DE2813521B2

DE2813521B2 - Verfahren zur Herstellung von Monokaryen durch Dedikaryotisierung dikaryotischer Stämme von Basidiomyceten

Info

Publication number: DE2813521B2
Application number: DE2813521A
Authority: DE
Inventors: Gerlind Prof. Dr. Eger
Original assignee: Individual
Current assignee: Fa Somycel Paris Fr
Priority date: 1978-03-29
Filing date: 1978-03-29
Publication date: 1980-05-14
Also published as: IE790749L; NL7902427A; PT69403A; ES479054A0; PL214483A1; GB2017753A; CA1111791A; IE48493B1; JPS54160639A; NL183199C; CH640266A5; DE2813521C3; GB2017753B; FR2420914A1; US4242832A; FR2420914B1; IT1165188B; DK127179A; DE2813521A1; BE875161A

Description

Zu den dikaryoiischen Basidiomyceten gehören einige der wichtigsten Speisepilze, die in Massen auf jo landwirtschaftlichen Abfallprodukten produziert werden. Die bisherigen Methoden zur Züchtung solcher Stämme für den Speisepilz-Anbau beruhen im wesentlichen auf der Auslese in der Natur vorkommender Dikaryen (die pro Hyphenabschnitt zwei verschiedene j'j Kerne enthalten), der Isolierung von Monokaryen (die pro Hyphenabschnitt einen Kern enthalten) über Einzelsporen von Fruchtkörpern dieser Dikaryen und der Kombination von Monokaryen zu neuen Dikaryen, die auf erwünschte Eigenschaften ausgelesen werden. Beim Durchgang durch die Meiosis während der Sporenbildung werden die Gene eines Dikaryons zufallsmäßig auf die Sporen verteilt. Dabei können neue, günstige Genkombinationen auftreten, aber auch besonders gute Genkombinationen wieder verloren gehen. Für die Züchtung von Dikaryen mit sporenlosen Fruchtkörpern, fortan »sporenlose Stämme« genannt, ist dieser Weg der Züchtung nicht gangbar, weil keine Sporen vorhanden sind. Sporenlose Stämme sind jedoch aus den nachstehenden Gründen höchst wünschenswert

Sporen von Speisepilzen sind Allergene für Mensch und Tier (T. Kondo et al, Japan J. Allergy, Bd. 18 [1969], S. 81; K. Shichijo et al., Japan. J. Clin. Med„ Bd. 28 [197oJ S. 575; F. Zadrazil, Naturwissenschaften, Bd. 61 [1974} S. 456; U. Noster et al., Deutsche Med. Wochenschr., Bd. 101 [1976], S. 1241-1245). Außerdem kann bei der unkontrollierbaren Sporenverbreitung holzzersetzender Arten Befall von Hölzern aller Art und damit erheblicher Schaden auftreten. Schließlich kann Virus t>o durch die Sporen von einer Kultur auf die andere übertragen werden (A. Dieleman-Van Zaayen, Mushroom Science VIII, London, 1972, S. 131-154; Der Champignon, Nr. 183, Nov. 1976) und den Pilzanbau selbst gefährden. μ

Sporenlosigkeit tritt als Mutation spontan oder nach Behandlung mit Mutagenen auf (T. Takemaru u. T. Kamada, Report Tottori Mycol. Inst. Japan, Bd. 9 [1971],

S. 21—35). Sporenlose Stämme sind deshalb häufig Mehrfachmutanten, die neben der erwünschten Sporenlosigkeit auch unerwünschte Eigenschaften besitzen, z. B. zu langsames Wachstum, geringer Fruchtkörperertrag, abnorme Fruchtkörper. T. Takemaru u. T. Kamada (Report Tottori Mycol. Inst Japan, Bd. 9 [1971], S. 21—35) und G. Eger et al. (Theoretical and Applied Genetics. Bd. 47 [1976], S. 155-163) haben versucht, die Sporenlosigkeit aus einem Dikaryon durch Paarung mit einem Monokaryon zu einem neuen Dikaryon zu kombinieren. Diese Methode ist problematisch (G. Eger et al. Theoretical and Applied Genetics, Bd. 47 [1976], S. 155—163) und erlaubt keine planmäßige Züchtung. Letztere erfordert die Kenntnis der im Züchtungsmaterial vorhandenen Gene und ihre Verteilung auf die einzelnen Kerne sowie ihre absichtsvolle Kombination zu neuen Stämmen. Zur Zeit ist die Genetik der Sporenlosigkeit noch unbekannt.

Es ist in der Vergangenheit wiederholt der Versuch unternommen worden, dikaryotische Stämme zu dedikaryotisieren. Die chirurgische Methode von R. Harder (Z. für Botanik, Bd. 19 [1927], S. 337-407) wurde auch von N. Fries u. K. Aschan (Svensk Bot. Tidskr, Bd. 46 [1952], S. 365 bis 391 und S. 429 bis 445) angewandt. Sie hat den Nachteil, daß sie äußerst mühsam ist, nur von hochqualifiziertem Personal durchgeführt werden kann und überwiegend nur einen Typ von Monokaryen ergibt statt der erwarteten zwei.

G. Miles u. J. R. Paper (Mycologia, Bd. 48 [1956J, S. 484—494) haben darum eine chemische Dedikaryotisierung versucht unter Verwendung von Gallensäiire bzw. Natriumtaurocholat. T. Takemaru (Report Tottori Mycol. Inst. Japan, Bd. 4 [1964], S. 37-40 und 41-43) benutzte Ochsengalle und Natriumcholat. In beiden Fällen konnte unter 50 bzw. 120 Isoiaicn in der Regel nur einer der beiden Komponentenkerne eines Dikaryons isoliert werden. Darunter befanden sich außerdem Mutanten. Y. Parag (Can. J. Microbiol., Bd. 7 [ 1961 ], S. 838-841), R. M. Kerruish u. E. W. B. Dacosta (Ann. of Botany, Bd. 27 [1963], S. 653-670), T. L. Amburgey

(Phytopathology, Bd 57 [1967], S. 486-491), M. McCIaren (Can. J. Botany, Bd 48 [1970J S. 787-790), T. Takemaru u. T. Kamada (Report Tottori MycoL Inst Japan, Bd 9 [1971], S. 21 -35). schließlich ließen verschiedene Zellgifte auf Dikaryen einwirken. Sie konnten in einigen Fällen Monokaryen isolieren. Sie erhielten jeweils nur einen, nämlich den gegenüber dem Zellgift resistenteren Kerntyp des Ausgangsdikaryons. Die Ausbeute an Monokaryen war sehr gering, und es traten Mutanten auf. Schließlich beobachtete A. ι ο Ginterova (Folia MicrobioL, Bd 18 [1973J S. 277-280) eine Dedikaryotisierung, wenn ein Dikaryon in Flüssigkeit mit bestimmter Frequenz geschüttelt wurde. Die Dedikaryotisierung erfolgte auch hier auf Kosten eines Kerns des ursprünglichen Dikaryons.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das eingangs beschriebene Verfahren, welches aus der üt-Stelle »Mycologia«, Bd 48, bekannt ist, so weiterzubilden, daß beide Kerne eines gegebenen Dikaryons mit unverändertem Genbestand in hoher Ausbeute und bei beliebiger Wiederholung reproduzierbar isoliert werden können.

Diese Aufgabe wird durch die im Kennzeichen des Hauptanspruchs beschriebenen Verfahrensschritte gelöst Mit den erfindungsgemäß hergestellten Monokary- en lassen sich mit paarungsverträglichen Partnern dikaryotische Stämme von Basidiomyceten herstellen, die pro Hyphenzelle zwei verschiedene Kerne enthalten, sogenannte Dikaryen.

Die Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe beruht «1 auf der Entwicklung eines neuartigen Dedikaryotisierungsverfahrens. Dieses Verfahren gestattet es, die beiden Kerne eines Dikaryons so schonend voneinander zu trennen, daß zwei Typen von Monokaryen entstehen. Die beiden Typen von Monokaryen, auch Neohaplonten « genannt, enthalten jeweils einen Kerntyp des Ausgangsdikaryons in unveränderter Form. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Feststellung, welche für die Züchtung wichtigen Gene sich in den einzelnen Monokaryen befinden. Es erlaubt die Auswahl der Monokaryen mit der jeweils erwünschten Genausstattung und ihre Kombination mit neuen monokaryotischen Partnern zu Dikaryen mit verbesserten Eigenschaften. Es gestattet ferner eine Identifizierung von Dikaryen und damit den Nachweis einer unrechtmäßi- 1; gen Vermehrung. Es gestattet schließlich auch den Nachweis einer unrechtmäßigen Entnahme eines Kerns aus einem Dikaryon und seine Paarung mit einem anderen Monokaryon.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat gegenüber den >n bekannten Methoden folgende Vorteile:

1. Das Verfahren verlangt keinen kostspieligen apparativen oder personellen Aufwand (wie die chirurgische Methode) und kann daher in jedem v, mikrobiologischen Laboratorium durchgeführt werden.

2. Das Verfahren ist sehr viel schneller als alle bisherigen Methoden.

3. Das Verfahren liefert regelmäßig zwei Monokary- t>o entypen in hoher Ausbeute, so daß der Aufwand für ihre Isolierung gering ist.

4. Die Kerne der Monokaryen sind dank der schonenden Behandlung mit den Kernen des Ausgangsmaterials identisch. h^r>

5. Die Dedikaryotisierung eines gegebenen Dikaryons bringt auch bei Wiederholung in längeren zeitlichen Abständen reproduzierbare Ergebnisse.

6. Auch Monokaryen mit abnormer Morphologie oder Stoffwechselblockaden (auxotrophe Mutanten), die zur Kennzeichnung eines Stammes in ein Dikaryon eingeführt worden sind können als Monokaryen aus diesem Dikaryon wiedergewonnen werden.

7. Das Verfahren ermöglicht erstmals die planvolle Züchtung sporenloser Stämme, die demgemäß weder Mensch noch Umwelt gefährden.

8. Das Verfahren ermgöicht erstmals die Identifizierung eines dikaryotischen Speisepilz-Stammes auf einfache Weise.

9. Das Verfahren ermöglicht erstmals den sicheren Nachweis einer unautorisierten Vermehrung eines dikaryotischen Pilzstamme:».

10. Das Verfahren ermöglicht außerdem erstmals den Nachweis einer unautorisierten Entnahme eines Kerns aus einem definierten Dikaryon für Züchtungszwecke.

Nachstehend werden folgende Schritte erläutert A) Dedikaryotisierung des Ausgangsmaterials;

B) Feststellung der Paarungsverträglichkeit (Inkompatibilität) von Monokaryen;

C) Feststellung wichtiger Gene, z. B. der Gene für Sporenlosigkeit, in Monokaryen;

D) Feststellung charakteristischer Merkmale in Monokaryen und den aus ihnen gebildeten Dikaryen;

E) Paarung ausgesuchter Monokaryen mit neuen Partnern zu neuen Dikaryen;

F) Prüfung der neuen Dikaryen auf Stabilität der Merkmale durch wiederholte Dedikaryotisierung;

G) Definition der Stämme. A) Dedikaryotisierung des Ausgangsmaterials

Als Ausgangsmaterial dient ein dikaryotischer Basidiomycet, beispielsweise Seitlings-(PIeurotus-)Arten, Samfluß- oder Winterrübling (Flammulina velutipes), Stockschwämmchen (Kuehneromyces mutabilis) und Shiitake (Lentinus edodes). Er kann ein Wildstamm sein oder ein mit Mutagenen behandelter Stamm. Wesentlich ist sein Gehalt an züchterisch wertvollen Eigenschaften, z. B. Sporenlosigkeit. leder Pilzstamm wird unter geeigneten, möglichst optimalen Wachstumsbedingungen angezüchtet.

Die vegetative Form des Pilzes, genannt Mycel, wird unter Zugabe von Flüssigkeit (sterilem destilliertem Wasser, Leitungswasser, physiologischer Kochsalzlösung, Puffer oder Dedikaryotisierungslösung) in sterilisierten Behältern eines Universal-Mixgerätes mit rotierendem Messerkopf (z. B. »Waring Blendor«) so zerkleinert, daß lebende Mycelfragmente mit überwiegend einem bis sehr wenigen Hyphenabschnitten entstehen. Dabei ist durch Kühlung dafür zu sorgen, daß die Temperatur zu keiner Zeit das Temperaturmaximum des jeweiligen Pilzes erreicht oder übersteigt. Das Temperaturmaximum des jeweiligen Pilzes ist, sofern es nicht bekannt ist, leicht zu ermitteln. Von den Fragmenten wird eine geringe Menge in den unteren Teil der Dedikaryotisierungslösung geimpft. Es ist darauf zu achten, daß die Fragmente und die daraus sich entwickelnden Mycelkügelchen stets von einer mindestens 2 mm hohen Flüssigkeitsschicht bedeckt sind. Die Zahl der Fragmente soll so gering sein, daß sie am

Grund der Flüssigkeit zu isolierten Mycelkügelchen auswachsen können. Die Ansätze in der Dedikaryotisierungsflüssigkeit werden bei einer Temperatur von 2 bis 35°C, am besten bei der für den jeweiligen Pilzstamm optimalen Wachstumstemperatur bebrütet

Als Dedikaryotisieningslösung dient eine sterilisierte, am besten hitzesterilisierte Flüssigkeit, mit mindestens einer Kohlenstoffquelle und einem neutralen, unter Einwirkung von Pepsin gewonnenen Pepton aus Fleisch, das durch einen hohen Gehalt an Glykokoll und geringen Gehalt an Phosphat- und Magnesiumionen gekennzeichnet ist, z. B. »Pepton P« der Fa. Oxoid (Best. Nr. L49), oder ein Mischpepton, das dieses oder ein anderes Pepton entsprechender Qualität enthält, oder Glykokoli an Stelle des Peptons, oder jede andere Flüssigkeit mit entsprechendem Glykokollgehalt Das neutrale Fleischpepton wird in einer Menge von 0,02 bis 7%, das Glykokoll in einer Menge von 0,01 bis 5% verwendet Ist das zu dedikaryotisierende Dikaryon oder eine seiner monokaryotischen Komponenten auxotroph in bezug auf Wuchsstoffe oder stickstoffhaltige Verbindungen, so muß die Dedikaryotisieningslösung mit geringen Mengen entsprechender Verbindungen supplementiert werden.

Nachdem die Mycelfragmente in der Dedikaryotisieningslösung zu sichtbaren Mycelkügelchen herangewachsen sind, werden Stichproben bei schwacher Vergrößerung (bis lOOx) unter dem Mikroskop auf das Ausmaß der Dedikaryotisierung überprüft. Unier optimalen Bedingungen beträgt sie 100%. Die Mycelkügelchen werden erneut, unter gleichen Bedingungen wie beim erstem Mal, in ein- bis wenigzellige Fragmente zerkleinert. Die Fragmente werden sodann auf oder in Nähragarplatten gebracht, und zwar in solcher Verdünnung, daß sie zu räumlich isolierten Einzelkolonien auswachsen können. Als Grundlage für den Nähragar dient ein für den jeweiligen Pilz geeignetes Nährmedium. Die Platten werden am besten bei der für den jeweiligen Pilz optimalen Temperatur bebrütet, bis die Kolonien mit freiem Auge sichtbar sind. Wenn nötig (Dedikaryotisierungsgrad der Mycelkügelchen kleiner als 100%) werden die einzelnen Kolonien bei schwacher Vergrößerung auf ihren monokaryotischen Zustand überprüft. Oft sind makroskopisch zwei Typen von Kolonien erkennbar. Dann wird von nicht mehr als 5 Kolonien eines jeden Typs (insgesamt höchstens 10) ein Stückchen auf neuen Nährboden übertragen. Falls alle Kolonien gleich aussehen, werden insgesamt nicht mehr als 20 Kolonien abgeimpft.

B) Feststellung der
Paarungsverträglichkeit von Monokaryen

Die Sexualität und damit auch die Fertilität der Basidiomyceten wird durch A- und B-Faktoren (Paarungsfaktoren) geregelt. Die hier genannten Arten der Gattungen Pleurotus, Flammulina, Kuehneromyces und Lentinus besitzen zwei A- und zwei B-Faktoren. Von jedem existieren in der Natur zahlreiche AHeIe, für Pleurotus ostreatus wurden mindestens 63 A- und 190 B-Faktoren geschätzt. (C. P. Eugenio u. N. A. Anderson, Mycologia, Bd. 60 [1968], S. 627-634). Ein aus einer einzelnen geschlechtlichen Spore entstandenes Monokaryon enthält einen A- und einen B-Faktor. Zwei Monokaryen können sich zu einem Dikaryon vereini-Een, wenn die A- und B-Faktoren verschieden sind. ?.. B.

A23B14 und A35B34. Das Dikaryon bildet Fruchtkörper mit Basidien, in denen die beiden Kerne miteinander verschmelzen und eine Meiosis durchmachen. Schließlich entstehen vier Tochterkerne, die in Sporen einwandern. Unter den Sporen eines Furchtkörpers befinden sich in bezug auf die Paarungsfaktoren vier Typen in gleicher Häufigkeit Zwei Typen entsprechen jeweils den Paarungsfaktoren der Ausgangsmonokaryen, z. B. AaBu und A35B54, die beiden anderen sind Rekombinanten, z. B. A₂₃B₅* und A₃₅B]₄.

Das Dikaryon ist meistens durch eine besondere Morphologie gekennzeichnet, es trägt sogenannte Schnallen. Sind A- und B-Faktoren in beiden Mycelien gleich oder nur der Α-Faktor bzw. der B-Faktor gemeinsam, gibt es kein Dikaryon. Im Falle gleicher Α-Faktoren wandern Kerne aus einem Mycel in das andere hinüber, was sich durch weitere Paarungen leicht feststellen läßt; vgl. K. Esser, »Kryptogamen«, Springerverlag, Berlin-Heideiberg-New York, 1976, S. 452-455 und S. 479—496. Die Identität der jeweiligen Paarungsfaktoren eines Monokaryons läßt sich demnach einwandfrei feststellen, indem man es mit Teststämmen (Testern) für Paarungsfaktoren paart Es werden z. B. die in Schritt A) aus einem bestimmten, mit Mutagenen behandelten Dikaryon erhaltenden Monokaryen mit vier, den einzelnen Sporentypen des Ausgangsdikaryons entsprechenden, Testern zusammengebracht; vgl. Tabelle I. Von den Testern der Tabelle sind jeweils Tester 1 und Tester 2 sowie Tester 3 und Tester 4 untereinander paarungsverträglich.

Tabelle I

Ermittlung der Paarungsfaktoren (PF) der in Schritt A) erhaltenen Monokaryen (Nh) eines Stammes durch Paarung mit vier Testern vorn Ausgangsdikaryon

Tester 1 Tester 2 Tester 3 Tetter4 PF der

Nh
(A,Β,) (A₂B₂) (A₁B₂) (A₂B,)

Nh 1 - +

Nh 2 +

Anm.: plus = Dikaryenbildung;

minus = keine Dikaryenbildung.

A₁B₁ A₂B₂

C) Feststellung wichtiger Gene,
z. B. der Gene für Sporenlosigkeit, in Monokaryen

Gene für Sporenlosigkeit können in Monokaryen aus Einzelsporen und auch in Monokaryen aus dedikaryotisierten Dikaryen vorhanden sein. Man erkennt sie durch Paarung mit Testmonokaryen (Testern) für Sporenlosigkeit. Solche Tester ergeben bei Paarung mit Monokaryen, die ein Gen für Sporenlosigkeit enthalten, sporenlose Dikaryen. Die einzelnen Dikaryen, die aus solchen Paarungen hervorgegangen sind, werden vermehrt und in Petrischalen herangezogen. Nach einer Schnellmethode (G. Eger in Mushroom Science, Bd. IX/1 [1974], S. 567-573, und G. Eger et al., Theoretical and Applied Genetics, Bd. 47 [1976], S. 155—163) werden sie im Laboratorium zur Fruchtkörperbildung gebracht. Die Lamellen der Fruchtkör-Der werden bei schwacher mikroskopischer Versröße-

rung (bis 100 χ ) auf Sporen abgesucht. Nachstehend ist in Tabelle Il ein Beispiel gegeben.

Tabelle II

Feststellung der Gene für Sporenlosigkeit (Sp-) durch Paarung von in Schritt A) erhaltenen Monokaryen (Nh) eines Stammes mit Testern für Sporenlosigkeit und anschließender Prüfung der Dikaryen auf sporenlose Fruchtkörper ic

Tester für Sporenlosigkeit
1 2

(A₂B₂) (A₁Bi)

Einstufung
der Nh

20

35

Nh 1 sporenlos kein Dikaryon Gen für Sp-

Nh 2 kein sehr viele —

Dikaryon Sporen

Danach befindet sich ein Gen für Sporenlosigkeit im Monokaryon 1.

D) Feststellung charakteristischer Merkmale in
Monokaryen und den aus ihnen gebildeten Dikaryen

Die in Schritt A) erhaltenen oder andere Monokaryen, die man für den Aufbau neuer Dikaryen verwenden möchte, werden auf verschiedenen Nährmedien auf makroskopische, mikroskopische und biochemische Merkmale untersucht, die sich in einfacher Weise feststellen lassen und geeignet sind, einen Stamm zu chrakterisieren.

Tabelle III

Zur Charakterisierung von Monokaryen geeignete _4f) Merkmale

morphologische Merkmale

a) makroskoptische Wachstumsraten auf bestimmten Nährmedien

dichtes oder lockeres Mycel

hohes oder flaches Luftmycel

glatter, diffuser oder gelappter Mycelrand

Strangbildung

federartiges oder wellenartiges Wachstum

b) mikroskopische Merkmale

kurze, aufgetriebene Hyphenabschnitte
reichliche, ± quirlige Verzweigung
buckelige Hyphen
Hyphen mit Pseudoschnallen oder Schnallen

c) biochemische Merkmale

Bedarf an bestimmten Vitaminen, Stickstoffverbindungen

Bildung von Farbstoffen auf bestimmten Nährmedien

Bildung von Farbstoffen bei Zusatz bestimmter Chemiaklien
Bildung charakteristischer Kristalle

Ferner werden die so geprüften Monokaryen mit mehreren bereits sehr gut bekannten Monokaryen gepaart und die entstandenen Dikaryen zur Fruktifika-

50

55 tion gebracht. Es wird darauf getestet, ob ein bestimmtes Monokaryon besondere Eigenschaften vererbt, die nur im Dikaryon sichtbar werden, z. B. phototropisches Verhalten der Fruchtkörper, Gestalt und Farbe der Fruchtkörper, weiter oder enger Lamellenabstand, abnorme Sporenzahl pro Basidium.

E) Paarung ausgesuchter Monokaryen
mit neuen Partnern zu neuen Dikaryen

Monokaryen, die in Paarungen mit den Testern in Schritt C) und D) erwünschte Eigenschaften offenbart haben, werden mit ausgesuchten Partnern zu neuen Dikaryen vereinigt. Bei der Wahl der Partner wird sowohl auf Eigenschaften geachtet, die im Dikaryon sichtbar werden, wie z. B. Fruktifikation bei geringer Lichtintensität, in bestimmten Temperaturbereichen, Fruchtkörperertrag und Aussehen, als auch auf einige, in einfacher Weise feststellbare Merkmale (vgl. Tabelle III), die zur Definition von Stämmen geeignet sind (siehe Schritt G).

F) Prüfung der neuen Dikaryen auf Stabilität
der Merkmale durch wiederholte Dedikaryotisierung

Bevor man ein Dikaryon in größerem Maßstab in Anbaubetrieben testet, wird die Stabilität seiner Merkmale und der Merkmale seiner Komponenten geprüft und der Stamm definiert. Das Dikaryon wird erfindungsgemäß dedikaryotisiert, die so erhaltenen Monokaryen werden auf ihre charakteristischen Merkmaie überprüft, dann paarweise zu Dikaryen vereint und deren Eigenschaften getestet. Haben sich danach alle wesentlichen Merkmale als stabil erwiesen, werden das alte und einige neue Dikaryen erneut erfindungsgemäß dedikaryotisiert und die daraus gewonnenen Monokaryen miteinander verglichen. Stimmen die Monokaryen aus altem Dikaryon und aus neuen Dikaryen überein und auch mit den Ausgangsstämmen, kann der Stamm definiert werden.

G) Definition der Stämme

Es werden nicht nur, wie bisher üblich, chrakteristische Merkmale der Dikaryen genannt Vielmehr werden außerdem mehrere, in einfacher Weise feststellbare Merkmale der aus den Dikaryen durch Dedikaryotisierung jeweils erhältlichen Monokaryen angegeben.

Beispiel einer Stammdefinition
Pilzart,

geographische Rasse oder Klimatyp (bzw. geographische Rasse oder Klimatyp der einzelner Komponenten des Dikaryons)

Anbau und Fruchtkörpermerkmale des Dikaryons

Merkmale der Monokaryenklasse 1:
Wuchseigenschaften des Mycels
besondere mikroskopische Merkmale
besondere biochemische Merkmale
besondere Gene, die im Dikaryon manifest werden

Merkmale der Monokaryenklasse 2:
entsprechend Monokaryneklasse 1

I»

Durch Angabe von mindestens 2 charakteristischen Merkmalen in den durch Dedikaryotisierung erhältlichen Monokaryen und durch deren Paarungsfaktoren ist ein Dikaryon eindeutig definiert; damit läßt sich eine unauthorisierte Vermehrung eindeutig nachweisen. Das ergibt sich aus der Mutationshäufigkeit von Genen und einer einfachen Wahrscheinlichkeitsrechnung. Die Mutationsrate bei Pilzen liegt bei 10~⁵ bis 10-⁷ (siehe K. Esser u. R. Kühnen, »Genetik der Pilze«, 1967, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York). Durch Mutagene kann bekanntlich die Häufigkeit einer Mutante etwa um den Faktor 100 erhöht werden. Die Wiederholungswahrscheinlichkeit für ein Dikaryon mit 4 Merkmalen ist das Produkt der Einzelwahrscheinlichkeiten und liegt demnach bei

10-20 (!o-s . 10-5 . 10-5 . io-5)bis
10-¹² (10-³ · 10-³ ■ 10-³ · 10-³).

Dabei sind die Paarungsfaktoren noch nicht berücksichtigt. Laut J. R. Raper (»Genetics of Sexuality in higher Fungi«, Ronald Press, N. Y., 1966) ist die geographische Verteilung der Paarungsfaktoren zufällig. Die Wahrscheinlichkeit, einen bestimmten Α-Faktor und einen bestimmten B-Faktor, z. B. bei Pleurotus ostreatus, in 2^r> der Natur ein zweites Mal zu finden, errechnet sich bei 63 A- und 190 B-Faktoren (siehe unter B) als ca. 1:12 000. Die Mutabilität der Paarungsfaktoren ist höher als die anderer Gene und liegt bei ΙΟ"³ (siehe ebenfalls Raper, a.a.O.). Für die spezielle Kombination jo eines bestimmten Α-Faktors mit einem bestimmten B-Faktor in den Kernen eines Dikaryons liegt die Wiederholungswahrscheinlichkeit deshalb im Bereich von höchstens 10~². Die Wiederholungswahrscheinlichkeit eines bestimmten Dikaryons verringert sich bei r, Berücksichtigung seiner Paarungsfaktoren darum um weitere 10~⁴ und liegt zwischen ΙΟ"²⁴ bis 10-^l6. Ein solches Dikaryon kann demnach weder ein zweites Mal aus der Natur isoliert, noch mit züchterischen Methoden aus anderen Stämmen geschaffen werden. Die einzelnen Komponenten eines Dikaryons sind dann hinreichend geschützt, wenn die durch Dedikaryotisierung dieses Dikaryons erhaltenen Monokaryen durch mindestens 3 Merkmale bzw. Gene geennzeichnet sind. Die Wiederholungswahrscheinlichkeit eines solchen Monokaryons liegt bei Berücksichtigung seiner Paarungsfaktoren zwischen 10"¹⁸ und 10-", d.h. seine Wiederholbarkeit ist ebenfalls praktisch unmöglich. Ergibt ein von einem unautorisierten Bruthersteller vertriebener Stamm nach seiner Dedikaryotisierung ein oder zwei Monokaryen, die mit den durch Dedikaryotisierung gewonnenen Monokaryen einer eigenen Züchtung in allen kennzeichnenden Merkmalen und den Paarungsfaktoren übereinstimmen, so sind von diesem Bruthersteller ein oder beide Monokaryen der Original-Züchtung entnommen worden.

Die Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.

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A) Dedikaryotisierung des Ausgangsmaterials
Beispiel 1

Als Ausgangsmaterial werden Dikaryen von z.B. Pleurotus ostreatus, Pleurotus cornucopiae, Pleurotus eryngii, Flammulina velutipes, Kuehneromyces mutabilis, Lentinus edodes verwendet Jeweils 1 —3 Impfstücke des zu dedikaryotisierenden Stammes werden auf eine Agar-Platte mit deproteiniertem Malzextrakt (siehe unter Schritt G) in Petrischalen geimpft und je nach Pilzart 5 bis 6 Tage bei 24 bis 28° C bebrütet. Der vom Mycel durchwachsene Nährboden einer Petrischale wird mit 50 ml sterilem, auf 1O⁰C gekühltem, destilliertem Wasser in einem mit Kühlmantel versehenem, sterilem »Semi-Mikrobehälter« eines »Waring-Blendors« 2,5 Min. bei hoher Drehzahl (entsprechend 20 500 U/min im unbelasteten Zustand) bearbeitet. Dabei soll die Endtemperatur im Behälter 26⁰C nicht übersteigen. Von dem Becherinhalt werden 20 μΐ in 50-ml-Erlenmayer-Kölbchen mit 25 ml Dedikaryotisierungslösung geimpft, so daß die Mycelfragmente am Grund der Flüssigkeitsschicht liegen. Die Dedikaryotisierungslösung besteht aus 20 g Glucose und 10 g »Pepton P« der Fa. Oxoid, Bestell Nr. L49, in ! Liter destilliertem Wasser. Sie wurde 15 Min. bei 1?1°C sterilisiert. Nach 5 bis 10 Tagen Bebrütung bei 24 bis 28° C sind (je nach Pilzstamm und Temperatur) die Mycelfragmente in der Flüssigkeit zu sichtbaren Mycelkügelchen herangewachsen. Jetzt werden die Kölbchen mit den Mycelkügelchen und die Kölbchen mit 30-ml-Portionen sterilen, destillierten Wassers auf 10⁰C heruntergekühlt. Das Mycel aus einem Kölbchen und 30 ml Wasser wird jeweils in einem sterilen »Semi-Mikrobehälter« mit Kühlmantel auf dem »Waring-Blendor« unter den gleichen Bedingungen wie beim ersten Mal erneut zerkleinert. ImI des Homogenats wird mit 15 ml sterilem, destilliertem Wasser verdünnt, und 10, 20 und 50 μΐ der Verdünnung werden auf der Oberfläche von Agarplatten mit deproteiniertem Malzextrakt verteilt. Nach 4 bis 7 Tagen Bebrütung bei je nach Pilzart 24 bis 28° C sind die lebenden Hyphenabschnitte zu sichtbaren Kolonien herangewachsen, die fast ausschließlich Monokaryen sind. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.

Tabelle IV

Dedikaryotisierungserfolg nach 5-lOTagen in einer Lösung mit 2% Glucose und 1% »Pepton P« in destilliertem Wasser

Pilzart	% Dedika	Monokaryen-	1 Ver
	ryotisie	klassen pro	hältnis
	rung	20 Kolonien
		Zah	3:2
			2:1
Pleurotus ostreatus			3:1
Handelsstamm 1	100	2	5:4
Handelsstamm 2	98	2
Handelsstamm 3	100	2
Handelsstamm 4	100	2	3:2
(Florida Typ)			3:2
Stämme:
»42X11«, sporenlos	100	2	5:4
»V 10«, sporenarm	100	2
Pleurotus cornucopiae			3:1
Handelsstamm	80	2
Pleurotus eryngii			3:1
Handelsstamm	100	2
Kuehneromyces mutabilis
Handelsstamm	100	2

Fortsetzung

Tabelle VI

Pilzart

VoDedika- Monokaryenryolisicklassen pro
rung 20 Kolonien

Zahl

Plammulina velutipes
Handelsstamm 100

Lentinus edodes
Handelsstamm 100

Verhältnis

3:1

Beispiel 2

Das Dikaryon »42 χ 11« wird auf eine Agarplatte mit deproteiniertem Malzextrakt in Petrischalen geimpft und 5 Tage bei 28°C bebrütet. Das Mycel von einer Petrischale wird entsprechend Beispiel 1 dedikaryotisiert, jedoch besteht die Dedikaryotisierungslösung aus 20 g Glucose und 3 g Glykokoll in 1 Liter Leitungswasser sehr geringer Härte (Gesamthärte 8 Deutsche Härtegrade, Nichtkarbonathärte 2,4; Monophosphate 1,67 mg/Liter). Tabelle V zeigt das Ergebnis der Dedikaryotisierung.

Tabelle V

Dedikaryotisierungserfolg in 10Tagen in einer Lösung von 2% Glucose und 0,3% Glykokoll in Leitungswasser

15

Pieuroius ostrcalus

% Dcdika- Monokaryenryotisicrung klassen pro
20 Kolonien

Zahl

Verhältnis

Stamm »42 X II«,
sporcnlos

100%

4(1

Beide Klassen von Monokarytn werden mit den 4 Testern für die Paarungsfaktoren (PF) des Ausgangsdikaryons gepaart Davon ist Tester 1 mit 2 und Tester 3 mit 4 paarungsverträglich. Das Ergebnis ist in Tabelle VI zusammengefaßt

Ergebnis der Paarungen der Monokaryen (Nh) aus dem Dikaryon »42 x 11« mit den Testern für PF des Pleurotus aus Florida

Nh-K lasse

Tester Tester Tester Tester

Zuordnung der Nh

10

1, entspricht
»11«

2, entspricht
»42«

sie entsprechen Tester 1

sie entsprechen Tester 2

B) Feststellung der
Paarungsverträglichkeit von Monokaryen

Beispiel 3

Als Ausgangsdikaryon dient ein Pleurotus-Stamm aus Florida, der auch kommerziell genutzt wird. Von einem Fruchtkörper wurden Einzelsporen isoliert darunter »42« und »41«. Gepaart ergeben sie ein sporenloses Dikaryon. Dieses wird dedikaryotisiert entsprechend Beispiel 1 oder 2. Es ergibt zwei morphologisch verschiedene Monokaryenklassen:

Klasse 1: langsamwachsende Kolonien mit hohem Luftmycel (entspricht dem Monokaryon

»11«)
Klasse 2: schnellerwachsende Kolonien mit flachem bo Luftmycel (entspricht dem Monokaryon »42«)

Danach stimmen die Monokaryen innerhalb der einzelnen Klassen auch in ihren Paarungsfaktoren überein.

Beispiel 4

Von einer Subkultur des Pleurotus-Dikaryons aus Beispiel 3, die innerhalb von fünf Jahren an einem anderen Ort mehrfach weiter subkultiviert wurde, wurden Fruchtkörper erzeugt und über die Isolierung einzelner Sporen Monokaryen erzeugt. Das Monokaryon »J136« wurde mit den Testern für die Paarungsfaktoren (PF) des Pleurotus aus Florida gepaart von denen Tester 1 und 2 und Tester 3 und 4 untereinander paarungsverträglich sind. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengefaßt.

Tabelle VII

Ergebnis der Paarung des Monokaryons »J136« mit den Testern für PF des Pleurotus aus Florida

Tester Tester Tester Tester Zuordnung der I j 3 4 PF des Mono

karyons

»J136«

sie entsprechen Tester 3

b5 Nachdem »J136« nur mit Tester 4 kompatibel ist hat es die gleichen Paarungsfaktoren wie Tester 3.

C) Feststellung der Gene für Sporenlosigkeit in Monokaryen

Beispiel 5

Monokaryon »J136« und andere Monokaryen derselben Herkunft werden mit einem paarungsverträglichen Tester für Sporenlosigkeit z.B. »12a«, gepaart Die

Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengefaßt. Danach enthält nur »1136« ein Gen für Sporenlosigkeit.

Tabelle VIII

Nachweis von Genen für Sporenlosigkeit durch Paarung mit einem Tester für Sporenlosigkeit

Mono- x
karyon

Tester Ergebnis der Paarungen

J136	X	12a
J88	X	12a
J105	X	12a
J109	X	12a
J161	X	12a
J202	X	12a

Fruchtkörper sporenlos Fruchtkörper mit vielen Sporen Fruchtkörper mit vielen Sporen Fruchtkörper mit vielen Sporen Fruchtkörper mit vielen Sporen Fruchtkörper mit vielen Sporen

Beispiel 6

Dikaryon »VI0« ist sporenarm, d. h„ die Fruchtkörper haben auf jeder Lamelle einzelne Sporen. Es ist aus einem Pleurotus-ostreatus-Stamm aus Michigan durch Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin entstanden. Gemäß Beispiel 1 dedikaryotisiert, ergibt »V10« zwei Klassen von Monokaryen, die sich mikroskopisch unterscheiden lassen (siehe Beispiel 7).

Klasse 1 hat die Monokaryen 1,2,3,6,8 Klasse 2 hat die Monokaryen 4,5,7,9,10

Die Monokaryen werden mit einem Tester für Sporenlosigkeit, z.B. »Ml7«, gepaart. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX zusammengefaßt.

Tabelle IX

Monokaryen x Tester Ergebnis der Paarungen

30

1,2,3,6,8 x M17
4,5,7,9, 10 x M17

5 Dikaryen mit sporenlosen Fruchtkörpern

5 Dikaryen, Fruchtkörper mit sehr vielen Sporen ₄-

Die Monokaryen 1,23,6 und 8 enthalten demnach Gene für Sporenlosigkeit

D) Feststellung chrakteristischer Merkmale in
Monokaryen und der aus ihnen gebildeten Dikaryen

Beispiel 7

Dikaryon »VI0« gibt gemäß Beispiel 6 zwei Monokaryenklassen. Die Monokaryen der Klasse 1 wachsen langsam. Sie haben auf deproteiniertem Malzextraktagar (s. unten Schnitt G) einen glatten Rand und hohes Luftmycel. Das Monckaryon »nh2« wurde eingehend getestet. Die Wachstumsraten auf deproteiniertem Malzagar und auf Kartoffel-Dextrose-Agar stimmen überein. Gibt man bei Zimmertemperatur mit einer Pasteur-Pipette 3 Tropfen Guajacol (Merck 4212) an einer Stelle auf ein 6 Tage altes, auf deproteiniertem Malzextraktagar bei 24 bis 28° C im Dunkeln gewachsenes Mycel, und zwar in die Nähe des Randes, so erhält man eine chrakteristische Farbreaktion. Innerhalb von 20 Min. bildet sich um das Guajacol ein aprikosenfarbiger Hof, der innerhalb weiterer 40 Min. nach rostfarbig umschlägt und schließlich (nach 2 und mehr Stunden) kastanienbraun wird. Das gleiche Mycel gibt mit 4 Tropfen einer lprozentigen Lösung von «-Naphthol in 50prozentigem Äthanol innerhalb von 60 Min. eine dunkel-bleiviolette Verfärbung des Agars, die besonders gut auf der Unterseite der Kultur sichtbar ist. Einige Tropfen einer lprozentigen Lösung von p-Anisidin in 20prozentigem Äthanol neben das Mycel direkt auf den Agar gegeben, bewirken nach 30 bis 60 Min. eine dunkel-weinrote Verfärbung des Agars. Monokaryen der Klasse 2 wachsen extrem langsam. Das Monokaryon »nh4« wurde mikroskopisch untersucht. Es trägt Schnallen. Mit Monokaryen anderer Herkunft (nicht aus Dikaryon »VI0«), die nachgewiesenermaßen Gene für Sporenlosigkeit besitzen, werden entweder keine oder sporenarme Fruchtkörper gebildet. Die Basidien der sporenarmen Fruchtkörper sind zu 50% fünf- und sechssporig.

E) Paarung ausgesuchter Monokaryen
mit neuen Partner zu neuen Dikaryen

Beispiel 8

Das langsamwüchsige Monokaryon »nh2« aus Beispie! 7 wird mit Monokaryon »Ml7« (Tester) gepaart. Das neue Dikaryon hat eine Wachstumsrate vergleichbar mit derjenigen erfolgreicher, kommerzieller Anbaustämme. Es ist sporenlos.

F) Prüfung der neuen Dikaryen auf Stabilität der Merkmale durch wiederholte

Dedikaryotisierung

Beispiel 9

Das Dikaryon »42 χ 11« und die draus gemäß Beispiel 1 oder 2 erhältlichen Monokaryen (Nh) »42« und »11« besitzen die in Beispiel 12 aufgeführten Merkmale.

Diese wurden auf ihre Stabilität bei wiederholte Dedikaryotisierung wie folgt geprüft:

42x11

dedikaryotisiert gemäß Beispiel 1

221

5 Hh "42"

allen Merkmalen identisch
mit Ausgangs—
monokaryen ι

5 Nh "11"

in allen iMerJcmalen !identisch mit Ausgangs— monokaryen | subkultiviert

42x11

42x11	42x11	42x11

42x11

in allen Merkmalen identisch mit Ausgange dikaryon

Subkultur

I I

dedikaryotisiert gemäß Beispiel 1 42x11

5x

Nh

42	11

5x dedikaryotisiert gem.
Beispiel 2

5xNh 5xNh

42	11	42	11	42	11	42	11

11

alle 35 Nh "42" und alle 35 Nh "11" sind in ihren Merkmalen identisch

G) Definition der Stämme

In den folgenden Beispielen werden für bestimmte Nährmedien Symbole gebraucht. Es bedeutet:

DPMA = deproteinierter Malzextrakt-Agar

20 g »Maltzin trocken, hell« der Fa. Diamalt (München) werden in 250 ml destilliertem Wasser gelöst. Der pH der Lösung wird durch Titration mit 1 n-NaOH um 1,5 erhöht. Dann werden 1,4 g CaCb ·2 Η2Ο zugegeben, gemischt und 15 min bei 12!°C autoklaviert.

Nach Abkühlung auf Zimmertemperatui wird filtriert. 75 ml Filtrat, 425 ml destillierte!

Wasser und 7,6 g Agar (Merck 1614) werder gemischt und 15 min bei 121 "C sterilisiert Die Agar-Platten enthalten 15 ml Medium ir Petri-Schalen von 8,5 cm Durchmesser.

GPPA = Glucose-Pepton P-Agar

10 g D-Glucose-Monohydrat (Merck 8342 für biochemische Zwecke, 5 g Pepton F

(Oxoid, L49), 7,6 g Agar (Merck 1614), 500 ml destilliertes Wasser werden gemischt und !5 min bei 121⁰C sterilisiert. Agarplatten wie oben.

PDA = Bacto Dehydrated Potato Dextrose Agar (DIFCO) wie auf der Packung angegeben. Agar-Platten wie oben.

Die Farbreaktionen werden mit 6 Tage alten, bei 24 ι ο bis 28° C im Dunkeln auf DPMA angezüchteten Mycelien durchgeführt Folgende Reagenzien werden verwendet:

Guajacol (Merck 4212) ι s

«-Naphthol: l%ige Lösung in 5O°/oigem Äthanol
p-Anisidin: 1 %ige Lösung in 20%igem Äthanol

Guajacol und a-Naphthol werden auf das Mycel in die Nähe des Randes gegeben (3 bis 4 Tropfen), das p-Anisidin auf den Agar neben das Mycel. Die Beschreibung der Farben erfolgt anhand von »A Mycological Colour Chart« von R. W. Rayner (1970), herausgegeben und verlegt von »Commonwealth Mycological Institute Kew«, Surrey, und »British ι-, Mycological Society«. Es werden die Farbnummern und dahinter die deutsche Übersetzung des Farbnamens angegeben.

Beispiel 10

Dikaryon»V10«

Pleurotus ostreatus aus Michigan, V.StA., entspricht Pleurotus sapidus einiger nordamerikani- r> scher Autoren

Wachstum langsamer als bei kommerziellen Anbaustämmen. Fruktifikation von 5 bis 27° C. Fruchtkörper sporenarm. Basidien zu 50% mit mehr als vier (5 bis 6) Sporen.

Merkmale der Monokaryenklasse 1,
entspricht »nh2« in Beispiel 7

1. auf DPMA Mycel mit glattem Rand

2. auf DPMA Luftmycel hoch, kegelförmig v>

3. Wachstumsraten auf DPMA und PDA annähernd gleich

4. p-Anisidinreaktion:

in 30 bis 60 Min. Verfärbung über 56 (Bleirot) nach 82 (Dunkelweinrot) w

5. Gen(e) für Sporenlosigkeit

Merkmale der Monokaryenklasse 2,
entspricht »nh4« in Beispiel 7

1. Hyphen mit Schnallen r,

2. gibt bei Paarung mit einem Tester für Sporenlosigkeit (vgl. Beispiele 5 und 6) Dikaryen mit sporenarmen Fruchtkörpern.

3. Gen(e) für hohen Anteil (50%) 5- und 6sporiger Basidien ho

Diese Definition des Stammes »VI0« enthält nur einen Teil der im Beispiel 7 aufgeführten Merkmale der Monokaryen. Einige Merkmale sind wenig spezifisch, wie die Guajacol- und die «-Naphtholreaktion (sie b^r> werden von vielen Stämmen gegeben), oder sie können züchterisch leicht beseitigt werden, wie extrem langsames Wachstum.

Beispiel 11
Dikaryon »nh2« χ Μ17«

Pleurotus ostreatus aus Michigan, V.SLA., entspricht Pleurotus sapidus einiger nordamerikanischer Autoren.

Wachstumsrats entspricht derjenigen kommerzieller Anbaustämme. Fruktifikation von +5 bis 27° C. Fruchtkörper sporenlos.

Merkmale der Monokaryenklasse »nh2«

siehe Beispiel 10
Merkmale der Monokaryenklasse »M17«

1. keine oder sehr schwache Reaktion mit Guajacol

2. keine oder sehr schwache Reaktion mit «-Naphthol

3. keine oder sehr schwache Reaktion mit p-Anisidin

4. gibt bei Paarung mit einem Tester für Sporenlosigkeit, Dikaryen mit sporenlosen Fruchtkörpern.

Beispiel 12
Dikaryon »42 χ 11«

Pleurotus ostreatus aus Florida, V.StA.
Schnellwüchsiges Mycel, fruktifiziert bei Temperaturen unter 10° C extrem langsam, bei 20 bis 30° C gut. Fruchtkörper sporenlos, von radiärer Symmetrie als Folge einer abnormen, phototropischen Reaktion.

Merkmale der Monokaryenklasse »42«

1. Wachstum auf DPMA bei 24°C im Dunkeln ca. 50 mm (Myceldurchmesser) in 6 Tagen (Impfstück 2 mm)

2. Mycelrand glatt

3. keine oder sehr schwache Reaktion mit Guajacol

4. keine oder sehr schwache Reaktion mit «-Naphthol

5. keine oder sehr schwache Reaktion mit p-Anisidin

6. Gen(e) für Sporenlosigkeit

Merkmale der Monokaryenklasse »11«

1. auf DPMA Mycel mit diffusem Rand

2. auf DPMA hohes, kegelförmiges Luftmycel

3. Wachstumsraten auf DPMA und PDA gleich

4. mit p-Anisidin in 30—60 min Verfärbung nach 59 (Ziegelrot)

5. gibt bei Paarung mit einem Tester für Sporenlosigkeit, Dikaryen mit sporenlosen Fruchtkörpern.

Beispiel 13
Dikaryon »J136 χ 12a«

Pleurotus ostreatus aus Florida, V.St.A.
Schnellwüchsiges Mycel, fruktifiziert bei Temperaturen unter 10°C extrem langsam, bei 20—30°C gut. Fruchtkörper sporenlos.

Merkmale der Monokaryenklasse »J136«

1. Mycel auf DPMA und PDA mehr oder weniger gelappt

2. auf GPPA nach 7 bis 14 Tagen Wachstum bei 24°C im Dunkeln vom !mpfstück ausgehende Verfärbung über 11 (Blaßgelb) und 12 (Gelb) nach 39 (Rost) bis 9 (Umbra)

3. Gene für Sporenlosigkeit

Merkmale der Monokaryenklasse »12a«

1. Mycel auf DPMA und PDA mehr oder weniger gelappt

2. Wachstumsrate bei 24°C im Dunkeln auf GPPA wenig (ca. 10%) geringer als auf PDA

3. auf GPPA nach 7 bis 14 Tagen Wachstum bei 24°C im Dunkeln vom Impfstück ausgehende Verfärbung aber 11 (Blaßgelb) und 12 (Gelb) nach 8 (Siena)bis39(Rost)

20

K)

Hinterlegung der Stämme r>

Alle hier definierten Stämme sind als Patentstämme bei den*. Northern Regional Research Laboratory des US-Departments of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, 111, 61604 -USA- unter folgenden Nr. Hinterlegt:

42 NRRL 11 241

11 NRRL 11242

42x11 NRRL 11243

M17 NRRL 11245

nh2 NRRL 11246

nh4 NRRL 11247

12a NRRL 11 248

J136 NRRL 11 249

VlO NRRL 11250

J136xl2a NRRL 11251

nh2xM17 NRRL 11252

Handelsstämine von Pleurotus-Arten, Kuehneromyces, Flammulina und Lentinus wurden nicht hinterlegt. Sie können entweder νου Pilzbrut-Herstellern bezogen oder aus gehandehen Fruchtkörpern leicht über sogenannte »Gewebekultur« isoliert werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Monokaryen durch Dedikaryot-sierung dikaryotischer Stämme von Basidiomyceten durch mechanische Zerkleinerung von Mycel in flüssigem Medium, dadurch gekennzeichnet, daß man das Mycel in wäßrigem Medium zu lebenden Myceifragmenten mit überwiegend einem bis sehr wenigen Hyphenabschnitten zerkleinert, daß man eine geringe Menge der erhaltenen Mycelfragmente in eine entweder Glykokoll oder ein neutrales Fleischpepton mit hohem Gehalt an Glykokoll und geringem Gehalt an Phosphat- und Magnesiumionen sowie mindestens eine Kohlenstoffquelle enthaltende Dedikaryotisierungslösung derart einbringt, daß die Mycelfragmente zu isolierten Mycelkügelchen auswachsen können, die stets von einer mindestens 2 mm hohen Flüssigkeitsschicht bedeckt sind, wobei man einzelne der ausgewachsenen Mycelkügelchen als Stichproben unter dem Mikroskop auf das Ausmaß der Dedikaryotisierung überprüft, daß man die sichtbare« Mycelkügelchen ebenfalls in wäßrigem Medium in ein- bis wenigzellige Hyphenabschnitte zerkleinert und diese so auf oder in Nähragarplatten bringt, daß sie ebenfalls zu räumlich isolierten Einzelkolonien auswachsen können und daß man, vorzugsweise nach Überprüfung dieser Kolonien auf ihren monokaryotischen Zustand, die monokyrotischen Kolonien auf neuen Nährboden überträgt.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß das Fleischpepton »Peton P« der Fa. Oxoid, Bestell-Nr. L49, ist

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Dedikaryotisierungslösung mit einzelnen Vitaminen und/oder stickstoffhaltigen Verbindungen supplementiert

4. Verwendung der gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 hergestellten Monokaryen zum Paaren mit paarungsverträglichen Partnern zu dikaryotischen Stämmen von Basidiomyceten.