CN107841491A - 一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法 - Google Patents

一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107841491A
CN107841491A CN201711072129.3A CN201711072129A CN107841491A CN 107841491 A CN107841491 A CN 107841491A CN 201711072129 A CN201711072129 A CN 201711072129A CN 107841491 A CN107841491 A CN 107841491A
Authority
CN
China
Prior art keywords
expression
thyroid peroxidase
hpp
pfbdm
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711072129.3A
Other languages
English (en)
Inventor
刘阳坤
姚伦广
尹延震
王铁军
胡小敏
李娜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanyang Normal University
Original Assignee
Nanyang Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanyang Normal University filed Critical Nanyang Normal University
Priority to CN201711072129.3A priority Critical patent/CN107841491A/zh
Publication of CN107841491A publication Critical patent/CN107841491A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y111/00—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11)
    • C12Y111/01—Peroxidases (1.11.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/34—Vector systems having a special element relevant for transcription being a transcription initiation element

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，是通过TC表达框对杆状病毒转移载体pFBDM‑IG进行改造，通过提高细胞活率和延长蛋白表达时间来增加甲状腺过氧化物酶在杆状病毒表达系统中的表达量。本发明的有益效果为：本发明提供的表达方法，包含有：杆状病毒反式激活因子IE0/1，嵌合启动子HPP，杆状病毒极晚期启动子polh，内部核糖体进入位点IRES基因和GFP基因，其中GFP基因表达可以产生绿色荧光蛋白，用于在病毒转染和感染时的细胞荧光观察；方法为：TC表达框构建，转移载体pFBDM‑TC‑TPO‑IG构建，Tn7位点转座，重组菌液感染Sf9细胞获得重组杆状病毒和甲状腺过氧化物酶表达量检测。本发明将甲状腺过氧化物酶表达量增加了约1.7倍，有效提高了甲状腺过氧化物酶的表达量。

Description

一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法。
背景技术
甲状腺过氧化物酶(thyroid peroxidase,TPO)是一种含有血红素辅基的膜结合糖蛋白，整个分子分为膜内区，跨膜区和膜外区，cDNA全长3kb，跨膜区的存在使TPO在表达时难以分泌出来，具有催化活性的部分伸向充满胶质滤泡腔的内部。TPO作为甲状腺激素在生物机体内合成过程中的一种重要酶，能参与催化碘的活化、甲状腺球蛋白上酪氨酸残基的碘化及碘化酪氨酸残基的偶联过程，最终生成甲状腺素(T3、T4)。TPO同时也是甲状腺微粒体的主要抗原组成成分，当生物体甲状腺发生病变，导致滤泡细胞的生物结构受到破坏时，TPO随即经过甲状腺滤泡细胞腔的边缘部分即甲状腺细胞顶部的部位向外周血进行遗漏，从而刺激机体进行免疫系统调节，免疫系统随即产生TPO抗体(TPO-Ab)以应对刺激。
人体自身免疫性甲状腺疾病(Autoimmune thyroid diseases，AITD)的发病机理是由T细胞介导的器官特异自身免疫性疾病，其生物学特征是患者血清内会产生针对甲状腺抗原的多种自身抗体。甲状腺过氧化物酶抗体就是其中最重要的一种，普遍存在于自身免疫性损伤的甲状腺疾病中，血清中甲状腺过氧化物酶抗体水平的测定，是对自身免疫性甲状腺疾病高危人群筛查、诊断和治疗的有效手段。因此，TPO-Ab水平的检测可以用于对AITD等甲状腺疾病的诊断、治疗和愈后观察。对于AITD的诊断，TPO-Ab检测较甲状腺微粒体抗体(TM-Ab)检测更加灵敏、特异和可靠，是诊断AITD的一项必不可少的实验室指标，TPO-Ab含量的高低目前在国际上已成为AITD的一常规检测项目。对原发性甲状腺机能减退的患者，结合hTSH升高情况，可以发现早期甲状腺机能减退病人。TPO-Ab的测定还可作为Graves病、桥本甲亢等诊断和鉴别诊断的生化首选检测指标。所以，对TPO的高效、低成本表达进行研究显得尤为重要。
目前国内使用的TPO抗原都来自进口，其价格大约为10000元/mg，不但成本较高，而且往往购买周期较长，无法满足临床的需求。而且有关TPO制备的文献报道也十分稀少，因TPO抗原具有分子量大，糖基化、磷酸化等蛋白质翻译后修饰过程十分丰富等特点，导致原核表达系统无法表达出高活性的TPO蛋白，目前只能使用蛋白表达量相对较低的传统杆状病毒表达系统进行表达，成本十分昂贵，严重阻碍了这种检测方法的大规模应用。因此，提高杆状病毒表达系统生产TPO蛋白的表达量对TPO蛋白研究和应用具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，是通过TC表达框对杆状病毒转移载体pFBDM-IG进行改造，通过提高细胞活率和延长蛋白表达时间来增加甲状腺过氧化物酶在杆状病毒表达系统中的表达量；所述TC表达框包括嵌合启动子HPP和杆状病毒反式激活因子IE0/1。
进一步的，上述一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，提高细胞活率是指利用极晚期启动子polh驱动杆状病毒反式激活因子IE0/1的表达。
进一步的，上述一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，延长蛋白表达时间是指利用嵌合启动子HPP替换晚期启动子p10来驱动甲状腺过氧化物酶基因的表达。
进一步的，上述一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，具体包括以下步骤：
1)TC表达框的构建：
利用融合PCR构建嵌合启动子HPP，所述嵌合启动子HPP包括转录增强序列hr1、杆状病毒强启动子p10和p6.9；利用PCR方法分别获得IE0基因、IE1基因，然后以重叠PCR方法将IE0基因和IE1基因融合为IE0/1基因，利用常规酶切克隆方法将IE0/1基因克隆于pFBDM-IG转移载体的polh启动子下游，将嵌合启动子替换p10启动子，获得含有TC表达框的杆状病毒转移载体pFBDM-TC-IG；
2)转移载体pFBDM-TC-TPO-IG的构建：
将TPO-pMD19Tsimple载体和pFBDM-TC-IG载体分别用EcoRI和SalI进行酶切、胶回收、连接、转化、酶切验证和测序，得到正确的pFBDM-TC-TPO-IG；
3)Tn7位点的转座：
制备AcMultiBac/rSW106-inv+asd-感受态细胞，加入5μL pFBDM-TC-TPO-IG质粒，冰浴30min，42℃热激90s，冰上放置2min，然后加入800μL含有DAP的LB培养基，32℃200rpm恒温摇床上振荡培养6h，涂布含Kan/Tet/Spe/Gm/DAP/IPTG/X-gal的固体LB平板上，32℃培养箱中培养24～48h，直至出现蓝白斑；挑取3～5个白斑于含Kan/Tet/Spe/Gm/DAP的LB培养液中32℃220rpm振荡培养，然后用TPO特异性引物进行菌液PCR验证，验证正确的菌液保存备用；
4)重组菌液感染Sf9细胞获得重组杆状病毒：
将构建的pFBDM-TC-TPO-IG/rSW106-inv+asd-重组菌液，按照以下方法感染Sf9细胞：用含8％FBS的Grace's培养基培养Sf9细胞于50mL培养瓶中，当细胞生长70％到80％单层之间，吹下细胞，铺于24孔板中，28℃培养一夜；第二天用双无培养基轻轻清洗3次，洗掉完全培养基；将鉴定正确的含有重组杆状病毒穿梭质粒的大肠杆菌过夜培养后取1mL菌液到1.5mL EP管里，5000rpm离心3min，倒掉上清，用PBS重悬菌体，5 000rpm离心3min，重复洗2次，倒掉上清，加入1mL双无培养基，在另外的装有500μL双无培养基的1.5ml EP管里稀释100倍、1 000倍；将稀释成100倍、1 000倍的500μL菌液与双无培养基混合液加入24孔板中，28℃孵育4h，将菌液与双无培养基混合液吸出，加入500μL完全培养基；3d后观察荧光检测是否感染成功；将有荧光的细胞上清收集起来即为P1代重组病毒，将P1代重组病毒感染新的Sf9细胞得到P2代重组病毒；
5)甲状腺过氧化物酶表达量的检测：
收集病毒感染的Sf9细胞，离心收集上清，用RIPA细胞裂解液将细胞沉淀裂解，然后以细胞上清和细胞沉淀为样品分别做ELISA检测。
进一步的，上述一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，所述步骤1)中，pFBDM-IG转移载体是在pFBDM原始载体的BstBI和PstI中插入IRES和GFP基因，IRES基因，即内部核糖体进入位点，介导核糖体与RNA结合，起始蛋白质翻译；GFP基因表达产生绿色荧光蛋白，在病毒转染和感染时起到报告基因的作用，IRES有助于GFP蛋白的表达。
进一步的，上述一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，所述步骤1)中的基因包括：
a)杆状病毒IE0基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
b)杆状病毒IE1基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
c)嵌合启动子HPP基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
进一步的，上述一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，所述步骤1)中的IE0/1基因片段，通过以下引物对扩增获得，其中，
IE0基因的扩增引物如下：
IE0-F序列如SEQ ID No.4所示；5'-aaggatccaacatgataagaaccagc-3'；
IE0-R序列如SEQ ID No.5所示；5'-gccgccagtgtcaacttgcaactgctgagcttctgcgca-3'；
IE1基因的扩增引物如下：
IE1-F序列如SEQ ID No.6所示；5'-gcttgcgcagaagctcagcagttgcaagttgacactg-3'；
IE1-R序列如SEQ ID No.7所示；5'-ccgtcgacttaattaaattcgaatttttt-3'；
IE0/1基因片段使用IE0-F和IE1-R引物进行扩增。
进一步的，上述一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，所述步骤1)中的HPP基因片段的扩增引物如下：
HPP-F1序列如SEQ ID No.8所示；5'-actagtcgtcgaccgaaattccgttttgcg-3'；
HPP-R1序列如SEQ ID No.9所示；5'-gctagcgtatacgtttaaattgtgtaattt-3'。
HPP-F2序列如SEQ ID No.10所示；5'-actagtgacatcatatttgagaataa-3'；
HPP-R2序列如SEQ ID No.11所示；5'-ctcgagatcttatctcataaacgcaact-3'。
进一步的，上述一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，所述甲状腺过氧化物酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。
本发明的有益效果为：本发明提供的一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，包含有特定的基因片段：嵌合启动子HPP，杆状病毒反式激活因子IE0/1，内部核糖体进入位点IRES基因和GFP基因。其中GFP基因表达可以产生绿色荧光蛋白，主要用于在病毒转染和感染时的细胞荧光观察；方法的具体操作步骤为：TC表达框的构建，转移载体pFBDM-TC-TPO-IG的构建，Tn7位点的转座，重组菌液感染Sf9细胞获得重组杆状病毒和甲状腺过氧化物酶表达量的检测。本发明将甲状腺过氧化物酶表达量增加了约1.7倍，有效提高了甲状腺过氧化物酶的表达量。
附图说明
图1为TC表达框的示意图。
图2为IE0/1基因的Overlap PCR扩增琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，1-3为IE0/1基因，M1为DL5000 DNA Marker，M2为DL2000DNA Marker。
图3为HPP基因片段1 PCR扩增琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，1为HPP基因片段1，M为DL2000 DNA Marker。
图4为HPP基因片段2 PCR扩增琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，1为HPP基因片段2，M为DL2000 DNA Marker。
图5为pFBDM-TC-TPO-IG质粒酶切琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，1为pFBDM-TC-TPO-IG质粒，2为pFBDM-TC-TPO-IG质粒MluI酶切，M1为Trans2K plus DNA Marker。
图6为重组穿梭载体菌液PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，Bac-TPO为pFBDM-TPO-IG质粒转座后穿梭载体，Bac-TC-TPO为pFBDM-TC-TPO-IG质粒转座后穿梭载体，C为阴性对照，M1为Trans2K plus DNA Marker。
图7为重组病毒感染的Sf9细胞荧光显微镜观察结果图，其中1为自然光照片，2为绿色荧光照片。
图8为重组病毒感染的Sf9细胞Western blotting结果图，其中1为BV-TPO病毒感染Sf9细胞，2为BV-TC-TPO病毒感染Sf9细胞，M为Protein Marker。
图9为重组病毒感染Sf9细胞ELISA检测结果图。
具体实施方式
实施例1：
1、构建TC表达框：
TC表达框含有IE0基因、IE1基因、嵌合启动子HPP基因，IRES和GFP基因(见图1)，其具体构建步骤如下：
(1)IE0/1基因的PCR扩增：以AcMNPV基因组为模板，先利用IE0-F和IE0-R为引物扩增出IE0基因片段，再以AcMNPV基因组为模板，利用IE1-F和IE1-R为引物扩增出IE1基因片段，最后利用Overlap PCR技术将IE0基因片段和IE1基因片段，基因序列长度为1994bp(见图2)；
(2)嵌合启动子HPP基因片段1的PCR扩增：以AcMNPV基因组为模板，先利用HPP F1和HPP R1为引物扩增出HPP基因片段1，基因序列长度为352bp(见图3)；
(3)嵌合启动子HPP基因片段2的PCR扩增：以AcMNPV基因组为模板，先利用HPP F2和HPP R2为引物扩增出HPP基因片段2，基因序列长度为554bp(见图3)；
(4)转移载体pFBDM-TC-IG的构建：将IE0-1基因通过BamHI和SalI克隆于转移载体pFBDM-IG的polh启动子下游，将HPP基因片段1和HPP基因片段2依次克隆于p10启动子上游，得到重组转移载体pFBDM-TC-IG(见图4)。
2、构建转移载体pFBDM-TC-TPO-IG：
将TPO-pMD19Tsimple载体和pFBDM-TC-IG载体分别用EcoRI和SalI进行酶切、胶回收、连接、转化、酶切验证，阳性质粒酶切出3227bp和8298bp的特异性条带(见图5)。
3、Tn7位点的转座：
(1)AcMulitBacmid/SW106/asd-/inv+感受态细胞的制备方法采用CaCl2法，制备过程大致如下：将保存于-80℃冰箱的菌种划线培养于Kan/Tet/Spe/DAP/IPTG/X-Gal的LB固体培养基上32℃培养48h左右，然后挑取蓝色单菌落放于相应抗性的LB培养液中32℃摇菌过夜。第二天，取菌液按照1:100的比例加入到新鲜的LB培养液中振荡培养至OD600达到0.2时加入终浓度为0.1％的L-阿拉伯糖继续培养，待OD600达到0.4～0.6时，转移菌液于干净的EP管中，冰置30min，然后4℃3000g离心10min；将细胞沉淀用25mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液重悬起来，冰置30min，4℃3000g离心10min；再依次用10mL和1mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬离心，最后加入终浓度为15％的甘油混匀，分装并立即冻存于-80℃超低温冰箱中备用。
2)pFBDM-TC-TPO-IG质粒的转座：从-80℃超低温冰箱中取1支
AcMulitBacmid/SW106/asd-/inv+感受态细胞放于冰上解冻，待感受态细胞溶化后加入1ng质粒轻轻混匀，然后冰浴30min后在42℃水浴锅中热激90s，加入800μL新鲜的含DAP营养素的LB培养液，32℃摇床上活化复苏6h左右，然后涂于含有合适抗生素的LB固体培养基上，然后放于32℃恒温培养箱中培养。24～48h后挑取白色单克隆摇菌并进行菌液PCR鉴定，PCR扩增得到1105bp的特异性条带(见图6)
4、构建重组杆状病毒：
用含8％FBS的Grace's培养基培养Sf9细胞于50mL培养瓶中，当细胞生长70％到80％单层之间，吹下细胞，铺于24孔板中，28℃培养一夜。第二天用双无培养基轻轻清洗3次，洗掉完全培养基。将鉴定正确的含有重组杆状病毒穿梭质粒的大肠杆菌过夜培养后取1mL菌液到1.5mL EP管里，5 000rpm离心3min，倒掉上清，用PBS重悬菌体，5 000rpm离心3min，重复洗2次，倒掉上清，加入1mL双无培养基，在另外的装有500μL双无培养基的1.5mlEP管里稀释100倍、1 000倍。将稀释成100倍、1 000倍的500μL菌液与双无培养基混合液加入24孔板中，28℃孵育4h，将菌液与双无培养基混合液吸出，加入500μL完全培养基。3d后观察荧光(见图7中1为明视野下Sf9细胞，2为激发光下细胞荧光)。
5、甲状腺过氧化物酶表达量检测：
Western blotting验证：病毒感染Sf9细胞96h后，收集细胞进行裂解，然后以小鼠抗6×His标签单克隆抗体为一抗，以HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体为二抗进行Westernblotting分析，重组病毒在94kDa左右有一明显的特异性条带(见图8)。
ELISA检测：对重组病毒感染24h、48h、72h和96h后的细胞样品用ELISA试剂盒测定TPO活性，在酶标仪波长450nm处读取数据。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，其特征在于，是通过TC表达框对杆状病毒转移载体pFBDM-IG进行改造，通过提高细胞活率和延长蛋白表达时间来增加甲状腺过氧化物酶在杆状病毒表达系统中的表达量；所述TC表达框包括嵌合启动子HPP和杆状病毒反式激活因子IE0/1。
2.根据权利要求1所述的一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，其特征在于，提高细胞活率是指利用极晚期启动子polh驱动杆状病毒反式激活因子IE0/1的表达。
3.根据权利要求1所述的一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，其特征在于，延长蛋白表达时间是指利用嵌合启动子HPP替换晚期启动子p10来驱动甲状腺过氧化物酶基因的表达。
4.根据权利要求1所述的一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)TC表达框的构建：
利用融合PCR构建嵌合启动子HPP，所述嵌合启动子HPP包括转录增强序列hr1、杆状病毒强启动子p10和p6.9；利用PCR方法分别获得IE0基因、IE1基因，然后以重叠PCR方法将IE0基因和IE1基因融合为IE0/1基因，利用常规酶切克隆方法将IE0/1基因克隆于pFBDM-IG转移载体的polh启动子下游，将嵌合启动子替换p10启动子，获得含有TC表达框的杆状病毒转移载体pFBDM-TC-IG；
2)转移载体pFBDM-TC-TPO-IG的构建：
将TPO-pMD19Tsimple载体和pFBDM-TC-IG载体分别用EcoRI和SalI进行酶切、胶回收、连接、转化、酶切验证和测序，得到正确的pFBDM-TC-TPO-IG；
3)Tn7位点的转座：
制备AcMultiBac/rSW106-inv+asd-感受态细胞，加入5μL pFBDM-TC-TPO-IG质粒，冰浴30min，42℃热激90s，冰上放置2min，然后加入800μL含有DAP的LB培养基，32℃200rpm恒温摇床上振荡培养6h，涂布含Kan/Tet/Spe/Gm/DAP/IPTG/X-gal的固体LB平板上，32℃培养箱中培养24～48h，直至出现蓝白斑；挑取3～5个白斑于含Kan/Tet/Spe/Gm/DAP的LB培养液中32℃220rpm振荡培养，然后用TPO特异性引物进行菌液PCR验证，验证正确的菌液保存备用；
4)重组菌液感染Sf9细胞获得重组杆状病毒：
将构建的pFBDM-TC-TPO-IG/rSW106-inv+asd-重组菌液，按照以下方法感染Sf9细胞：用含8％FBS的Grace's培养基培养Sf9细胞于50mL培养瓶中，当细胞生长70％到80％单层之间，吹下细胞，铺于24孔板中，28℃培养一夜；第二天用双无培养基轻轻清洗3次，洗掉完全培养基；将鉴定正确的含有重组杆状病毒穿梭质粒的大肠杆菌过夜培养后取1mL菌液到1.5mL EP管里，5000rpm离心3min，倒掉上清，用PBS重悬菌体，5 000rpm离心3min，重复洗2次，倒掉上清，加入1mL双无培养基，在另外的装有500μL双无培养基的1.5ml EP管里稀释100倍、1 000倍；将稀释成100倍、1 000倍的500μL菌液与双无培养基混合液加入24孔板中，28℃孵育4h，将菌液与双无培养基混合液吸出，加入500μL完全培养基；3d后观察荧光检测是否感染成功；将有荧光的细胞上清收集起来即为P1代重组病毒，将P1代重组病毒感染新的Sf9细胞得到P2代重组病毒；
5)甲状腺过氧化物酶表达量的检测：
收集病毒感染的Sf9细胞，离心收集上清，用RIPA细胞裂解液将细胞沉淀裂解，然后以细胞上清和细胞沉淀为样品分别做ELISA检测。
5.根据权利要求4所述的一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，其特征在于，所述步骤1)中，pFBDM-IG转移载体是在pFBDM原始载体的BstBI和PstI中插入IRES和GFP基因，IRES基因，即内部核糖体进入位点，介导核糖体与RNA结合，起始蛋白质翻译；GFP基因表达产生绿色荧光蛋白，在病毒转染和感染时起到报告基因的作用，IRES有助于GFP蛋白的表达。
6.根据权利要求5所述的一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，其特征在于，所述步骤1)中的基因包括：
a)杆状病毒IE0基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
b)杆状病毒IE1基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
c)嵌合启动子HPP基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
7.根据权利要求6所述的一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，其特征在于，所述步骤1)中的IE0/1基因片段，通过以下引物对扩增获得，其中，
IE0基因的扩增引物如下：
IE0-F序列如SEQ ID No.4所示；
IE0-R序列如SEQ ID No.5所示；
IE1基因的扩增引物如下：
IE1-F序列如SEQ ID No.6所示；
IE1-R序列如SEQ ID No.7所示；
IE0/1基因片段使用IE0-F和IE1-R引物进行扩增。
8.根据权利要求7所述的一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，其特征在于，所述步骤1)中的HPP基因片段的扩增引物如下：
HPP-F1序列如SEQ ID No.8所示；
HPP-R1序列如SEQ ID No.9所示。
HPP-F2序列如SEQ ID No.10所示；
HPP-R2序列如SEQ ID No.11所示。
9.根据权利要求3所述的一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，其特征在于，所述甲状腺过氧化物酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。
CN201711072129.3A 2017-11-03 2017-11-03 一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法 Pending CN107841491A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711072129.3A CN107841491A (zh) 2017-11-03 2017-11-03 一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711072129.3A CN107841491A (zh) 2017-11-03 2017-11-03 一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107841491A true CN107841491A (zh) 2018-03-27

Family

ID=61681406

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711072129.3A Pending CN107841491A (zh) 2017-11-03 2017-11-03 一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107841491A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109022382A (zh) * 2018-09-05 2018-12-18 郑州伊美诺生物技术有限公司 悬浮培养昆虫细胞制备重组tpo蛋白的方法
CN112051402A (zh) * 2020-09-15 2020-12-08 郑州伊美诺生物技术有限公司 一种定量检测甲状腺过氧化物酶的试剂盒和非诊断目的检测方法
CN112501141A (zh) * 2020-10-22 2021-03-16 重庆中元汇吉生物技术有限公司 一种增加人甲状腺过氧化物酶产量的试剂和表达方法
CN114196643A (zh) * 2021-12-24 2022-03-18 中元汇吉生物技术股份有限公司 一种纯化tpo的工艺及方法
CN115850397A (zh) * 2022-07-22 2023-03-28 南阳师范学院 一种ii型草鱼呼肠孤病毒样颗粒及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105861458A (zh) * 2016-04-20 2016-08-17 南阳师范学院 甲状腺过氧化物酶表达方法
CN107184968A (zh) * 2017-04-18 2017-09-22 中农威特生物科技股份有限公司 一种a型赛尼卡谷病毒样颗粒疫苗及其制备方法和用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105861458A (zh) * 2016-04-20 2016-08-17 南阳师范学院 甲状腺过氧化物酶表达方法
CN107184968A (zh) * 2017-04-18 2017-09-22 中农威特生物科技股份有限公司 一种a型赛尼卡谷病毒样颗粒疫苗及其制备方法和用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PUI SETO: "Autoantibodies in the sera of patients with autoimmune thyroid disease recognize a secreted form of human thyroid peroxidase generated in a baculovirus system", 《MOLECULAR AND CELLULAR ENDOCRINOLOGY》 *
刘高强: "昆虫杆状病毒表达系统的研究与应用进展", 《中国生物工程杂志》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109022382A (zh) * 2018-09-05 2018-12-18 郑州伊美诺生物技术有限公司 悬浮培养昆虫细胞制备重组tpo蛋白的方法
CN112051402A (zh) * 2020-09-15 2020-12-08 郑州伊美诺生物技术有限公司 一种定量检测甲状腺过氧化物酶的试剂盒和非诊断目的检测方法
CN112501141A (zh) * 2020-10-22 2021-03-16 重庆中元汇吉生物技术有限公司 一种增加人甲状腺过氧化物酶产量的试剂和表达方法
CN114196643A (zh) * 2021-12-24 2022-03-18 中元汇吉生物技术股份有限公司 一种纯化tpo的工艺及方法
CN115850397A (zh) * 2022-07-22 2023-03-28 南阳师范学院 一种ii型草鱼呼肠孤病毒样颗粒及其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107841491A (zh) 一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法
CN101477126A (zh) 一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测的方法
CN113121704B (zh) 基于纳米颗粒的冠状病毒疫苗
CN103033626B (zh) 猪tgev抗体与猪pedv抗体胶体金试纸条
CN104725517B (zh) 一种提高酵母细胞表面目的蛋白展示量的方法
CN105861458A (zh) 甲状腺过氧化物酶表达方法
CN108912214A (zh) 肠道病毒71型vp1抗原的免疫原性多肽及其制备方法与应用
CN111413499A (zh) 一种检测禽腺病毒i群的间接免疫荧光试剂盒
CN102816246B (zh) 一种人巨细胞病毒免疫原融合蛋白及其制备方法和用途
CN102643835A (zh) 大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白的原核表达及多抗制备和应用
CN105925597A (zh) 一种pedv s基因主要抗原表位串联的重组基因及其制备方法和应用
CN104894045B (zh) 一种共表达口蹄疫病毒vp1基因与免疫佐剂牛il-6基因的重组乳酸杆菌及其制备方法和应用
CN109652450A (zh) 一种猪用疫苗载体
CN110079543B (zh) 一种蓝舌病病毒核心样颗粒的制备方法
CN108130340B (zh) 表达鸭源禽流感病毒ns1蛋白的方法以及该方法的应用
CN105949320A (zh) 埃可病毒1型vp1蛋白特异性抗原表位及其融合蛋白的制备、应用
CN102604993A (zh) 免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制备方法
CN104744595A (zh) 抗草鱼出血病病毒工程蛋白tat-vp7-tat及制备方法和应用
CN112730829B (zh) 一种快速检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的胶体金试纸条及其应用
CN107266580A (zh) 一种优化的基于细菌细胞表面展示系统的目标物捕获体系
CN104004093B (zh) 一种抗人甲状旁腺激素的纳米抗体及其筛选方法和应用
CN102559614A (zh) 一种猪瘟疫苗及其制备方法
CN106397602A (zh) 一种分子佐剂加强型鸡马立克氏病蛋白工程疫苗
CN104711288A (zh) 重组载体、利用该载体制备的重组杆状病毒以及该病毒在疟疾疫苗制备中的应用
CN110221080A (zh) 一种人源诺如病毒免疫胶体金试剂盒及细胞株

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180327