CN113403329A - 一种用于猫冠状病毒的rna疫苗及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于RNA疫苗的技术领域，具体涉及一种用于猫冠状病毒的RNA疫苗及其构建方法。所述RNA疫苗为采用含有5’UTR、S蛋白、终止密码子、3’UTR以及polyA核酸的序列合成；所述S蛋白选自FCoV‑I型或FCoV‑II型；所述5’UTR、3’UTR的序列选取自猫源的猫血红蛋白或猫白蛋白，所选序列的同源性在50%~100%；本发明的RNA疫苗能够实现同时诱导细胞免疫和体液免疫，可以做到无细胞生产、且生产时无需导入有毒化学品，能够高效迅速地对付病毒变异，相较传统疫苗，本发明的用于猫冠状病毒的RNA疫苗能够有效地缩短疫苗研发和生产周期，为防控FCoV的爆发提供有效的技术手段。

Description

一种用于猫冠状病毒的RNA疫苗及其构建方法

技术领域

本发明属于RNA疫苗的技术领域，具体涉及一种用于猫冠状病毒的RNA疫苗及其构建方法。

背景技术

猫冠状病毒（Feline coronavirus，FCoV）是家猫和野生猫致死性疾病猫传染性腹膜炎（Feline infectious peritonitis，FIP）的病原，通过口鼻传播，主要感染幼年和老龄猫，在世界猫群中广泛流行。

FCoV病毒有4种主要结构蛋白，分别是刺突蛋白（Spike protein，S）、膜蛋白（Membrane protein，M）、小膜蛋白（Small envelope protein，E）和核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein，N）。其中S蛋白是排列在包膜突起的糖蛋白，分子量约为180~200kDa，它对于诱导宿主的抗体应答和细胞免疫很重要。冠状病毒可通过S蛋白与特定的细胞受体结合，是决定病毒致病性和组织嗜性的关键因素，S蛋白是诱导机体产生中和抗体的保护性抗原，目前疫苗的相关研究的也集中在S蛋白区域。

FCoV根据S蛋白氨基酸序列和抗体交叉中和差异分为2种血清型：I型和II型。血清I型是主要流行毒株类型，其S蛋白完全来源于FCoV。血清II型FCoV临床不常见，由犬冠状病毒(Canine coronavirus，CCoV)和FCoV双重重组而来。FCoV-І型在世界范围内广泛流行，在美国和欧洲一些国家，FCoV-І型毒株感染率高达80-95%；在亚洲地区主要流行FCoV-ІІ型，感染率高达25%。血清I型和II型 FCoV毒株均存在2种在抗原和形态学上不同的生物型(或病理型)：猫肠道冠状病毒（Feline enteric coronavirus，FECV）和猫传染性腹膜炎病毒（Feline infectious peritonitis virus，FIPV）。

其中猫肠道冠状病毒（FECV）的感染仅局限于消化道，会引起猫的体温上升，食欲不振甚至脱水等症状，致死率较低。猫传染性腹膜炎病毒，是猫肠道冠状病毒的高毒力突变株，具有高传染性及高致死率的特点。在临床上，猫传染性腹膜炎又可以分为渗出性和非渗出性两种病理型。由于暂无有效治疗药物，携带FIPV的猫咪一旦发病，难以康复，死亡率高。

近年来我国养猫数量逐年增加，由于国内市场并无相关疫苗，猫感染FIP的风险与日俱增。FECV及其转化的FIPV基因型毒株中存在由不同程度的单核苷酸多态性和插入/缺失现象，同时FIP潜伏期几周至几年不等，这种巨大差异给防疫工作带来严峻挑战。目前针对FIPV感染猫的治疗只能起到延缓疾病的作用，不能达到根治的效果，所以疫苗的预防显得尤为重要。

国内外现有疫苗的大都还处于研究阶段，由于该病毒特殊的感染机制，使得常规疫苗和重组疫苗效果不佳。FECV及其转化的FIPV基因型毒株中存在由不同程度的单核苷酸多态性和插入/缺失现象。FECV感染率达80%-95%，而FIP的致死率高达95%，目前并没有有效的疫苗上市，猫一旦感染FIPV几乎只能靠治疗延缓死亡，因此，FCoV疫苗的市场很有潜力，并且对FCoV预防具有重要意义。前期疫苗的研究FIP减毒活疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗免疫猫后均可观察到ADE，使FIP潜伏期缩短至1-2 d，病程更短，死亡更快。随着基因工程技术和分子生物学技术的发展，人们开始把注意力活载体疫苗及核酸疫苗等新型基因工程疫苗上。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于猫冠状病毒的RNA疫苗及其构建方法，选取特定的5’UTR、3’UTR、S蛋白、终止密码子、polyA核酸序列，构建得到FCoV的RNA疫苗，将其转染细胞后能够高效表达，免疫动物后能够产生高水平的抗体，该抗体具有较高的中和效价及滴度。

本发明的技术内容如下：

本发明提供了一种用于猫冠状病毒的RNA疫苗，所述RNA疫苗为采用含有5’UTR、S蛋白、终止密码子、3’UTR以及polyA核酸的序列合成；

所述S蛋白选自FCoV-I型或FCoV-II型；

所述疫苗还包括纳米脂质颗粒，所述纳米脂质颗粒包裹RNA疫苗；

所述纳米脂质颗粒包括BHEM-Chol、PEG_5k-b-PLGA_11k、PLGA_11k聚合物的混合物；

所述5’UTR、3’UTR的序列选取自猫源的猫血红蛋白或猫白蛋白，所选序列的同源性在50%~100%；

所述5’UTR、3’UTR分别选自六组不同的猫血红蛋白或猫血清白蛋白，其核酸序列分别为序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的六组；

所述5’UTR、3’UTR的六组序列选自GenBank中NCBI参考序列XM_023246781.1、XM_011290755.3、XM_003992859.2、XM_003992882.4、XM_003998693.4、X84842.1；

所述猫冠状病毒的S蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.13所示，其核酸序列如序列表SEQ ID NO.14所示；

所述RNA疫苗的核酸序列包括如序列表SEQ ID NO.15~20所示；

所述终止密码子为TGA、TAA、TAG的自由组合，个数为1-10个；

所述polyA中的碱基A的个数为1-200个。

本发明还提供了一种用于猫冠状病毒的RNA疫苗的构建方法，包括如下步骤：

选取5’UTR、3’UTR、S蛋白、终止密码子、polyA核酸序列合成RNA疫苗的核酸序列构建于载体上，转染到细菌得到重组菌，将重组菌进行质粒提取得到重组质粒，将重组质粒进行酶切、转录、纯化得到RNA疫苗核酸，所述RNA疫苗的核酸序列如序列表SEQ ID NO.15~20所示；

所述S蛋白选自FCoV-I型或FCoV-II型；

所述RNA疫苗包括由脂质纳米颗粒载体包裹，所述脂质纳米颗粒的制备原料包括聚合物PEG_5k-b-PLGA_11k、PLGA_11k和BHEM-Chol；

所述脂质纳米颗粒包裹RNA疫苗的操作为：将RNA疫苗核酸溶液与BHEM-Chol、PEG_5k-b-PLGA_11k、PLGA_11k混合，超声得到油相-水相的初乳液，加入无核酸酶水再超声乳化得到水相-油相-水相的复乳液，将复乳液中的有机溶液去除，浓缩，即得到脂质纳米颗粒包裹的RNA疫苗；

所述RNA疫苗核酸溶液为RNA疫苗核酸使用无核酸酶水溶解得到；

所述BHEM-Chol、PEG_5k-b-PLGA_11k、PLGA_11k使用之前分别溶于色谱级三氯甲烷溶液中。

本发明的有益效果如下：

本发明的用于猫冠状病毒的RNA疫苗，为通过选取特定的5’UTR、3’UTR、S蛋白、终止密码子、polyA核酸序列，构建得到FCoV的RNA疫苗，将其转染细胞后能够高效表达，免疫动物后能够产生高水平的抗体，该抗体具有较高的中和效价及滴度；

本发明的RNA疫苗能够实现同时诱导细胞免疫和体液免疫，可以做到无细胞生产、且生产时无需导入有毒化学品，能够高效迅速地对付病毒变异，相较传统疫苗，本发明的用于猫冠状病毒的RNA疫苗能够有效地缩短疫苗研发和生产周期，为防控FCoV的爆发提供有效的技术手段；

本发明的RNA疫苗的构建，成本低，生产效率高，因制造速度快，受微生物污染的几乎也相对较低，RNA疫苗的安全性相对较高，制备脂质纳米颗粒作为RNA疫苗的运送载体，脂质纳米颗粒具有核酸包封率高，能够有效转染，组织穿透性增强，细胞毒性和免疫原性低等特点，细胞转染后的脂质纳米颗粒FCoV-S-mRNA能够高效表达。

附图说明

图1为RNA疫苗核酸的凝胶电泳图；

图2为RNA疫苗的体外表达试验SDS-PAGE以及Western blot结果图；

图3为RNA疫苗的抗体水平检测结果图；

图4为RNA疫苗中和抗体滴度的测定结果图。

具体实施方式

以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。

若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。

实施例

一种用于猫冠状病毒的RNA疫苗及其构建：

1.重组菌构建：

选取5’UTR、3’UTR、S蛋白（FCoV-I型中的UU4毒株S蛋白（GenBank:FJ938054.1））、终止密码子、polyA核酸序列进行人工合成RNA疫苗的DNA于pUC57载体上，无缝克隆于pUC57的EcoRV酶切位点，并转化大肠杆菌DH5α，获得FCoV-S-pUC57-DH5α；

本实施例所述S蛋白选用来自FCoV-I型中的UU4毒株S蛋白（GenBank:FJ938054.1），所述S蛋白还可选自FCoV-II型，也可以是所选S蛋白中的一段氨基酸序列或具有50-100%同源性的氨基酸序列，操作与上相同，在此不作重复赘述；

2.质粒的提取

将获得的重组菌进行摇菌，按照常规方法提取质粒，参照质粒抽提试剂盒（E.Z.N.A® Plasmid MiniprEppendorf Kit I）说明书进行：

2.1）取菌液于1.5mL Ep 管中12000r/min离心30s，弃上清；

2.2）加250µL溶液Ⅰ/RNase A，充分重悬菌泥；

2.3）加250µL溶液Ⅱ，颠倒4～6次混匀，室温作用2min至溶液变成澄清；

2.4）加350µL溶液Ⅲ，颠倒4～6次混匀以形成白色沉淀； 12000r/min离心10min，

2.5）转移上清至DNA吸附柱中，室温静置2min。12000r/min离心1min，弃液。

2.6）加入500 μL的Buffer HB，12000r/min离心1min，弃液。

2.7）加入750 μL的DNA Wash Buffer，12000r/min离心1min，弃液。

2.8）重复该步骤一次，再空管12000r/min离心1min。

2.9）移至新的1.5 mLEp管中，加入50~100 μL的TE室温下放置2min，12000r/min离心1min，洗脱的质粒于-20℃保存备用，取少量于1.0％琼脂糖凝胶中低压电泳检测质粒效果。

3.酶切线性化、纯化

对重组质粒进行Quick Cut MluI酶切，酶切反应体系如表1所示：

表1 酶切反应体系

将上述成分加入0.5mL的EP管中，混匀，37℃酶切15min。纯化试剂盒进行纯化回收线性化重组质粒。

根据OMEGA公司的Cycle-pure纯化试剂盒使用说明书，线性化质粒进行纯化回收，方法如下：

3.1）将线性化质粒收集在一个1.5ml的EP管中；

3.2）加入6倍体积的Buffer CP于装有PCR产物的EP管中，小心混匀；

3.3）将上述混合液全部加至试剂盒配的有滤膜的管HiBind spin-column中，10000 r/min离心1 min，弃去离心出来的溶液；

3.4）加入700 µLSPW Buffer，等待2~3min，10 000 r/min离心1 min，弃去离心出来的溶液；

3.5）重复步骤3.4）；

3.6）空管10 000 r/min离心1min；

3.8）弃去下面的离心管，将柱子放入新的干净的1.5mL离心管中，在柱子中央加入50µL DNA Elution Buffer，室温下放置2min，10 000r/min离心1min，收集离心管中的液体即为回收的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳检测后即用或-20℃冰箱保存备用。提高洗脱液的温度至55℃~80℃，有利于提高DNA的洗脱效率。

4.体外转录和纯化

采用体外转录试剂盒（mMESSAGE mMACHINE™ T7 ULTRA Transcription Kit）对线性化的质粒进行体外转录。

采用纯化试剂盒（MEGAclear™ Transcription Clean-Up Kit）对转录的产物进行纯化处理，即得RNA疫苗核酸；

取来自的猫源的六组5’UTR、3’UTR（选自GenBank中NCBI参考序列XM_023246781.1、XM_011290755.3、XM_003992859.2、XM_003992882.4、XM_003998693.4、X84842.1），按照以上步骤制备成六组RNA疫苗核酸，纯化之后的RNA疫苗核酸进行1%琼脂凝胶电泳鉴定，如图1所示，可见其体外转录成功。

5.纳米脂质颗粒的制备

5.1）将-80℃冰箱保存的聚合物PEG_5k-b-PLGA_11k，PLGA_11k和BHEM-Chol取出，平衡到室温后在干燥环境下开封，分别以62.5 mg/mL，39.5mg/mL和22.5mg/mL的浓度溶于色谱级三氯甲烷溶液中；

5.2）将-80℃冰箱保存的mRNA溶液在冰上融化，使用无核酸酶水(DEPC水)调整其浓度为4 mg/mL，在50mL无菌离心管中，依次加入25 μL mRNA(0.1 mg)，100 μL BHEM-Chol(2 mg)，350 μL PEG_5k-b-PLGA_11k(21.875 mg)和50 μL PLGA_11k(1.925 mg)；

5.3）将该离心管置于冰水中，超声探头用DEPC水冲洗后放入离心管的溶液中，在80W功率和冰水浴条件下，以超声5s停2s的方式超声乳化溶液60 s，得到油相-水相的初乳液。随后，将5 mLDEPC水沿管壁加入到初乳液中，并在同样条件下，以超声10s停2s的方式再次乳化60 s，形成水相-油相-水相的复乳液；

5.4）将复乳液转移到DEPC处理并高压过的无菌无核酸酶100mL圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪在低温条件下缓慢地减压旋蒸以除去乳液中的三氯甲烷，并浓缩其水溶液体积到1mL左右，制备好的脂质纳米颗粒包裹的mRNA转移到1.5mL EP管中保存于4C冰箱中待用。

6.检测细胞转染后的FCoV-S-mRNA脂质体表达情况

6.1）取24孔板，接种猫肾细胞（CRFK）(200000个细胞/孔)，采用含10％血清无抗培养基培养18小时；

6.2）当细胞贴壁融合度约达60 %时，在转染前一小时更换为无血清的Opti-MEM培养基，转染脂质纳米颗粒FCoV-S-mRNA(1μg RNA/孔)，培养6小时；

6.3）将培养基替换为新鲜的培养基，培养42小时；

6.4）1000g离心10min，收集上清液；

6.5）取上清液，进行非还原型SDS-PAGE，然后进行Western blot。Western blot采用的一抗为抗E2蛋白的鼠源单克隆抗体，二抗为抗鼠源抗体。

7. FCoV-S-mRNA疫苗免疫小鼠及其抗体的测定

将6-8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为5组(每组5只)：FCoV-S-mRNA1组、FCoV-S-mRNA2组、FCoV-S-mRNA3组、FCoV-S-mRNA4组、FCoV-S-mRNA5组、FCoV-S-mRNA6组及PBS空白对照组。

采用肌内免疫，试验第1天进行初次免疫，试验第28天进行加强免疫，FCoV-S-mRNA中的各组组每次免疫剂量相同，均为20g，体积为200L，PBS空白注射组注射等体积的PBS（pH7.2，0.01M）。分别在二免14天后进行尾部采血，收集血清，用间接ELISA法测定抗体水平。

如图3所示，OD450测定结果显示FCoV-S-mRNA1组、FCoV-S-mRNA2组、FCoV-S-mRNA3组、FCoV-S-mRNA4组、FCoV-S-mRNA5组、FCoV-S-mRNA6组实验组均能够达到一定的抗体水平。

8.血清中和试验中中和效价及抗体滴度的测定

对第42d的血清进行血清中和试验，如表2所示，结果显示FCoV-S-mRNA1组、FCoV-S-mRNA2组、FCoV-S-mRNA3组、FCoV-S-mRNA4组、FCoV-S-mRNA5组、FCoV-S-mRNA6组抗体效价均显著高于PBS对照组。

表2 RNA疫苗的中和效价表

组别	中和效价
		FCoV-S-mRNA1	1:320
FCoV-S-mRNA2	1:304
		FCoV-S-mRNA3	1:326
FCoV-S-mRNA4	1:256
		FCoV-S-mRNA5	1:304
FCoV-S-mRNA6	1:288
		PBS对照	1:8

如图4所示，抗体滴度测定试验中FCoV-S-mRNA1组、FCoV-S-mRNA2组、FCoV-S-mRNA3组、FCoV-S-mRNA4组、FCoV-S-mRNA5组、FCoV-S-mRNA6组实验组中和抗体滴度均高于2⁴，可见，本发明制备的猫冠状病毒RNA疫苗可以起到很好的保护作用，为FCoV的防控提供了有效的技术手段。

序列表

<110> 东莞博盛生物科技有限公司

<120> 一种用于猫冠状病毒的RNA疫苗及其构建方法

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gccccgcacc ttctggtccc gacacagact cagagagaac caacc 45

<210> 2

<211> 94

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gtgaagccgg ggcgatcgtc ctgagggccc ggggcctctt gggctccggg cacccgaact 60

tcctgatctt tgaataaagt ctgagtgggc tgca 94

<210> 3

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atcgcgtccg tgctgccatc cggcgcggag cgctcgccgc tcaacgccgg atccgcg 57

<210> 4

<211> 78

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

actcggagag gggcgcccgc cgcccagccg cccctcccgc gagttccaga gtttgagtaa 60

agtccccgca agaaagcc 78

<210> 5

<211> 61

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ccaacagcag cacatacccg cttctctctc tgatcgcctg taagttccca gatctgacat 60

c 61

<210> 6

<211> 132

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gtcttccttc cagttcaacg gtgctctttt gtgtccccag ggccctcctt ctgcatatgg 60

ggacttgcgt ttggccttga gagcacagct tctgtttaat aaagttcatt ctattcagtc 120

atcataaatg aa 132

<210> 7

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ttacacttgc ttctgacaca actgtgttcg ctatcaacca cacaaacaga cacc 54

<210> 8

<211> 126

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gctccctttc ttgctttcca gggaaagtcc cttggtcccc agaccctaat acctggacat 60

gtctaaatca tgaaattctt tgaacatctg gctcctgcct aataaagaat atttattttc 120

attgca 126

<210> 9

<211> 118

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

gggcgtttcc ctcttaggct gacacttgac tccttgtcta catttagctt agagagggac 60

atacataccc tggaaagtgt gggggagacg tacatagcac tgttggacct gaaggcag 118

<210> 10

<211> 165

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

acatctgaat cacccactgc cttctctcta gcctggaaac ccaggcctac atccataaga 60

agcccttaaa tccttcctct gtgttcttca agtgctcagg ctctgacatt tcatggtgtt 120

accctaccct gacactttaa taaagactaa attggtttgc tggtc 165

<210> 11

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

gtcgactttg gcaca 15

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

aacaacacaa tcacaacatc tcagcctacc ctgagagtcg ac 42

<210> 13

<211> 1465

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 13

Met Ile Leu Leu Ile Leu Ala Leu Leu Ser Ile Ala Ser Ser Glu Asp

1 5 10 15

Ala Pro His Gly Val Thr Leu Pro His Phe Asn Thr Ser His Asn Asn

20 25 30

Ser Lys Phe Glu Leu Asn Phe Tyr Asn Phe Leu Gln Thr Trp Asp Ile

35 40 45

Pro Pro Asn Thr Glu Thr Ile Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Tyr Cys Asp

50 55 60

His Glu Asp Asn Cys Gly Trp Tyr Asn Phe Val Tyr Asn Asn Lys Val

65 70 75 80

Gly Pro Asn Ala Lys Tyr Ser Tyr Ile Asn Thr Gln Asn Leu Asn Ile

85 90 95

Pro Asn Val His Gly Val Tyr Phe Asp Val Arg Glu His Asn Ser Asp

100 105 110

Gly Val Trp Asp Gln Ile Asp Arg Val Gly Leu Leu Ile Ala Ile His

115 120 125

Gly Thr Ser His Tyr Ser Leu Leu Met Val Leu Gln Asp Gly Val Glu

130 135 140

Ala Ser Gln Pro His Val Ala Val Lys Ile Cys His Trp Asn Pro Gly

145 150 155 160

Asn Ile Ser Thr Tyr His Gln Phe Asp Val Asn Leu Gly Asp Gly Gly

165 170 175

Gln Cys Val Phe Asn Gln Arg Phe Ser Leu Asp Thr Val Leu Thr Ala

180 185 190

Asn Asp Phe Tyr Gly Phe Gln Trp Thr Asp Thr Tyr Val Asp Ile Tyr

195 200 205

Leu Gly Gly Thr Ile Thr Lys Val Trp Val Val Asn Asp Trp Ser Val

210 215 220

Val Glu Ala Ser Ile Ser Ser His Trp Asn Ala Leu Asn Tyr Gly Tyr

225 230 235 240

Tyr Ile Gln Phe Val Asn Arg Thr Thr Tyr Tyr Ala Tyr Asn Ser Thr

245 250 255

Gly Gly Ser Asn Tyr Thr His Leu Gln Leu Thr Glu Cys His Thr Asp

260 265 270

Tyr Cys Ala Gly Tyr Ala Lys Asn Val Phe Val Pro Ile Asp Gly Lys

275 280 285

Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe Ser Asn Trp Phe Leu Leu Thr Asp Lys

290 295 300

Ser Thr Leu Val Gln Gly Arg Val Leu Ser Ser Gln Pro Val Phe Val

305 310 315 320

Gln Cys Leu Arg Pro Val Pro Thr Trp Ser Asn Asn Thr Ala Val Val

325 330 335

His Phe Lys Asn Asp Val Phe Cys Pro Asn Val Thr Ala Asp Val Leu

340 345 350

Arg Phe Asn Leu Asn Phe Ser Asp Thr Asp Val Tyr Thr Asp Ser Thr

355 360 365

Thr Asp Asp Gln Leu His Phe Thr Phe Glu Asp Asn Thr Thr Ala Ser

370 375 380

Ile Thr Cys Tyr Ser Ser Ala Asn Val Thr Asp Asn Gln Pro Ala Ser

385 390 395 400

Gly Ser Ile Ser His Thr Pro Phe Val Ser Asn Ser Tyr Leu Cys Phe

405 410 415

Ala Asn Phe Ser His Ser Ser Val Ser Arg Gln Phe Leu Gly Ile Leu

420 425 430

Pro Pro Thr Val Arg Glu Phe Ala Phe Gly Arg Asp Gly Ser Ile Phe

435 440 445

Val Asn Gly Tyr Lys Tyr Phe Ser Leu Gln Pro Ile Lys Ser Val Asn

450 455 460

Phe Ser Ile Ser Ser Val Glu Asn Tyr Gly Phe Trp Thr Ile Ala Tyr

465 470 475 480

Thr Asn Tyr Thr Asp Val Met Val Asp Val Asn Gly Thr Val Ile Thr

485 490 495

Arg Leu Phe Tyr Cys Asp Ser Pro Leu Asn Arg Ile Lys Cys Gln Gln

500 505 510

Leu Lys His Glu Leu Pro Asp Gly Phe Tyr Ser Ala Ser Met Leu Val

515 520 525

Lys Lys Asp Leu Pro Lys Thr Phe Val Thr Met Pro Gln Phe Tyr Asn

530 535 540

Trp Met Asn Val Thr Leu His Val Val Leu Asn Asp Ile Glu Lys Lys

545 550 555 560

Ala Asp Ile Ile Leu Ala Gly Ala Pro Glu Leu Ala Ser Leu Ala Asp

565 570 575

Ile His Phe Glu Ile Ala Gln Ala Asn Gly Ser Val Val Asn Val Thr

580 585 590

Ser Val Cys Val Gln Ala Arg Gln Leu Ala Leu Phe Tyr Lys Tyr Thr

595 600 605

Ser Leu Gln Gly Leu Tyr Thr Tyr Ser Asn Leu Val Gln Leu Gln Asn

610 615 620

Tyr Asp Cys Pro Phe Ser Pro Gln Gln Phe Asn Asn Tyr Leu Gln Phe

625 630 635 640

Glu Thr Leu Cys Phe Asp Val Ser Pro Ala Val Ala Gly Cys Lys Trp

645 650 655

Ser Leu Val His Asp Val Lys Trp Arg Thr Gln Phe Ala Thr Ile Thr

660 665 670

Val Ser Tyr Lys Asp Gly Ala Met Ile Thr Thr Met Pro Lys Ala Gln

675 680 685

Leu Gly Phe Gln Asp Ile Ser Asn Ile Val Lys Asp Glu Cys Thr Asp

690 695 700

Tyr Asn Ile Tyr Gly Phe Gln Gly Thr Gly Ile Ile Arg Ser Thr Thr

705 710 715 720

Ser Arg Leu Val Ala Gly Leu Tyr Tyr Thr Ser Ala Ser Gly Asp Leu

725 730 735

Leu Gly Phe Lys Ile Ser Thr Thr Gly Glu Ile Phe Thr Val Val Pro

740 745 750

Cys Asp Leu Thr Ala Gln Ala Ala Val Ile Asn Asp Glu Ile Val Gly

755 760 765

Ala Ile Thr Ala Thr Asn Gln Thr Asp Leu Phe Glu Phe Val Asn His

770 775 780

Thr Trp Ser Arg Ser Ala Arg Gly Ser Ser Pro Ser Thr Val Asn Thr

785 790 795 800

Tyr Thr Met Pro Gln Phe Tyr Tyr Ile Thr Lys Trp Asn Asn Gly Thr

805 810 815

Ser Ser Asn Cys Thr Ser Val Ile Thr Tyr Ser Ser Phe Ala Ile Cys

820 825 830

Asn Thr Gly Glu Ile Lys Tyr Val Asn Val Thr His Val Glu Ile Val

835 840 845

Asp Asp Ser Val Gly Val Ile Lys Pro Val Ser Thr Gly Asn Ile Thr

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Ile Pro Lys Asn Phe Thr Val Ala Val Gln Ala Glu Tyr Val Gln Ile

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Gln Val Lys Pro Val Ala Val Asp Cys Ala Lys Tyr Val Cys Asn Gly

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Asn Arg His Cys Leu Asn Leu Leu Thr Gln Tyr Thr Ser Ala Cys Gln

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Thr Ile Glu Asn Ser Leu Asn Leu Gly Ala Arg Leu Glu Ser Leu Met

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Leu Asn Asp Met Ile Thr Val Ser Asp Arg Ser Leu Glu Phe Ala Thr

930 935 940

Val Asp Lys Phe Asn Thr Thr Ala Leu Gly Gly Glu Lys Leu Gly Gly

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Leu Tyr Phe Asp Gly Leu Ser Ser Leu Leu Pro Pro Arg Val Gly Met

965 970 975

Arg Ser Ala Val Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Val Thr Ser Gly

980 985 990

Leu Gly Thr Val Asp Asp Asp Tyr Lys Lys Cys Ser Ala Gly Thr Asp

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Val Ala Asp Leu Val Cys Ala Gln Tyr Tyr Asn Gly Ile Met Val Leu

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Pro Gly Val Val Asp Tyr Asn Lys Met Ala Met Tyr Thr Ala Ser Leu

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Ile Gly Gly Met Ala Leu Gly Ser Ile Thr Ser Ala Val Ala Val Pro

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Phe Ser Met Gln Val Gln Ala Arg Leu Asn Tyr Val Ala Leu Gln Thr

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Asp Val Leu Gln Glu Asn Gln Lys Ile Leu Ala Asn Ala Phe Asn Asn

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Ala Ile Gly Asn Ile Thr Leu Ala Leu Gly Lys Val Ser Asn Ala Ile

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Ile Gln Ser Val Val Asn Gln Gln Gly Glu Ala Leu Ser His Leu Ile

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Ser Gln Leu Gln Lys Asn Phe Gln Ala Ile Ser Ser Ser Ile Ala Glu

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Ile Tyr Asn Arg Leu Glu Lys Val Glu Ala Asp Ala Gln Val Asp Arg

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Leu Ile Thr Gly Arg Leu Ala Ala Leu Asn Ala Tyr Val Ala Gln Thr

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Leu Thr Gln Tyr Ala Glu Val Lys Ala Ser Arg Gln Leu Ala Met Glu

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Leu Leu Phe Phe His Thr Val Leu Leu Pro Thr Glu Trp Glu Glu Val

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Val Gln Ile Thr Ser Cys Glu Val Thr Phe Leu Asn Thr Thr His Thr

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Ala Asp Met Leu Glu Gln Tyr His Ser Asn Tyr Thr Thr Pro Glu Leu

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Asp Leu Gln Leu Glu Ile Phe Asn Gln Thr Lys Leu Asn Leu Thr Ala

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Leu Glu Trp Leu Asn Arg Ile Glu Thr Tyr Val Lys Trp Pro Trp Tyr

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Val Trp Leu Leu Ile Gly Leu Val Val Val Phe Cys Ile Pro Leu Leu

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Leu Phe Cys Cys Leu Ser Thr Gly Cys Cys Gly Cys Phe Gly Cys Leu

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Gly Ser Cys Cys His Ser Leu Cys Ser Arg Arg Gln Phe Glu Ser Tyr

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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agatctattg ttcaataaag tggtaactag tggtcttggc actgtggatg atgattataa 3120

aaagtgttca gctggtacag atgtagctga cctagtttgt gcccaatatt acaacggcat 3180

aatggtctta cctggcgtcg tagattataa taagatggcc atgtatactg catctttaat 3240

aggaggtatg gctttgggtt ctattacttc agctgtcgcc gtgccttttt ctatgcaagt 3300

acaggccaga cttaactatg tcgcgttaca aactgatgtc ctacaggaaa accagaaaat 3360

acttgctaat gcttttaata atgccattgg caacattaca ctagctcttg gaaaagtttc 3420

caatgctatt acaaccgtct cagatggatt taatagtatg gcctcagcac tgactaagat 3480

tcagagtgta gttaaccaac agggtgaagc gttgagtcat ctcatcagtc agttacagaa 3540

aaacttccag gctattagta gttccattgc tgaaatctac aatagattgg aaaaagtgga 3600

agctgatgct caagttgacc gactcattac tggaagattg gcagcactta atgcctatgt 3660

ggctcaaact ttaactcagt atgctgaagt caaggctagt agacagttgg caatggagaa 3720

agttaatgag tgtgtgaaat cacagtcgga taggtatggg ttctgtggaa atggaacgca 3780

cctattctca ctcgtcaatt ccgcacctga tggtttgctt ttctttcaca cagtcttgct 3840

tcctacagaa tgggaagaag tgacggcatg gtcaggaata tgtgttaatg acacttatgc 3900

atatctgttg aaagatttcg atcattccat tttcagctac aatggcacgt atatggtaac 3960

tcctcgtaac atgtttcaac ctagaaaacc tcagatgagt gatttcgtgc aaattacgag 4020

ttgtgaagtg acatttctga acactacaca tacgacattt caggagattg tgattgatta 4080

tattgacatc aacaagacta tcgctgatat gcttgaacaa taccattcta attacacaac 4140

acctgagtta gacttacagc tggaaatttt taatcagaca aagttaaacc tcactgcaga 4200

aatagaccaa ttggaacaaa gagcagacaa cctcactaat atcgcacatg aactacagca 4260

gtacattgac aaccttaata agactattgt tgacctcgaa tggctcaaca ggattgaaac 4320

ttatgtaaaa tggccatggt atgtgtggct actaattgga ttagtagtag tcttctgcat 4380

accattgtta ctgttttgct gtcttagcac aggctgctgt gggtgttttg gttgtcttgg 4440

aagttgttgt cattctcttt gcagtagacg tcaatttgaa agttatgaac ctattgaaaa 4500

ggttcacgtt cattgatgaa catctgaatc acccactgcc ttctctctag cctggaaacc 4560

caggcctaca tccataagaa gcccttaaat ccttcctctg tgttcttcaa gtgctcaggc 4620

tctgacattt catggtgtta ccctaccctg acactttaat aaagactaaa ttggtttgct 4680

ggtcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4740

aaaaaaaaaa aaaa 4754

<210> 20

<211> 4528

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

gtcgactttg gcacaatgat cttgttaata cttgcactcc ttagcattgc tagctctgaa 60

gatgctcctc atggtgtcac cttgccccac ttcaacacgt cccataacaa ttccaagttt 120

gaacttaact tttacaattt cttacagact tgggacatac caccgaatac agaaactatt 180

ctgggtggtt acttaccata ttgtgaccat gaagacaatt gtggatggta taattttgtt 240

tataacaaca aagtgggacc aaatgctaag tattcctaca taaacaccca aaacttgaac 300

ataccaaatg tccatggtgt gtactttgat gtacgagaac acaattctga tggtgtgtgg 360

gatcaaattg acagagttgg cttattgata gccattcatg gcacttcgca ttatagtcta 420

cttatggttt tacaggatgg cgtggaggcg agtcagcctc atgttgctgt taaaatttgc 480

cattggaatc caggtaacat aagtacttac catcaatttg atgtaaatct aggagatggt 540

ggtcaatgcg tttttaatca aagattctca ttggacaccg tgttgaccgc taatgacttc 600

tatggcttcc aatggactga cacatatgta gacatatact taggtggcac tattactaaa 660

gtatgggttg taaatgattg gagtgttgtt gaagctagca tttcatctca ttggaatgca 720

cttaattatg gttactacat tcaatttgtc aatcgcacca cttattacgc ttacaatagt 780

actggtggtt caaattatac ccatctgcag ttaactgagt gccatactga ctactgtgct 840

ggttatgcta agaatgtctt tgtgccaatt gatggcaaaa taccagaagg cttttctttt 900

agcaattggt ttcttttaac agataaatcc actctagtgc aaggacgtgt tcttagtagt 960

cagcctgttt ttgtacaatg ccttagacct gtaccaacat ggtctaacaa tactgctgtg 1020

gtgcatttta aaaatgatgt tttctgccct aacgtcacgg cagacgtttt gaggttcaat 1080

ctaaatttta gtgacactga tgtttataca gattcaacaa ctgatgatca gttgcatttt 1140

acatttgaag ataatacaac tgcatccata acctgttaca gcagtgctaa tgtcactgac 1200

aaccaacctg caagtggcag catctcacat actccctttg tcagcaactc ttacctctgt 1260

tttgccaatt tttctcactc tagtgtgagc agacagttct taggtatact accaccaact 1320

gtacgagagt ttgcattcgg cagagatgga tccatttttg ttaatggcta taaatatttt 1380

agtttacaac ctattaagag tgttaacttc tccatcagtt cagtggagaa ttatggcttt 1440

tggaccatag cctatactaa ctatacagat gtaatggtgg atgttaatgg cacagttatt 1500

actaggttat tctattgtga ctcacccctc aatagaatta agtgtcaaca attgaagcat 1560

gagctaccag atgggtttta ttcagctagc atgcttgtta aaaaggatct acctaagact 1620

tttgtaacta tgccacagtt ctacaattgg atgaatgtta cgctacatgt cgttttaaat 1680

gacattgaaa aaaaagctga catcatcttg gctggggctc cagaattagc ttcacttgcc 1740

gacatacact ttgaaatagc acaggctaat gggagtgtag tgaatgtcac tagtgtgtgt 1800

gttcaggcaa gacagttggc tttattctac aagtacacta gcctacaagg tttgtacact 1860

tattctaatc tggtgcagtt acaaaattat gactgtccct tctcgccaca gcagtttaat 1920

aattatttgc agtttgaaac tctgtgtttt gatgtaagcc cagctgttgc aggttgtaag 1980

tggtcgttag ttcatgacgt taaatggcgc acacagtttg caacaattac tgtgtcttac 2040

aaagatggtg caatgattac tactatgcca aaggcacagc tgggttttca ggacatctcc 2100

aatattgtta aagatgaatg tacagattat aatatatatg gctttcaagg cacaggcatt 2160

attagaagta ccacatcaag attggtcgct ggtctttact acacctcagc tagtggtgac 2220

ctcctcggat ttaaaattag cactacaggt gaaattttca ccgtggtgcc atgtgactta 2280

acagctcaag cagcagtgat taatgacgaa atagtgggag ctataacagc cactaatcaa 2340

actgatctgt ttgagtttgt aaatcacaca tggtcgagaa gtgcacgcgg gtcatcacca 2400

agcacagtta acacctacac tatgccccaa ttttattaca taacaaagtg gaataatggc 2460

acatcttcta attgcacatc tgtcattacc tactcctctt ttgcaatctg taatactggt 2520

gaaattaaat atgttaatgt tacccatgtt gaaattgtgg atgacagtgt aggtgttatt 2580

aaacctgttt caacaggtaa tataactata cctaaaaatt tcacagttgc agtgcaagct 2640

gaatatgttc agattcaagt caaacctgtt gctgttgatt gtgctaagta cgtttgcaat 2700

ggaaatagac attgccttaa cttgctaaca caatacacct cggcttgtca aacaatagaa 2760

aattccctta accttggtgc acgccttgaa tcgttaatgc ttaatgacat gatcacagtg 2820

tcagatcgta gtctagaatt cgcaactgtt gataagttta atactacagc tttaggtggt 2880

gaaaaactgg gtggtttata ctttgatggt ctgagtagcc tattaccacc cagagtaggt 2940

atgaggtctg ctgttgaaga tctattgttc aataaagtgg taactagtgg tcttggcact 3000

gtggatgatg attataaaaa gtgttcagct ggtacagatg tagctgacct agtttgtgcc 3060

caatattaca acggcataat ggtcttacct ggcgtcgtag attataataa gatggccatg 3120

tatactgcat ctttaatagg aggtatggct ttgggttcta ttacttcagc tgtcgccgtg 3180

cctttttcta tgcaagtaca ggccagactt aactatgtcg cgttacaaac tgatgtccta 3240

caggaaaacc agaaaatact tgctaatgct tttaataatg ccattggcaa cattacacta 3300

gctcttggaa aagtttccaa tgctattaca accgtctcag atggatttaa tagtatggcc 3360

tcagcactga ctaagattca gagtgtagtt aaccaacagg gtgaagcgtt gagtcatctc 3420

atcagtcagt tacagaaaaa cttccaggct attagtagtt ccattgctga aatctacaat 3480

agattggaaa aagtggaagc tgatgctcaa gttgaccgac tcattactgg aagattggca 3540

gcacttaatg cctatgtggc tcaaacttta actcagtatg ctgaagtcaa ggctagtaga 3600

cagttggcaa tggagaaagt taatgagtgt gtgaaatcac agtcggatag gtatgggttc 3660

tgtggaaatg gaacgcacct attctcactc gtcaattccg cacctgatgg tttgcttttc 3720

tttcacacag tcttgcttcc tacagaatgg gaagaagtga cggcatggtc aggaatatgt 3780

gttaatgaca cttatgcata tctgttgaaa gatttcgatc attccatttt cagctacaat 3840

ggcacgtata tggtaactcc tcgtaacatg tttcaaccta gaaaacctca gatgagtgat 3900

ttcgtgcaaa ttacgagttg tgaagtgaca tttctgaaca ctacacatac gacatttcag 3960

gagattgtga ttgattatat tgacatcaac aagactatcg ctgatatgct tgaacaatac 4020

cattctaatt acacaacacc tgagttagac ttacagctgg aaatttttaa tcagacaaag 4080

ttaaacctca ctgcagaaat agaccaattg gaacaaagag cagacaacct cactaatatc 4140

gcacatgaac tacagcagta cattgacaac cttaataaga ctattgttga cctcgaatgg 4200

ctcaacagga ttgaaactta tgtaaaatgg ccatggtatg tgtggctact aattggatta 4260

gtagtagtct tctgcatacc attgttactg ttttgctgtc ttagcacagg ctgctgtggg 4320

tgttttggtt gtcttggaag ttgttgtcat tctctttgca gtagacgtca atttgaaagt 4380

tatgaaccta ttgaaaaggt tcacgttcat tgatgaaaca acacaatcac aacatctcag 4440

cctaccctga gagtcgacaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 4528

Claims (8)

1.一种用于猫冠状病毒的RNA疫苗，其特征在于，所述RNA疫苗为采用含有5’UTR、S蛋白、终止密码子、3’UTR以及polyA核酸的序列合成；

所述S蛋白选自FCoV-I型或FCoV-II型。

2.由权利要求1所述的用于猫冠状病毒的RNA疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括纳米脂质颗粒，所述纳米脂质颗粒包裹RNA疫苗。

3.由权利要求1所述的用于猫冠状病毒的RNA疫苗，其特征在于，所述5’UTR、3’UTR的序列选取自猫源的猫血红蛋白或猫白蛋白，所选序列的同源性在50%~100%。

4.由权利要求1所述的用于猫冠状病毒的RNA疫苗，其特征在于，所述5’UTR、3’UTR分别选自六组不同的猫血红蛋白或猫血清白蛋白，其核酸序列分别为序列表SEQ ID NO.1和SEQID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的六组。

5.由权利要求1所述的用于猫冠状病毒的RNA疫苗，其特征在于，所述5’UTR、3’UTR的六组序列选自GenBank中NCBI参考序列XM_023246781.1、XM_011290755.3、XM_003992859.2、XM_003992882.4、XM_003998693.4、X84842.1。

6.由权利要求1所述的用于猫冠状病毒的RNA疫苗，其特征在于，所述猫冠状病毒的S蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.13所示，其核酸序列如序列表SEQ ID NO.14所示。

7.由权利要求1所述的用于猫冠状病毒的RNA疫苗，其特征在于，所述RNA疫苗的核酸序列包括如序列表SEQ ID NO.15~20所示。

8.一种用于猫冠状病毒的RNA疫苗的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

选取5’UTR、3’UTR、S蛋白、终止密码子、polyA核酸序列合成RNA疫苗的核酸序列构建于载体上，转染到细菌得到重组菌，将重组菌进行质粒提取得到重组质粒，将重组质粒进行酶切、转录、纯化得到RNA疫苗核酸，所述RNA疫苗的核酸序列如序列表SEQ ID NO.15~20所示；

所述S蛋白选自FCoV-I型或FCoV-II型。

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