CN105132437B

CN105132437B - 表达鼠伤寒沙门菌OmpL蛋白的重组猪痘病毒载体疫苗

Info

Publication number: CN105132437B
Application number: CN201510452639.8A
Authority: CN
Inventors: 范红结; 周红; 蔺辉星; 方臻; 方一臻
Original assignee: Nanjing Changji Biotechnology Co Ltd; Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Changji Biotechnology Co Ltd; Nanjing Agricultural University
Priority date: 2015-07-28
Filing date: 2015-07-28
Publication date: 2018-06-08
Anticipated expiration: 2035-07-28
Also published as: CN105132437A

Abstract

本发明属于生物制品领域，提供一种鼠伤寒沙门菌外膜蛋白L的编码基因、包括该基因的转移载体pUSG11/P28‑OmpL、重组猪痘病毒rSPV‑OmpL及其应用、制备方法。编码基因序列如SEQ ID NO.1所示。重组猪痘病毒是在猪痘病毒VR‑363中插入鼠伤寒沙门菌外膜蛋白L基因获得的。重组猪痘病毒载体疫苗rSPV‑OmpL能够在免疫动物体内大量表达目的蛋白OmpL，能够诱导动物体内产生较高效价的针对OmpL的抗体，并对免疫动物产生良好的保护作用，对小鼠的免疫保护率可高达80％，兼具有弱毒疫苗的免疫效果好和灭活疫苗的安全性高等特点，是一种理想的新型疫苗。

Description

表达鼠伤寒沙门菌OmpL蛋白的重组猪痘病毒载体疫苗

技术领域

本发明属于生物制品领域，涉及一种表达鼠伤寒沙门菌OmpL蛋白的重组猪痘病毒载体疫苗，具体涉及一种鼠伤寒沙门菌外膜蛋白L的编码基因、包括该基因的转移载体pUSG11/P28-OmpL、重组猪痘病毒rSPV-OmpL及其应用、制备方法。

背景技术

鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)是一种重要的人畜共患病原菌，其感染发病率居沙门菌感染的首位。鼠伤寒沙门菌在自然界分布广泛，主要经水和食物传播，可引起人类和动物的多种疾病。鼠伤寒沙门菌感染仔猪，可导致仔猪副伤寒(swineparatyphoid)。主要引起猪的败血症、肠炎、肺炎和肝炎，也可使怀孕母猪发生流产。随着养猪业的集约化发展，该病对猪场正常生产的不利影响越来越大。

外膜蛋白L(outer membrane porin L，OmpL)是鼠伤寒沙门菌外膜中的主要结构，对该菌的免疫和致病作用都有重要影响。OmpL蛋白具有良好的免疫原性，能增强实验动物的细胞免疫和体液免疫，抵抗同源菌或异源菌的攻击，不同血清型菌株之间具有相同的外膜蛋白免疫抗原，可产生交叉免疫保护作用。

重组猪痘病毒(Swinepox virus，SPV)作为表达载体，有许多特有的优点：(1)SPV的复制发生在细胞质内，避免了病毒基因组整合到宿主细胞染色体中的可能，从而消除了对人类和其他动物的潜在威胁。(2)SPV基因组容量大，至少能容纳25kb外源基因的插入，适合研制多价疫苗，并且具有多个复制非必需基因可用作外源基因的插入位点。(3)SPV只感染猪，具有严格的宿主特异性，生物安全性高。(4)重组SPV载体疫苗有多种接种途径，包括口服免疫，可大大降低劳动强度，同时可避免因疫苗接种导致的应激反应。目前，并没有报道利用SPV载体构建表达鼠伤寒沙门菌的外膜蛋白L的重组猪痘病毒，更没有利用SPV载体表达鼠伤寒沙门菌的外膜蛋白L预防鼠伤寒沙门菌的疫苗或药物的报道。

发明内容

本发明的目的是研制一种能够有效防制鼠伤寒沙门菌的重组猪痘病毒载体疫苗，对猪感染鼠伤寒沙门菌的预防工作提供有力的支持。

本发明的目的通过以下技术方案实现

1.本发明提供一种鼠伤寒沙门菌外膜蛋白L的编码基因，该编码基因序列如SEQiD NO.1所示，表达的外膜蛋白L影响鼠伤寒沙门菌的免疫和致病。

2.本发明还提供一种鼠伤寒沙门菌外膜蛋白L基因的转移载体pUSG11/P28-OmpL，该专利载体具有鼠伤寒沙门菌外膜蛋白L基因，其序列如SEQ ID NO.1所示，通过将鼠伤寒沙门菌外膜蛋白L基因序列插入到BamHI和SalI酶切位点之间。

3.本发明还提供一种重组猪痘病毒rSPV-OmpL，所述猪痘病毒是在猪痘病毒VR-363中插入鼠伤寒沙门菌外膜蛋白L基因获得的，其中，所述鼠伤寒沙门菌外膜蛋白L基因序列如SEQ ID NO.1所示，能够表达目的蛋白OmpL。

本发明通过Western blot、间接免疫荧光检测证明重组猪痘病毒rSPV-OmpL能够在细胞内高效率的表达蛋白OmpL。通过动物免疫试验，重组猪痘病毒rSPV-OmpL能够在免疫动物体内大量表达目的蛋白OmpL，能够诱导动物体内产生较高效价的针对OmpL的抗体，并对免疫动物产生良好的保护作用。

4.本发明还提供一种疫苗组合物，该组合物包括重组猪痘病毒rSPV-OmpL，该重组猪痘病毒包括猪痘病毒载体VR-363和鼠伤寒沙门菌外膜蛋白L基因。

5.本发明还提供上述1提供的编码基因在预防猪感染鼠伤寒沙门菌上的应用。

6.本发明还提供上述2或3所述的转移载体pUSG11/P28-OmpL在预防猪感染鼠伤寒沙门菌上的应用。

7.上述4提供的疫苗组合物在预防猪感染鼠伤寒沙门菌上的应用，其中，疫苗中所述重组猪痘病毒rSPV-OmpL的浓度维持在1.0×10⁸PFU/mL。

本发明所述疫苗的接种途经包括但不限于肌肉注射等。

8.本发明还提供上述重组猪痘病毒rSPV-OmpL的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)引物设计：根据鼠伤寒沙门菌的基因序列设计一对针对ompL基因的特异性引物，在引物的5’端分别含有限制性内切酶SalI和BamHI的酶切位点；

(2)目的基因片段与载体连接：以鼠伤寒沙门菌基因组为模板，通过步骤(1)设计的特异性引物进行PCR扩增获得扩增片段；利用限制性内切酶BamHI和SalI对扩增片段进行酶切，获得目的片段，其序列如SEQ ID NO.1所示；利用限制性内切酶BamHI和SalI酶切pUSG11/P28获得酶切载体，试剂盒回收；连接酶反应体系中，连接目的片段和酶切载体，获得穿梭载体pUSG11/P28-OmpL；

(3)重组猪痘病毒rSPV-OmpL的构建：用脂质体转染法使穿梭载体pUSG11/P28-OmpL与猪痘病毒发生同源重组，收获重组猪痘病毒rSPV-OmpL原液；

(4)通过噬斑纯化重组猪痘病毒。

9.上述8提供的制备方法，其中，步骤(1)所述的特异性引物为，P1序列如SEQ IDNO.2所示，P2序列如SEQ ID NO.3所示。

10.上述8提供的制备方法，其中，步骤(3)所述的重组猪痘病毒rSPV-OmpL原液的构建方法为：提前一天将PK15细胞接种到24孔细胞培养板上，使其长成单层细胞；先用0.05MOI的SPV感染PK15单层细胞，1h后将脂质体与穿梭载体的混合液加入到24孔细胞培养板中；PK15细胞继续在37℃5％的二氧化碳培养箱中培养4天，待能看到明显的病毒噬斑后，将其反复冻融3次，收获重组猪痘病毒rSPV-OmpL原液。

本发明的有益效果：

1.本发明首次将鼠伤寒沙门菌外膜蛋白L的编码基因插入到载体pUSG11/P28获得转移载体pUSG11/P28-OmpL，以该转移载体与猪痘病毒VR-363发生同源重组，获得重组猪痘病毒。该重组猪痘病毒能够稳定、高效率表达鼠伤寒沙门菌外膜蛋白L，培养滴度稳定在10^8.2PFU/mL。

2.通过免疫试验证明，重组猪痘病毒rSPV-OmpL免疫组的小鼠血清抗体效价显著高于对比组，证明本发明所述重组猪痘病毒rSPV-OmpL能有效的刺激机体产生免疫反应。经过攻毒保护试验，以重组猪痘病毒rSPV-OmpL制成的疫苗对小鼠的免疫保护率可高达80％。

3.重组猪痘病毒不感染其他动物，只感染猪，在猪体产生温和反应，使用比较安全。突破了鼠伤寒沙门菌常规灭活疫苗和弱毒疫苗的局限性，兼具有弱毒疫苗的免疫效果好和灭活疫苗的安全性高等特点，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1转移载体pUSG11/P28-OmpL结构示意图；其中，LF和RF分别为猪痘病毒左、右同源交换序列；P11和P28为猪痘病毒启动子；GFP为报告基因；OmpL为目的蛋白基因

图2转移质粒pUSG11/P28-OmpL双酶切产物电泳检测结果；其中，1、2：转移质粒pUSG11/P28-OmpL双酶切产物；M：DL 5000DNA Marker

图3重组猪痘病毒rSPV-OmpL的PCR检测；其中，M：DL 5000DNA Marker；1：重组猪痘病毒rSPV-OmpL；2：猪痘病毒野毒SPV

图4重组猪痘病毒rSPV-OmpL的Western blot检测；其中，1：感染猪痘病毒野毒SPV的PK15细胞；2：感染重组猪痘病毒rSPV-OmpL的PK15细胞；M：预染蛋白Marker

图5重组猪痘病毒rSPV-OmpL的间接免疫荧光检测；其中，A：重组猪痘病毒rSPV-OmpL感染的PK15细胞，能够看到明显的红色荧光；B：猪痘病毒野毒SPV感染的PK15细胞，未见红色荧光

图6重组猪痘病毒rSPV-OmpL免疫小鼠的血清抗体效价检测

图7重组猪痘病毒载体疫苗rSPV-OmpL的攻毒保护检测

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。

实施例1

1 ompL基因的克隆及鉴定

1.1 ompL基因PCR扩增

根据鼠伤寒沙门菌(GenBank：AE006468.1)的基因序列设计一对针对ompL基因的特异性引物，在引物的5’端分别含有限制性内切酶SalI和BamHI的酶切位点。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。序列如下：

P1：5’-CAGGTCGACGGCGCTTATGTAGAAAACC-3’(SEQ ID NO.2)

P2：5’-CTAGGATCCTCAGAAGAAATACTTCGCCC-3’(SEQ ID NO.3)。

以本实验室2014年从江苏宿迁某规模化猪场发病仔猪肠道分离的鼠伤寒沙门菌JSSQ14株(该菌株纯化方法属于常规技术，公众能通过普通方法再次获得。该菌株为本实验室保存，愿意提供给公众进行研究)基因组为模板，通过PCR扩增ompL基因。具体操作如下：取2×Master Mix 25μL，P1 1μL、P2 1μL，沙门菌JSSQ14株核酸模板3μL，用无菌超纯水补至总体积50μL。在PCR仪上进行反应。循环参数为94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，共进行30个循环；然后72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切下含目的条带的琼脂糖凝胶块，用DNA快速回收纯化试剂盒回收凝胶中的目的片段。具体操作步骤按Geneaid公司凝胶回收试剂盒的说明书进行。

1.2 PCR产物酶切与纯化

酶切反应总体积为80μL：PCR回收片段60μL，10×T buffer 12μL，BamHI 4μL，SalI4μL。37℃作用4h，然后进行琼脂糖凝胶电泳并用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。

1.3 pUSG11/P28质粒酶切与纯化

酶切反应总体积为80μL：pUSG11/P28质粒60μL，10×T buffer 12μL，BamHI 4μL，SalI 4μL。37℃作用4h，然后进行琼脂糖凝胶电泳并用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。

其中，pUSG11/P28的构建方法为：

以质粒pEGFP-N1(Takara)为模板，用引物：

11G1：5’-GGTACCGGCTGATTATGATCTAGAGTCG-3’

11G2：5’-CTCGAGATATAGTAGAATTTCATTTTGTTTTTTTCTATGCTATAAATGAACATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’。扩增出绿色荧光蛋白GFP的基因，通过酶切、连接，克隆到1.1中构建的载体pUS01中的Kpn I-SalI位点，形成转移载体pUSG11。

设计并合成两条互补的寡核苷酸链：

P281：5’-CAGATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCATATAAATGGTCGACTCGAGAGCTCCCGGGGATCCATCGATGC-3’

P282：5’-GGCCGCATCGATGGATCCCCGGGAGCTCTCGAGTCGACCATTTATATGCCAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATCTGGTAC-3’。二者退火形成带Kpn I和Not I粘性末端的双链DNA片段。此片段中含经过改造的痘苗病毒强启动子P28序列及9个可用于外源基因插入的限制性酶切位点SalI、HincII、XhoI、SacI、XmaI、SmaI、BamHI、ClaI和NotI。然后把这个DNA片段克隆到载体pUSG11的Kpn I和Not I位点，得到通用穿梭载体pUSG11/P28

1.4转移质粒pUSG11/P28-OmpL的构建

连接反应总体积为10μL：酶切回收PCR产物6μL，载体pUSG11/P28酶切回收产物2μL，10×T4连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶1μL，混匀各产物后在16℃连接过夜。连接产物pUSG11/P28-OmpL(图1)转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。

1.5转移质粒pUSG11/P28-OmpL的鉴定

用质粒提取试剂盒提取重组质粒pUSG11/P28-OmpL，用BamHI/SalI双酶切鉴定，在双酶切鉴定中可以见到目的条带(图2)。

1.6目的基因ompL序列分析

在转移质粒pUSG11/P28-OmpL所有插入片段的两侧设计引物，进行PCR反应，扩增pUSG11/P28-OmpL中所有的插入基因。PCR产物送上海英俊生物科技有限公司进行测序。测序结果如SEQ ID NO.1所示，将所测得的序列与GeneBank数据库中的ompL基因进行同源性比较，表明本发明所克隆的ompL基因与鼠伤寒沙门菌其他菌株的碱基序列同源性高达98％，而且克隆的基因完全符合载体阅读框要求。

2含有ompL基因的重组猪痘病毒的制备及测定

2.1重组猪痘病毒rSPV-OmpL的构建

用脂质体转染法使穿梭载体pUSG11/P28-OmpL与猪痘病毒(ATCC：VR-363)发生同源重组。具体操作步骤是：提前一天将PK15细胞接种到24孔细胞培养板上，使其长成单层细胞。先用0.05MOI的SPV感染PK15单层细胞，1h后将脂质体与穿梭载体的混合液加入到24孔细胞培养板中。PK15细胞继续在37℃5％的二氧化碳培养箱中培养4天，待能看到明显的病毒噬斑后，将其反复冻融3次，收获重组猪痘病毒rSPV-OmpL原液。

2.2重组猪痘病毒的噬斑纯化

在6孔细胞板的每一个孔接种3×10⁵个细胞，5％的二氧化碳温箱中静置培养；待细胞长成完全单层后，把重组病毒原液按1∶5倍比稀释接种到单层细胞上，37℃吸附1.5h；弃去感染液，用DHanks缓冲液轻轻地洗两次；然后每孔加入3mL含2％胎牛血清(FBS)的1.5％甲基纤维素营养液，37℃5％的二氧化碳温箱中静止培养3-5天，观察噬斑；待能观察到明显的噬斑后，在荧光显微镜下，用灭菌枪头挑取显绿色荧光的噬斑放入含200μL无菌PBS的无菌离心管中，反复冻融三次；12000rpm离心5min；收获的病毒接种于一新的6孔细胞培养板中，重复10次。

2.3重组猪痘病毒滴度的测定

按病毒学操作手册介绍的方法，用含青霉素和链霉素的DHanks缓冲液将病毒作10倍梯度稀释。然后分别接种于长满PK15细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种8个孔，每孔接种100μL。同时设定阴、阳性对照。37℃5％CO₂温箱培养2h后，换维持液继续培养。逐日观察细胞病变，并按Reed-Muech法计算病毒滴度。通过计算得出，本发明所研发的重组猪痘病毒rSPV-OmpL的培养滴度稳定在10^8.2PFU/mL。

2.4重组猪痘病毒的PCR检测

取出同步接种重组猪痘病毒rSPV-OmpL的PK15细胞和接种猪痘病毒野毒SPV的PK15细胞各一管，用Geneaid病毒核酸提取试剂盒按其说明提取病毒DNA，以提取的DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物电泳检测结果如图3所示，结果表明重组猪痘病毒中含有ompL基因片段，大小为633bp。而对照的猪痘病毒野毒中扩增不出ompL基因。

按5MOI将重组猪痘病毒rSPV-OmpL接种到PK15细胞单层上，37℃5％的二氧化碳温箱中培养2天，使病毒大量增殖；弃去细胞培养液，并用灭菌PBS冲洗两次，加入少量灭菌PBS，用细胞刮子将单层细胞刮下，收获细胞；反复冻融两次，使重组猪痘病毒充分释放，进行SDS-PAGE电泳，同时设SPV野毒感染的阴性对照；再将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转印到PVDF膜上；然后用5％脱脂奶封闭，置4℃冰箱中过夜；次日将膜放入含1∶5000稀释的含一抗(抗OmpL多抗)的封闭液中置37℃摇床中50rpm作用1h，将膜取出用TBST洗三次，每次5min，再将膜放入含1∶10000稀释的含酶标二抗(HRP标记的羊抗兔)的封闭液中，同样条件作用1h，再用TBST洗三次，每次5min，将膜放入“沉淀型TMB单组份底物”中，使其显色。结果(图4)表明目的蛋白OmpL在重组猪痘病毒rSPV-OmpL中有较高效率的表达，而在阴性对照中则没有目的蛋白出现。

2.6重组猪痘病毒的间接免疫荧光检测

在6孔细胞培养板上接种PK15细胞，使其长成细胞单层；用DHanks缓液将重组猪痘病毒进行稀释，按15PFU/孔接种细胞，同时设定阴性对照；在37℃5％的二氧化碳温箱中温育60h；弃去营养液，用PBS洗涤细胞，然后弃去PBS；加入-20℃预冷的甲醇，固定10min；用PBST冲洗3次后加入含10％BSA的PBST，37℃封闭Ih；加入兔源抗OmpL多抗，37℃孵育Ih；PBST冲洗3次，加入罗丹明标记的羊抗兔IgG二抗，37℃作用0.5h；最后用PBST冲洗3次后，在荧光显微镜下观察。结果(图5)表明：A组接种了重组猪痘病毒，感染的PK15细胞胞浆内出现了明显的荧光；而阴性对照组B组接种了猪痘病毒野毒，未观察到荧光。

3重组猪痘病毒载体疫苗对实验动物的免疫保护检测

3.1重组猪痘病毒载体疫苗rSPV-OmpL的ICR小鼠免疫试验

取40只5周龄清洁级ICR小白鼠随机分成四组，每组10只；第一组用2.0×10⁷PFU的重组猪痘病毒rSPV-OmpL肌肉注射免疫，其余三组分别为猪痘病毒野毒SPV免疫的阴性对照、灭活的鼠伤寒沙门菌(CVCC542)全菌免疫的阳性对照以及PBS处理的空白对照。初次免疫后的第14天和第28天分别按相同方法进行二免和三免；每天观察实验小鼠，以记录其免疫反应；在初次免疫的前一天及第7、14、21、28和35天小鼠眼眶采血，分离血清，用间接ELISA法测其OmpL抗体效价。结果(图6)表明：重组猪痘病毒rSPV-OmpL免疫组的小鼠血清抗体效价显著高于其他三组，证明本发明所述重组猪痘病毒rSPV-OmpL能有效的刺激机体产生免疫反应。

3.2重组猪痘病毒载体疫苗rSPV-OmpL的攻毒保护试验

最后一次免疫(三免)后两周，所有的小鼠均腹腔接种对数生长期的鼠伤寒沙门菌0.2mL，约为5倍的LD₅₀(5.0×10⁵CFU)；每天观察小鼠的变化，并记录死亡率，连续观察10天；10天仍未死亡的小鼠，施以安乐死；对死亡小鼠进行剖检并分离病原菌，染色及PCR检测均证明是鼠伤寒沙门菌。结果(图7)表明：重组猪痘病毒载体疫苗rSPV-OmpL对小鼠的免疫保护率可高达80％。

综上所述，本专利所涉及的重组猪痘病毒载体疫苗rSPV-OmpL能够在免疫动物体内大量表达目的蛋白OmpL，能够诱导动物体内产生较高效价的针对OmpL的抗体，并对免疫动物产生良好的保护作用，是一种理想的新型疫苗。

可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种鼠伤寒沙门菌外膜蛋白L的编码基因，其特征在于：该编码基因序列如SEQ IDNO.1所示，表达的外膜蛋白L影响鼠伤寒沙门菌的免疫和致病。

2.一种鼠伤寒沙门菌外膜蛋白L基因的转移载体pUSG11/P28-OmpL，其特征在于：该转移载体具有鼠伤寒沙门菌外膜蛋白L基因，其序列如SEQ ID NO.1所示，通过将鼠伤寒沙门菌外膜蛋白L基因序列插入到BamHI 和SalI酶切位点之间。

3.一种重组猪痘病毒rSPV-OmpL，其特征在于：所述猪痘病毒是在猪痘病毒VR-363中插入鼠伤寒沙门菌外膜蛋白L基因获得的，其中，所述鼠伤寒沙门菌外膜蛋白L基因序列如SEQID NO.1所示，能够表达目的蛋白OmpL。

4.一种疫苗，其特征在于：该疫苗由权利要求3所述的重组猪痘病毒rSPV-OmpL组成，重组猪痘病毒包括猪痘病毒载体VR-363和鼠伤寒沙门菌外膜蛋白L基因。

5.重组猪痘病毒rSPV-OmpL的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）引物设计：根据鼠伤寒沙门菌的基因序列设计一对针对ompL基因的特异性引物，在引物的5’端分别含有限制性内切酶SalI和BamHI的酶切位点；

（2）目的基因片段与载体连接：以鼠伤寒沙门菌基因组为模板，通过步骤（1）设计的特异性引物进行PCR扩增获得扩增片段；利用限制性内切酶BamHI和SalI对扩增片段进行酶切，获得目的片段，其序列如SEQ ID NO.1所示；利用限制性内切酶BamHI和SalI酶切pUSG11/P28获得酶切载体，试剂盒回收；连接酶反应体系中，连接目的片段和酶切载体，获得穿梭载体pUSG11/P28-OmpL；

（3）重组猪痘病毒rSPV-OmpL的构建：用脂质体转染法使穿梭载体pUSG11/P28-OmpL与猪痘病毒发生同源重组，收获重组猪痘病毒rSPV-OmpL原液；

（4）通过噬斑纯化重组猪痘病毒。

6.权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述的特异性引物为，P1序列如SEQ ID NO.2所示，P2序列如SEQ ID NO.3所示。

7.权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述的重组猪痘病毒rSPV-OmpL原液的构建方法为：提前一天将PK15细胞接种到24孔细胞培养板上，使其长成单层细胞；先用0.05MOI的SPV感染PK15单层细胞，1 h后将脂质体与穿梭载体的混合液加入到24孔细胞培养板中；PK15细胞继续在37℃ 5%的二氧化碳培养箱中培养4天，待能看到明显的病毒噬斑后，将其反复冻融3次，收获重组猪痘病毒rSPV-OmpL原液。