DE19615934C1 - Verfahren zur qualitativen und quantitativen analytischen Erfassung des Schimmelpilzes Fusarium Graminearum in Reinkulturen und in jeglichem Probenmaterial - Google Patents
Verfahren zur qualitativen und quantitativen analytischen Erfassung des Schimmelpilzes Fusarium Graminearum in Reinkulturen und in jeglichem ProbenmaterialInfo
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Description
Die Erfindung betrifft Verfahren, die auf der Grundlage der enzymatischen Aktivität, der
Proteinstruktur, sowie der für das Protein kodierenden Gensequenz des Enzyms Galaktose-
Oxidase, für den qualitativen und quantitativen Nachweis des Pilzes Fusarium graminearum
in Reinkulturen sowie in jeglichem Probenmaterial eingesetzt werden.
Fusarium graminearum ist ein seit langem bekannter Pilz mit weltweiter Verbreitung. Er
kommt vornehmlich in Böden der gemäßigten bis wärmeren Klimazonen vor. In
Süddeutschland tritt er verbreiteter auf als in Norddeutschland. Er befällt Getreide und Mais.
An diesen Pflanzen verursacht er bekannte Krankheiten, die sich als Augenflecken an den
Halmen, Blattnekrosen, Wurzelschädigungen und Weißährigkeit bei Getreide sowie als
Kolbenfäule bei Mais äußern. Der jährliche Verlust an Erntegut durch diesen Pilz ist
bedeutend. Wirksame Fungizide stehen zur Zeit nicht zur Verfügung. Neben den Schäden
durch Ertragseinbußen durch befallenes Getreide führt der Pilz auch zu einer erheblichen
Kontamination des Getreides mit giftigen Stoffwechselprodukten (Mykotoxinen). Diese
können bei Verzehr durch Mensch und Tier zu ernsten Vergiftungen führen, die insbesondere
im Bereich der Tiererzeugung immer wieder zu massiven wirtschaftlichen Schäden führen.
Beim Menschen sind durch die Wirkung von Trichothecen-Mykotoxinen, die insbesondere
durch Fusarium graminearum gebildet werden, verschiedene Krankheitsbilder bekannt (red
mold disease, Kashin-Beck-Syndrom, Alimentäre toxische Aleukie). Auch im Bereich der
Biererzeugung verursacht der Pilz Qualitätsmängel durch in das Bier gelangende Mykotoxine.
Auch an dem in manchen Jahren in verschiedenen Ländern der Welt verstärkt auftretenden
Überschäumen von Bieren (Gushing) ist Fusarium graminearum als Auslöser maßgeblich
beteiligt.
Galaktose-Oxidase ist ein Enzym, welches die Oxidation der am C-6 Atom des Zuckers
D-Galaktose vorhandenen Hydroxylgruppe zur Ketogruppe katalysiert. Das entstehende Produkt
ist D-Galactohexodialdose. Die genaue ökologische Funktion des Enzyms ist bisher nicht
bekannt. Ein Zusammenhang mit Infektionsmechanismen des produzierenden Pilzes wurde
diskutiert, blieb jedoch bisher unbewiesen. Das Enzym wird häufig in Stämmen des Pilzes
Fusarium graminearum gefunden, wie dies in einer brasilianischen Studie an 48 Stämmen
gezeigt wurde (Dias, D., Kemmelmeier, C. (1987): Galaktose oxidase occurrence in
Fusarium graminearum, Rev. Microbiol. 18, 276-278). Dabei wiesen 18 der 48 untersuchten
Stämmen eine Aktivität dieses Enzyms auf. Neben der Oxidase Aktivität konnte eine Lectin
Aktivität des Enzyms aufgezeigt werden (Zakharova, I.Ya., Kovalenko, E. A., Buglova, T.
T. (1986): Lectin properties of Galaktose oxidase of Fusarium graminearum IMV-F-1060,
Biokhimiya (Moskau), 51, 1249-1255). Der Hauptproduzent für kommerziell hergestellte
Präparate der Galaktose-Oxidase ist der Pilzstamm Cladobotryum dendroides NRRL 2903
(identisch mit ATCC 46032). Dieser Stamm ist der einzige dieser Art, für den die Bildung
von Galaktose-Oxidase gezeigt werden konnte. Die Namengebung des Stammes NRRL 2903
wurde mehrfach geändert, da er infolge fehlender Sporulation mit den Mitteln der klassischen
Taxonomie bisher nicht exakt klassifiziert werden konnte. Durch die Verwendung spezieller
Nährböden konnte das Isolat zur Produktion weniger, morphologisch nicht eindeutig
einzuordnender Konidien gebracht werden (Ögel, Z. B., Brayford, D., McPherson, M. J.
(1994): Cellulose-triggered sporulation in the Galaktose oxidase-producing fungus
Cladobotryum (Dactylium) dendroides NRRL 2903 and its re-identification as a species of
Fusarium, Mycol. Res. 98, 474-480). In der zitierten Arbeit wurde vermutet, daß es sich bei
dem Pilzstamm um Fusarium chlamydosporum handelt. Dies konnte jedoch in der genannten
Arbeit nicht bewiesen werden. Insbesondere eine Verbindung zwischen dem untersuchten
Stamm und Fusarium graminearum wurde dort nicht hergestellt und auch nicht vermutet.
Bereits in früheren Arbeiten wurde die Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz des
Enzyms Galaktose Oxidase aus Cladobotryum dendroides NRRL 2903 beschrieben
(McPherson, M. J., Ögel, Z. B., Stevens, C., Yadav, K. D. S., Keen, J. N. und Knowles,
P. F. (1992): Galaktose oxidase of Dactylium dendroides - gene cloning and sequence
analysis. Journal of Biological Chemistry 267, 8146-8152; GenBank Accession No.
M86819). Auch in dieser Arbeit wurde keine Verbindung zwischen Cladobotryum dendroides
NRRL 2903 und Fusarium graminearum hergestellt oder auch nur vermutet.
Da eine Bekämpfung des Pilzes auf dem Feld oder im Boden derzeit nicht möglich ist und der
Einsatz präventiver chemischer Behandlungsmaßnahmen in Lebensmittelbereich sich
ausschließt, kann ein Schutz des Verbrauchers vor den negativen Folgen des Befalles von
Getreide mit Fusarium graminearum nur durch eine Qualitätsprüfung von
Lebensmittelrohstoffen und auch von Saatgut in der Landwirtschaft gewährleistet werden. Aus
diesem Grunde muß eine Untersuchung auf den Befall mit dem Pilz vorgenommen werden.
Dazu wurden verschiedene Verfahren beschrieben:
Ausplattieren gemahlener Getreide- Pflanzen- oder Bodenproben auf mikrobiologische
Nährböden mit anschließender mikroskopischer Analyse der nach Bebrütung wachsenden
Pilzmyzelien.
Auslegen von ganzen Körnern, Wurzeln oder Erdpartikeln auf mikrobiologische Nährböden
mit anschließender mikroskopischer Analyse der nach Bebrütung wachsenden Pilzmyzelien.
Ausplattieren von Getreide-, Pflanzen- oder Bodenproben auf mikrobiologische Nährböden,
auf denen das Pilzmyzel eine bestimmte spezifizierende Eigenschaft aufweist wie z. B. eine
Verfärbung des Mediums durch Ausscheidung von farbigen Stoffwechselprodukten.
Nachteile der oben genannten Methoden sind die lange Analysendauer von etwa zwei Wochen
sowie die oftmals sehr weitgehenden Spezialkenntnisse, die für die Auswertung und
Interpretation der Ergebnisse mikrobiologischer Methoden notwendig sind. Darüber hinaus
eignen sich mikrobiologische Methoden ausschließlich für die Analyse von lebenden
Schimmelpilzen. Abgestorbene Myzelien, die insbesondere für die Beurteilung der Qualität
von Lebensmitteln und deren Rohstoffen von besonderer Bedeutung sind, können nicht erfaßt
werden. Als weiterer Nachteil mikrobiologischer Methoden kommt hinzu, daß eine
Quantifizierung des Pilzbefalles sehr schwierig ist und stark von der verwendeten Methode
der Probenaufbereitung (z. B. Mahlen mit unterschiedlicher Drehzahl) abhängt.
Hier werden Antiseren verwendet, die gegen das Pilzmyzel oder gegen vom Pilz gebildete
Substanzen gerichtet sind. Die in Verfahren bisher beschriebenen Antigene waren vor allem
extrazelluläre Polysaccharide. Auch gegen Proteine, die sowohl aus dem Medium als auch aus
dem Myzel von Pilzen isoliert wurden, konnten Antiseren gewonnen werden. In den
genannten Fällen handelte es sich jedoch stets um gattungsspezifische Antiseren, die keine
einzelne Art spezifisch erfassen konnten. Auch wurde eine deutliche Abhängigkeit der
Antigenproduktion von den Wachstumsbedingungen festgestellt. Für einen monoklonalen
Antikörper, der sich ebenfalls für den Nachweis der Gattung Fusarium eignet, wurde
Patentschutz beantragt (Chemical Patents Indes, Documentation Abstracts Journal, Sect. D,
Derwent Publications, London 1993; Nr. 92-384725/47; JP 04281796 A). Auch ein mit
diesem Antikörper erstelltes Verfahren, bei dem Pilze aus Bodenproben nach dem
Durchwachsen einer Gelschicht an einer Membran fixiert und anschließend mit Antikörpern
nachgewiesen werden, wurde zum Patent angemeldet (Chemical Patents Index,
Documentation Abstracts Journal, Sect. D, Derwent Publications, London 1994; Nr. 94-
211680/26; JP 06148194 A). Ein streng artspezifisches immunchemisches Nachweisverfahren
für Fusarium graminearum wurde bisher jedoch noch nicht beschrieben.
Direkte Analyse von Stoffwechselprodukten, die von dem Pilz produziert werden (z. B.
Mykotoxine, Ergosterin) mit Hilfe chromatographischer Methoden. Bei der direkten Analyse
von Stoffwechselprodukten führt die oft starke Umweltabhängigkeit der Bildung solcher
Substanzen sowie ihre meist bei mehreren Arten vorkommende Produktion zu Unsicherheiten
bei der Interpretation der Ergebnisse. Ergosterin kommt in allen pilzlichen Zellmembranen
vor, was lediglich seine Verwendung für eine summarische Abschätzung der Belastung von
Probenmaterial mit Pilzen erlaubt.
Ziel eines Nachweises mit molekularbiologischen Methoden ist die DNA von Organismen.
Diese Art der Analytik ist im Bereich der medizinischen Diagnostik sowie in der Forensik
und zunehmend auch in der Mikrobiologie weit verbreitet. Die bisher vorhandenen
Nachweisverfahren beruhen nahezu ausschließlich auf der Verwendung von DNA Sequenzen,
die durch die Analyse von Fragmenten erhalten wurden, die mit Zufallsprimern erzeugt
werden (sog. RAPD Fragmente). Sie sind daher keinem bestimmten Gen zuzuordnen. Für
den Nachweis von pflanzenpathogenen Pilzen, unter denen auch verschiedene Fusarium-Arten
eine Bedeutung haben, wurden jedoch auch PCR-gestützte Nachweisverfahren zum Patent
angemeldet, die auf der Nukleotid-Sequenz der ITS Segmente 1 und 2 (Internal Transcribed
Spacer) von verschiedenen Pilzen, unter anderem auch von Fusarium graminearum, beruhen
(WO 95/29260 A2). Eine weitere Patentanmeldung bezieht sich auf ein Verfahren, das mit
Hilfe von Oligonukleotidsonden und PCR Primern pflanzenpathogene Pilze wie
Pseudocercosporella herpotrichoides (eyespot), Septoria oder Fusarium nachweisen kann (WO
94/19489 A2). Die dort beschriebenen DNA-Sequenzen wurden aus den für 18S ribosomale
RNA kodierenden Genen der betreffenden Pilze abgeleitet. Die Verwendung von Sequenzen
aus den ITS Segmenten der pilzlichen rDNA birgt jedoch die allgemeine Gefahr, daß sich in
diesen Teilen des Gen-Clusters hochvariable Bereiche befinden. Von diesen Bereichen
abgeleitete Oligonukleotidsequenzen sind deshalb mit großer Wahrscheinlichkeit nicht für eine
ganze Art charakteristisch, sondern nur für einzelne Stämme oder gar Individuen. Die
Verwendung von DNA-Sequenzen, die aus wohlbekannten und definierten Genen stammen,
die für eine Art charakteristisch sind, umgeht die genannten Nachteile, indem von vornherein
Sequenzen verwendet werden, die nur der Zielorganismus hat. Da die Sequenz aus einem
funktionierenden Gen stammt, ist die zu erwartende Variabilität in der Basenfolge zwischen
einzelnen Stämmen sehr gering. Damit steigt die Wahrscheinlichkeit, daß alle Stämme der zu
erfassenden Art in positiver Weise reagieren, deutlich an. Ein solcher Weg wurde in der
Erfindung gemäß vorliegendem Anspruch 1 gewählt.
Der im Patentanspruch 1 angegebenen Erfindung liegt das Problem zugrunde, daß bisher
keine Methode existiert, mit der in Forschung und Praxis eine einfache und sichere
Identifizierung des Schadpilzes Fusarium graminearum mit vertretbarem Aufwand an Zeit und
Kosten bei absoluter Selektivität auch in Mischungen, mit hoher Sensitivität und bei einfacher
Überprüfbarkeit gelingt. Aufgabe der Erfindung ist es, einfach handhabbare und ohne
Spezialkenntnisse im betrieblichen Labor, in der Forschung oder auf dem Feld durchführbare
Verfahren bereitzustellen, die mit einem deutlich geringeren als dem bisher notwendigen
Aufwand an Zeit bei verbesserter Genauigkeit eine Aussage über den Kontaminationsgrad von
Probenmaterialien mit Fusarium graminearum als wichtigem Qualitätsparameter gestatten.
Dieses Problem wird durch die Erfindung "VERFAHREN ZUR QUALITATIVEN UND
QUANTITATIVEN ANALYTISCHEN ERFASSUNG DES SCHIMMELPILZES FUSARIUM
GRAMINEARUM IN REINKULTUREN UND IN JEGLICHEM PROBENMATERIAL" gelöst.
Der besondere Vorteil des hier beschriebenen Lösungsweges ist die Tatsache, daß die
Messung der Pilzbelastung auf einem Parameter beruht, der mit den verschiedenen in den
Unteransprüchen aufgeführten Verfahren und Verfahrensvarianten nur in Verbindung mit
Fusarium graminearum eine im Sinne des Verfahrens positive Reaktion zeigt. Weiterhin bietet
die Erfindung die Möglichkeit, durch die Kombination verschiedener Verfahren wie etwa der
Messung der Enzymaktivität und der zusätzlichen Amplifikation von Teilen der Gensequenz
eines zu testenden Pilzisolates, Messergebnisse abzusichern. Diese Sicherheit in der Analyse
in Verbindung mit einer relativ kurzen Analysenzeit wird von keinem der bisher verwendeten
Verfahren erreicht.
Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von als Anspruch 4 aufgeführten Verfahren, bei
denen Teile der Gensequenz des Galaktose-Oxidase-Gens von Fusarium graminearum
enzymatisch in hochspezifischer Weise in einer Polymerase Kettenreaktion (PCR) amplifiziert
werden. Das Auftreten eines solchen Amplifikates wird dabei als sicheres Indiz für das
Vorhandensein von DNA aus dem Zielorganismus in einer Probe gewertet. Dabei ist es
besonders vorteilhaft, daß nicht nur lebende Zellen von Fusarium graminearum erfaßt
werden, sondern auch solche, die z. B. durch Lagerung oder Verarbeitung von
Lebensmittelrohstoffen abgetötet wurden. Da diese abgetöteten Zellen vor ihrem Tod
qualitätsmindernde oder auch toxische Stoffe gebildet haben könnten, bietet ein Verfahren
nach Anspruch 4 die bisher nicht vorhandene Möglichkeit, tote und lebende Zellen
gemeinsam zu erfassen. Dies gelingt in spezifischer Weise auch dann, wenn Fusarium
graminearum in Mischung mit anderen Pilzen, Bakterien oder auch pflanzlichen Zellen
vorliegt.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Verfahren nach den
Unteransprüchen zum Hauptanspruch angegeben. Die Weiterbildung nach diesen
Unteransprüchen ermöglicht die Entwicklung von praxistauglichen Analyseverfahren, die in
Form von vorgefertigten diagnostischen Test-Systemen in besonders Anwender-freundlicher
Form hergestellt werden können. Ein Vorteil der Verwendung des in Anspruch 3 genannten
Nachweisreagenzes ist, daß es die für den Anwender hochgiftigen Alkohole, die bei einem
Direktnachweis der Galaktose-Oxidase-Aktivität verwendet werden, durch geringgiftige
Substanzen ersetzt.
Ausführungsbeispiele für die Unteransprüche 2, 3 und 4 sind in Fig. 1 und Fig. 2 dargestellt
und werden im folgenden näher beschrieben. Das Ausführungsbeispiel für Unteranspruch 5
enthält keine Figuren.
Es zeigen
Fig. 1 kolorimetrische Messung der Aktivität von Galaktose-Oxidase mit einer nach
Anspruch 2 hergestellten Meßanordnung unter Verwendung der Indikatorlösung nach
Anspruch 3. Es wurde als Standard eine Verdünnungsreihe von käuflicher Galaktose-Oxidase
verwendet. Als Proben wurde Kulturüberstand aus Flüssigkulturen von Fusarium
graminearum DSM 4527 und Cladobotryum dendroides NRRL 2903 (=Fusarium
graminearum NRRL 2903) verwendet. Die Kontrolle enthielt nur die enzymfreie
Indikatorlösung nach Anspruch 3.
Fig. 2 mit Hilfe der Polymerase Chain Reaction (PCR) amplifizierte Fragmente aus der
DNA verschiedener, nahe mit Fusarium graminearum verwandter Schimmelpilze. Die obere
Bande zeigt ein Fragment, welches als interne Kontrolle mit jeder Pilz-DNA erzeugt wird.
Die untere Bande entsteht zusätzlich nur dort, wo DNA von Fusarium graminearum Stämmen
eingesetzt wurde. Der nicht spezifisch reagierende Stamm von Fusarium graminearum konnte
als zu einer anderen Art gehörig identifiziert werden.
Fig. 3 Nukleotidsequenz des Galaktose-Oxidase-Gens (GaoA) und angrenzender Regionen,
wie sie für Dactylium dendroides NRRL 2903 (Synonym Cladobotryum dendroides,
Hauptfruchtform Hypomycess rosellus) in GenBank hinterlegt wurde (Accession No. M866819
vom 4.2.1994; siehe auch McPherson et al., Journal of Biological Chemistry 267, 8146-8152
(1992)).
Galaktose-Oxidase (EC 1.1.3.9) ist ein Enzym, dessen Bildung bei wenigen
Schimmelpilzarten beobachtet wurde. Die Ordnungszahl weist es als ein Enzym aus der
Gruppe der Oxido-Reduktasen aus. Es katalysiert spezifisch die Oxidation der 6′-
Hydroxylgruppe des Zuckers Galaktose zum entsprechenden Keton. Dabei wird in Lösung
vorhandener Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid (H₂O₂) reduziert. Bei den verschiedenen
bekannten Meßmethoden macht man sich sowohl die Abnahme der O₂-Konzentration
(manometrische Verfahren) als auch die Entstehung von H₂O₂ und die Möglichkeit der
Reduktion anderer Alkohole zu gefärbten Substraten zunutze. In den beiden letzten Fällen
erfolgt die Messung mit kolorimetrischen Verfahren. Diese Art der Messung ist gegenüber
der manometrischen deutlich empfindlicher und genauer. Man unterscheidet direkte
Verfahren, die die Farbveränderung einer Lösung eines organischen Alkohols (z. B. 3-
Methoxybenzylalkohol) hervorgerufen durch die Oxidation in Anwesenheit des Enzyms zur
Messung verwenden. Daneben sind gekoppelte Verfahren bekannt, die indirekt das
entstehende H₂O₂ durch Einschaltung eines weiteren Enzyms, der Peroxidase, messen. Dabei
führt Peroxidase eine Spaltung des Wasserstoffperoxid zu Sauerstoff und Wasser durch,
wobei stets ein Elektronendonator vorhanden sein muß. In dem hier beispielhaft aufgezeigten
System wird eine Probe aus dem Überstand einer in einem Sorbose-haltigen Medium
gewachsenen Kultur entnommen und mit einem Galaktose-Oxidase Nachweisreagenz
gemischt. Sorbose induziert die Produktion von Galaktose-Oxidase, wird jedoch selber von
dem Enzym nicht oxidiert. Das verwendete Nachweisreagenz (Anspruch 3) enthält Galaktose
als Enzym-Substrat, Peroxidase als ein Enzym zur Umsetzung des Produktes der Galaktose
Oxidase sowie 3,5-Dichlor-2-hydroxysulfonsäure und 4-Amino-2,3-dimethyl-1-phenyl-3-
pyrazolin-5-on als elektronenlieferndes Cosubstrat der Peroxidase. Durch die Oxidation dieser
Substanzen durch Peroxidase werden diese in ihrer Struktur so verändert, daß sie ein farbiges
Produkt ergeben. Die Menge dieses Produktes ist der Extinktionsänderung der Lösung
proportional, weshalb sie als Maß für die Aktivität an Galaktose-Oxidase verwendet werden
kann (siehe Fig. 1). Mit diesem Testsystem reagieren ausschließlich solche Pilzisolate, die mit
Referenzmethoden (PCR, Mannit-PCNB-Agar, Morphologie) als Fusarium graminearum
charakterisiert wurden. Durch Verwendung verschiedener Substrate für die Peroxidase kann
das Prinzip der hier beschriebenen Messung an unterschiedliche Problemstellungen angepaßt
werden.
Die Anordnung der Nukleotide Guanin, Cytosin, Tymidin und Adenin in der Nukleinsäure
von Organismen (Nukleotid-Sequenz) kann ein für eine Organismenart charakteristisches
Merkmal sein. Diese Sequenz kommt in identischer Weise bei keiner anderen Art vor und
eignet sich daher sehr gut für die Identifizierung. Eine weitverbreitete Methode für die
Charakterisierung von Organismen ist die Polymerase Chain Reaction (PCR). Dabei binden
sich unter experimentellen Bedingungen kurze Oligonukleotide an komplementäre Bereiche
eines Nukleinsäure (DNA)-Einzelstranges. Diese Bindung ist bei optimalen Bedingungen
hoch spezifisch und kommt nur in Verbindung mit der DNA vor, von der diese
Oligonukleotide abgeleitet wurden. Das Enzym DNA-Polymerase kann sich an das gebundene
Oligonukleotid anlagern und entsprechend der Sequenz des DNA-Einzelstranges einen dazu
komplementären Strang synthetisieren. Wird dieser Vorgang mehrmals zyklisch wiederholt,
so nimmt die Anzahl synthetisierter Stränge exponentiell zu (Amplifikation). Durch
Übertragung des Reaktionsansatzes auf ein Agarosegel mit anschließender elektrophoretischer
Trennung und Färbung der DNA kann das amplifiziert DNA-Fragment sichtbar gemacht
werden (siehe Fig. 2). Die Entstehung eines Fragmentes mit der richtigen Länge gilt dabei als
Nachweis des Pilzes. Es wird gezeigt, daß bei Verwendung eines Primer Paares, welches aus
der in Fig. 3 dargestellten Nukleotidsequenz von Cladobotryum dendroides abgeleitet wurde,
mit DNA Proben aus einer Anzahl sehr nahe mit Fusarium graminearum verwandter Pilze aus
der Gattung Fusarium sowie aus anderen Pilzen, Bakterien und Pflanzen, nur dort eine
positives Signal erhalten wird, wo die DNA aus dem Zielorganismus stammt. Verfahren nach
dem in dem Beispiel gezeigten Schema können sehr gut für eine schnelle, genaue und
spezifische Erfassung des Pilzes, auch aus Mischungen verschiedener Organismen heraus,
verwendet werden.
Galaktose-Oxidase kann leicht aus Kulturüberständen von Fusarium graminearum gewonnen
werden. Mit dem gereinigten Enzym können Tiere immunisiert werden, die gegen die
Strukturen des Enzyms (Epitope) Antikörper bilden. Durch Gewinnung von Serum der
immunisierten Tiere werden die Antikörper für analytische Zwecke erhalten. Diese
Antikörper sind in der Lage, sich spezifisch an Galaktose-Oxidase zu binden. Durch
Verwendung geeigneter Detektionsverfahren kann diese Bindung nachgewiesen werden. Mit
einem solchen System können Proben auf das Vorhandensein von Galaktose-Oxidase
untersucht werden. Das Auftreten des Enzyms z. B. in Lebensmittel- oder Futtermittelproben
wird als Nachweis für das Vorhandensein von Fusarium graminearum in der untersuchten
Probe gewertet. Durch Variation des Testaufbaues nach verschiedenen immunchemischen
Standardmethoden kann eine Anpassung des Systems an unterschiedliche Problemstellungen
erreicht werden.
Neben der Gewinnung von monoklonalen oder auch polyklonalen Antikörpern können unter
Einsatz moderner gentechnologischer Methoden auch Teile von Antikörpern in Bakterien zur
Expression gebracht und aus den Zellen oder dem Kulturüberstand in reiner Form gewonnen
werden.
Claims (6)
1. Verfahren zur qualitativen und quantitativen analytischen Erfassung des
Schimmelpilzes Fusarium graminearum in Reinkulturen und in jeglichem
Probenmaterial, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) die enzymatische Aktivität des Enzyms Galaktose-Oxidase (EC 1.1.3.9), das durch Fusarium graminearum gebildet wird,
- b) die Bindung von Antikörpern oder deren Derivaten an die Proteinstruktur dieses Enzyms und/oder
- c) die Nukleotidsequenz des für dieses Enzym codierenden Genes alleine oder in Kombination zum gezielten Nachweis des Schimmelpilzes Fusarium graminearum eingesetzt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Stoffe zugesetzt werden,
die die Produktion des Enzyms Galaktose-Oxidase in Fusarium graminearum auf
festen oder in flüssigen Wachstumsmedien anregen, und die Bildung des Enzyms mit
Hilfe einer detektierbaren enzymatischen Reaktion direkt oder auch indirekt unter
Verwendung einer oder mehrerer weiterer enzymatischer oder chemischer Reaktionen
qualitativ oder quantitativ nachgewiesen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß für den Nachweis der
Aktivität von Galaktose-Oxidase ein Nachweisreagenz, bestehend aus Galaktose als
Enzym-Substrat, Peroxidase als ein Enzym zur Umsetzung des Produktes der
Galaktose-Oxidase sowie 3,5-Dichlor-2-hydroxysulfonsäure und 4-Amino-2,3-
dimethyl-1-phenyl-3-pyrazolin-5-on als elektronenlieferndes Cosubstrat der
Peroxidase, verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für den Nachweis des Pilzes
Fusarium graminearum die Gesamtheit oder auch Teile der Nukleotidsequenz des
Galaktose-Oxidase-Gen und seiner angrenzenden Regionen, wie sie in diesem Pilz
oder auch in andersnamigen Pilzen, die sich eindeutig als zur Art Fusarium
graminearum gehörig charakterisieren lassen, vorliegt, sowie aus diesem Gen durch
enzymatische Reaktion in vivo oder in vitro abgeleitete RNA- und DNA-Sequenzen
verwendet werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die strukturellen
Eigenschaften des Enzyms Galaktose-Oxidase sowie seine Aminosäuresequenz oder
deren Teile für die Herstellung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern
jeglichen Subtyps benutzt werden und diese Antiköper als Serum, als Serumfraktion
oder in gereinigter Form für den Nachweis von Fusarium graminearum mit Hilfe
beliebiger Testformate eingesetzt werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Gene oder Teile von
Genen, die für Antikörper oder auch Teile von Antikörpern kodieren, die gegen
Galaktose-Oxidase aus Fusarium graminearum gerichtet sind, auch wenn Teile dieser
Gene gegenüber ihrer Ursprungssequenz künstlich verändert worden sind, in
heterologer oder homologer Weise in anderen als den diese Antikörper sezernierenden
Zellen zur Expression gebracht und für den Nachweis des Pilzes mit Hilfe beliebiger
Testformate verwendet werden.
Priority Applications (1)
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|---|---|
| DE (1) | DE19615934C1 (de) |
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1996
- 1996-04-22 DE DE19615934A patent/DE19615934C1/de not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
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