CN110079543B - 一种蓝舌病病毒核心样颗粒的制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种同时表达蓝舌病病毒vp3和vp7蛋白的大肠杆菌以及蓝舌病病毒核心样颗粒的制备方法。本申请将蓝舌病病毒vp3基因和vp7基因插入到双表达载体pETDuet‑1，构建原核双表达质粒pETDuet‑VP3‑VP7，并转化表达型大肠杆菌BL21(DE3)中，获得含原核双表达质粒pETDuet‑VP3‑VP7的表达菌，自诱导表达后，通过超声破碎和蔗糖梯度离心获得蓝舌病病毒核心样颗粒。本申请实现了以原核表达方式高量高纯度表达具有良好免疫活性的蓝舌病病毒核心样颗粒。

Description

一种蓝舌病病毒核心样颗粒的制备方法

技术领域

本申请涉及分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种同时表达蓝舌病病毒VP3和VP7蛋白的原核表达系统。

背景技术

蓝舌病(Bluetongue,BT)是由呼肠孤病毒科、环状病毒属蓝舌病病毒(Bluetonguevirus,BTV)引起，主要是由库蠓传播的反刍动物非接触性病毒性传染病。蓝舌病已被世界动物卫生组织(OIE)认为是影响反刍动物最重要的疾病之一。蓝舌病早在19世纪发现于南非，并蔓延到热带、亚热带和温带等多个地区。1979年我国首次在云南省确定蓝舌病的发生后，相继又在湖北省、安徽省、四川省、山西省爆发过此病。现已确认有26种血清型，而我国主要的致病血清型为16型。近年来在我国的蓝舌病流行呈上升趋势，如何有效的控制该病的流行，引起越来越多人的关注。

目前，我国已经研制出蓝舌病的弱毒疫苗和灭活疫苗，但它们保护效果欠佳，并且存在一些弊端，因此研究者将目光转移到研制新型基因工程疫苗上，主要集中在蓝舌病病毒样颗粒的研究上，通过重组杆状病毒在sf9细胞中共表达蓝舌病病毒VP3和VP7蛋白，获得蓝舌病病毒核心样颗粒。但该方法不能用于大规模生产，同时还存在杆状病毒污染造成公共卫生安全隐患的风险。现有技术中也有个别采用原核表达系统分别表达VP2-VP7等，随后再混合组装病毒核心样颗粒，但该方法实际过程中效率低，操作繁琐，而且产生的病毒核心样颗粒数量少，且颗粒均一性较差，实际应用价值相对较低。

目前，国内外少有通过原核表达系统共表达获得蓝舌病病毒核心样颗粒的报道，基于此，提出本发明。

发明内容

本申请的目的之一是提供了一种共表达VP3和VP7的表达载体及其构建方法。

本申请的目的之二是提供了一种共表达VP3和VP7的表达菌及其构建方法。

本发明的目的之三是提供了一种蓝舌病病毒核心样颗粒的制备方法。

本申请的目的之四是提供了一种应用，该应用是利用构建的重组表达菌制备大量、高纯度的蓝舌病病毒核心样颗粒。

为实现上述目的，本申请提供了一种重组质粒pETDuet-VP3-VP7，它含有蓝舌病病毒蛋白VP3和VP7优化基因；

在一些实施方式中，所述VP3和VP7基因的优化序列分别如SEQ ID NO.1和2所示；

在一些实施方式中，所述质粒载体为pETDuet-1；所述蓝舌病病毒VP7基因插入pETDuet-1多克隆位点MSC2的酶切位点NdeI和AvrII之间；所述蓝舌病病毒VP3基因插入pETDuet-1多克隆位点MSC1的酶切位点NotI和NcoI之间；

本申请还提供了一种含有上述重组表达质粒的表达菌或宿主细胞，所述表达菌或宿主细胞为大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)；

本申请还提供了一种上述重组表达质粒或表达菌的构建方法，包括以下步骤：

1)合成VP7基因，获得重组质粒pUC–VP7；用限制性内切酶NdeI和AvrII分别对质粒pUC–VP7和载体pETDuet-1进行37℃双酶切1h，切胶回收获得线性的VP7和pETDuet-1；

2)通过T4 DNA连接酶，连接线性的VP7和pETDuet-1,16℃条件下连接3h；

3)通过热激转化的方式转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α，通过鉴定获得重组质粒pETDuet-VP7；

4)合成VP3基因，获得重组质粒pUC–VP7；限制性内切酶NotI和NcoI分别对质粒pUC–VP3和质粒pETDue-VP7进行双酶切，获得具有粘性末端的VP3和pETDuet-VP7；

5)通过T4 DNA连接酶，连接线性的VP3和pETDuet-VP7，16℃条件下连接4h；

6)通过热激转化的方式转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α，通过鉴定获得重组质粒pETDuet-VP3-VP7；

7)将重组质粒pETDuet-VP3-VP7通过热激转化的方式转化入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，鉴定后，获得含重组质粒pETDuet-VP3-VP7的表达菌。

本申请还提供一种蓝舌病病毒核心样颗粒的制备方法，包括以下步骤：

1)合成VP7基因，获得重组质粒pUC–VP7；用限制性内切酶NdeI和AvrII分别对质粒pUC–VP7和载体pETDuet-1进行37℃双酶切1h，切胶回收获得线性的VP7和pETDuet-1；

2)通过T4 DNA连接酶，连接线性的VP7和pETDuet-1,16℃条件下连接3h；

3)通过热激转化的方式转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α，通过鉴定获得重组质粒pETDuet-VP7；

4)合成VP3基因，获得重组质粒pUC–VP7；限制性内切酶NotI和NcoI分别对质粒pUC–VP3和质粒pETDue-VP7进行双酶切，获得具有粘性末端的VP3和pETDuet-VP7；

5)通过T4 DNA连接酶，连接线性的VP3和pETDuet-VP7，16℃条件下连接4h；

6)通过热激转化的方式转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α，通过鉴定获得重组质粒pETDuet-VP3-VP7；

7)将重组质粒pETDuet-VP3-VP7通过热激转化的方式转化入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，鉴定后，获得含重组质粒pETDuet-VP3-VP7的表达菌；

8)利用含重组质粒pETDuet-VP3-VP7的表达菌表达和纯化蓝舌病毒核心样颗粒的步骤。

在一些实施方式中，所述VP3和VP7基因序列分别如SEQ ID NO.1和2所示；

在一些实施方式中，所述表达和纯化蓝舌病毒核心样颗粒的步骤包括：

a、含重组质粒pETDuet-VP3-VP7的表达菌接种至自诱导培养基中，37℃诱导表达12h；

b、取诱导表达的菌液，12000rpm 4℃离心10min，弃上清，加入缓冲液重悬沉淀，超声破碎20min，12000rpm离心10min，收集上清；

c、取3mL上清，加入30％和50％蔗糖各1mL，4℃，26400rpm/min水平转头高速离心3h；

d、加入缓冲液，重悬沉淀物，即蓝舌病病毒核心样颗粒。

在一些实施方式中，所述蓝舌病病毒核心样颗粒的制备方法，还包括：9)醋酸铀负染蓝舌病病毒核心样颗粒，电镜观察颗粒形态。

本申请的有益效果在于：

1)本申请首次将蓝舌病病毒结构蛋白VP3和VP7基因插入到原核双表达载体中构建了重组原核双表达载体pETDuet-VP3-VP7，实现了在原核表达系统中共表达VP3和VP7蛋白，最终获得蓝舌病病毒核心样颗粒。

2)本发明通过将蓝舌病病毒结构蛋白VP3和VP7基因进行了序列优化，获得适于大肠杆菌共表达且能组装成具有免疫活性病毒杨颗粒。

3)相较于传统通过昆虫杆状病毒在sf9细胞中共表达VP3和VP7获得蓝舌病病毒核心样颗粒，本申请采用原核表达系统可以获得大量的蓝舌病病毒核心样颗粒，且只需要通过一次蔗糖梯度离心即可纯化，操作简单，生产成本低，易于大量获得。

4)相较于VP3和VP7单独表达后再混合组装的制备方式，本申请具有操作简单，成本低，病毒和核心样颗粒均一，以及颗粒活性高等优势。

5)经透射电镜观察以及免疫学试验证明，本申请原核表达系统中获得的蓝舌病病毒核心样颗粒，具有数量多、均一性好，且良好免疫学活性，利于工业化生产应用，在国内蓝舌病防控和研究方面具有十分广阔的应用。

附图说明

图1为本申请的实验技术流程图；

图2为本申请的重组表达质粒pETDuet-VP3-VP7图谱；

图3为本申请的重组质粒pETDuet-VP7菌落PCR和双酶切鉴定结果图，图中，1为菌落PCR结果，2为双酶切结果，3为DNA Marker；

图4为本申请的重组表达质粒pETDuet-VP3-VP7菌落PCR和双酶切鉴定结果图，图中，1为菌落PCR结果，2为双酶切结果，3为DNA Marker；

图5为本申请的含pETDuet-VP3-VP7的表达菌菌落PCR结果图，图中，1为以vp7上下游引物进行菌落PCR结果，2为以vp3上下游引物进行菌落PCR结果，3为DNA Marker；

图6为本申请的表达产物和核心样颗粒SDS-PAGE结果图，图中，1为蛋白Marker，2为含pETDuet-1的表达菌诱导结果，3为含pETDuet-VP3-VP7的表达菌诱导结果，4为纯化的核心样颗粒；

图7为本申请的核心样颗粒Western blot结果图，图中，1为核心样颗粒，2为含pETDuet-1的表达菌对照，3为蛋白Marker；

图8为本申请的核心样颗粒透射电镜结果图；

图9为本申请的免疫小鼠抗体水平分析图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。

实例1.靶基因的序列优化和pETDuet-VP7质粒的构建

(1)鉴于蓝舌病病毒的VP3和VP7天然基因难于在原核系统中共表达，本申请对VP3和VP7序列进行了分析优化，通过单因素试验设计一系列优化序列，经重组表达预实验，确立适于本申请的优化序列。具体地，VP3优化序列如SEQ ID NO.1所示,VP7优化序列如SEQID NO.2所示。

(2)根据优化后的VP7序列，参见SEQ ID NO.2,合成BTV-VP7整个开放阅读框(在VP7序列5’端引入NdeI酶切位点，3’端引入AvrII酶切位点)，从而获得的重组质粒pUC–VP7。

(3)用限制性内切酶NdeI和AvrII分别对质粒pUC–VP7和载体pETDuet-1进行双酶切，获得具有粘性末端的VP3和pETDuet-1。酶切体系如下：

37℃，反应1h。酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用Takara公司的琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收纯化。

(4)连接用T4 DNA连接酶将具有粘性末端的VP7和pETDuet-1进行连接，VP7和pETDuet-1mol数比约为4:1，16℃，连接2h。连接体系如下：

(5)转化将连接产物通过热激转化的方式转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α。取100ul感受态细胞DH5α在冰上融化，加入10μL连接产物，轻轻混匀。冰上放置30min。随后42℃水浴热激45s，再冰上放置2min。添加SOC培养基500μL，并与37℃振荡培养1h(160-225rpm)。取适量涂布于含Amp的LB平板，37℃过夜培养。

(6)阳性质粒的鉴定

挑取白色菌落，接种至含Amp的LB液体培养基中，37℃过夜培养。取少量菌液进行菌落PCR，琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。取菌落PCR阳性的菌液用Takara公司的质粒小量提取试剂盒进行小量质粒提取，并进行双酶切鉴定。选取菌落PCR和酶切鉴定均阳性的阳性质粒进行测序鉴定，即获得重组质粒pETDuet-VP7，结果见图3。

实例2.pETDuet-VP3-VP7质粒的构建

(1)根据优化后的VP3序列,参见SEQ ID NO.1,合成BTV-VP3整个开放阅读框(在VP3序列5’端引入NotI酶切位点，3’端引入NcoI酶切位点)，从而获得的重组质粒pUC–VP3。

(2)用限制性内切酶NotI和NcoI分别对质粒pUC–VP3和质粒pETDue-VP7进行双酶切，获得具有粘性末端的VP3和pETDuet-VP7。酶切体系如下：

37℃，反应1.5h。酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用Takara公司的琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收纯化。

(3)连接用T4 DNA连接酶将具有粘性末端的VP3和pETDuet-VP7进行连接，VP3和pETDuet-VP7mol数比约为5:1，16℃，连接3h。连接体系如下：

(4)转化将连接产物通过热激转化的方式转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α。取100ul感受态细胞DH5α在冰上融化，加入10μL连接产物，轻轻混匀。冰上放置30min。随后42℃水浴热激45s，再冰上放置2min。添加SOC培养基500μL，并与37℃振荡培养1h(160-225rpm)。取适量涂布于含Amp的LB平板，37℃过夜培养。

(5)阳性质粒的鉴定挑取白色菌落，接种至含Amp的LB液体培养基中，37℃过夜培养。取少量菌液进行菌落PCR，琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。取菌落PCR阳性的菌液用Takara公司的质粒小量提取试剂盒进行小量质粒提取，并进行双酶切鉴定。选取菌落PCR和酶切鉴定均阳性的阳性质粒进行测序鉴定，即获得重组质粒pETDuet-VP3-VP7，结果见图4。

实例3.含重组表达质粒pETDuet-VP3-VP7的表达菌的获得

(1)转化将重组表达质粒pETDuet-VP3-VP7通过热激转化的方式转化入表达型的大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)。取50ul感受态细胞BL21(DE3)在冰上融化，加入10ng重组表达质粒pETDuet-VP3-VP7。冰上放置30min。随后42℃水浴热激1min，再冰上放置2min。添加SOC培养基500μL，并与37℃振荡培养1h(160-225rpm)。取适量涂布于含Amp的LB平板，37℃过夜培养。

(2)阳性菌的鉴定采用菌落PCR方式鉴定阳性菌，即获得含重组表达质粒pETDuet-VP3-VP7的表达菌。

分别以VP7特异性引物(序列参见SEQ ID NO.3-4)和VP3特异性引物(序列参见SEQID NO.5-6)进行菌落PCR，结果能分别扩增出VP7基因和VP3基因，说明重组表达质粒pETDuet-VP3-VP7成功转化入表达菌BL21中，结果见图5。

实例4.蓝舌病病毒核心样颗粒的表达和纯化

(1)诱导表达：取少量含重组表达质粒pETDuet-VP3-VP7的表达菌接种至3mL含Amp的LB液体培养基中，37℃过夜培养。取过夜培养的菌液按照1:100的量加入到含Amp的自诱导表达培养基中，所述自诱导培养基为Overnight Express^TMInstant LBMedia，37℃，过夜诱导表达。

(2)超声裂解：取100mL的诱导表达后的菌液，12000rpm 4℃离心10min。按每克湿重菌体加4mL缓冲液(50mMTris–HCl，15mMNaClpH 8.4)，震荡重悬菌体。同时加入溶菌酶、核酸酶和蛋白酶抑制剂，冰上超声裂解20min。12000rpm离心10min，收集上清。

(3)蔗糖梯度离心：取3mL上清，加入30％和50％蔗糖各1mL。4℃，26400rpm/min水平转头高速离心3h。弃去所有液体，加入500ul缓冲液(50mMTris–HCl，15mMNaClpH 8.4)，轻轻混匀，即获得蓝舌病病毒核心样颗粒。SDS-PAGE以及Western Blot验证蓝舌病病毒核心样颗粒的纯度和免疫学活性。

SDS-PAGE结果见图6，与泳道2的pETDuet-1表达菌相比，泳道3的含pETDuet-VP3-VP7的表达菌在38KDa和100KDa大小的位置出现两条明显的蛋白条带，与预期的VP7和VP3蛋白的大小一致，且两者蛋白总量约占细菌蛋白总量的50％以上，说明本发明制备的表达菌可同时大量表达VP7和VP3蛋白；泳道4的核心样颗粒在同样的位置存在两条明显的蛋白条带，且这两条蛋白条带约为蛋白总量的90％以上，其他蛋白很少，通过Western Blot(结果见图7)，进一步证实该两条蛋白条带即VP7和VP3蛋白，无其他非特异性条带，说明本发明制备的核心样颗粒纯度很高。SDS-PAGE以及Western Blot结果，表明含pETDuet-VP3-VP7的表达菌经诱导表达可同时大量表达VP7和VP3蛋白，通过蔗糖梯度离心可以大量获得高纯度的蓝舌病病毒核心样颗粒，且具有免疫原性。

实例5.透射电镜观察蓝舌病病毒核心样颗粒形态

采用醋酸铀负染法对样品进行负染。将收集的病毒核心样颗粒进行1：10稀释，用毛细管吸取样品，滴加到载网上，滤纸吸去多余的液体，再滴加负染液(0.75％醋酸铀，pH4.5)，随后用滤纸吸去多余的染液。干燥后，即可在透射电镜下进行观察。

结果显示，蔗糖梯度离心纯化得到的样品中存在大量密集且形态均一的中空颗粒，这在现有技术中是难得的，颗粒直径在70～80nm左右，且表面有突起，其形态、大小均与文献报道的杆状病毒表达系统获得的蓝舌病病毒核心样颗粒一致，说明本系统原核表达获得了大量的蓝舌病病毒核心样颗粒，结果见附图8。

实例6.纯化的核心样颗粒免疫动物及抗体水平分析

为更进一步分析本发明制备的蓝舌病病毒核心样颗粒的免疫原性，以本发明制备的蓝舌病病毒核心样颗粒免疫小鼠并通过建立的ELISA方法对其抗体水平进行分析。

(1)动物免疫步骤

取15只6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，随机分成3组，每组5只，第1组为核心样颗粒免疫组，第2组为蓝舌病病毒灭活疫苗免疫组，第3组为空白对照组。每组分别腹腔注射相应的免疫原与完全弗氏佐剂的混合物，2周后与同量不完全弗氏佐剂混匀，重复注射，此后2周每周重复注射1次，但不加佐剂。最后一次注射2周后眼眶无菌采血，分离血清。

(2)抗体水平分析

以蓝舌病全病毒包被抗原的间接ELISA方法对免疫小鼠血清中的抗体水平进行分析，具体步骤：以包被缓冲液稀释蓝舌病全病毒抗原，100μL/孔，4℃包被过夜；PBST洗涤3次；每孔加入100μL/孔新鲜配制的封闭液(含3％脱脂乳和1％BSA)，37℃封闭2h；PBST洗涤3次；以封闭液倍比稀释待检血清，100μL/孔，室温孵育1h；PBST洗涤3次；加入HRP标记的兔抗小鼠IgG(1:5000稀释)，100μL/孔，室温孵育1h；PBST洗涤3次；加入TMB底物，100μL/孔，室温避光显色10min；加入终止液，100μL/孔，终止显色；酶标仪读数OD₄₅₀。以OD₄₅₀大于或等于1.5的最高稀释倍数为抗体滴度。

结果表明：核心样颗粒免疫组和蓝舌病病毒灭活疫苗组的小鼠血清中均能够检测到蓝舌病病毒抗体，而空白对照组的蓝舌病病毒抗体均为阴性；同时可以看出，核心样颗粒免疫组和蓝舌病病毒灭活疫苗免疫组的小鼠血清中BTV抗体水平很接近，两者之间差异不显著，结果见图9。通过免疫小鼠抗体水平分析，进一步证实本发明制备的蓝舌病病毒核心样颗粒具有良好的免疫原性，免疫动物后可刺激机体产生与蓝舌病病毒灭活疫苗相当的免疫效果。

实例7.以纯化的核心样颗粒包被酶标板建立间接ELISA方法

为进一步确认原核表达系统获得的核心样颗粒的免疫活性，以纯化的蓝舌病病毒核心样颗粒倍比稀释后包被酶标板建立间接ELISA方法，检测蓝舌病阳性血清和阴性血清，并与商品化的蓝舌病抗体ELISA试剂盒(Kernel公司的BTV Ab.ELISA试剂盒)对比，验证其符合率。间接ELISA方法具体步骤：以碳酸钠缓冲液倍比稀释纯化的蓝舌病病毒核心样颗粒，100μL/孔，4℃包被过夜；PBST洗涤3次；含5％脱脂奶粉的封闭液，37℃封闭1h；PBST洗涤3次；80份待检绵羊血清样品(1:20稀释)，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤3次；HRP标记的兔抗绵羊IgG(1:5000稀释)，100μL/孔，37℃孵育30min；PBST洗涤3次；TMB底物，100μL/孔，室温避光孵育10min；0.5％硫酸终止液，100μL/孔，终止显色；酶标仪读取OD₄₅₀值。

蓝舌病核心样颗粒包被酶标板的最佳稀释倍数为2000倍，说明本发明通过原核表达系统制备的蓝舌病病毒核心样颗粒可作为包被抗原。同时，以纯化的核心样颗粒作为包被抗原建立的间接ELISA方法，检测80份待检血清样品的结果与商品化的蓝舌病抗体ELISA试剂盒的检测结果一致，符合率为100％，结果见表1，进一步说明本发明制备的蓝舌病病毒核心样颗粒具有良好的反应原性。

表1符合率实验

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心

<120> 一种蓝舌病病毒核心样颗粒的制备方法

<130> 2019

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2706

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcggcac agaacgaaca gcgtccggaa cgtatcaaaa ccaccccgta cctggaaggt 60

gatgttctga gcagcgacag cggcccgctg ctgtctgttt tcgcgctgca ggaaatcatg 120

cagaaagttc gtcaggttca ggccgattac atgaccgcaa cgcgtgaagt tgatttcact 180

gttccggatg tgcagaaaat tctggatgat attaaagctc tggcggcaga acaggtgtac 240

aaaatcgtta aagttccgtc catctctttt cgtcatatcg ttatgcagag ccgtgatcgt 300

gtgctgcgtg ttgacacgta ttacgaagag atgtcccagg ttggtgatgt tattaccgaa 360

gacgaaccgg aaaaattcta cagcaccatt atcaaaaaag ttcgtttcat tcgtggtaaa 420

ggttctttta tcctgcatga catcccgacc cgtgatcacc gtggcatgga agttgcagaa 480

ccggaagttc tgggtgtgga atttaaaaac gtgctgccgg ttttgaccgc tgaacatcgc 540

gcgatgattc agaatgcact ggacggctct atcatcgaaa acggtaacgt agcgacccgt 600

gatgttgatg ttttcatcgg tgcatgcagc gaaccggtct atcgtatcta caaccgtctt 660

cagggctaca ttgaagcggt gcagctgcag gaactgcgta actccattgg ctggctggaa 720

cgtttgggtc atcgcaaacg tatcacctat agccaggaag ttctgactga tttccgccgt 780

caggatacca tttgggtcct ggctctgcaa ctgccggtga acccgcaagt tgtgtgggac 840

gttccgcgct ccagcatcgc gaacctgatt atgaacatcg cgacctgctt gccgaccggt 900

gaatacatcg ctccaaaccc gcgtatctct tccatcaccc tgacccagcg tattaccact 960

accggcccgt ttgccatcct gaccggctct accccgaccg cccagcagct gaacgatgtg 1020

cgtaaaatct acctggctct gatgttccct ggccagatca ttctggatct gaaaattgat 1080

ccaggtgagc gcatggaccc ggcagttcgt atggtggctg gcgttgtagg ccacctgctg 1140

ttcactgcgg gcggtcgttt tacgaacttg acccagaaca tggcgcgcca gctggatatc 1200

gcactgaacg attacctgct gtacatgtat aacacccgcg ttcaggtgaa ctatggcccg 1260

accggtgaac cgctggattt tcagatcggc cgtaaccaat acgattgtaa cgtttttcgt 1320

gctgatttcg caacgggtac cggttacaac ggttgggcca ctatcgatgt ggaataccgt 1380

gaaccggccc cgtacgtgca cgcgcagcgc tatattcgtt actgcggtat cgactcccgt 1440

gagctgatca acccgactac ctacggtatc ggtatgacct accattgtta caatgaaatg 1500

ctccgtatgc tggtagcggc tggtaaagat agcgaggcgg catactttcg ctctatgctg 1560

ccgttccaca tggttcgttt cgctcgtatt aaccagatca ttaacgaaga cctgcactct 1620

gttttctctc tgccggatga tatgttcaac gcgctgctgc cggatctgat cgctggcgca 1680

caccagaacg ctgatccggt tgtacttgac gtttcctgga tctctctgtg gttcgcgttc 1740

aaccgctcct tcgaaccgac ccaccgcaac gaaatgctgg aagtggcgcc gctgattgaa 1800

tccgtttatg cctccgaact gagcgttatg aaagttgata tgcgccacct gtccctgatg 1860

cagcgtcgct tcccggacgt tctgattcaa gcgcgccctt ctcatttctg gaaagcagta 1920

ctgaatgatt ctcctgaagc tgtgaaagct gttatgaatc tcagccactc ccacaacttc 1980

attaacatcc gtgatatgat gcgttgggtg atgctgccat ccctgcagcc gagcctgaaa 2040

ctggcgctgg aggaagaagc ttgggctgca gcaaatgatt tcgaagacct gatgttgacc 2100

gaccaggttt acatgcatcg tgacatgctg ccagaaccgc gtctggatga tattgaacgt 2160

ttccgccagg aaggcttcta ttacaccaac atgctggaag ctccaccgga aatcgatcgt 2220

gttgtgcagt acacctatga aatcgcacgc ctgcaagcta acatgggtca attccgtgca 2280

gcgctgcgtc gcattatgga tgatgatgat tgggttcgct tcggtggcgt gttacgtacc 2340

gtgcgtgtta aattttacga tgcacgccca ccggatgatg tactgcaggg tctgccgttt 2400

agctacgaca ctaatgaacg cggtggcctg gcgtatgcga cgatcaaata tgccactgaa 2460

accacgatct tctacctgat ctataacgtt gaattctcta acacgccgga ttccctggtt 2520

ctgatcaacc cgacctatac catgaccaaa gtgtttatta acaaacgtat tgttgaacgt 2580

gtgcgtgttg gtcagattct ggctgttctg aaccgtcgtt tcgtggccta caaaggtaaa 2640

atgcgtatca tggatatcac ccagtccctg aaaatgggca ctaaactggc ggcgccgacc 2700

gtttaa 2706

<210> 2

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggatacca tcgcagcgcg tgcgctgacc gtgatgcgtg cgtgcgcgac cctgcaggaa 60

gcgcgtatcg ttctggaagc gaacgttatg gaaatcctgg gcatcgcgat caaccgttac 120

aacggtctga ccctgcgtgg cgttaccatg cgtccgacct ccctggcgca gcgtaacgaa 180

atgttcttca tgtgcctgga tatgatgctg agcgcggcgg gcatcaacgt tggcccgatc 240

tccccggatt acacccagca catggcgacc atcggcgttc tggcgacccc ggaaatcccg 300

ttcaccaccg aagcggcgaa cgaaatcgcg cgcgttaccg gtgaaaccag cacctggggt 360

ccggcgcgtc agccgtacgg cttcttcctg gaaaccgaag aagtttacca gccgggtcgt 420

tggttcatgc gcgcggctca ggttgttacc ccggttgtgt gcggtccgga tatgatccag 480

gtgagcctga acgcgggcgc tcgtggtgat gtccagcaga tcttccaggg ccgtaacgat 540

ccgatgatga tctatttagt ttggcgccgt attgaaaact tttctatgcc gcagggtaat 600

agccaacgta cactggctgg tgtaaccgtt agcgtaggcg gtgttgatat gcgcgcaggt 660

cgcattattg catgggacgg tcaggcagtt ctgcagatcc ataacccgac tcagcagaac 720

gcaatggttc agatccaagt ggtattttac atctctatgg ataaaactct gaaccagtac 780

ccggcactga ccgctgaaat cttcaacgtt tacagcttcc gtgaccacac ctggcacggt 840

ctgcgtaccg cgatcctgaa ccgtaccacc ctgccgaaca tgctgccgcc gatcttcccg 900

ccgaacgatc gtgatagcat cctgaccatc ctgctgctga gcaccctggc ggatgtgtac 960

agcgttctgc gtccggaatt cgcgatccac ggcgtgaacc cgatgccggg cccgctgacc 1020

cgtgcgatcg cgcgtgcggc gtacgcgtaa 1050

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

accgtgatgc gtgcgtgcgc gacc 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccggcatcgg gttcacgccg tgga 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acgaacagcg tccggaacgt atca 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgccgccagt ttagtgccca tttt 24

Claims (10)

1.一种共表达蓝舌病病毒VP3和VP7的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pETDuet-VP3-VP7；所述VP3和VP7基因序列如SEQ ID NO.1和2所示；所述蓝舌病病毒VP7基因插入pETDuet-1多克隆位点MSC2的酶切位点NdeI和AvrII之间；所述蓝舌病病毒VP3基因插入pETDuet-1多克隆位点MSC1的酶切位点NotI和NcoI之间。

2.重组菌，其特征在于，包含权利要求1所述的质粒的重组菌。

3.权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为表达型大肠杆菌BL21(DE3)。

4.权利要求1所述重组质粒的构建方法：其特征在于，具体步骤包含：

1)合成VP7基因，获得重组质粒pUC–VP7，限制性内切酶NdeI和AvrII分别对质粒pUC–VP7和载体pETDuet-1进行双酶切，胶回收纯化酶切产物，获得线性的VP7和pETDuet-1；

2)T4 DNA连接酶连接线性的VP7和pETDuet-1，16℃条件下连接3h；

3)将连接产物通过热激转化方式转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α，鉴定后，获得重组质粒pETDuet-VP7；

4)合成VP3基因，获得重组质粒pUC–VP3，限制性内切酶NotI和NcoI分别对质粒pUC–VP3和载体pETDuet-VP7进行双酶切，胶回收纯化酶切产物，获得线性VP3和pETDuet-VP7；

5)T4 DNA连接酶连接线性VP3和pETDuet-VP7，16℃条件下连接4h；

6)将连接产物通过热激转化的方式转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α，通过鉴定后，获得重组质粒pETDuet-VP3-VP7。

5.权利要求3所述重组菌的构建方法，其特征在于，包括权利要求4所述的步骤1)-6)，并进一步包括步骤：

7)将重组质粒pETDuet-VP3-VP7通过热激转化的方式转化入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，鉴定后，获得含重组质粒pETDuet-VP3-VP7的表达菌。

6.一种蓝舌病病毒核心样颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括权利要求5所述的步骤1)-7)，并进一步包括步骤：

8)利用含重组质粒pETDuet-VP3-VP7的表达菌表达和纯化蓝舌病毒核心样颗粒的步骤。

7.权利要求6所述的蓝舌病病毒核心样颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤8)为：

a、将含重组质粒pETDuet-VP3-VP7的表达菌接种至自诱导培养基中，37℃诱导表达12h；

b、取诱导表达的菌液，离心后加入缓冲液，超声破碎后离心，取上清；

c、取上清，加入30％和50％蔗糖，进行蔗糖梯度离心；

d、加入缓冲液，重悬沉淀物，即蓝舌病病毒核心样颗粒。

8.权利要求7所述的蓝舌病病毒核心样颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤b为：取诱导表达的菌液，12000rpm4℃离心10min，弃上清，加入缓冲液重悬沉淀，超声破碎20min，12000rpm离心10min，收集上清；所述步骤c为：取3mL上清，加入30％和50％蔗糖各1mL，4℃，26400rpm/min水平转头高速离心3h。

9.权利要求7或8任一所述的蓝舌病病毒核心样颗粒的制备方法，其特征在于，还包括步骤：

9)醋酸铀负染蓝舌病病毒核心样颗粒，电镜观察颗粒形态。

10.权利要求1所述的重组质粒或权利要求2和3任一所述的重组菌在制备具有免疫活性蓝舌病病毒核心样颗粒中的应用。

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