DE69812697T2

DE69812697T2 - Pilze der gattung piriformospora

Info

Publication number: DE69812697T2
Application number: DE69812697T
Authority: DE
Inventors: Philipp Franken; Ajit Varma
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1997-12-05
Filing date: 1998-12-04
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2018-12-05
Also published as: ATE235153T1; WO1999029177A9; DE69812697D1; AU2267899A; ES2195448T3; EP1035776B1; EP1035776A1; WO1999029177A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Pilze der Gattung Piriformospora, Chlamydosporen und Myzelien solcher Pilze, Kulturen und Kulturmedien dieser Pilze sowie Substrate und Zusammensetzungen, die die Pilze, Chlamydosporen, Myzelien oder Kulturmedien umfassen, zur Förderung der Entwicklung des Wachstums, der Gesundheit, der Ernährung von Pflanzen, der Regeneration von Pflanzen und zur Förderung der Keimung von Pflanzensamen.
Pilze wechselwirken mit Pflanzen als Pathogene oder Wohltäter und beeinflussen die Erträge im Ackerbau und im Forstwesen sowie in der Blumenzucht und im Gartenanbau erheblich. Die am meisten verbreiteten Symbionten sind arbusculäre Mycorrhiza-Pilze (AMF), die bei mehr als 80% aller Landpflanzen auftreten (Newman, New Phytol. 106 (1987), 745–751 und Tester, Can. J. Bot. 65 (1987), 419–431). Als Mutualisten sind sie in der Lage, das Wachstum von Kulturpflanzen auf nährstoffarmem Boden zu verbessern und gleichzeitig den Einsatz von teuren und umweltverschmutzenden chemischen Düngern und Pestiziden zu reduzieren (Gianinazzi, Crit. Rev. Biotechnol. 15 (1995), 305-311 und Bethlenvalvay in "Mycorrhizae in sustainable agriculture"; Hrsg. Bethlenfalvay und Linderman, American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin, USA (1992), 1–27). Unglücklicherweise können AMF nicht in reiner Kultur gezüchtet werden. Deshalb sind viele Studien sehr schwierig durchführbar, was jeder Art von grundlegender Forschung und, was wichtiger ist, deren biotechnologische Anwendung verlangsamt.
Deshalb ist das technische Problem der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung von Pilzen, die in der Lage sind, vorteilhalft eine Wechselwirkung mit Pflanzen einzugehen und die leichter zu handhaben sind, als die bekannten arbusculären Mycorrhiza-Pilze. Dieses Problem wurde durch die Bereitstellung der Ausführungsformen gelöst, die in den Ansprüchen definiert sind.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung einen Pilz der Gattung Piriformospora, der zumindest die folgenden Merkmale aufweist:

(a) die Hyphen sind septiert;
(b) die septalen Poren bestehen aus Doliporen mit kontinuierlichen Parenthesomen;
(c) das Myzel produziert an den Spitzen der Hyphen Chlamydosporen, die apikal entstehen;
(d) die Chlamydosporen haben eine birnenförmige Struktur; und
(e) der Pilz weist die Fähigkeit auf, mit lebenden Pflanzenwurzeln zu interagieren.

Ein Pilz, der die vorstehend erwähnten Eigenschaften hat, wurde während einer Routine-Einzelsporen-Inoculum-Präparation eines arbusculären Mycorrhiza-Pilzes in Nordwest-Indien aus einem Wüstenboden isoliert. Es zeigte sich, dass dieser Pilz zu keiner der bekannten Gattungen von Pilzen gehört und somit eine neue Gattung darstellt, die aufgrund des Aussehens der Chlamydosporen, die von dem Pilz produziert werden, Piriformospora genannt wurde. Darüber hinaus wurde herausgefunden, dass der Pilz leicht gezüchtet werden kann und einige vorteilhafte Wirkungen auf Pflanzen zeigt, wenn er mit ihren Wurzeln interagiert. Wie vorstehend angegeben, ist ein Merkmal des erfindungsgemäßen Pilzes, dass die Hyphen septiert sind. Diese Septierung ist vorzugsweise unregelmäßig (2D). In diesem Fall ist es möglich, dass die einzelnen Kompartimente der Hyphen mehr als einen Kern enthalten.
Die Zellwände des erfindungsgemäßen Pilzes sind vorzugsweise sehr dünn und zeigen noch mehr bevorzugt vielschichtige Strukturen (6, Pfeil 1). Typischerweise bewegen sich die Hyphen des Myzels in einem Durchmesser-Bereich von etwa 0,7 bis etwa 3,5 mm. Die Doliporen der septalen Poren sind vorzugsweise sehr dominant mit einer vielschichtigen Innenwand und besitzen vorzugsweise auch eine mediane Verdickung, die hauptsächlich aus Elektronen-transparentem Material besteht. Am meisten bevorzugt dehnen sich die Elektronen-transparenten Schichten der Innenwände tief in die mediane Verdickung hinein, fächern sich jedoch nicht auf. Es wird bevorzugt, dass in dem medianen Bereich der septalen Poren die Parenthesomen gerade sind und mehr bevorzugt den gleichen Durchmesser, wie die entsprechende Dolipore besitzen.
Darüber hinaus besitzen die Parenthesomen vorzugsweise keinerlei Arten von Poren, d. h. sie sind flache Scheiben ohne irgendwelche Perforation (6, Pfeil 2). Die Parenthesomen bestehen vorzugsweise aus einer elektronendichten äußeren Schicht und einer weniger dichten inneren Schicht. Diese innere Schicht zeigt vorzugsweise eine unscheinbare dunkle Linie in der medianen Region. Mehr bevorzugt sind die Parenthesomen in Kontakt mit dem endoplasmatischen Retikulum. Die Membranen des endoplasmatischen Retikulums werden meistens typischerweise nahe der Dolipore gefunden.
Die Sporen des Pilzes, die Chlamydosporen sind, werden vorzugsweise aus dünnwandigen Vesikeln an den Spitzen (Scheitelpunkt) der Hyphen gebildet (3), vorzugsweise am Scheitelpunkt undifferenzierter Hyphen. Sie können vereinzelt oder in Anhäufungen auftreten. Die Chlamydosporen der erfindungsgemäßen Pilze haben eine typische birnenförmige Struktur. Sehr junge Sporen haben vorzugsweise einschichtige dünne, klare Wände. Im ausgereiften Zustand besitzen sie vorzugsweise mindestens eines der nachfolgenden Merkmale: sie sind dick, doppelwandig, glatt und/oder blassgelb. Mehr bevorzugt ist das Cytoplasma in der Spore dicht mit granulären Materialien ausgefüllt. Noch mehr bevorzugt enthält das Cytoplasma mehrere Kerne, im Besonderen etwa 8–25 Kerne ( 4). Typischerweise treten keine Schnallen oder Sexualstrukturen auf.
Der erfindungsgemäße Pilz hat die Fähigkeit, mit der Wurzel lebender Pflanzen zu interagieren. Das bedeutet, dass der Pilz nicht nur ein Saprophyt ist, sondern er ist auch biotroph. Darüber hinaus wird bevorzugt, dass der Pilz auf der Wurzel (5A) sowie innerhalb der Wurzel (5B) leben kann. Mehr bevorzugt entwickeln die Hyphen des Pilzes Appressorienähnliche Strukturen, wenn sie mit lebenden Pflanzenwurzeln in Kontakt kommen (8a).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Pilz in der Lage, die lebenden Pflanzenwurzeln zu kolonisieren, vorzugsweise die Wurzeln von Mais oder Tabak, sowohl interzellulär als auch intrazellulär. Mehr bevorzugt kolonisiert der Pilz die Wurzelrinde intra- und interzellulär (8b). Es wird darüber hinaus bevorzugt, dass die Hyphen eine weitere Differenzierung zeigen, wenn sie in den Zellen wachsen. Vorzugsweise ist diese Differenzierung die Entwicklung von intrazellulären Spiralen oder Ästen (8c) und Sporen- oder Vesikel-ähnlichen Strukturen (8d). Mehr bevorzugt dringen die Hyphen des erfindungsgemäßen Pilzes nicht in Leitbündel-Gewebe ein und wandern nicht aufwärts in den Trieb, wenn sie mit der lebenden Pflanze interagieren. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Pilz in der Lage, sowohl durch das Myzel, das innerhalb der lebenden Pflanzenwurzel wächst, als auch durch das Myzel, das außerhalb der lebenden Pflanzenwurzel wächst, Chlamydosporen zu produzieren.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform messen die Chlamydosporen, die von dem erfindungsgemäßen Pilz produziert werden, etwa 14–33 μm in der Länge und etwa 9–20 μm in der Breite.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Pilz in der Lage, auf verschiedenen natürlichen und synthetischen Medien zu wachsen. Im Besonderen kann der Pilz leicht in oder auf einer Vielzahl unterschiedlicher Medien und Substrate gezüchtet werden. Das Medium, das für die Züchtung des Pilzes verwendet wird, kann ein flüssiges Medium oder ein festes Medium sein. Der Pilz kann zum Beispiel mit einer großen Auswahl synthetischer und komplexer Medien gezüchtet werden, die im Allgemeinen für die Züchtung von Pilzen verwendet werden, z. B. auf Minimalmedium (MM1), das normalerweise für die in vitro-Keimung von AM-Pilzen mit 10% Saccharose oder Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet wird, auf Medien für Aspergillus sp., z. B. CM- und MM2-Medium und auf Moser b-Medium. Der erfindungsgemäße Pilz kann vorzugsweise auch auf natürlichen Substraten gezüchtet werden, wie junge oder reife Hanfblätter (Cannabis sativa L.), junge Blätter von Cynodon dactylon (L.) Pers., auf Getreidekörnern, Hafermehl (Difco), Kartoffel-Karotte, Kartoffel-Dextrose (Difco), Tomaten-Dextrose-Agar, Tomatensaft (Difco), Limabohne (Difco) oder Maismehl (Difco).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Pilz der Pilz, der am 16. Oktober 1997 bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Braunschweig, Germany, mit der Hinterlegungsnummer DSM 11827 hinterlegt wurde.
Aufgrund des Auftretens typischer Doliporen mit fortlaufenden Parenthesomen gehört dieser Pilz zu den Hymenomyceten (Basidiomycota). Er ähnelt jedoch keinem der bekannten Pilze. Demgemäß wurde eine neue Gattung eingeführt und wegen der charakteristischen Sporenstruktur und dem Ort seiner Isolierung, wurde er Piriformospora indica genannt.
Die Sequenzanalyse der 18S-rDNA des Pilzes und Vergleich mit den 18S-rDNA-Sequenzen von anderen Basidiomycota ergab, dass Piriformospora indica mit der Rhizoctonia-Gruppe (Ceratobasidiales) verwandt ist. Die höchste Ähnlichkeit wurde mit Rhizoctonia solani und Thanatephorus praticola gefunden.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung auch Chlamydosporen des erfindungsgemäßen Pilzes. Eine solche Chlamydospore hat eine typische birnenförmige Struktur. Vorzugsweise misst die Chlamydospore etwa 14–33 μm in der Länge und 9–20 μm in der Breite. Sehr junge Sporen haben vorzugsweise einschichtige dünne, klare Wände. Im ausgereiften Zustand besitzen sie vorzugsweise mindestens eines der nachfolgenden Merkmale: sie sind dick, doppelwandig, glatt und/oder blassgelb. Mehr bevorzugt ist das Cytoplasma, in der Spore dicht mit granulären Materialien vollgepackt. Sogar noch mehr bevorzugt enthält das Cytoplasma einige Kerne, im Besonderen etwa 8–25 Kerne. Typischerweise treten keine Schnallen oder sexuelle Strukturen auf. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Myzel des erfindungsgemäßen Pilzes. Die Hyphen dieses Myzels sind septiert und sind vorzugsweise dünnwandig und von einem Durchmesser von etwa 0,7 bis 3,5 mm. Sie können ineinander verflochten sein und sich gegenseitig überlappen, wenn sie auf einem festen Kulturmedium gezüchtet werden.
Das Myzel ist vorzugsweise meistens flach und taucht in das Substrat ein, wenn es auf einem festen Kulturmedium gezüchtet wird. In älteren Kulturen kann es passieren, dass Hyphen unregelmäßig aufgebläht sind, wobei sie eine knotenförmige bis coralloide Gestalt zeigen. Wenn das Myzel auf Wurzeloberflächen wächst, ist es möglich, dass dichte granulierte Körper beobachtet werden können.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung eine Kultur des erfindungsgemäßen Pilzes. Wie bereits vorstehend erwähnt, kann der Pilz auf einer Vielzahl synthetischer oder natürlicher Substrate gezüchtet werden. Der Pilz kann zum Beispiel auf unterschiedlichen Arten von festen Kulturmedien, wie MM1-Medium, gezüchtet werden, und auf unterschiedlichen Medien für Aspergillus sp., z. B. CM- und MM2-Medium, oder Moser b-Medium. Der Pilz kann auch auf verschiedenen natürlichen Quellen gezüchtet werden, wie die Blätter verschiedener Pflanzen, Getreidekörner, Weizenmehl, Kartoffel-Karotte, Kartoffel-Dextrose oder Tomaten-Dextrose-Agar.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Kulturmedium, in dem der erfindungsgemäße Pilz gezüchtet wird, ein flüssiges Medium. Das Medium kann ein synthetisches oder komplexes Medium sein. Vorzugsweise ist das Medium für Aspergillus sp., z. B. MM2- oder CM-Medium, oder Moser b-Medium. Die flüssige Kultur des erfindungsgemäßen Pilzes kann nach Verfahren durchgeführt werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Vorzugsweise wird das Kulturmedium während der Züchtung konstant geschüttelt, z. B. mit etwa einer Rotation pro Sekunde (RpS). Darüber hinaus liegt die Züchtungstemperatur in einem Bereich von etwa 20–30°C.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein flüssiges Kulturmedium, das aus einer erfindungsgemäßen Züchtung stammt, das frei oder im Wesentlichen frei von erfindungsgemäßem Pilz ist. Dieses Kulturmedium kann hergestellt werden, indem zuerst der erfindungsgemäße Pilz in einem flüssigen Kulturmedium gezüchtet wird und dann das flüssige Kulturmedium von dem Pilz, der darin gewachsen ist, abgetrennt wird. Die Trennung kann mit verschiedenen Mitteln erreicht werden, die dem Fachmann bekannt sind, z. B. durch Zentrifugation oder Filtration. Es ist zum Beispiel möglich, das Medium mit dem Pilz zweimal für 30 Minuten auf etwa 80°C zu erhitzen und dann das Pilz-Material durch Zentrifugation zu entfernen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das flüssige Kulturmedium, das von einer Züchtung des Pilzes erhalten wurde, ein Filtrat. Ein solches Filtrat wird vorzugsweise durch Filtrierung des Kulturmediums durch einen Filter erhalten, der eine Porengröße von. nicht größer als 2 μm besitzt, vorzugsweise durch einen Filter, der eine Porengröße von nicht mehr als 0,2 μm besitzt. Der Filtrationsschritt sollte vorzugsweise zu dem Entfernen von im Wesentlichen allen Pilzhyphen führen, mehr bevorzugt sollte die Filtration auch die Chlamydosporen entfernen und noch mehr bevorzugt sollte er jegliches Pilzmaterial entfernen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Substrat, umfassend den Pilz, die Chlamydospore, das Myzel gemäß der Erfindung oder das Kulturmedium oder das Filtrat davon gemäß der Erfindung oder jede mögliche Kombination von jeder dieser Komponenten. Das Substrat kann flüssig oder fest sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Substrat als ein Wachstumssubstrat für Pflanzen verwendet werden. Beispiele sind verfestigte synthetische oder natürliche Medien für die Züchtung von Pflanzen, insbesondere in vitro. Andere Beispiele sind Erde, Sand, Humus oder Torf oder Gemische davon.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen, die die Pilze, die Chlamydospore, das Myzel, das erfindungsgemäße Kulturmedium oder Kulturfiltrat oder irgendeine mögliche Kombination von irgendwelchen dieser Verbindungen, umfassen. Eine solche Zusammensetzung umfasst darüber hinaus vorzugsweise einen oder mehrere landwirtschaftlich verträgliche Träger, z. B. einen angemessenen festen oder flüssigen Zusatz.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Zusammensetzung ein Düngemittel.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung des Pilzes, der Chlamydospore, des Myzels, des Kulturmediums oder Filtrats, die der Erfindung entsprechen, zur Förderung von Entwicklung, Wachstum, Gesundheit und/oder Ernährung von Pflanzen. Es wurde herausgefunden, dass die Überimpfung von Substraten mit dem erfindungsgemäßen Pilz, vorzugsweise mit Myzel und Chlamydosporen, das Wachstum von Pflanzen signifikant erhöht, die auf dem inokulierten Substrat gezüchtet werden. Der gleiche Effekt konnte beobachtet werden, wenn ausschließlich das Kulturmedium oder Filtrat einer Flüssigkultur des Pilzes verwendet wurde.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Förderung von Entwicklung, Wachstum, Gesundheit und/oder Ernährung von Pflanzen, umfassend den Schritt der Zugabe des Pilzes, des Myzels, der Chlamydosporen, des Kulturmediums oder Filtrats, entsprechend der Erfindung, oder einer beliebigen Kombination dieser Komponenten zu dem Substrat, auf dem die Pflanze gezüchtet wird, oder zu der Pflanze selbst oder zu dem Substrat und der Pflanze.
Die Förderung von Gesundheit bedeutet vorzugsweise eine verstärkte Resistenz gegenüber Pathogenen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Förderung der Pflanzengesundheit eine Prophylaxe gegen Beschädigung der Wurzeln der Pflanze durch andere Organismen. Im Besonderen schützt das Wachstum des erfindungsgemäßen Pilzes auf lebenden Pflanzenwurzeln diese Wurzeln vor negativen Auswirkungen, die durch einige andere Organismen verursacht werden, im Besonderen durch Rhizoctonia spec. oder Fusarium spec. Die Förderung von Resistenz kann z. B. dadurch getestet werden, dass zuerst eine Pflanze mit dem erfindungsgemäßen Pilz beimpft wird, gefolgt von einer Beimpfung der Pflanzenwurzel mit zum Beispiel Rhizoctonia oder Fusarium oder unter Verwendung von Blättern mit Alternaria, und dann die Wirkung des Pathogens getestet wird.
Darüber hinaus könnte eine Förderung von Pflanzengesundheit bedeuten, dass der Pilz, das Myzel, die Chlamydospore, das Kulturmedium oder das Filtrat verwendet werden, um einen kontaminierten Boden zu behandeln, auf dem Pflanzen gezüchtet werden, um die Pflanzen widerstandfähiger gegen toxische Substanzen wie Schwermetalle oder chlorierte oder nitrierte Kohlenwasserstoffe zu machen, und/oder zu verhindern, dass diese Substanzen in die Nahrungskette gelangen. Eine Förderung von Gesundheit in diesem Zusammenhang kann zum Beispiel dadurch bestimmt werden, dass Pflanzen, die mit dem erfindungsgemäßen Pilz überimpft wurden und Kontrollpflanzen auf Substraten gezüchtet werden, die mit Schwermetallen kontaminiert sind und indem die Produktion von Biomasse und die Schwermetallkonzentrationen verglichen werden.
In einer anderen Ausführungsform resultiert die Förderung des Pflanzenwachstums in mindestens einer der nachfolgenden Wirkungen:

– eine Zunahme des Gesamtertrags der Pflanze;
– eine Zunahme der Qualität des Pflanzenmaterials;
– eine Zunahme des Sprosswachstums;
– eine Zunahme des Chlorophyllgehalts von photosynthetischem Gewebe;
– eine Zunahme des Wurzelwachstums; und
– eine Zunahme der Gesamtbiomasseproduktion der Pflanze.

Eine Zunahme des Gesamtertrags bedeutet vorzugsweise eine Zunahme des Ertrags von erntbaren Teilen der Pflanze. In Abhängigkeit von der Pflanze kann dies zum Beispiel die Knolle (z. B. Kartoffel), die Rübe (z. B. Zuckerrübe), der Stamm (z. B. Zuckerrohr), die Blätter (z. B. Tabak, Artemisia), die Frucht (z. B. Tomate, Gurke, Kürbis, Weintraube, Apfel, Pfirsich, Kirsche etc.) oder der Samen (z. B. Getreide wie Mais, Reis, Roggen, Gerste, Weizen, Hafer; Baumwolle) sein. Der Ertrag kann zum Beispiel entweder insofern gesteigert werden, dass die Anzahl erntbarer Teile erhöht ist und/oder deren Gewicht und/oder Gehalt an einlagerbaren Substanzen, interessanten Metaboliten usw. erhöht ist.
Ein Anstieg in der Qualität bedeutet vorzugsweise eine Verbesserung der gewünschten Qualitäten einer Pflanze. Dies wiederum kann von Pflanze zu Pflanze unterschiedlich sein. Hinsichtlich der Zierpflanzen, z. B. Petunien, kann ein Anstieg der Qualität eine Zunahme der Anzahl von Blüten oder der Anzahl von Blättern bedeuten. Im Hinblick auf Getreide kann eine Zunahme an Qualität eine Zunahme an Protein- oder Stärkegehalt in den Samen oder eine gewünscht Veränderung in der Struktur oder Zusammensetzung der eingelagerten Substanzen bedeuten.
Eine Zunahme des Sprosswachstums bedeutet vorzugsweise eine Zunahme der Gesamthöhe der Pflanze.
Eine Zunahme des Chlorophyllgehalts photosynthetischer Gewebe bedeutet vorzugsweise eine Zunahme um mindestens etwa 10%, wenn man unbehandelte mit behandelten Pflanzen vergleicht.
Eine Zunahme des Wurzelwachstums bedeutet vorzugsweise, dass die behandelten Wurzeln eine stärkere Verzweigung und eine viel größere Anzahl Wurzelhaare aufweisen, als unbehandelte Wurzeln.
Eine Zunahme der Gesamtbiomasseproduktion der Pflanze bedeutet, dass die Biomasse einer Pflanze, wenn sie mit dem Pilz, der Chlamydospore, dem Myzel, dem Kulturmedium oder Filtrat, entsprechend der vorliegenden Erfindung, behandelt wurde, mindestens 20%, vorzugsweise mindestens 40%, mehr bevorzugt 60% und besonders bevorzugt mindestens 90% höher ist, im Vergleich mit unbehandelten Pflanzen. Mehr bevorzugt ist die Biomasse behandelter Pflanzen mindestens zweimal so hoch wie die Biomasse unbehandelter Pflanzen.
Die Förderung der Entwicklung von Pflanzen bedeutet zum Beispiel, dass die Entwicklung von Blüten und Frucht beschleunigt ist, dass die Reifung von Samen beschleunigt ist oder dass die Regeneration von Pflänzchen aus Zellen oder Kallus beschleunigt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform resultiert die Förderung von Pflanzenernährung in einer Zunahme der Phosphataufnahme.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Pilzes, der Chlamydospore, des Myzels, des Kulturmediums und/oder des Kulturfiltrats, entsprechend der Erfindung, um die Regeneration von Pflanzen aus Pflanzenmaterial, wie Pflanzenzellen, z. B. Protoplasten oder Einzelzellen mit Zellwänden aus verschiedenen Geweben, Gewebe-Explantaten, Ausstanzungen aus Stiel, Blättern oder Wurzeln oder Kallus-Gewebe zu ermöglichen oder zu fördern. Es wurde beobachtet, dass der erfindungsgemäße Pilz die frühe Differenzierung des Kallus in Wurzeln und Triebe induzieren kann, wenn er dem Kallus-Gewebe oder dem Kulturmedium, auf dem der Kallus gezüchtet wird, zugegeben wird (9b). Darüber hinaus erlangen regenerierte Pflänzchen, die von dem Pilz kolonisiert werden, wenn sie in die Erde transferiert werden, eine frühe Etablierung und die Überlebensrate beträgt nahezu 100%. In einigen Fällen wurde herausgefunden, dass die Zugabe des Pilzes die Regeneration von Pflänzchen aus Kallus ermöglicht, wo dies bisher schwierig gewesen ist, z. B. für die Aubergine (Eierpflanze). In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Pflanzenzellen, die Zellen des Gewebe-Explantats oder die Zellen des Kallus transformierte Zellen, d. h. Zellen, in die ein DNA-Molekül mit Hilfe eines der im Stand der Technik bekannten Verfahren eingebracht wurde. Damit sind der Pilz, die Chlamydospore, das Myzel, das Kulturmedium und das Filtrat, entsprechend der Erfindung, besonders geeignet für die Regeneration von Pflanzen, die bisher nicht regeneriert werden konnten, wenn von Zellen, Gewebe-Explantaten oder Kallus-Gewebe ausgegangen wurde. Darüber hinaus verbessern diese die Gesamteffizienz der Regeneration außerordentlich, insofern als sie eine frühe Differenzierung induzieren, die Entwicklung fördern, das Wachstum und die Zell-Biomasse erhöhen und zu einer sehr erhöhten Überlebensrate führen.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Regeneration von Pflanzen aus Pflanzenmaterial, das die Zugabe des Pilzes, der Chlamydospore, des Myzels, des Kulturmediums und/oder des Filtrats, entsprechend der Erfindung, zumindest in einer Stufe des Regenerationsprozesses, zu dem Substrat beinhaltet, auf dem das Pflanzenmaterial oder das sich entwickelnde Pflänzchen gezüchtet wird, und/oder zu dem Pflanzenmaterial oder dem sich entwickelnden Pflänzchen selbst.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Pilzes, der Chlamydospore, des Myzels, des Kulturmediums und/oder des Filtrats, entsprechend der Erfindung, für die Förderung der Reifung von Pflanzensamen. Es wurde herausgefunden, dass die Zugabe von mindestens einer dieser Substanzen zu den Samen oder zu dem Substrat, in dem oder auf dem diese gehalten werden, die Reifung der Samen signifikant verstärkt (9a). Im Besonderen keimen die Samen früher, sie produzieren mehr Wurzeln und Wurzelhaare, die Gesamtbiomasse des sich entwickelnden Keimlings steigt schneller an und die sich entwickelnden Blätter haben einen höheren Chlorophyllgehalt.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Förderung der Keimung von Pflanzensamen, umfassend die Schritte Zugabe des Pilzes, des Myzels, der Chlamydospore, des Kulturmediums oder des Filtrats, entsprechend der Erfindung, oder einer beliebigen Kombination dieser Komponenten zu dem Substrat, auf oder in dem der Same keimt, oder zu dem Samen selbst oder zu dem Substrat und dem Samen.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Pilzes, des Myzels, der Chlamydospore, des Kulturmediums oder des Filtrats, entsprechend der Erfindung, oder einer beliebigen Kombination dieser Komponenten, zur Behandlung eines Substrats, das für Pflanzenzucht geeignet ist, um dessen strukturelle, chemische Zusammensetzung und/oder biologische Zusammensetzung für die Züchtung von Pflanzen zu verbessern. Das behandelte Substrat enthält vorzugsweise Erde, Sand, Humus, Torf oder eine beliebige Kombination dieser Komponenten. Das Substrat wird vorzugsweise derart behandelt, dass der Pilz darin gezüchtet wird, bevor das Substrat für die Züchtung von Pflanzen verwendet wird.
Die vorstehend erwähnten Verwendungen und Verfahren können mit allen möglichen Pflanzen und Zellen oder Gewebe durchgeführt werden, die von solchen Pflanzen abstammen. Im Besonderen können sie mit allen Gymnospermen und Angiospermen (Monocotyledonen oder Dicotyledonen) oder mit Pflanzenmaterial, das von solchen Pflanzen abstammt, einschließlich Bäume, Sträucher, Kräuter und Gräser, durchgeführt werden. Vorzugsweise werden die Verwendungen und Verfahren mit nützlichen Pflanzen oder Material oder Zellen solcher Pflanzen angewendet, mehr bevorzugt für landwirtschaftliche, Garten- oder forstwirtschaftliche Pflanzen. Beispiele sind Bäume und Sträucher, Gemüsepflanzen, wie Tomate, Gurke, Aubergine, Zucchini, Rübe, Senf, Mohrrübe, Raps, Kürbis, Melone, Salat, Lauchzwiebel, verschiedene Hülsenfrüchte wie Erbse, dicke Bohne (Puffbohne), Trifolium, Medicago, etc., Fruchtpflanzen wie Orange, Weintraube, Apfel, Himbeere, Brombeere, Erdbeere, Birne, Pflaume, Kirsche, etc., Getreidepflanzen wie Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Mais, Reis, Hirse oder andere landwirtschaftlich interessante Pflanzen wie Kartoffel, Maniuk-Strauch (Kassawe, Cassawa), Zuckerrübe, Rohrzucker, Baumwolle, Hanf, Leinsamen, Flachs, usw. Pflanzen, die für die Forstwirtschaft interessant sind, sind z. B. Pappel, Eukalyptus, Fichte, Kiefer usw. Pflanzen, die für den Gartenbau interessant sind, sind zum Beispiel Petunie, Begonie, Geranie, Chrysantheme. Darüber hinaus können Pflanzen für medizinische Zwecke wie Artemisia, Barcopa etc. eingesetzt werden.
1 zeigt das Koloniewachstum von Piriformospora indica. Eine Agarscheibe wurde auf CM-Medium transferiert und bei 30°C inkubiert. Aufnahmen wurden 15 Tage (A) und 30 Tage (B) nach Überimpfung gemacht.
2 zeigt die Morphologie der Hyphen. P. indica wurde auf (A) MM-Agar, auf (B) Moser B-Agar, auf (C) der Oberfläche einer Maiswurzel und auf (D) MM2-Agar gezüchtet. Die Hyphen wurden unter dem Lichtmikroskop ohne Färbung (A, B), nach Trypanblau-Färbung (C) oder unter dem Epifluoreszenz-Mikroskop nach Calcofluor-Färbung gefärbt.
3 zeigt Chlamydosporen von Piriformospora indica.
4 zeigt Kerne in einer Chlamydospore. Die Chlamydosporen wurden mit DAPI gefärbt und mit dem Epifluoreszenz-Mikroskop beobachtet. Verschiedene optische Ebenen wurden in ein Bild zusammengesetzt, wobei das Improvision-Software-Paket (Improvision, Coventry, UK) verwendet wurde.
5 zeigt die Wurzel-Kolonisierung. Maiswurzeln wurden mit P. indica gezüchtet und sieben Tage (A) oder 14 Tage (B) nach Überimpfung abgeerntet. Der Pilz wurde mit Trypanblau (A) oder Cloracolschwarz E (B) gefärbt.
6 zeigt Doliporen und Parenthesomen von P. indica. Ausstanzungen der Hyphen wurden mit Hilfe von TEM beobachtet. Die Zellwand (1) und die Parenthesomen (2) sind durch Pfeile gekennzeichnet.
7 zeigt ein Dendrogramm evolutionärer Abstände verschiedener Pilze, das auf einem Teil der 18S rDNA-Sequenzen basiert. Der Vergleich wurde auf der Grundlage der Jukes-Cantor-Gleichung durchgeführt. Die Zahlen zeigen die Signifikanz einer "boots trag"-Analyse an. Der Balken zeigt 2% Unterschiede in der Nucleotid-Zusammensetzung an.
8 zeigt die Pflanzenkolonisierung und Infektion durch Piriformospora indica. Die Maßstab-Balken oberhalb aller Photographien geben eine Länge von 10 μm an. a, ein Pilz-Appressorium, das mit Trypanblau gefärbt wurde und das auf die Wurzel von Mais (Zea mays L.) aufgesetzt ist. b, lichtmikroskopische Aufnahme einer Maiswurzel, sieben Tage nach Beimpfung mit dem Endophyten. Das Trypanblau-gefärbte Segment zeigt interzelluläre Hyphen. c, lichtmikroskopische Aufnahme einer Maiswurzel 16 Tage nach Überimpfung, die gewundene (Pfeil 1) und verzweigte (Pfeil 2) intrazelluläre Hyphen zeigt. d, die gleiche Maiswurzel mit intrazellulären Clustern aus runden Körpern.
9 zeigt den fördernden Effekt von Piriformospora indica für die Pflanzenentwicklung. a, Reifung von Maissamen auf minimalem Agar-Medium, das 10% Saccharose enthält. Der Setzling auf der rechten Seite wurde mit zwei Agar-Scheiben (1 cm im Durchmesser) behandelt, die Hyphen und einige Chlamydosporen des Pilzes enthielten (rechte Pflanze) oder Kontroll-Agarscheiben ohne den Pilz (linke Pflanze). Ein Oberflächen-sterilisierter Samen wurde auf die Agar-Platte aufgebracht. Die Pfeile zeigen zwei Pilz-Agarscheiben an, jede 1 cm im Durchmesser. Die Inkubation wurde 14 Tage lang durchgeführt. b, Kalli von Auberginen (Solanum melangena) differenzieren sich in Austrieb und Blätter innerhalb einer Inkubationszeit von 14 Tagen, bei Behandlung der Kallus-Gewebe mit dem Pilz (wie unter a) und der linke Bereich diente als die Kontrolle.
10 zeigt einen Vergleich von Artemisia annua-Pflanzen, die in Anwesenheit von P. indica (rechte Pflanze) und in Abwesenheit von P. indica (linke Pflanze) gezüchtet wurden. Pflänzchen wurden, wie in Varma (Crit. Rev. Biotech. 15 (1995), 179–199) beschrieben, aus Kalli gezüchtet. Sobald die Pflanzen in Töpfe übertragen wurden, wurden sie mit dem Pilz, wie in Beispiel 2 beschrieben, beimpft. Die Figur zeigt Pflanzen vier Wochen nach Beimpfung.
11 zeigt einen Vergleich von Populus tremula-Pflanzen, die in Anwesenheit von P. indica (rechte Pflanze) und in Abwesenheit von P. indica (linke Pflanze) gezüchtet wurden. Die Pflanzen wurden wie für 10 beschrieben behandelt.
12 zeigt Maispflanzen, die mit dem Kulturfiltrat (CF) von Piriformospora indica behandelt wurden (rechts) und unbehandelte Kontrollpflanzen (links).
13 zeigt die Biomasse der Blätter von Maispflanzen, die mit dem Kulturfiltrat (CF) von Piriformospora indica behandelt wurden (rechts) und von unbehandelten Kontrollpflanzen (links).
Die nachfolgenden Beispiele sind eine weitere Veranschaulichung der Erfindung.
Beispiel 1
Isolierung eines neuen Pilzes mit Namen Piriformospora indica
Feld-isolierte Sporen von arbusculären Mycorrhiza (AM)-Pilzen sind häufig nicht nur mit Bakterien sondern auch mit Pilzen kontaminiert (Lee, Mycol. Res. 98 (1994), 458–466), wovon einige als Hyperparasiten wirken können (Ross, in: Methods and principles of mycorrhizal research, Hrsg. Schenk, American Pathological Society, St. Paul, USA (1982), 55–58). Während einer Routine-Präparation einer Einzelsporen-Massenüberimpfung von Glomus mosseae, der aus einem Wüstenboden in Nordwest-Indien isoliert wurde, trat ein neuer Pilz auf.
Isolierung und Züchtung: arbusculäre Mycorrhiza(AM)-Pilzsporen wurden aus der Rhizosphere des Bodens des hölzernen Strauchs Prosopis juliflora (Swartz) Dc. und Zizyphus nummularia (Burm. f.) Wt. & Arn. aus den Böden der Sanddünen-Wüste von Rajasthan, Nordwest-Indien erhalten. Die Etablierung von Einzelart-Topfkulturen von arbusculären Mycorrhiza-Pilzsporen wurde durchgeführt, indem einzelne neu gebildete Sporen, wie beschrieben (Varma, Crit. Rev. Biotechnol. 15 (1995), 179–199), nahe den Wurzeln von 5–7 Tage alten Mais-Setzlingen platziert wurden. Die Topfkulturen wurden drei Monate nach Beimpfung geerntet und die Sporen wurden isoliert (Gerdemann, Trans. Brit. Mycol. Soc. 46(1963), 235–244), die Oberfläche wurde sterilisiert und auf Minimalmedium (MM1, Williams in: Methods in Microbiology, Hrsg. Norris and Read, Academic Press, London (1992), 201–209) ausgesetzt. Die Hyphen, die auswuchsen und die offensichtlich nicht von einem AM-Pilz stammten, wurden ausgeschnitten und in ein frisches Medium übertragen. Nach einigen Übertragungen erhielten sie den Status einer keimfreien Kultur (Lane, Can. J. Bot. 41 (1974), 1–17).
In einem späteren Stadium wurde der neue Pilz auch auf Agar-Platten und in Flüssigkultur gezüchtet, wobei einige andere Medien verwendet wurden, die komplexe Nährstoffe enthielten, namentlich CM (Komplexmedium für Aspergillus, Pontecorvo, Adv. Genet. 5 (1953), 141–238), MM2 (Minimalmedium für Aspergillus, Käfer, Adv. Genet. 19 (1977), 33–131) und Moser B-Medium (Moser, "Die Gattung Phlegmacium", Klinkhardt, Bad Heilbrunn, Österreich). Keimlinge und Chlamydosporen wurden 45 Min. lang in 8% Formaldehyd in PME-Puffer (50 mM PIPES, pH 6,9; 25 mM EGTA; 5 mM MgSO₄) fixiert, dreimal mit PME-Puffer gewaschen und dann zur Beobachtung der Kerne auf Vectashield-Medien mit DAPI (1,5 μg/ml; Vector Laboratories, Berlingame, CA, USA) und zur Sichtbarmachung von Septen mit Calcoflor (1,5 μg/ml) (Fischer, J. Cell Biol. 128 (1995), 485–498) aufgebracht.
Beispiel 2
Charakterisierung des Pilzes
Morphologie: Der isolierte Pilze war in der Lage, auf einer großen Auswahl synthetischer und komplexer Medien zu wachsen, z. B. auf Minimalmedium (MM1), das normalerweise für in vitro-Keimung von AM-Pilzen mit 10% Saccharose oder Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet wird, auf zwei verschiedenen Medien für Aspergillus sp. (CM und MM2) und auf Moser b-Medium. Junge Myzelien wurden weiß und nahezu klar (1a ), aber unauffällige Zonen wurden in älteren Kulturen verzeichnet (1b). Das Myzel war meist, flach und tauchte in das Substrat unter. Die Hyphen waren dünnwandig und von unterschiedlichem Durchmesser, der sich von 0,7–3,5 mm erstreckte (2a). Sie verflochten sich häufig und überlappten einander (2b). In älteren Kulturen waren die Hyphen häufig unregelmäßig aufgebläht, wobei sie ein knotenförmiges bis coralloides Aussehen zeigten (2c, 3). Es wurden hauptsächlich granulierte dichte Körper beobachtet, wenn der Pilz auf Wurzeloberflächen wuchs (2c). Die septierten Hyphen zeigten manchmal Anastomose (2d). Da die Septierung unregelmäßig war, konnten die einzelnen Kompartimente mehr als einen Kern enthalten. Die Chlamydosporen wurden aus dünnwandigen Vesikeln an der Spitze der Hyphen gebildet (3). Sie traten vereinzelt oder in Anhäufungen (Clustern) auf. Aufgrund ihrer birnenförmigen Struktur, die (14)16–25(33) μm Länge und (9)10–17(20) μm Breite maß, waren diese Chlamydosporen unverwechselbar. Sehr junge Sporen hatten einschichtige dünne klare (hyaline) Wände. Im ausgereiften Zustand erschienen sie dick (bis 1,5 μm), doppelwandig, glatt und blassgelb. Das Cytoplasma war dicht gepackt mit granulärem Material und enthielt gewöhnlich 8–25 Kerne (4). Es konnten weder Klemmverbindungen noch eine sexuelle Struktur beobachtet werden.
Signifikante quantitative und morphologische Veränderungen wurden nachgewiesen, wenn der Pilz dazu herausgefordert wurde, auf unterschiedlichen Medien zu wachsen: die Inkubation in einem schüttelnden Stadium behinderte das Wachstum in MM1-Flüssigkulturen (12–7 g Frischegewicht pro 1 nach 2 Wochen bei 30°C), wobei eine solche negative Wirkung niemals während der Kultivierung auf irgendeinem anderen Substrat beobachtet wurde. In der Tat wurde die Pilz-Biomasse in Schüttelkulturen mit Aspergillus CM bemerkenswert verstärkt (manchmal bis zu 50 g Frischegewicht pro 1 nach 2 Wochen bei 30°C). Auf Moser B-Medium erschienen die Kolonien kompakt, runzelig mit Furchen und zusammengeschnürt. Das Myzel produzierte definierte Zonen und eine große Menge weißer luftiger Hyphen. Die Hyphen waren stark miteinander verflochten, hafteten oft aneinander und ergaben das Erscheinungsbild einer einfachen Schnur. Neue Verzweigungen traten unregelmäßig auf und die externen Wände der Hyphen zeigten in regelmäßigen Intervallen einige Ablagerungen, vielleicht Polysaccharide und/oder einige hydrophobe Proteine, die mit Toluidinblau intensiv gefärbt wurden. Die Chlamydosporen waren sehr klebrig (nahezu verleimt) und es erforderte drastische und heftige physikalische Behandlung, um sie voneinander zu trennen. Das untergetauchte Myzel produzierte auf MM1, CM und MM2 auch Chlamydosporen mit niedriger bis hoher Frequenz, die Chlamydosporen waren jedoch spärlich und lagen häufig in losen Clustern vor.
Das Myzel, d. h. die Hyphen und die Sporen des Pilzes wurden mit Hilfe von Transmissions-Elektronenmikroskopie weiter untersucht. Für diesen Zweck wurden Myzel und Chlamydosporen aus Flüssigkulturen über Nacht mit 2% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylat-Puffer (pH 7,2) bei Raumtemperatur fixiert. Nach 6 Überführungen in 0,1 M Natriumcacodylat-Puffer, wurden die Proben in 1% Osmiumtetroxid im gleichen Puffer 2 Stunden im Dunkeln nachfixiert, in destilliertem Wasser gewaschen und in 1% Uranylacetat 1 Stunde im Dunkeln gefärbt. Nach 3 Waschschritten in destilliertem Wasser wurden die Proben in Aceton dehydriert, wobei 10-minütige Wechsel in 10%, 25%, 50 %, 70%, 95% Aceton und 3 10-minütige Austausche in 100% Aceton verwendet wurden. Die Proben wurden in Spurr's-Plastik (Spurr, J. Ultrastruct. Res. 26 (1969), 31–43) eingebettet. Die Schnitte wurden mit Hilfe eines Reichert-Jung-Ultracut E, ausgestattet mit einem Diamantmesser, angefertigt und auf Formvar-beschichtete Einzeltaschen-Kupfer-Gitter aufgebracht. Die Schnitte wurden mit Bleicitrat bei Raumtemperatur 5–8 Minuten lang gefärbt (Reinols, J. Cell. Biol. 17 (1963), 208-212) und mit destilliertem Wasser gewaschen. Sie wurden mit einem Philips 301 G-Transmissions-Elektronenmikroskop untersucht.
Ultrastruktur: Um mehr Information über die systematische Position des neuen Pilzes zu erhalten, wurde die Ultrastruktur der septalen Pore und die Zellwand untersucht. Die Zellwände waren sehr dünn und zeigten vielschichtige Strukturen (6, Pfeil 1). Die septalen Poren bestanden aus Doliporen mit kontinuierlichen Parenthesomen (6, Pfeil 2), was ein Beweis für die systematische Position innerhalb der Hymenomyceten ist. Die Doliporen waren sehr markant mit einer vielschichtigen Innenwand-Verdickung, die hauptsächlich aus Elektronen-durchlässigem Material bestand. Die Elektronen-durchlässigen Schichten der inneren Wände erstrecken sich bis tief in die mediane Verdickung, fächern sich jedoch nicht auf. In medianen Schnitten der septalen Poren waren die Parenthesomen immer gerade und besaßen den gleichen Durchmesser wie die entsprechende Dolipore. Irgendeine Art von Poren konnte nicht nachgewiesen werden. Das bedeutet, dass es sich um flache Scheiben ohne irgendeine Perforierung handelt. Die Parenthesomen bestanden aus einer Elektronen-dichten äußeren Schicht und einer weniger dichten inneren Schicht, die eine unscheinbare dunkle Linie in der medianen Region zeigte. Sie waren in Kontakt mit dem ER und die Membranen wurden meist nahe der Dolipore gefunden.
Analyse der 18S rDNA: Darüber hinaus wurde die 18S rDNA isoliert und analysiert, um eine genauere Vorstellung über die nächsten Verwandten der isolierten Pilze zu bekommen. Für diesen Zweck wurde junges Myzel, das aus flüssigen CM-Kulturen geerntet wurde, für eine DNA-Extraktion gemäß dem Verfahren für filamentöse Pilze von Timberlake (Science 244, (1989), 1313–1317) verwendet. Die PCR wurde mit 100 ng genomischer DNA durchgeführt, wobei das Primer-Paar NS1 und NS2 (White, in PCR protocols, Hrsg. Innis, Gelfand, Suinsky, White, Academic Press, N.Y. (1990), 315–322) verwendet wurde. Die Amplifikation wurde in 20 μl-Volumen mit 0,5 Einheiten Taq-Polymerase (Gibco-BRL), 200 μM dNTPs und 1 μM von jedem Primer mit Pufferbedingungen wie sie von dem Anbieter des Enzyms empfohlen wurden, durchgeführt. Der erste Denaturierungsschritt wurde 5 Minuten bei 95°C durchgeführt, gefolgt von 30 Zyklen, wobei jeder Schritt 1 Minute dauerte (94°C; 50°C; 72°C) und einer finalen Verlängerung (Elongation) von 5 Minuten bei 72°C. Die PCR-Produkte wurden aus 2%-Agarosegelen ausgeschnitten, mit dem Geneclean-System (BIO101, Dianova) aufgereinigt und gemäß den Angaben des Anbieters in den pT7Blue-Vektor cloniert (Novagene). Rekombinante Plasmide wurden verwendet, um elektrokompetente E. coli XL1-Blue-Zellen zu transformieren (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Die PCR-Clone, die aus drei unabhängigen Kulturen erhalten wurden, wurden gezüchtet, die Plasmid-DNA wurde mit Säulen, die ein Anionen-Austausch-Harz enthielten (Genomed) isoliert und mit dem Sequenzierungsautomaten Alf Express (Pharmacia) sequenziert, wobei die Cy5^TM-markierten (Biological Detection Systems) Universal- und Reverse-Primer 18.1 und 18.2 verwendet wurden. Die Sequenz erscheint in der EMBL/Genebank mit der Registrier-Nummer AF014929 (5'-Region der 18S rRNA). Ähnlichkeiten wurden berechnet, indem 525 Nucleotid-Positionen verglichen wurden. Evolutionäre Abstände zwischen den Organismen wurden mit der Jukes-Kantor-Gleichung bestimmt (Dukes, in: Mammalian Protein metabolism, Hrsg. Munro, Academic Press, N.Y. (1969), 21–532), wobei das DNANIST-Programm des PHYLIP-Pakets (Felsenstein, PHYLIP (Phylogeny inference package) Version 3.5p, University of Washington, Seattle) verwendet wurde. Um die statistische Signifikanz des daraus erhaltenen Dendrogramms zu testen, wurde eine "boots trag"-Analyse anhand von 500 Daten aus Wiederholungsprobenahmen durchgeführt, wobei die Nachbarschafts-Angrenzungs-Methode des MEGA-Programms (Kumar, MEGA: Molecular evolutionary genetic analysis, Version 1.0, Pennsylvania State University) verwendet wurde.
Entsprechend den vorstehend beschriebenen Verfahren wurden Teile der 18S rRNA amplifiziert, sequenziert und mit allen entsprechenden Daten von unterschiedlichen Basidiomyceten verglichen, die in der Genebank-Sequenzbibliothek erhältlich waren, sowie von einigen Ascomyceten und Basidiomyceten (Ascomycota und Basidiomycota) (Daten sind nicht gezeigt). Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde eine zweite Analyse durchgeführt, bei der ausschließlich zwei Ausgruppierungen (ein Ascomycete und eine Zygomycete) verwendet wurden und nur diejenigen Basidiomyceten (Basydiomycota), die zu dem Verständnis der evolutionären Verwandschaft des neuen Pilzes beitragen (7). Das Dendrogramm gab die Klassifizierung in die verschiedenen Ordnungen innerhalb der Basidiomyceten (Basidiomycota) wieder, mit Ausnahme der Aphyllophorales und der Agaricales, die zusammen gruppiert wurden. Die größte Ähnlichkeit der 18S rRNA-Sequenz des neuen Pilzes trat mit der Rhizoctonia-Gruppe (Ceratobasidiales) auf, namentlich Rhizoctonia solani und Thanatephorus praticola. P. indica hat mit diesen einen gemeinsamen Vorfahren mit einem "boots trap"-Wert von 61%. Wenn die gleiche Analyse ohne diese Gruppe durchgeführt wird, stimmt der neue Pilz mit keiner anderen Art überein.
Infektion von Pflanzenwurzeln: Mais (Zea mays L.)-Setzlinge wurden aus Oberflächen-sterilisierten Samen auf angereicherter Tonerde unter Bedingungen, wie sie für Petersilie beschrieben sind (Franken, Mol. Plant-Microbe Interact. 7 (1994), 612-620), gezüchtet. Nach Transfer der Setzlinge in Töpfe, wurden 5 g (Frischegewicht) des Inoculums, das Myzel und Chlamydosporen enthielt, das aus flüssigen CM-Kulturen geerntet wurde, mit dem Substrat gemischt und etwa 1 cm unterhalb der Oberfläche eingesetzt. Die Pflanzen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Beimpfung geerntet, die Wurzeln wurden mit Chlorazolschwarz E (Brundrett, Can. J. Bot. 62 (1984), 2128–2134) oder Trypanblau (Dickson, in: Mycorrhizal Manual, Hrsg. Varma, Springer Verlag, Heidelberg, Tokyo, N.Y. (1997), 77–84) gefärbt und mit Lichtmikroskopie untersucht.
Im Besonderen wurden Topfkulturen von Mais mit dem Myzel des Pilzes überimpft, um dessen Fähigkeit mit Pflanzenwurzeln zu interagieren zu überprüfen. Zunächst wurden Infektionsstrukturen ähnlich Appressorien nach 7 Tagen beobachtet (5a). Eine Woche später entwickelten sich an der Außenseite Chlamydosporen (5b) und innerhalb (5 c) die Wurzeln.
Fazit: Das klassische Artenkonzept basiert hauptsächlich auf der Morphologie. In der Systematik werden Individuen auf der Grundlage von Ähnlichkeiten eingruppiert und werden von anderen auf der Grundlage von Unstetigkeiten in ihren Charakteren unterschieden. Dieses Konzept ist mehr oder weniger erfolgreich verwendet worden, es ist jedoch schwierig auf sich asexuell reproduzierende Pilze anwendbar. Der neue Pilz produziert ausschließlich Chlamydosporen an der Spitze von undifferenzierten Hyphen. Es wurden unterschiedliche Arten von Substraten getestet, um eine sexuelle Entwicklung zu induzieren, wie junge und reife Blätter von Hanf (Cannabis sativa L.), junge Blätter von Cynodon dactylon (L.) Pers. und Pollenkörner, Getreidemehl, Kartoffel-Karotte, Kartoffel-Dextrose- oder Tomaten-Dextrose-Agar. Da all diese Anstrengungen nicht zu den gewünschten Ergebnissen führten, gab es ausschließlich einige wenige Merkmale, um den Pilz morphologisch zu charakterisieren und ihn entsprechend dem klassischen Artenkonzept einzugruppieren.
Untersuchungen der Ultrastruktur des Myzels zeigten vielschichtige Zellwände und Doliporen mit kontinuierlichen Parenthesomen. Das stellte unter Beweis, dass der Pilz zu den Hymenomyceten (Basidiomycota) gehört. Doliporen mit kontinuierlichen Parenthesomen treten ausschließlich unter den Hymenomyceten auf und sind auf einige wenige Ordnungen (Auriculariales, Dacrymycetales, Hymenochaetales, Tulasnellales) und Gattungen (Botryobasidium, Clavulicium, Hyphodontia, Paulicorticium, Trichaptum) beschränkt. Einige davon haben auch anamorphe Stadien, insbesondere einige Arten der Gattung Botryobasidium, bilden Anamorphosen aus, die zu den Gattungen Haplotrichum und der monotypischen Allescheriella gehören (Langer, J. Cramer, Berlin (1994)). Unter diesen zeigen nur die Eigenschaften von A. crocea (Mont.) Hughes, was die anamorphe Form von Botryobasidium croceum Lentz (Lentz, Mycopathol. Mycol. Appl. 32 (1967), 1-25) ist, einige Ähnlichkeiten zu den Strukturen, die in dem neuen Pilze gefunden wurden. Beide bilden dickwandige mehr oder weniger pigmentierte Sporen mit zwei in der LM unterscheidbaren Wandschichten aus (Hughes, Mycol. Pap. 41 (1951), 1–17). Die Größe und das Aussehen der Sporen sind ebenfalls ähnlich. Die Hyphen von B. croceum sind jedoch konstant breiter als diejenigen des neuen Pilzes und sie zeigen eine sehr charakteristische Art der Verzweigung, wie in allen Arten der Gattung Botryobasidium, die sich von der des Endophyten unterscheidet. Unglücklicherweise sind keine Züchtungseigenschaften von A. crocea erhältlich, somit bleibt die Vergleichbarkeit der diskutierten Merkmale fragwürdig. A. crocea wurde jedoch ausschließlich in Verbindung mit fauligem Holz berichtet und man geht davon aus, dass er saprotroph ist, wie es für die Botryobasidium-Arten typisch ist. Im Gegensatz dazu wurde der neue Pilz aus Sporen von Glomus mosseae isoliert und zeigte eine Interaktion mit Wurzeln lebender Pflanzen. Darüber hinaus hatten alle Arten der Gattung Botryobasidium, die bisher im Hinblick auf ihre septalen Poren untersucht wurden (Langer, loc. cit.) Parenthesomen, die becherförmige Strukturen ausbilden, die die mediane Verdickung bedecken, während der neue Pilz scheibenartige Strukturen zeigt, die niemals über diese hinausreichen.
In den letzten Jahren werden mehr und mehr molekulare systematische Untersuchungen für die Klassifizierung von Pilzen verwendet. Der breiteste Bereich über die unterschiedlichen Ebenen der Systematik wird durch Sequenzierung der nucleären rDNA-Gene erreicht (Bruns, Ann. Rev. Ecol. Syst. 22 (1991), 525–564). Deshalb wurde beschlossen, den 5'-Teil der 18S rRNA zu analysieren, wobei die meisten Sequenzen in der Datenbank erhältlich sind. Die Ergebnisse zeigten klar, dass der neue Pilz zu den Basidiomyceten (Basidiomycota) gehört. Die molekulare Analyse zeigte eine relativ enge Verwandtschaft zu der Rhizoctonia-Gruppe, die Wahrscheinlichkeit für einen gemeinsamen Vorfahren ist jedoch mit einem "boots trap"-Wert von 61% nicht sehr signifikant. Unglücklicherweise wurden Mitglieder der Tulasnellalen oder der Gattung Botryobasidium bis jetzt nicht unter Verwendung molekularer Verfahren analysiert. Mitglieder der Ceratobasidialen sind im Hinblick auf ihre septalen Poren gut untersucht. Alle Gattungen dieser Ordnung haben einen sehr charakteristischen Typ von Doliporen mit diskontinuierlichen Parenthesomen und die mediane Verdickung zeigt eine zarte Struktur (Tu, "Culture, devlopment and sexual states of Rhizoctonia, Sclerotium and related fungi", PhD-Thesis (1974), University of Florida, Gainsville, USA; Tu, Bot. Gaz. 139 (1978), 454–466; Langer, loc. cit.). Von den Mitgliedern von Ceratobasidiales ist keine Chlamydosporen-Produktion bekannt, einige Arten sind jedoch dafür bekannt Sclerotien als anamorphe Strukturen zu produzieren, die zu der Form der Gattung Rhizoctonia gehören. Interessanterweise sind Rhizoctonia-Arten ebenfalls in der Lage mit Pflanzen zu interagieren, meist jedoch als Wurzel-Pathogene (Domsch, Cempedium of soil fungi, Academic Press, London (1980)) oder mit Orchideen als Mutualisten (Smith, Mycorrhizal symbiosis, Academic Press, London (1997)). Als Zusammenfassung gibt es keine existierende Gattung, die alle Eigenschaften des neuen Pilzes umfasst. A1lescheriella, als eine monotypische Gattung mit einigen Ähnlichkeiten im Hinblick auf die Chlamydosporen ist verschieden, weil es sich um einen saprotrophen Holz-Zersetzer mit einer charakteristischen Botryobasidium-ähnlichen Morphologie des Myzels und der septalen Pore handelt. Andere Gruppen von Basidiomyceten (Basidiomycota), die aufgrund ihrer molekularen oder ultrastrukturellen Daten verwandt sein können, sind nicht dafür bekannt, in der Lage zu sein, Chlamydosporen zu produzieren oder eine unterschiedliche Lebensart zu haben. Es wurde deshalb eine neue Gattung eingerichtet und der Pilze wurde Piriformospora indica genannt.
Beispiel 3
Interaktion des Pilzes mit Pflanzenwurzeln und seine Wirkung auf Pflanzenwachstum und Entwicklung
Tabak- und Mais-Setzlinge wurden mit Piriformospora indica überimpft. Die Interaktion des Pilzes mit den Pflanzen wurde mit Mikroskopie untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in 8 gezeigt. Sobald die Hyphen mit den Wurzeln in Kontakt kamen, entwickelten sie eine Appressoriaähnliche Struktur (8a). Weiter kolonisierte der Pilz die Wurzelrinde sowohl inter- als auch intrazellulär (8b). In den Zellen zeigten die Hyphen, wie AMF, weitere Differenzierung. Im Besonderen entwickelte der Pilz intrazelluläre Windungen oder Verzweigungen (8c) und Sporen- oder Vesikel-ähnliche Strukturen (8d). Die Hyphen drangen weder in das Stelar-Gewebe ein, noch erstreckten sie sich aufwärts in den Trieb. Die Beimpfung von Substraten mit P. indica (Myzel + Chlamydosporen) erhöhte das Wachstum der getesteten Pflanzen, Tabak, Petersilie, Mais, Espe, und zwei Heilpflanzen-Wirte, Artemisia annua und Bacopa monnieri (9a, Tabelle 1). Im Allgemeinen war die Wurzel- und Trieb-Biomasse etwa verdoppelt nach Behandlung mit dem Endophyten im Vergleich mit den Kontrollen. Zusätzlich wurde die Entwicklung von Blüten und Früchten beschleunigt. Die Behandlung von in Gewebekultur gezogenen Pflänzchen (Solanum melongena, Artemisia annua und Bacopa monnieri) mit dem Pilz förderte nicht nur das Wachstum und stellte eine höhere Zell-Biomasse bereit, sondern induzierte auch eine frühe Differenzierung der Kalli in Wurzeln und Triebe (9 b). Mit Pilz kolonisierte Pflänzchen erlangten nach Transfer in Töpfe eine frühe Etablierung und die Überlebensrate betrug nahezu 100%. Im Gegensatz dazu benötigten die unbehandelten Pflänzchen fast drei Wochen länger, um den "Transfer-Schock" zu überwinden und die Überlebensrate bewegte sich von 30% bis 70%. Experimente mit Mais- oder Petersilien-Samen legten ebenfalls eine förderliche Wirkung auf die Entwicklung offen. Die Keimung war verstärkt und das Wachstum der Pflanzen verbessert (9c). Im Besonderen waren die Triebe chlorophyllhaltiger und die Wurzeln zeigten eine stärkere Verzweigung und eine viel höhere Anzahl an Wurzelhaaren.
Ein Großteil der Forschung über Wurzel-kolonisierende Endophyten mit Pflanzen-Wachstums-fördernder Wirkung beschäftigt sich mit AMF, die bei mehr als 80% aller Landpflanzen auftreten. Da es sich um obligate Symbionten handelt, sind Untersuchungen, um die Grundlage dieser Interaktion zu verstehen, und die Herstellung von Inoculum für ihre Verabreichung kompliziert und zeitaufwendig. Im Gegensatz dazu können ericoide Mycorrhizen oder eine Anzahl von Ectomycorrhizen in reiner Kultur gezüchtet werden, ihr Wirtsspektrum ist jedoch auf die Ericaceae oder auf Holzpflanzen beschränkt. Die Kenntnis, die andere kultivierbare Wurzel-Endophyten betrifft, ist gering. Die meisten Studien wurden mit Pilzen von Pflanzen aus alpinen und subalpinen Regionen durchgeführt, die später auch in anderen Ökosystemen nachgewiesen wurden. Es konnte ein positiver Einfluss auf das Pflanzenwachstum gezeigt werden, das jedoch artspezifisch zu sein schien (Haselwandter, Oecologia 53 (1982), 352–254). In einigen Fällen wurden auch andere Pilze studiert, doch diese Berichte betrafen nur die Wirkung auf eine Pflanze und/oder die Verstärkung von Pflanzenwachstum war relativ gering. P. indica kombiniert die klare Pflanzenwachstum-fördernde Wirkung und die breite Wirtsspezifität von AMF mit der Fähigkeit anderer Pilze in keimfreien Kulturen gezüchtet werden zu können. Er ist somit ein ideales Werkzeug, um die kommerzielle Pflanzenproduktion in Töpfen zu verbessern, auf dem Feld oder bei der Vermehrung im Mikromaßstab und könnte für unterschiedliche Ackerbau-, Forstwirtschaft- und Blumenzucht-, Gartenbau-Anwendungen sehr nützlich sein.
Die nachfolgende Tabelle illustriert die Pflanzenwachstumfördernde Wirkung von P. indica auf verschiedene Pflanzenarten.
Tabelle 1
Die Pflanzen wurden mit 1 g Myzel, beinhaltend Chlamydosporen, pro 100 ml Substrat beimpft. Nach 4 Wochen wurden Wurzeln und Triebe für die Messung ihres Gewichts geerntet. Die Zahlen, die in der Tabelle gezeigt sind, stellen das Verhältnis der Werte, die aus der Behandlung (Endophyt) erhalten wurden, geteilt durch die Werte der Kontrolle (nur Medium), dar. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Erbse (Pisum sativum L.) (Beimpfung, Kultur-Filtrat), Arabidopsis thaliana L. (Beimpfung, Kultur-Filtrat) und Tomate (Lycopersicum esculentum L.) erhalten. Darüber hinaus wurde eine Pflanzenwachstum-fördernde Wirkung bei der Vermehrung im Mikromaßstab und der Akklimatisierung von Tabak (Nicotiana tabacum L.) beobachtet.
Beispiel 4
Wirkung des Kultur-Filtrats auf Pflanzenwachstum und Entwicklung
Um zu untersuchen, ob das Kulturmedium, in dem der neu entdeckte Pilz gezüchtet wurde, selbst eine Wirkung auf das Pflanzenwachstum und die Entwicklung hat, die der des Pilzes ähnlich ist, wurde der Pilz 21 Tage in MM2-Flüssigmedium gezüchtet und das Medium wurde durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,2 μm filtriert.
Oberflächen-sterilisierte Maissamen wurden auf Wasser-Agar keimen gelassen und in Töpfe mit 250 ml angereicherter Tonerde eingepflanzt. Neben der normalen Düngung wurden jede Woche 200 μl des Kultur-Filtrats oder des Wachstumsmediums (Kontrolle) in die Töpfe zugegeben. Vier Wochen später wurden die Pflanzen geerntet und die Trocken-Biomasse wurde bestimmt. Die Pflanzen, die mit dem Kultur-Filtrat behandelt wurden, entwickelten sich schneller als die unbehandelten Pflanzen (12). Das Trieb-Gewichtsverhältnis (cf/Kontrolle) betrug im Durchschnitt 2,3, während das Wurzel-Gewichtsverhältnis im Durchschnitt 1,1 betrug. Darüber hinaus war die Blatt-Biomasse von Pflanzen, die mit dem Pilz behandelt worden waren, außerordentlich erhöht (13). Ähnliche Ergebnisse wurden mit Tabak und Petersilie erhalten.
Beispiel 5
Wirkung des Pilzes auf die Phosphat-Aufnahme von Pflanzen
Petersilie-Pflanzen wurden gezüchtet und beimpft wie beschrieben, mit der Ausnahme, dass in einer Serie von Experimenten das Phosphat aus dem Dünger entfernt wurde. Vier Wochen nach Beimpfung wurden sie geerntet, in einem Ofen getrocknet (5 Stunden; 500°C) und der Phosphatgehalt wurde mit der Molybdo-P-Blau-Methode bestimmt, wie von Herbert et al. beschrieben (in: Norris, Ribbons (Hrsg.) Methods in Microbiology 5b, Academic Press, New York (1971) 209–334). Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle 2 gezeigt. Wie aus dieser Tabelle ersichtlich ist, führt die Beimpfung mit dem Pilz zu einem Anstieg an Phosphataufnahme durch die Pflanzen. Im Prinzip gibt es zwei Möglichkeiten, um die Ergebnisse zu erklären. Der Pilz könnte das Phosphat in der Erde aufnehmen und es über die Hyphen in die Pflanzenwurzel transportieren. Andererseits könnte der Pilz in der Lage sein, das Phosphat in der Erde mit extrazellulären Enzymen zu solubilisieren, um es somit für die Aufnahmesysteme der Pflanze leichter zugänglich zu machen.
Tabelle 2 Biomasse und Phosphat-Gehalt von Petersilie-Pflanzen:

+/–P =: +/–Phosphat im Long Ashton-Dünger (Hewitt, Tech. Comm. 22 (1966), 430–434)
+F =: Zugabe von Pilz-Inoculum (wie für Tabelle 1)
–F =: Zugabe von Wachstumsmedium alleine (wie für Tabelle 1)

Claims

Pilz der Gattung Piriformospora, der zumindest die folgenden Merkmale aufweist: (a) die Hyphen sind septiert; (b) die septalen Poren bestehen aus Doliporen mit kontinuierlichen Parenthesomen; (c) das Myzel produziert an den Spitzen der Hyphen Chlamydosporen, die apikal entstehen; (d) die Chlamydosporen haben eine birnenförmige Struktur; und (e) der Pilz weist die Fähigkeit auf, mit lebenden Pflanzenwurzeln zu interagieren.
Pilz nach Anspruch 1, der die lebende Pflanzenwurzel sowohl intrazellulär als auch extrazellulär kolonisiert.
Pilz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Chlamydosporen von Myzel produziert werden, das innerhalb der lebenden Pflanzenwurzel wächst, als auch von Myzel, das außerhalb der lebenden Pflanzenwurzel wächst.
Pilz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Chlamydosporen etwa 14 bis 33 μm in der Länge und etwa 9 bis 20 μm in der Breite messen.
Pilz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass er in der Lage ist, auf verschiedenen natürlichen und synthetischen Medien zu wachsen.
Pilz nach einem der Ansprüche 1 bis 5, der DSM 11827 ist.
Chlamydospore des Pilzes nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
Myzel des Pilzes nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
Kultur des Pilzes nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
Kultur nach Anspruch 9, die eine Flüssigkultur ist.
Kulturmedium, erhalten von der Kultur nach Anspruch 10, das frei oder im wesentlichen frei von Pilzen ist.
Kulturmedium nach Anspruch 11, das ein Kulturfiltrat ist.
Substrat, umfassend den Pilz nach einem der Ansprüche 1 bis 6, die Chlamydospore nach Anspruch 7, das Myzel nach Anspruch 8, das Kulturmedium nach Anspruch 11 oder das Filtrat nach Anspruch 12 oder eine beliebige Kombination dieser Komponenten.
Substrat nach Anspruch 13, das ein Flüssigsubstrat ist.
Substrat nach Anspruch 13, das ein Festsubstrat ist.
Substrat nach einem der Ansprüche 13 bis 15, das als Wachstumssubstrat für Pflanzen genutzt werden kann.
Zusammensetzung, umfassend den Pilz nach einem der Ansprüche 1 bis 6, die Chlamydospore nach Anspruch 7, das Myzel nach Anspruch 8, das Kulturmedium nach Anspruch 11 oder das Filtrat nach Anspruch 12 oder eine beliebige Kombination dieser Komponenten.
Zusammensetzung nach Anspruch 17, die ein Dünger ist.
Verwendung des Pilzes nach einem der Ansprüche 1 bis 6, der Chlamydospore nach Anspruch 7, des Myzels nach Anspruch 8, des Kulturmediums nach Anspruch 11 und/oder des Filtrats nach Anspruch 12 zur Förderung der Entwicklung, des Wachstums, der Gesundheit und/oder der Ernährung von Pflanzen.
Verfahren zur Förderung der Entwicklung, des Wachstums, der Gesundheit und/oder der Ernährung von Pflanzen, umfassend den Schritt des Zugebens des Pilzes nach einem der Ansprüche 1 bis 6, der Chlamydospore nach Anspruch 7, des Myzels nach Anspruch 8, des Kulturmediums nach Anspruch 11 oder des Filtrats nach Anspruch 12 oder einer beliebigen Kombination dieser Komponenten zu dem Substrat, auf dem die Pflanze kultiviert wird, oder zu der Pflanze selbst oder zu dem Substrat und der Pflanze.
Verwendung nach Anspruch 19 oder Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Förderung der Pflanzengesundheit eine Prophylaxe gegen Beschädigung der Wurzeln der Pflanze durch andere Organismen oder die Verbesserung der Toleranz der Pflanzen gegen toxische Substanzen ist.
Verwendung nach Anspruch 19 oder Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Förderung des Pflanzenwachstums zu einer Zunahme des Gesamtertrags der Pflanze, zu einer Zunahme der Qualität des Pflanzenmaterials, zu einer Zunahme des Sproßwachstums, zu einer Zunahme des Chlorophyllgehalts von photosynthetischem Gewebe, zu einer Zunahme des Wurzelwachstums und/oder zu einer Zunahme der Gesamtbiomasseproduktion der Pflanze führt.
Verwendung nach Anspruch 19 oder Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Förderung der Pflanzenernährung zu einer Zunahme der Phosphataufnahme führt.
Verwendung des Pilzes nach einem der Ansprüche 1 bis 6, der Chlamydospore nach Anspruch 7, des Myzels nach Anspruch 8, des Kulturmediums nach Anspruch 11 oder des Filtrats nach Anspruch 12 oder einer beliebigen Kombination dieser Komponenten zur Förderung der Regeneration von Pflanzen aus Pflanzenmaterial.
Verfahren zur Regeneration von Pflanzen aus Pflanzenmaterial, das die Zugabe des Pilzes nach einem der Ansprüche 1 bis 6, der Chlamydospore nach Anspruch 7, des Myzels nach Anspruch 8, des Kulturmediums nach Anspruch 11 oder des Filtrats nach Anspruch 12 oder einer beliebigen Kombination dieser Komponenten zumindest in einer Stufe des Regenerationsprozesses zu dem Substrat umfasst, auf dem das Pflanzenmaterial oder das sich entwickelnde Pflänzchen kultiviert wird, oder zu dem Pflanzenmaterial oder dem sich entwickelnden Pflänzchen selbst oder zu dem Substrat und zu dem Pflanzenmaterial oder Pflänzchen.
Verwendung nach Anspruch 24 oder Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Pflanzenmaterial genetisch modifizierte Zellen umfasst.
Verwendung des Pilzes nach einem der Ansprüche 1 bis 6, der Chlamydospore nach Anspruch 7, des Myzels nach Anspruch 8, des Kulturmediums nach Anspruch 11 oder des Filtrats nach Anspruch 12 oder einer beliebigen Kombination dieser Komponenten zur Förderung der Keimung von Pflanzensamen.
Verfahren zur Förderung der Keimung von Pflanzensamen, umfassend den Schritt des Zugebens des Pilzes nach einem der Ansprüche 1 bis 6, der Chlamydospore nach Anspruch 7, des Myzels nach Anspruch 8, des Kulturmediums nach Anspruch 11 oder des Filtrats nach Anspruch 12 oder einer beliebigen Kombination dieser Komponenten zu dem Substrat, auf oder in dem der Same keimt, oder zu dem Samen selbst oder zu dem Substrat und dem Samen.