：步骤如下：
⑴优化合成ALP成熟肽DNA
按毕赤酵母密码子偏好性优化合成，优化合成的ALP成熟肽基因序列为：序列1；
序列2、序列3分别为EcoR I、Xba I的酶切位点；
⑵重组质粒pPICZαA-ALP的构建
①双酶切
优化合成的ALP成熟肽DNA和质粒pPICZαA经EcoR I和Xba I双酶切，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收酶切产物，酶切后得目的基因ALP；
优化合成的ALP成熟肽DNA的酶切体系和条件如下：
补充ddH2O至20μl体系，22-37℃水浴反应5min-4h，60-80℃灭活5-10min；
质粒pPICZαA的酶切体系同以上体系，反应条件相同，得酶切后pPICZαA质粒；
酶切产物经l％琼脂糖凝胶电泳鉴定，琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化目的片段，得目的基因ALP；
②连接
目的基因ALP与酶切后质粒pPICZαA按10：1摩尔比混合于反应体系中，16-25℃水浴连接5min-4h，得连接产物；
20μl的反应体系如下：
③转化和阳性克隆的鉴定
于冰上，取连接产物2μl加入100μl E.coli DH5α感受态细胞中，冰浴30min后，42℃热激转化90sec，冰浴1-3min，加入LB液体培养基700μl；37℃振荡培养1-2h，取菌液涂于含博来霉素50-150μg/ml的LB低盐平板上；37℃过夜培养，挑取阳性克隆接种于含博来霉素50-150μg/ml的LB低盐培养液中；37℃振荡培养10-16h，提取质粒，用EcoR I和XbaI进行双酶切鉴定，结果经1％琼脂糖凝胶电泳分析；
④线性化
取PCR和双酶切均鉴定为阳性克隆的菌液，用含博来霉素50-150μg/ml的LB低盐培养液扩大培养后，提取全部质粒；取纯化的单拷贝质粒，用SacI完全酶切，琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化DNA片段，溶解于10-30μl的无菌去离子水，得线性化的单拷贝质粒；
SacI线性化酶切体系如下：
10×FastDigest buffer 5μl；
纯化的单拷贝质粒 8-10μg；
SacI 2-6μl；
补充ddH2O至50μl体系，22-37℃水浴反应1-4h，60-80℃灭活5-10min；
⑤毕赤酵母X-33感受态细胞的制备
挑取YPD平板上X-33菌株接种接入20ml YPD培养基，29℃，250rpm培养至OD600＝1.3-1.5，4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用10ml冰浴的无菌去离子水重新悬浮细胞；4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用5ml冰冷的无菌去离子水悬浮重新悬浮细胞；4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用2ml冰冷的无菌1M山梨醇悬浮重新悬浮细胞；4℃，1500g，离心5min沉淀细胞，用200ul冰冷的无菌1M山梨醇悬浮，得X-33感受态细胞；
⑥电转化
按线性化的单拷贝质粒：X-33感受态细胞的体积比为1：8的比例，分别取线性化的单拷贝质粒加入X-33感受态细胞并轻轻混匀，转入预冷电转杯，冰上放置5min，放入电转仪，电击转化，电压：1500V，电击时间：分别为5.4ms 5.6ms，电击完成后，立即加入1ml、1M冰浴的山梨醇，混匀后转移到离心管中，28-30℃，静止1h，涂含博来霉素50-150μg/ml的YPDS平板；28-30℃，培养2-4d，得转化子；
⑦提取酵母基因组
挑取转化子于含100ug/ml博来霉素的YPD液体培养基中，30度，220rpm/min过夜培养，次日提取转化子酵母基因组；
⑧pPICZαA-ALPX33阳性菌株的PCR鉴定
提取的酵母基因组利用通用引物5’AOX1和3’AOX1进行PCR鉴定，引物序列如下：
5’AOX1：序列4；
3’AOX1：序列5；
PCR反应体系为：条件为：PCR参数：55℃退火30s，25-30个循环；
PCR反应体系为：
PCR反应条件为：
共设定25-30个循环，最后于72℃条件下延伸5-10min。
PCR产物经l％琼脂糖凝胶电泳鉴定，得阳性克隆子；
⑶重组蛋白ALP的表达和纯化
①诱导表达和优化条件
划线阳性克隆子于YPD平板，2天后挑取单菌落接种于BMGY培养基中，生长40h-48h，4℃8000rpm离心5-10min，将沉淀换至含体积分数0.5-1.0％甲醇的培养基BMMY，28-30℃，220-250rpm/min诱导表达；
②大量表达和纯化
甲醇诱导24-72h后，全部取样，经冻干20倍浓缩，过滤，按照Ni-NTAAgarose试剂盒说明书纯化目的蛋白，然后将目的蛋白经1％(质量百分数)PBS、pH＝7.0透析过夜，超滤器浓缩于Tris-HCl缓冲液pH 8.0中，-20℃冻存，即得白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP。
2.根据权利要求1所述的新型抗凝剂白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP的表达制备方法，其特征在于：所述培养基的组成及配制方法如下：
LB低盐培养基(1L)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g；
YPD液体培养基：l％酵母浸出粉，2％蛋白胨，2％D-葡萄糖，加双蒸水定容后，高温高压灭菌后，置4℃保存；
YPD固体培养基：1％酵母浸出粉，2％蛋白胨，2％D-葡萄糖，2％琼脂粉，加双蒸水定容后，高温高压灭菌后，置4℃保存；
YPDS培养基：1％酵母浸出粉，2％蛋白胨，2％D-葡萄糖，1M山梨醇，2％琼脂粉，加双蒸水定容后，高温高压灭菌后，置4℃保存；
BMGY：1％酵母浸出粉，2％蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液pH 6.0，1.34％酵母基础氮源，4×10-5％生物素，1％甘油；
BMMY：1％酵母浸出粉，2％蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液pH 6.0，1.34％酵母基础氮源，4×10-5％生物素，1％甲醇。
3.根据权利要求1所述的新型抗凝剂白纹伊蚊唾液腺白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP的表达制备方法，其特征在于：所述步骤⑶③中过滤使用0.45μm滤嘴过滤；所述超滤器为10KD。
4.根据权利要求1所述的新型抗凝剂白纹伊蚊唾液腺白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP的表达制备方法，其特征在于：所述步骤⑶重组蛋白ALP的表达和纯化的具体步骤为：
①诱导表达和优化条件
划线阳性克隆子于YPD平板，2天后挑取单菌落接种于BMGY培养基中，生长40h-48h，4℃8000rpm离心5-10min，将沉淀换至含体积分数0.5-1.0％甲醇的培养基BMMY，28-30℃，220-250rpm/min诱导表达；每隔24取样1ml，补上甲醇至终浓度0.5-1.0％，连取5天样品；将菌液在4℃条件下，10000rpm离心5-10min，收集上清，经冻干10倍浓缩，保存于-80℃备用；
②SDS-PAGE检测和Western Blot鉴定
取每天收集的样本各10μl分别跑10％的SDS-PAGE，结合考马斯亮蓝染色初步检测目的蛋白的表达情况；依据SDS-PAGE的结果，取相应时期的样本进行Western Blot鉴定；WesternBlot条件：一抗为小鼠源性的Anti-6X His antibody，按1:10000稀释，二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠，按1:50000稀释，用DAB显色；
③大量表达和纯化
甲醇诱导24-72h后，全部取样，经冻干20倍浓缩，过滤，按照Ni-NTAAgarose试剂盒说明书纯化目的蛋白；随后，所有洗脱于500mM咪唑中的目的蛋白，经1％(质量百分数)PBS(pH＝7.0)透析过夜，超滤器浓缩于Tris-HCl缓冲液pH 8.0中，-20℃冻存，即得白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP。
5.如权利要求1至4任一项所述的新型抗凝剂白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白ALP的表达制备方法制得的蛋白ALP在作为抗凝剂方面的应用。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113876931A (zh) * | 2021-10-15 | 2022-01-04 | 温州医科大学 | Def C蛋白用于抗登革病毒的用途及其表达方法 |
| CN115141840A (zh) * | 2022-07-05 | 2022-10-04 | 南京瑞源生物技术有限公司 | 一种酵母优化的工艺制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2361634A1 (en) * | 2010-02-25 | 2011-08-31 | Institut de Recherche pour le Développement | Proteins/peptides having immunogenic properties and their biological applications |
| CN102851264A (zh) * | 2011-06-30 | 2013-01-02 | 复旦大学 | 一种白纹伊蚊的Apyrase编码基因及其蛋白制备方法和用途 |
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2015
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2361634A1 (en) * | 2010-02-25 | 2011-08-31 | Institut de Recherche pour le Développement | Proteins/peptides having immunogenic properties and their biological applications |
| CN102851264A (zh) * | 2011-06-30 | 2013-01-02 | 复旦大学 | 一种白纹伊蚊的Apyrase编码基因及其蛋白制备方法和用途 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 吴松泉 等: "白纹伊蚊唾液三磷酸腺苷二磷酸酶在毕赤酵母中的分泌表达", 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 * |
| 李星潘 等: "白纹伊蚊唾液腺重组aegyptin相似蛋白alALP的制备及抗原性分析", 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113876931A (zh) * | 2021-10-15 | 2022-01-04 | 温州医科大学 | Def C蛋白用于抗登革病毒的用途及其表达方法 |
| CN115141840A (zh) * | 2022-07-05 | 2022-10-04 | 南京瑞源生物技术有限公司 | 一种酵母优化的工艺制备方法 |
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