LU81084A1

LU81084A1 - Verfahren zur herstellung von monokaryen durch dedikaryotisierung dikaryotischer staemme von basidiomyceten

Info

Publication number: LU81084A1
Application number: LU81084A
Authority: LU
Inventors: G Eger; H Lara
Original assignee: G Eger; H Lara
Priority date: 1978-03-29
Filing date: 1979-03-27
Publication date: 1980-04-21
Also published as: DE2813521A1; IT1165188B; NL7902427A; DE2813521C3; BE875161A; IT7967647A0; ES479054A0; NL183199B; PL214483A1; DE2813521B2; US4242832A; GB2017753A; CH640266A5; FR2420914B1; IE48493B1; PT69403A; IE790749L; DK127179A; CA1111791A; NL183199C

Description

BL-2606/EM/mg ~ TT Â" «GRAND-DUCHÉ DE LUXEMBOURG Brevet N°__________Q......j......(j.......(J *f du --------------------2? * 3.,..1.9.7.$— Monsieur le Ministre

Rvsiëb de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes

Titre délivre : ------------------------------------- pK

Service de la Propriété Industrielle

~~ LUXEMBOURG

Demande de Brevet d’invention I. Requête

Prof .Dr .Ger lind Eger, Leckergässchen 2 , Marburg^Lahn , R.F, A.et (1) Hermiïô "86-602, Marbürg/haSm, r7f".'a'......................

représentés.....par MM.E,Meyers et E.T.Freylinger,ing.cons.en prop^ir 46,rue du cimetière,Luxembourg,agissant en qualité de mandataires dépose........ vingt-sept mars mil neuf cent soixante-dix-neuf^ à.....1.5..·..9.9..... heures, au Ministère de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes, à Luxembourg : 1. la présente requête pour l’obtention d’un brevet d’invention concernant :

Verfahren zur Herstellung von Monokaryen durch Dedikaryotl-____________(4) .s.ierung-.dikaryatlscher-St amrne von .Ba s 1 d 3 omyc&ten---------------------------------------------------------------- déclare, en assumant la responsabilité de cette déclaration, que l’(es) inventeur(s) est (sont) : JLfes_âsPiQ!Sâa.t;E.......................................................................................................................................................................................................................(5) 2. la délégation de pouvoir, datée de ............................................................. le ...............................

3. la description en langue.............................................. de l’invention en deux exemplaires ; 4.............i.................. planches de dessin, en deux exemplaires ; 5. la quittance des taxes versées au Bureau de l’Enregistrement à Luxembourg, le via#·.....sept mars mil .neuf cent :.r-r>euf..................................................................

revendique pour la susdite demande de brevet la priorité d’une (des) demande(s) de ?» vingt—neuf mars mil neuf.....een..,-......c ; -ctx-huit sous le...........................¢) fô.....Γ ~2c ' 11 5 21,2 ' ' au nom de*®.....OepOScUlt S....................................................................................................................................................................................................(9) élit domicile pour lui (elle) et, si désigné, pour son mandataire, à Luxembourg .......................................

.46.,......rue du Cimetière..................................................................................................................................................................................üO) « sollicite la délivrance d’un brevet d’invention pour l’objet décrit et représenté dans les annexes susmentionnées, — avec ajournement de cette délivrance à.........../.................................mois.

mandataire 23Μ2Γ7 M"— "y J IL Procès-verbal de Dépôt

La susdite demande de brevet d’invention a été déposée au Ministère de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes, Service de la Propriété Industrielle à Luxembourg, en date du :

Pr. le Ministre à 15,00 heures ' l’Économie Nationale et des Classes Moyennes,

MS M......'.................... V

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/ Prioritatsbeanspruchung einer <5,_ Patentanmeldung eingereicht in 7* Deutschland am 29.3.1978 unter / Nr P 28 13 521.9 i

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|! ‘ PATENTANMELDUNG

Prof. Dr. Gerlind Eger, und Hermilo Leal Lara

Verfahren zur Herstellung von Monokaryen durch Dedikaryotisierung dikaryotischer Stämme von Basidiomyceten.

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Μ 1 .

5 Zu den dikaryötischen Basidiomyceten gehören einige der wichtigsten Speisepilze, die in Massen auf landwirtschaftlichen Abfallprodukten produziert werden· Die bisherigen Methoden zur Züchtung solcher Stämme für den Speisepilz-Anbau beruhen im wesentlichen auf der Auslese in der Natur vorkommender Dikaryen 10 (die pro Hyphenabschnitt zwei verschiedene Kerne enthalten), der Isolierung von Monokaryen (die pro Hyphenabschnitt einen Kern enthalten) über Einzelsporen von Fruchtkörpem dieser Dikaryen und der Kombination von Monokaryen zu neuen Dikaryen, die auf erwünschte Eigenschaften ausgelesen werden* Beim Durch-15 gang durch die Meiosis während der Sporenbildung werden die Gene eines Dikaryons zufarismäßig auf die Sporen verteilt. Da-bei können neue, günstige Genkombinationen auftreten, aber auch besonders gute Genkombinationen wieder verloren gehen. Für die Züchtung von Dikaryen mit sporenlosen Fruchtkörpern, fortan 20 "sporenlose Stämme" genannt, ist dieser Weg der Züchtung nicht gangbar, weil keine Sporen, vorhanden sind. Sporenlose Stämme sind jedoch aus den nachstehenden Gründen höchst wünschenswert.

Sporen von Speisepilzen sind Allergene für Mensch und Tier 25 (T. K0ND0 et al., Japan J. Allergy, Bd. 18 (1969), S. 81; K. SHICHIJO et al., Japan, J. Clin. Med., Bd. 28 (1970), S.

575> F. ZADRAZIL, Naturwissenschaften, Bd. 6l (197*0, S. 4565 U. NOSTER et al., Deutsche Med. Woehenschr., Bd. 101 (1976), S. 1241 - 1245). Außerdem kann bei der unkontrollierbaren Spo-30 renverbreitung holzzersetzender Arten Befall von Hölzern aller Art und damit erheblicher Schaden auftretèn. Schließlich kann Virus durch die Sporen von einer Kultur auf die andere übertragen werden (A. DIKLEMAN-VAN ZAAYEN, Mushroom Science VIII, London, 1972, S. 131 - 154; Der Champignon Nr. 183, Nov. 1976) '' \ ?5 und den Pilzanbau selbst gefährden.

r~ 1 L - · • ' #.

1 Sporenlosigkeit tritt als Mutation spontan oder nach Behand-. lung mit Mutagenen auf (T, TAKEMARU u. T. KAMADA, Report Tottori Mycol..Inst. Japan, Bd, 9 (1971) S· 21 - 35)* Sporenlose Stämme 'Sind deshalb häufig Mehrfachmutanten, die neben der erwünseh-. 5 ten Sporenlosigkeit auch unerwünschte Eigenschaften besitzen, z. B. zu langsames Wachstum, geringer Fruchtkörperertrag, abnorme Fruchtkörper. T. TAKEMARU li, T. KAMADA (Report Tottori Mycol. Inst. Japan, Bd, 9 (1971)* S. 21 - 35) und G. EÇER et al.

. (Theoretical and Applied Genetics, Bd, 47 (1976), S« 155 - 1β3) 10 haben versucht, die Sporenlosigkeit aus einem Dikaryon durch Paarung mit einem·.-·- λ - ·- V Monokaryori zu einem neuen Di- karyon zu kombinieren. Diese Methode ist problematisch (G. EGER et al., Theoretical and Applied Genetics, Bd. 47 (1976), S.

155 - 163) und erlaubt keine planmäßige Züchtung. Letztere er-15 fordert die Kenntnis der im Züchtungsmaterial vorhandenen Gene und ihre Verteilung auf die einzelnen Kerne sowie ihre absichtsvolle Kombination zu neuen Stämmen./ Zur Zeit ist die Genetik der Sporenlosigkeit noch unbekannt.

20 Es ist in der Vergangenheit wiederholt der Versuch unternommen •worden, dikaryotische Stämme zu dedikaryotisieren. Die chirurgische Methode von R. HARDER (Z, für Botanik, Bd. 19 (1927),1 S. 337 - .407),.wurde auch von N. FRIES u. K. ASCHAN (Svensk 1 Bot. Tidskr., Bd. 46 (1952), S. 365) bis 391 und S. 429 bis 445) 25 angewandt. Sie hat den Nachteil, daß sie äußerst mühsam ist, nur von hochqualifiziertem Personal durchgeführt werden kann und überwiegend nur einen Typ von Konokaryen ergibt statt der erwarteten zwei.

G. MILES u. J. R. RAPSR (Mycologia, Bd, 48 (1956), S. 484 - \ 30 \ 494) haben darum eine chemische Dedikaryotisierung versucht unter Verwendung von Gallensäure bzw. Natriumtaurocholat.

T, TAKEMARU (Report Tofctori Mycol. Inst, Japan, Bd, 4 (1964), S, 37 - 40 und 41 - 43) benutzte Ochsengalle und Natrlumcholat·

In beiden Fällen konnte unter 50 bzw, 120 Isolaten in der Re-3! I .

gel nur einer der beiden Komponentenkerne eines Dikaryonsjiso-

, J -I

. ' Γ >3 - -1

B

j liert werden. Darunter befanden sich außerdem Mutanten, Y, PARAC (Can. J. Microbiol., Bd. 7 (1961), S. 838 - 84l), R. M. KERRUISE U, E,W,B. DACOSTA (i^vOf-Botany^Bd. "27 (^-963),5. 653 - 670)» T.L.

. AMBURGEY (Phytopathology,Bd. 57 (1967),S. 486 - 491), M.McCLAREf

5 (Can. J. Botany, Bd. 48 (1970), S. 787 - 790), T, TAKEMARU

U. T, KAMADA (Report Tottori Mycol. Inst, Japan, Bd, 9 (197D, S. 21 - 35) schließlich ließen verschiedene Zellgifte auf DI-__ karyen einwirken. Sie konnten in einigen Fällen| Monokaryen .__f isolieren. Sie erhielten Jeweils nur einen, nämlich den gegen-| 10 über dem Zellgift resistenteren Kerntyp des Ausgangsdikaryons.J • Die Ausbeute anjMonokaryen war sehr gering,und es traten Mu- .tanten auf. Schließlich beobachtete A. GINTEROVA (Folia Kicro-biol., Bd. 18 (1973), S. 277 - 280) eine Dedikaryotisierung, -, wenn ein Dikaryon in Flüssigkeit mit bestimmter Frequenz ge-15 schüttelt wurde. Die Dedikaryotisierurvg erfolgte auch hier auf Kosten eines Kerns des ursprünglichen Dikaryons.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neuartiges Verfahren zur Dedikaryotisierung dikaryotischer Stämme von Basidio-20 myceten zu schaffen, so daß beide Kerne eines gegebenen Dikaryons mit unverändertem Genbestand in hoher.Ausbeute und. bei beliebiger Wiederholung reproduzierbar.J isoliert werden können.

Diese Aufgabe wird durch die im Kennzeichen des Eauptanspruchs 25 beschriebenen Verfahrensschritte gelöst. Mit den erfindungsge-mäss hergestellten Monokaryen lassen sich mit paarungsverträglichen Partnern dikaryotische Stämme von Basidiomyceten hersteilen, die pro Hyphenzelle zwei verschiedene Kerne enthalten, ! sogenannte Dikaryen.

30 Die Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe beruht auf der Entwicklung eines neuartigen Dedikaryotisierungsverfahrens. Dieses Verfahren gestattet es, die beiden Kerne eines Dikaryons M# * so schonend voneinander zu trennen, daß zwei Typen von Monokaryen entstehen. Die beiden Typen von Monokaryen, auch Neo-35 haplonten genannt, enthalten Jeweils einen Kerntyp des Ausgangs· dikaryons in unveränderter Form. Das erfindungsgemäße Verfahren « / , L -

V

• r ·· - V - . ^ Λ ' - » 1 erlaubt die Feststellung, welche für die Züchtung wichtigen Gene sich in den einzelnen Monokaryen befinden*.Es erlaubt die Auswahl der Monokaryen mit der jeweils erwünschten Genausstattung . * und ihre Kombination mit neuen monokaryotischen Partnern zu Di-5 karyen mit verbesserten Eigenschaften. Es gestattet ferner eine Identifizierung von Dikaryen und damit den Nachweis einer unrechtmäßigen Vermehrung. Es gestattet schließlich auch den Nachweis einer unrechtmäßigen Entnahme eines Kerns aus einem Di-karyon und seine Paarung mit einem anderen Monokaryon.

io ; ~ ' _______________λ. _ ,.....„.____

Das erfindungsgemäße Verfahren hat gegenüber den bekannten Methoden folgende Vorteile : .1. Das Verfahren verlangt keinen kostspieligen apparativen 15 oder personellen Aufwand (wie die chirurgische Methode) und kann daher In jedem mikrobiologischen Laboratorium durchgeführt werden. · . 2. Das Verfahren ist sehr viel schneller als alle bisherigen Methoden.

20 '·—· .. · - - ~ " . 3. Das Verfahren liefert regelmäßig zwei Mdriok^yehtypeh -'i.

In hoher Ausbeute, so daß der Aufwand für ihre Isolierung gering ist, * - * i· v 25 ':;4.DIe Kerne der Monokaryen sind dank der schonenden Be handlung mit den Kernen des Ausgangsmaterials identisch.

.5.' Die Dedikaryotisierung eines gegebenen Dikaryons bringt auch bei Wiederholung in längeren zeitlichen Abständen 30 reproduzierbare Ergebnisse, 6. Auch Monokaryen mit abnormer Morphologie oder Stoffwechselblockaden (auxotrophe Mutanten), die zur Kennzeichnung eines Stammes in ein Dikaryon eingeführt worden sind, kön-35 nen als Monokaryen aus diesem Dikaryon wiedergewonnen werden,

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• · Γ -5 - -1 t ' .

• . g. : : ' ljf\,7.:Das Verfahren ermöglicht .erstmals die planvolle Züchtung sporenloser Stämme^die demgemäß weder Mensch noch Umwelt gefährden, .8. Das Verfahren ermöglicht erstmals die Identifizierung 5 eines dikaryotischen Speisepilz-Stammes auf einfache ' Weise, : ,9. Das Verfahren, ermöglicht erstmals den sicheren Nachweis einer unauthorisierten Vermehrung eines dikaryotischen 10 Pilzstammes.

Vfö Das Verfahren ermöglicht außerdem erstmals den Nachweis einer unauthorisierten Entnahme eines Kerns aus einem definierten DIkaryon für Züchtungszwecke. ν' -

Nachstehend werden folgende Schritter erläutert.

20 A) Dedikaryotisierung des Ausgangsmaterials; j B) Feststellung der Paarungsverträglichkeit (Inkompatibilität) von Monokaryen; C) Feststellung wichtiger Gene, z, B, der Gene für Sporen-losigkeit, in Monokaryen; 25 D) Feststellung charakteristischer Merkmale in Monokaryen und den aus ihnen gebildeten Dikaryen; E) Paarung ausgesuchter Monokaryen mit neuen Partnern zu neuen Dikaryen; F) Prüfung der neuen Dikaryen auf Stabilität der Merkmale ’ durch wiederholte Dedikaryotisierung; G) Definition der Stämme.

A) Dedikaryotisierung des Ausgangsmaterials i - —-- ,· 35 Als Ausgangsmaterial dient ein dikaryotischer Basidiomycet, vorzugsweise Seitlings- (Pleurotus)-Arten, Samtfuß- oder J _ Γ “1 - é - . ' 1 Winterrübling (Plaimnulina valutipes), Stockschwämmchen (Kuehneromyces mutabllis) und Shiitake ( Leritinus edodes)· Er kann ein Wildstamm sein oder ein mit Mutagenen behandelter Stamm· Wesentlich ist sein Gehalt an züchterisch wertvollen 5 Eigenschaften, z. B. Sporenlosigkeit· Jeder Pilzstamm wird unter geeigneten, möglichst optimalen Waehstumsbedingungen angezüchtet·

Die vegetative Form des Pilzes, genannt Mycel, wird unter Zu-, 10 gäbe von Flüssigkeit (sterilem destilliertem Wasser, Leitungswasser, physiologischer Kochsalzlösung, Puffer oder Dedikaryo-tisierungslösung) in sterilisierten Behältern eines Universal- %

Mixgerätes mit rotierendem Messerkopf „(z· B. "Waring.Blendor”) • so zerkleinert, dass 50% der lebenden Mycelfragmente einen Hyphenabschnitt und die restlichen Fragmente nicht mehr als etwa zwei 15 bis vier Hyphenabschnitte haben. Dabei ist durch Kühlung dafür zu sorgen, daß diè Temperatur zu keiner Zeit das Terape-, raturmaximum des jeweiligen Pilzes erreicht oder übersteigt.

, ) Das Temperaturmaximum des jeweiligen Pilzes ist, sofern es nicht .bekannt ist, leicht zu ermitteln· Von den Fragmenten 20 wird eine geringe Menge in den unteren Teil der Dedikaryoti-. . sierungslös.ung geimpft. Es ist darauf zu achten, daß die Frag mente und die daraus sich entwickelnden Myœlkügelchen stets ναι J einer mindestens 2 mm hohen Flüssigkeitsschicht bedeckt sind·

Die Zahl der Fragmente soll so gering sein, daß sie am Grund 25 der Flüssigkeit zu isolierten Mycelkügelchen auswachsen können* Die Ansätze in der Dedikaryotisierungsflüssigkeit werden bei einer Temperatur von 2 bis 35°C, am besten bei der für den jeweiligen Pilzstamm optimalen Wachstumstenroèratur, bebrütet* 1' .

^3^· 30 Als Dedikaryotisierungslösung dient eire sterilisierte, am / besten hitzesterilisierte Flüssigkeit, mit mindestens einer vier Worte z.B. Glucose oder Maltose , . , beigefügt Kohlenstoffquelle/und einem neutralen, unter Einwirkung von

Pepsin gewonnenen îèpton aus Fleisch, das durch einen hohen

Gehalt an Glykokoll (mindestens etwa 10% der gesamten Amino-35 säuren) und einen geringen Phosphationengehalt (bestimmt als P2057 wen*9er &ls e^wa 1%) und einen geringen Magnesiumionengehalt (weniger als etwa 100 ppm) gekennzeichnet ist, z.B.

"Pepton P" der Fa. OXOID (Best.Nr. L 49), oder ein Mischpepton, das dieses oder ein anderes Pepton entsprechender Qualität ent- ihält oder

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• Γ - ? - ' "Ί * 1 Glykokoll an Stelle des Peptons, oder Jede andere Flüssigkeit mit entsprechendem Glykokollgehalt· Das neutrale Fleischpepton wird in einer Menge von 0,02 bis 7 das Glykokoll in einer Menge von 0,01 bis 5 %9 verwendet. Ist das zu dedikaryotisie-5 rende Dikaryon oder eine seiner monokaryotischen Konsonanten auxotroph.· In Bezug auf Wuchsstoffe oder stickstoffhaltige Verbindungen, so muß die Dedikaryotisierungslösung mit geringen Mengen entsprechender Verbindungen supplementiert werden.

10 Nachdem die Mycelfragmente In der Dedikaryotisierungslösung zu sichtbaren Mycelkügelchen herangewachsen sind, werden Stichproben bei schwacher Vergrößerung (bis lOOx) unter dem Mikroskop auf das Ausmaß der Dedikaryotisierung überprüft. Unter optimalen Bedingungen beträgt sie 100 %, Die Mycelkügelchen werden •15 erneut, unter gleichen Bedingungen wie beim erstem Mal, in ein-] bis wenigzeilige Fragmente zerkleinert. Die Fragmente werden | sodann auf oder In Nähragarplatten gebracht, und zwar In sol- j eher Verdünnung, daß sie" zu räumlich isolierten Einzelkolonien auswachsen können. Als Grundlage für den Nähragar dient ein für 20 den jeweiligen Pilz geeignetes Nährmedium. Die Platten werden am ^ besten bei der für den jeweiligen Pilz optimalen Temperatur be- I brütet, bis die Kolonien mit freiem Auge sichtbar sind. Wenn Ι nötig (Dedikaryotisierungsgrad der Mycelkügelchen kleiner als l 100 %) werden die einzelnen Kolonien bei schwacher Vergrößerung 125 auf Ihren monokaryotischen Zustand überprüft. Oft sind mäkro- I skopisch zwei Typen von Kolonien erkennbar. Dann wird von nicht mehr alsj 5 Kolonien eines jeden Typs (Insgesamt höchstens ί . / 10) ein Stückchen auf neuen Nährboden übertragen» Falls alle ! ein Wort bei- nicht I gefügt Kolonien gleich aussehen, werden insgesamt/mehr als 20 Kolonien 1 30 | abgeimpft, ϊί l jj B) Feststellung cer Faarungsverträgllchkeit von Monokaryen ?

Die Sexualität und damit auch die Fertilität der Basidiomyce-35 * ten wird durch A- und B-Faktoren (Paarungsfaktoren) geregelt.

Die hier genannten Arten der Gattungen Pleurotus 3 Flammulina, Γ . -1 : -8 » · 1' Kuehneromyces und Lentinus besitzen zwei A- und zwei B-Fakto-ren* Von Jedem existieren in der Natur zahlreiche Allele, für Pleurotus ostreatus wurden mindestens 63 A- und 190 B-Faktoren geschätzt (C. P. EU6ENI0 u. N. A. ANDERSON, Mycologia, Bd. 60 5 (1968), S, 627 ** 631}). Ein aus einer einzelnen gesehlechtli-* chen Spore entstandenes Monokaryon enthält einen A- und einen B-Faktor. Zwei Monokaryeri können sich zu einem Dikaryon vereinigen, wenn die A- und B-Faktoren verschieden sind, z, B. ^23^14 m<* ^35^5¾* Bas Dikaryon bildet Fruchtkörper mit Basidi- 10 en, in denen die beiden Kerne miteinander verschmelzen und . eine Meiosis durchmachen. Schließlich entstehen vier Tochter-' kerne, die in Sporen einwandern. Unter den Sporen eines Fruchtkörpers befinden sich in Bezug auf die Paarungsfaktoren vier ' - Typen in gleicher Häufigkeit. Zwei Typen entsprechen Jeweils 15 den Paarungsfaktoren der Ausgangsmonokaryén, z. B. A^B^ und die beiden anderen sind Rekombinanten, z. B. Α,,^Β,-^ und A35Bi2j *

Das Dikaryon ist meistens durch eine besondere Morphologie 20 gekennzeichnet, es trägt sogenannte Schnallen. Sind A- und B-Faktoren in beiden Mycelien gleich oder nur der A-Faktor bzw. der B-Faktor gemeinsam, gibt es kein Dikaryon, Im Falle gleicher A-Faktoren wandern Kerne aus einem Mycel in das andere hinüber, was sich durch weitere Paarungen leicht feststellen 25 läßt J vgl. K. Esser, "Kryptogamen", Springerverlag, Berlin-Heidel- j berg-New York, 1976, S. 452 - 45s| und S. 479-- W. Die Identität der Jeweiligen Paarungsfaktoren eines Monokaryons läßt sich demnach einwandfrei feststellen, indem man es mit Teststämmen * (Testern) für Paarungsfaktoren paart. Es werden z. B. die in 30 Schritt A) aus einem bestimmten, mit Mutagenen behandelten Dikaryon erhaltenden Monokaryen mit vier, den einzelnen Sporentypen des Ausgangsdikaryons entsprechenden, Testern zusammenge-* bracht; vgl. Tabelle I. Von den Testern der Tabelle sind Jeweils Tester 1 und Tester 2 sowie Tester 3 und Tester 4 unter- Γ '.........

11 J

j v_ r · - 3 - n

• 1 Tabelle I

Ermittlung der Paarungsfaktoren (PF) der in Schritt A) erhaltenen Monokaryen (Nh) eines Stammes durch Paarung mit vier -.5 Testern vom Ausgangsdikaryon

Tester Tester Tester Tester pj· der " 2 ^ » (A^B|) . (A2B2) (AgBj) • 1C & 1 - + - -'ab' -, - · A1Bt ' . Anm»; plus = Dikaryenbilduhg; minus = keine‘ Dikaryen- bildung C) Feststellung -wichtiger Gene, z. B. der Gene für Sporenlosigkeit, in Monokaryen 20 Gene für Sporenlosigkeit können in Monokaryen aus Einzelsporen und auch in Monokaryen aus dedikaryotisierten Dikaryen vorhanden sein. Man erkennt sie durch Paarung mit Testmonokaryen (Testern) für Sporenlosigkeit. Solche Tester ergeben bei Paarung mit Monokaryen, die ein Gen für Sporenlosigkeit enthalten, spo- 25 renlose Dikaryen. Die einzelnen Dikaryen, die aus solchen Paa-' rungen hervorgegangen sind, werden vermehrt und in Petrischalen herangezogen. Nach einer Schnellmethode (G. EGER in Mush-room Science Bd. ix/l|(197*1), S. 567 - 573, und Theoretical and Applied Geiietics^ Bd. kJ (1976), S. 155) werden sie im Labora- 30 torium zur Fruchtkörperbildung gebracht. Die Lamellen der Fruchtkörper werden bei schwacher mikroskopischer Vergrößerung (bis iOOx) auf Sporen abgesucht. Nachstehend ist in Tabelle II ein Beispiel gegeben.

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✓ fr r - JO - Π

1 Tabelle II

Feststellung der Gene für Sporenlosigkeit (Sp-) durch Paarung von in Schritt A) erhaltenen Monokaryen (Nh) eines Stammes mit -5 Testern für Sporenlosigkeit und anschließender Prüfung der Di- karyen auf sporenlose Fruchtkörper .· .

Tester für Sporenlosigkeit Einstufung 1 , · 2 · ·der Nh 10 ^ (AiBi) '. -

Eh 1 sporenlos iein^Dikary- Gen für Sp-

Nh 2 kein. Dikary— sehr viele ------:----- on Sporen ‘ 15 % . . -

Danach befindet sich ein Gen für Sporenlosigkeit im Mono- -Ç- .

'karyon f; 20 D) Feststellung charakteristischer Merkmale in Monokaryen und den aus ihnen gebildeten Dikaryen

Die in Schritt A) erhaltenen oder andere Monokaryen, die man für den Aufbau neuer Dikaryen verwenden möchte, werden auf ver-25 schiedenen Nährmedien auf makroskopische, mikroskopische und biochemische Merkmale untersucht, die sich in einfacher Weise feststeilen lassen und geeignet sind, einen Stamm zu charakterisieren.

♦ -

30 Tabelle III

Zur Charakterisierung von Monokaryen geeignete Merkmale morphologische Merkmale \ a) makroskopische 1 35 / Wachstumsraten auf bestimmten Nährmedien 1 dichtes oder lockeres Mycel 1

J

» » Γ. -JA - η .· *

* 1 hohes oder flaches Luftmycel I

glatter, diffuser oder gelappter Mycelrand l Stranghildung I

- federartiges oder wellenartiges Wachstum 5 b) mikroskopische Merkmale kurze, aufgetriebene Hyphenabschnitte.

reichliche, + quirlige Verzweigung buckelige Hyphen

Hyphen mit Pseudoschnallen oder Schnallen 10 ..... ; . ; c) biochemische Merkmale

Bedarf ah bestimmten Vitaminen,.StickstoffVerbindungen · :"···*'£*

Bildung von Farbstoffen auf bestimmten Hahrmedien 15 Bildung von Farbstoffen bei Zusatz bestimmter - Chemikalien

Bildung charakteristischer Kristalle

Ferner werden die so geprüften Monokaryen mit mehreren bereits 20 sehr gut bekannten Honokaryen gepaart und die entstandenen Di-karyen zur Fruktifikation gebracht. Es wird darauf getested, ch ein bestimmtes Monokaryon besondere Eigenschaften vererbt, die nur j im Dikaryon sichtbar werden, z, B. phototropisches Verhalten i der Fruchtkörper, Gestalt und Farbe der Fruchtkörper, weiter I25 oder enger Lamellenabstand, abnorme Sporenzahl pro Basidium.

E) Paarung ausgesuchter Monokaryen mit neuen Partnern zu 1 neuen Dikaryen ! 30 Monokaryen, die in Paarungen mit den Testern in Schritt C)

! J

• und D) erwünschte Eigenschaften offenbart haben, werden mit \ ausgesuchten Partnern zu neuen.Dikaryen vereinigt. Bei der ! Wahl der Partner wird sowohl auf Eigenschaften geachtet, die | im Dikaryon sichtbar werden, wie z. B. Fruktifikation bei ge- 35 ringer Lichtintensität, in bestimmten Temperaturbereichen, •Fruchtköroerertrag und Aussehen, als auch auf einige, in ein- b i- r .-.A- * 1 fâcher Weise feststellbare Merkmale (vgl. Tabelle III), die zur Definition von Stämmen geeignet sind (siehe Schritt G), F) Prüfung der neuen Dikaryen auf Stabilität der Merkmale 5 durch wiederholte Dedikaryotisierung

Bevor man ein Dikaryon in größerem Maßstab in Anbaubetrieben testet, wird die Stabilität seiner Merkmale und der Merkmale seiner Komponenten geprüft und der Stamm definiert. Das Di-10 karyon wird erfindungsgemäß dedikaryotlsiert, die so erhaltenen Monokaryen werden auf ihre charakteristischen Merkmale überprüft, dann paarweise zu Dikaryen vereint und deren Eigenschaften getestet, Haben sich danach alle wesentlichen Merkmale als stabil erwiesen, werden das alte und einige neue Di-15 karyen erneut erfindungsgemäß dedikaryotlsiert und die daraus gewonnenen Monokaryen miteinander verglichen. Stimmen die Monokaryen aus altem Dikaryon und aus neuen Dikaryen überein und | auch mit den Aus gangs Stämmen, kann der Stamm definiert werden, 20 G) Definition der Stämme

Es werden nicht nur, wie bisher üblich, charakteristische Merkmale der Dikaryen genannt. Vielmehr werden außerdem mehrere, in einfacher Weise feststellbare Merkmale der aus den \ 25 Dikaryen durch Dedikaryotisierung jeweils erhältlichen Mono- :· karyen angegeben,

Beispiel einer Stammdefinition:

Pilzart,’ geographische Rasse oder Klimatyp (bzw, geographische v Rasse oder Klimatyp der einzelnen .Komponenten des 30 DIkaryons)

Anbau und Fruchtkörcermerkmale des Dikaryons ♦

Merkmale der Monokaryenklasse 1: J

Wuchseigenschaften des Mycels 4 besondere mikroskooische îierkmale * ! besondere biochemische Merkmale besondere Gene, die im Dikaryon manifest werden / L -f Γ Ί ; - t 1 Merkmale der Monokaryenklasse 2: entsprechend Monokaryenklasse 1 ' Durch Angabe von mindestens 2 charakteristischen Merkmalen in 5 den durch Dedikaryotisierung erhältlichen Monokaryen und durch deren Paarungsfaktoren ist ein Dikaryon eindeu-• tig definiert; damit läßt sich eine unauthorisierte Vermehrung' eindeutig nachweisen» Das ergibt sich aus der Mutationshäufig-v " keit von Genen und einer einfachen Wahrseheinlichkeitsrech- jo nung, Die Mutationsrate bei Pilzen liegt bei 10*"3 bis 10“^ (sie he K. ESSER u, R. KÜHNEN, »Genetik der Pilze", 1967, · Springerverlag, Berlin-Heidelberg-New York). Durch Mutagene* kann bekanntlich die Häufigkeit einer Mutante etwa um den Faktor 100 erhöht werden, ^ Die Wiederholungswahrscheinlichkeit für ein Dikaryon mit 4 15 Merkmalen ist das Produkt der Einzelwahrscheinlichkeiten und liegt demnach bei ΙΟ“20 (10"^*10"^.10*"^.10*·^) bis lO“1^ J10~3,10"3.10'"3.IO“3). Dabei sind die| Paarungsfaktoren noch nicht berücksichtigt. Laut J. R, RAPER ("Genetics of / Sexuality in higher Fungi», Ronald Press, N,Y,, 1966) ist die / 20 geographische Verteilung der Paarungsfaktoren zufällig. Die Wahrscheinlichkeit, einen bestimmten A-Faktor und einen bestimmten B-Faktor, z. B, bei Pleurotus ostreatus, in der^ Natur ein zweites Mal zu finden, errechnet sich bei 63 A-und I90 B-Faktoren (siehe unter B) als ca, 1 : 12000, Die Mu-25 tabilität der Paarungsfaktoren ist höher als die anderer Gene und liegt bei 10“^ (siehe ebenfalls RAPER, a.a.O·). Für die spezielle Kombination eines bestimmten A-Faktors mit einem bestimmten B-Faktor in den Kernen eines Dikaryons liegt ♦ die Wiederholungswahrscheinlichkeit deshalb im Bereich von

QQ

höchstens 10 . Die Wiederholungswahrscheinlichkeit eines be stimmten Dikaryons verringert sich bei Berücksichtigung seiner PaarungsFaktoren darum um weitere 10 und liegt zwi schen IO“2** bis 10~lé. Ein solches Dikaryon kann demnach weder ein zweites Kal aus der Natur isoliert, noch mit züchterischen Methoden aus anderen Stämmen geschaffen v/erden. Die einzelnen I Komponenten eines Dikaryons sind dann hinreichend geschützt,

JL

Ψ- Γ η » ” · 1 wenn die durch Dedikaryotisierung dieses Dikaryons erhaltenen

Monokaryen durch mindestens 3 Merkmale bzw, Gene gekennzeich-net sind· Die Wiederholungswahrscheinlichkeit eines solchen Monokaryons liegt bei Berücksichtigung seiner Paarungsfaktoren 5 zwischen 10 und 10 , d. h. seine Wiederholbarkeit ist ebenfalls praktisch unmöglich. Ergibt ein von einem unautori—visierten Bruthersteller vertriebener Stamm nach seiner Dedikaryotisierung ein oder zwei Monokaryen, die mit den durch Dedikaryotisierung gewonnenen Monokaryen einer^bestimmten. Züchtung in 10 allen kennzeichnenden Merkmalen und den Paarungsfaktoren Übereinstimmen, so sindhrcn diesem Bruthersteller ein ..V'* oder beide, n Wort zu- j bestimmten fügt -I Monokaryen -dieser-;:/ Züchtung entnommen worden.

' Die Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.

15 · ...

• A) Dedikaryotisierung des Ausgangsmaterials Beispiel 1

Als Ausgangsmaterial werden Dikaryen ’ ·, von z. B.

20 Pleurotus ostreatus. Pleurotus cornucopiae, Pleurotus eryngii» Flammulina velutines. Kuehneromyces mutabilis. Lentinus edodes • verwendet. Jeweils 1-3 Impfstücke des zu dedikaryotisieren-<Lden Stammes werden auf eine Agar-Platte mit deproteiniertem jefügt / Malzextrêî:ïieîi“/Un-te^ Sciiri/î^letrischalen geimpft und je 25 nach Pilzart 5 bis 6 Tage bei 24* bis 28°C bebrütet. Der vom Mycel durchwachsene Nährboden einer Petrischale wird mit 50 ml sterilem, auf 10°C gekühltem, destilliertem Wasser in einem « mit Kühlmantel· versehenem, sterilem nSeml-Mikrobehältern eines "Waring-Blendors” 2,5 Mihvbei hoher Drehzahl (entspre-30 ehend 20500 U/min im unbelasteten Zustand) bearbeitet. Dabei soll die Endtemperatur im Behälter 26°C nicht übersteigen.

Von dem Becherinhalt werden 20 ul in 50 ml Erlenmayer-Kölbchen ‘ mit 25 ml Dedikaryotisierungslösung geimpft, so daß die Mycel- . fragmente am Grund der Flüssigkeitsschicht liegen. Die Dedi-35 karyotisierungslSsung besteht aus 20 g‘Glucose und 10 g "Pep-•ton P" der Fa. 0X0ID, Bestell Nr. L 49, in 1 Liter destillier- r 1 I : - /5 - * * ' I 1 tem Wasser. Sie wurde 15 Min. bei 121°C sterilisiert. Nach 5 - | 10 Tagen Bebrütung bei 24 · bis 28°C sind (je nach Pilzstamra und Temperatur) die Myeelfragmente In der Flüssigkeit zu sichtbaren Mycelkügelchen herangewachsen. Jetzt werden die Kölbchen 5· mit den M^celkügelchen und die Kölbchen mit 30 mL-Portionen sterilen, , destillierten Wassers auf 10°C heruntergekühlt. Das Mycel aus einem · Kölbchen und 30 ml Wasser wird .. jeweils In einem sterilen . “Semi-Mikrobehälter" mit Kühlmantel auf dem "Waring-Blendor" unter den gleichen Bedingungen wie beim ersten Mal. verneut 10 zerkleinert. 1 ml;;des Hancgenats wird mit 15 ml', sterilem, destilliertem Wasser verdünnt und 10, 20 und 50 jil der Verdünnung j ~ . werden auf der Oberfläche ναι Agarplatten mit deproteiniertem Malz extrakt verteilt, Nach 4 bis 7 Tagen Bebrütung bei je nach 'Pilzart 24'-bis '28°C sind die lebenden Hyphenabschnitte'r2Ui:;;.

15 tsJ-chfebaren -KolOhlen herangewachsen, die fast aus^chlieftlich^^ ! Monokaryen sind. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammenge- ‘ faßt.

i . 20 Tabelle IV

ti « — I ... I I

s | Dedikaryotisierungserfolg nach 5-10 Tagen in einer ! Lösung mit 2Glucose und îf° "Pepton P" in destillier- * tem Wasser ; p£ · . .

Pilzart $ Dedika- Monokaryenklasaan y ryotisierung pro 20 Kolonien

Zahl Verhältnis

Pleurotus ostreatus

Handelsstamm 1 100 2 3:2

Handelsstamm. 2 98 2 2:1 30 Handelsstamm 3 100 2 3:t

Handelsstamm 4 (Florida Typ) 100 2 5:4 •Stämme : "42x11 ”, sporenlos 100 2 3:2 "V10",sporenarm 100 2 3:2 35 Pleurotus cornucopiae

Handelsstamm 80 2 5:4 * r -1 ; - λ - 1 ?leurotus eryngii

Handelsstamm 100 2 3ï1

Kuehneromyces mutabilis 100 2 3:1

Handelsstamm

Plammulina velutipes 5· Handelsstamm 100 .2 32Î 'Lentinus edodes

Handelsstamm 100 2 2 s 1 .

10 Beispiel 2

Das Dikaryon 1142x1ln wird auf eine Agarplatte mit deproteinier-tem Malzextrakt in Petrischalen geimpft und 5 Tage bei 28°C bebrütet. Das Mycel von einer Petrischale wird entsprechend Beispiel 1 .dedikaryotisiert, Jedoch besteht die Dedikaryotisie-15 rpngslösung aus 20 g Glucose und 3 g Glykokoll in 1 Liter Lei-, tungswasser sehr geringer Härte (Gesamfchärte 8 Deutsche Härtegrade, Nicht- kaxbonathärte 2,4; Monophosphate 1,67 mg/Liter). Tabelle V zeigt das Ergebnis der · Dedikaryotisierung.

20 Tabelle V

Ledikaryotisierungserfolg in 1.0 Tagen in einer Lösung von 2$ Glucose und 0,3^ Glykokoll in Leitungswasser pleurotus ostreatus # Dedikaryoti- Monokaryenkiassen · 25 Stamm,- : «42*11« sierung pro 20 Kolonien enftrofliAa - Zahl Verhältnis sporenlos |00j5 2 t-t B) Feststellung der Paarungsverträglichkeit von Monokaryen 30 ‘ - '

Beispiel 3 > ‘

Als Ausgangsdikaryon dient ein Pleurotus-Stamm aus Florida, der auch kommerziell genutzt wird. Von einem Fruchtkörper wurden Einzelsporen isoliert, darunter "k2v und ”11", Gepaart ergeben j 35 sie ein sporenloses Dikaryon. Dieses wird dedikaryotisiert entsprechend Beispiel 1 oder 2. Es ergibt zwei morphologisch ver- - i

k I

Γ * 1 schiedene Monokaryénklaasent.·.: ::

Klasse 1; langsamwachsende Kolonien mit hohem Luftmycel . (entspricht dem Monokaryon niln) 5 Klasse 2: schnellerwachsende Kolonien mit flachem Luft mycel (entspricht dem Monokaryon "42")

Beide Klassen von Monokaryen werden mit den 4 Testern für die 10 Paarungsfaktoren' (PP) des Ausgangsdikaryons gepaart. Davon ist Tester 1 mit 2 und Tester 3 mit 4 paarungsverträglich.

«» · ^ Das Ergebnis ist in Tabelle VI zusammengefaßt*

Tabelle VI 15

Ergebnis der Paarungen der Monokaryen (Nh) aus dem Dikaryon "42x11" mit den Testern für PP des Pleurotus aus Florida

Nh-Klasse Tester Tester Tester Tester Zuordnung 1 2 3 4 der Nh äj 1, ent- 1 + a spricht ~ ~~ + “ - sie ent- I »1-1» ? + " ~ sprechen 1 “ Z ** ~ - Tester 1 ! 5 - _ 25 2, ent- 1 + spricht 2 + - _ _ sie ent- "4211 3 + - _ I sprechen 4 - + ' _ _ ~ Tester 2

M 5 + - - I

30 Danach stimmen die Monokaryen innerhalb der einzelnen Klasser auch in ihren Paarungsfaktoren überein.

Beispiel 4 ' Von einer Subkultur des Pleurotus-Dikaryons aus Beispiel 3, 1 35 innerhalb von fünf Jahren an einem anderen Ort mehrfach weit! ; subkultiviert wurde, wurden Fruchtkoroer erzeugt und über die l· . \ --- il/ t Γ “1 - Ât - 1 Isolierung einzelner Sporen Monokaryen erzeugt. Das Monokaryon "J136M wurde mit den Testern für die Paarungsfaktoren (PP) des Pleurotus aus Florida gepaart, von denen Tester 1 und 2 und Tester 3 und 4 untereinander paarungsverträglieh sind. Die 5 Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengefaßt.

a '

Tabelle VII

Ergebnis der Paarung des Monokaryons ”J136” mit 10' den Testern für p;p des pleurotus aus Florida.

Tester Tester Tester Tester Zuordnung der P· F

1 2 3 4 des Monokaryons . sie entspre chen Tester 3 15

Nachdem "J136" nur mit Tester 4 kompatibel ist, hat es die gleichen ~ Paarungsfaktoren ' ; wie Tester 3* j 20 c) Festellung der Gene für Sporenlosigkeit in Monokaryen Beispiel 5

Monokaryon MJ136” und andere Monokaryen derselben Herkunft werden mit einem paarungsverträglichen Tester für Sporenlo-25 sigkeit, z. B. n12a", gepaart. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusamnengefaSt. Danach enthält nur MJ13£>" ein Gen für *

Sporenlosigkeit.

* Tabelle VIII

30

Nachweis von Genen für Sporenlosigkeit durch Paarung mit einem Tester für Soorenlosigkeit .

35

L_ J

I . r “I

- J3- -

' 1 Monokaryon x Tester 12a Ergebnis der Paarungen . I

J 156 x 11 ” Fruchtkörper sporenlos I

- J 88 x " « Fruchtkörper mit vielen Sporen J 105 x ” « « « w !t 5 J 109 X " » » μ n tt ’j 16t x " « « « μ π | * J 202 x ” « « η n........11 - - j · ----- ! 10 Beispiel 6 • Dikaryon "V10w ist sporenarm, d, h. die Pruchtkörper haben auf jeder Lamelle einzelne Sporen, Es ist aus einem Pleurotus-ostrëatus-Stamm aus 'Michigan durch Behandlung mit N-Methyl-N1-, ! nitro-N-nitrosoguanidin entstanden. Gemäß Beispiel l.dedikaryo- 1 15 tisiert, ergibt nV10” zwei Klassen von Monokaryen* die sich mikroskopisch unterscheiden lassen (siehe Beispiel 7).

j Klasse 1 hat die Monokaryen 1,2,3,6,8

Klasse 2 hat die Monokaryen 5*7,9,10 20

Die Monokaryen werden mit einem Tester für Sporenlosigkeit, z» B,"Ml7”gepaart. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX zusammengefaßt, !

25 . Tabelle IX

Monokaryen x Tester Ergebnis der Paarungen * 1,2,3,6,8 x Mt7 5 Dikaryen mit sporenlosen Frucht- | körpern | x Mt7 5 Dikaryen, Fruchtkörper mit sehr ? vielen Sporen i il £ SDie Monokaryen 1,2,3,6 und 8 enthalten demnach Gene für Sporen-35 losigkeit.

I f

L

- Γ -fr · ». * 1 d) Feststellung charakteristischer Merkmale in Monokaryen- und der aus Ihnen gebildeten Dikaryen Beispiel 7 5 Dikaryon "VIO" gibt gemäß Beispiel 6 zwei Monokaryenklassen. Die Monokaryen der Klasse 1 wachsen langsam. Sie haben auf de-proteiniertem Malzextraktagar (s. unten Schritt , q) einen glatten Rand und hohes Luftmycel, Das Monokaryon "ntrë*· wurde einge-. hend getestet. Die Wachstumsraten auf deproteiniertem Malz-· ~ 10 agar und auf Kartoffel-Dextrose-Agar stimmen überein, Gibt man bei Zimmertemperatur mit einer Pasteur-Pipette 3 « . *

Tropfen. Guajacol (Merck 4212) an einer Stelle auf ein^ 6 Tage altes, auf deproteiniertem Malzextrakt agar bei 24 -• 28°C im Dunkeln gewachsenes Mycel, und zwar in die Nähe des 15 Randes, so erhält man eine charakteristische Farbreaktion, Innerhalb von 20 Min,bildet sich um das Guajacol ein aprikosenfarbiger Hof, der Innerhalb weiterer 40 Min. nach rostfarbig um-! schlägt und schließlich (nach 2 und mehr Stunden) kastanienbraun xdLrd* Das gleiche Mycel gibt mit 4 Tropfen einer lprozen-20. tigen Lösung von oc-Naphthol 'in 50prozentigem Äthanol innerhalb von 60 Min. eine dunkel-bleiviolette Verfärbung des Agars, die besonders gut auf der Unterseite der Kultur sichtbar ist. Einige Tropfen einer Iprozentigen Lösung von p-Anisidin 'in 20prozent±.gem. Äthanol/· neben das Mycel direkt auf den Agar ge-25 geben, bewirken nach 30 bis 60 Min. eine dunkel-weinrote Verfär- Ϊ bung des Agars,jMonokaryen der Klasse 2 wachsen extrem langsam.

Das .Monokaryon nnh4·” wurde mikroskopisch untersucht» Es trägt » *

Schnallen. Mit Monokaryen anderer Herkunft (nicht aus Dikaryon "VIO"), die nachgewiesenermaßen Gene für Sporenlosigkeit be-33 sitzen, werden entweder keine oder sporenarme Fruchtkörper gebildet, Die Basidien der sporenarmen Fruchtkörper sind zu 50 ? fünf- und sechssporig, E) Paarung ausgesuchter Monokaryen mit neuen Partnern zu I neuen Dikaryen f-

L 7 -I

* · Γ . . ' * Ί , ' * : ’τ «Μ - · ». -j Beispiel 8 I Das längsamwüchsige Monokaryon ,,nh2w aus Beispiel 7 wird mit

Monokaryon "M17” (Tester) gepaart. Das neue Dikaryon hat eine Ifechstums- rate vergleichbar mit derjenigen erfolgreicher, kommerzieller 5 Anbaustämme. Es ist sporenlos. .· ^ • F), Prüfung der nëuen Dikaryen auf Stabilität der Merkmale durch .· -· wiederholte Dedikaryotisierung . - ' 10- Beispiel $

Das Dikaryon "42x11" und die daraus gemäß Beispiel ! oder 2 erhältlichen Monokaryen (Nh) "42" und "11" besitzen die in'“ * Beispiel 12 aufgeführten . Merkmale, Diese wurden auf ihre Stabilität bei wiederholter Dedikaryotisierung wie folgt geprüft: >....... - 20 25 » ' · 30 .. - · l_ · .

• 35 - JX -.

t ' ' • * ·* / 42x11 .'χ/'*.· , - .. ;· * ·· ’ dedikaryotisiert^»^^ .. ' r^~î I j r~r r . .» 5 Nh "42" I 15 Nh "11" j · subkultiyiert in allen Merk- in allen {ï/terk- ...;% \ : . malen identisch malen |identisch ίτ \ · .

mit Ausgangs- mit Ausgangs- . \ monokaryen | ... monokaryen | l

. T

.42x11 42x11 42x11 ^ 42x11 42x11 \ in allen Merkmalen identisch mit Aus- . '\ ’gangsdikaryon 1 I. I 1 · :ir^

Subkultur . 42x11 ^ I . dedikaryoti· dedikaryotisiert gemäß Beispiel 1. siert gern* A Λ a Λ Λ Τ^λ 2 ^ Nh ^ lm\ lm\ /Iih\ ßh\ 5xNh 5xNh 42 ΤΓ -J42 ΪΓ 42 1Î 42* ΪΓ 42 ÏÎ ‘ ' ^ ' ^ alle 35 Nh ,r42" und alle 35 Nh "11" sind in ihren Merkmalen identisch

A

i.- · I ; · r -λ- "· I a Ι> * 1 G) Definition der Stämme

In den folgenden Beispielen werden für bestimmte Nährmedien Symbole gebraucht* Es bedeutet: 5. \ DPMA = deproteinierter Malzextrakt-Agar i - i / 20g "Maltzin trocken, hell” der Fa. DÏAMALT (München) werden/in 250 ml destilliertem Wasser gelöst. Der pH -1q der Lösung wird durch Titration mi:t ln NaOH um 1,5

erhöht. Dann werden 1,4 g-CaClg^HgO zugegeben, gemischt und 15 min bei 121°C autoklaviert. Hach Abkühlung auf Zimmertemperatur wird filtriert. 75 ml Filtrat, 425 ml destilliertes Wasser und 7,6 g Agar . 15 (MERCK 1614) werden gemischt und 15 min bei 121°C

sterilisiert. Die Agar—platten enthalten 15 ml Medium in Petri—Schalen von 8,5 cm Durchmesser. .

GPPA = Glucose-Pepton P — Agar Γ 10 g D-Glucose-Monohydrat (MERCK 8342) für biochemi— | 20 sehe Zwecke J 5 g Pepton p (0XpID,L49)i 7,6 g Agar I ” (MERCK 1614); 500 ml destilliertes Wasser··werden ge mischt und 15 min bei 121°C sterilisiert. Agarplatten wie oben.

PDA = Bacto Dehydrated potato Dextrose Agar (DIFC0) wie 25 auf der Packung angegeben. Agar-Platten wie oben.

Die Farbreaktionen werden mit 6 Tage alten, bei 2k - 28 C im Dunkeln auf DPMA engezüchteten Mycelien durchgeführt. Folgende Reagenzien werden verwendet: .

Guajacol (MERCK 4212) l ^-Haphtholsteige Lösung in 50$igem Äthanol ! p-AnisidinjI^ige Lösung in 20^igem Äthanol f | 35 Gyajacol und (X-Naohthol werden auf das Mycel in die Nähe des

Randes gegeben (3-4 Tropfen), das p-Anisidin auf den Agar ‘ ' Γ , - ΪΊ - 1 neben das Mycel. Die Beschreibung der Farben erfolgt anhand von ,rA Mycological Colour Chart" von R. W. RAYNER (1970), herausgegeben und verlegt von "Commonwealth Mycological Institute Kew", Surrey, und "British Mycological Society". Es werden die Farb-5 nummern und dahinter die deutsche Übersetzung des Farbnamens angegeben. ·

Beispiel 10

Dikaryon "V10" 10 Pleurotus ostreatus aus Michigan, V.St.A., entspricht pleurotus sapidua einiger nordamerika— nischer Autoren ¥achstum langsamer als bei kommerziellen Anbaustämmen. Fruktifikation von +5 bis 27°Co Fruchtkörper sporenarm.

15 Basidien zu 50$ mit mehr als vier ( 5 "bis .6) Sporen.

Merkmale der Monokaryenklas sé 1.entspricht_”nh2"_InJ3ei-

1„auf DPMA Mycel mit glattem Rand .SßiSl-I

2. " " Luftmycel hoch, kegelförmig 20 . 3· Wachstumsrat en auf DPMA und PDA annähernd gleich 4.p-Anisidinreaktions in 30 bis 60 Min Verfärbung über £6 (Bleirot) nach 82 (Dun- ' kelweinrot) 5*Gen(e) für Sporenlosigkeit 25 .

Merkmale der Monokaryenklas 3e 2 ^ ent so rieht "nh4” in Bei-.

1 · Hyphen mit Schnallen 2. gibt bei Paarung mit einem Tester für Sporenlosigkeit (vgl. ^Beispiele 5 und 6) Dikaryen mit sporenarmen Fruchtkörpern. 30 3_. Gen(e) iür hohen Anteil (50$) 5- und 6-sporiger j

Basidien j

Diese Definition des Stammes "V10" enthält nur einen Teil der im Beispiel 7 aufgeführten Merkmale der Monokaryen. Einige .35 Merkmale sind wenig spezifisch, wie die Guajacol- und die

Cx -Naontholreaktion (sie werden von vielen Stämmen gegeben), Λ r % Γ *1 j ; - äs - ! * » · . * 1 oder sie können züchterisch leicht beseitigt werden, wie extrem langsames Wachstum.

Beispiel 11 / 5 ’

Dikaryon Mnh2 3: Ml7,r

Pleurotus ostreatus aus Michigan, V.StJW, entspricht Pleurotus sapidus einiger nordamerikanischer Autoren.

10 Wachstumsrate entspricht derjenigen kommerzieller

Anbaustämme. Fruktifikation von +5 "bis 27°0. Frucht— körper sporenlos.

Merkmalé der Monokaryenklas^g."nh2" ' siehe Beispiel 10 15

Merkmale der Monokaryenklasse "Ml?".' 1. keine oder sehr schwache Reaktion mit Guajaeol 2. keine oder isehr schwache Reaktion mit ctHJaphthol 3. keine oder sehr schwache Reaktion mit p—Anisidin 20 gibt bei Paarung mit einem Tester für Sporenlosigkeit,

Dikaryen mit sporenlosen Fruchtkörpern.

Beispiel 12 " -------- - 25 Dikaryon" 4-2x11 "

Pleurotus ostreatus aus Florida, V,'StVA·* ;

Schnellwüchsiges Mycel, fruktifiziert bei Temperaturen unter tO°C extrem langsam, hei 20 bis 30°C gut. Fruchtkörper sporenlos,von radiärer Symmetrie als Folge einer 30 abnormen, phototropisehen Reaktion.

Merkmale der Monokaryenklasse·- "^11 ’ 1. Wachstun auf DPMA hei 24°C im Dunkeln ca. 50 mm ‘ i (Myceldurchmesser) in 6 Tagen (Impfstück 2mm) 35 2. Mycelrand glatt I. 3« keine oder sehr schwache Reaktion mit Guajacol ,. Γ - it, - η * ^ * · .1 4* keine oder sehr schwache Reaktion mit ct-Raphthol 5· keine oder sehr schwache Reaktion mit p-Anisidin 6. Gen(e) für Sporenlosigkeit 5 Merkmale __der_Monokar^enkla.sse "1111 1. auf DPMA Mycel mit diffusem Rand 2* auf DPMA hohes, kegelförmiges Luftmycel 3 c. Wachstumsraten auf DPMA und PDA gleich 4. mit p-Anisidin in 30—60 min Verfärbung nach 10 , 59 (Ziegelrot) 5· gibt bei Paarung mit einem Tester für Sporenlosigkeit, Dikaryen mit Sporenlosen Fruchtkörpem.

. - ' - · . f 15 Beispiel 13 . .

Dikaryon "dt36 x 12a”

Pleurotus ostreatus aus Florida, V-St.A.

Schnellwüchsiges Mycel, fruktifiziert hei Temperatu— 2Q ren unter 10°G extrem langsam, hei 20-30°C gut,

Fruchtkörper sporenlos0

Merkmale^der^Monokaryenklasse "Ul36"

1· Mycel auf DPMA und PDA mehr oder weniger gelappt 25 2. auf GPPA nach 7 bis 14 Tagen Wachstum hei 24°C

im Dunkeln vom Impfstück ausgehende Verfärbung über 1t (3laßgelb)und 12 (Gelb) nach 39 (Rost) bis 9 (Umbra) χ3β Gene für Sporenlosigkeit 30 r^onokaryenklasse "12a"

1. Mycel auf DPMA und PDA mehr oder v/eniger gelappt 2* Wachstumsraxe bei 24°C im Dunkeln auf GPPA wenig Qt. (ca*10$) geringer als auf PDA

f3e auf GPPA nach 7 bis 14 Tagen Wachstum bei 24°C

im Dunkeln vom Impfstück ausgehende Verfärbung J

f ' - ' i % ft ‘ ’ r -Î) - i .

k 1 über 11 (Blaßgelb) und 12 (Gelb) nach 8 (siena) bis 39 (Rost) . 4* gibt bei Paarung mit 'einem Tester für Sporenlosigkeit, *Dikaryen mit sporenlosen Fruchtkörpern -5 . .... .

b

Hinterlegung der Stämme I

Alle hier definierten Stämme sind als Patentstämme i

10 bei dem . I

Northern Regional Research laboratory des US-Depart- I

mentö of Agriculture, t81f? North TJniversity Street, l • . Peoria, Hl, 61604 -USA- l , I unter folgenden Nr. hinterlegt:, | : 15 l 42...........NRRI 11241 nh4...........NRRI 11.247 11...........NRRI 11 242 12a...........NRRI 11.248 ! 42x11.'..........NRRI 11.243 Jt36...........NRRI 11.249 I M17...........NRRI 11.245 V10...........NRRI 11/250 * nh2...........NRRI 11.246 J136x12a.......NRRI 11.251 } 20 ! nh2xMl7.......NRRI 11.252 - i ·

ί I

I .

ί ) Handels stamme von Pie uro tus-Arten, Kuehneromyces t Flammulina l und Lentinus wurden nicht hinterlegt. Sie können entweder von jj 25 Pilzbrut-Herstellern bezogen odep aus gehandelten Fruchtkör- j | pern leicht über sogenannte "Gewebekultur” isoliert werden.

I -^k · · l / . ^ Ϊ 30 / l 35 ’ 4 4

K

i L ·

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Monokaryen durch Dedikaryo- tisierung dikaryotischer Stämme von. Basidiomyceten, dadurch gekennzeichnet, dass man a) das Mycel in einem wässrigen Medium zu lebenden Mycelfragmenten mit überwiegend einem bis sehr wenigen Hyphenabschnitten zerkleinert, b) dass man eine geringe Menge der erhaltenen Mycelfragmente in eine Glykokoll sowie mindestens eine Kohlenstoffquelle enthaltende Dedikaryo'tisierungslösung derart einbringt, dass die Mycelfragmente zu isolierten Mycelkügelchen auswachsen können,die stets von einer mindestens 2 mm hohen Flüssigkeitsschicht bedeckt sind, wobei man einzelne der erhaltenen ausgewachsenen Mycelkügelchen als Stichproben unter dem Mikroskop auf das Ausmass der Dedikaryotisierung überprüft, dass man c) die Mycelkügelchen ebenfalls in dem wässrigen Medium in ein- bis wenigzeilige Hyphenabschnitte zerkleinert and d) diese so auf oder in Nähragarplatten bringt, dass sie ebenfalls zu räumlich isolierten Einzelkolonien auswachsen können und dass man e) vorzugsweise nach Überprüfung dieser Kolonien auf ihren monokarvotischen Zustand, die monokarvotischen Kolonien auf einen neuen Nährboden überträgt. , . -23-. ? T k »

2. Verfahren zur Herstellung von Monokaryen durch Dedikaryo-tisierung dikäryotischer Stämme von Basidiomyceten, dadurch gekennzeichnet, dass man a) das Mycel in einem wässrigen " , · Medium zu lebenden Mycelfragmenten mit überwiegend einem bis sehr wenigen Hyphenabschnitten zerkleinert, dass man b) eine geringe Menge der erhaltenen Mycelfragmente in eine ein neutrales Fleischpepton mit hohem Gehalt an Glykokoll und geringem Gehalt an Phosphat- und Magnesiumionen sowie mindestens eine Kohlenstoffquelle enthaltende Dedikaryotisierungslösung derart einbringt, dass die Mycel-* fragmente zu isolierten Mycelkügelchen auswachsen können, die stets von einer mindestens 2 mm hohen Flüssigkeits- · Schicht bedeckt sind, wobei man einzelne.der. erhaltenen ausgewachse nen Mycelkügelchen als Stichproben unter dem Mikroskop auf das Ausmass der Dedikaryotisierung überprüft, dass man c) die Mycelkügelchen ebenfalls in dem wässrigen Medium in ein- bis wenigzeilige Hyphenabschnitte zerkleinert und d) diese so auf oder in Nähragarplatten bringt, dass sie ebenfalls zu räumlich isolierten Einzelkolonien auswachsen können und dass man e) vorzugsweise nach Überprüfung dieser Kolonien auf ihren monokaryotischen Zustand, die monokaryotischen Kolonien auf einen neuen Nährboden | überträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Fleischpepton * "Pepton P" (OXOID, Bestell-Nr. L 49) ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Dedikaryotisierungslösung 0.02 bis 7% Fleischpepton enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Dedikaryotisierungslösung ein Mischpepton mit "Pepton P" oder ein entsprechendes neutrales Fleischpepton enthält.

6. Æ Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass - 30 - \ * die Dedikâryotisierungslosung 0.01 bis 5% Glykokoll ent hält.

7. Verfahren nach Anspruch.1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, * dass man die Dedikäryotisierungslösuiig mit Vitaminen und/ oder stickstoffhaltigen Verbindungen supplementiert.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, it dass man Mycel sporenarmer oder sporenloser Dikaryen von Basidiomyceten verwendet.

* 9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man Mycel der Gattung Pleurotus verwendet

, 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass ............i man Mycel von Pleurotus ostreatus verwendet.

11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichhet, dass man Mycel von Kuehneromyces mutabilis verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man Mycel von Flammulina velutipes verwendet.

13. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man Mycel von Shiitake (Lentinus edodes) verwendet. 1 /

14- Verwendung der gemäss den Ansprüchen 1 bis 13 hergestellten Monokaryen zum Paaren mit paarungsverträglichen Partnern zu dikaryotischen Stämmen von Basidiomyceten.