JP3251685B2 - 菌根菌検出用ｄｎａプローブ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はマツタケ菌、ホンシメジ
菌等の菌根菌の核酸と相補的結合するＤＮＡを含むプロ
ーブに関し、さらに具体的には、菌根菌の検出に有用な
菌根菌検出用ＤＮＡプローブに関する。

【従来の技術】マツタケ、ホンシメジ等の菌根菌キノコ
は、自然環境の荒廃により発生が極度に減少している。
このため、これら菌根菌キノコの人工栽培が積極的に試
みられている。これらの方法として、例えば林地におけ
る胞子の散布や菌の植菌、感染苗による二次感染等が行
われている。しかし、菌根菌の成育は極度に遅いので、
これらの方法による人工栽培の成果が判明するまでに
は、少なくとも５年以上を要していた。また、成育の遅
い菌根菌を土壌や菌根から直接に分離することは殆ど不
可能であり、菌が分離できた場合にも、菌根菌の中でも
マツタケ菌やホンシメジ菌等は形態的な特徴に乏しいの
で菌の同定が著しく困難であった。このため、菌根菌を
視覚的に検出できる方法の開発が切望されていた。

【０００２】

【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するため
の手段】従って本発明は、マツタケ菌、ホンシメジ菌等
の菌根菌の検出に有用な検出手段を提供することを目的
とするものである。本発明者は、菌根菌の菌糸が松等の
宿主植物の根に活着ないし増殖しているか否かを正確に
判定することができる手段として、菌根菌の有する核酸
のうち、菌根菌に固有の配列を有する核酸に特異的に相
補的な結合ができるオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ
が、菌根菌検出用のＤＮＡプローブとして有用であるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発
明は、菌根菌の核酸と特異的に相補結合するオリゴヌク
レオチドを含むＤＮＡプローブを提供するものである。
該プローブに含まれるＤＮＡは、菌根菌由来の核酸のう
ち、菌根菌に固有の配列を有する核酸に対して相補的に
結合する性質を有する。この様なＤＮＡとしては、好ま
しくは、(1) 菌根菌由来の１８Ｓr ＲＮＡの塩基配列中
に含まれる菌根菌固有の塩基配列に相補的なＤＮＡ；
(2) 菌根菌由来の１８Ｓr ＲＮＡをコードするセンスＤ
ＮＡの塩基配列中に含まれる菌根菌固有の塩基配列に相
補的なＤＮＡ；及び(3) 菌根菌由来の１８Ｓr ＲＮＡを
コードするセンスＤＮＡに相補的なアンチセンスＤＮＡ
の塩基配列中に含まれる菌根菌固有の塩基配列に相補的
なＤＮＡを挙げることができる。

【０００３】本発明のＤＮＡプローブは、例えば以下の
工程： (1) 複数のキノコの菌糸または子実体より核酸（ＲＮＡ
またはＤＮＡ）を抽出する工程； (2) 核酸の塩基配列を決定する工程； (3) 塩基配列を比較して目的とする菌特有の塩基配列を
選択する工程； (4) 固有の塩基配列を含むＲＮＡもしくはＤＮＡに相補
的な配列を含むＤＮＡプローブ（いわゆる標識配列特異
的オリゴヌクレオチドプローブ）を製造する工程；及び (5) 目的とする菌、異種の菌、及び無関係の生物のＤＮ
Ａと、上記のＤＮＡプローブとをハイブリッド形成さ
せ、ＤＮＡプローブ中に設けられた標識によりプローブ
を検出し、該ＤＮＡプローブが目的とする菌由来のＤＮ
Ａのみを検出することを確認する工程、を含む製造方法
により製造することができる。本発明のＤＮＡプローブ
の製造方法に好適に使用される、リボソームＲＮＡ及び
該リボソームＲＮＡ（r ＲＮＡ）をコードするＤＮＡ
は、マツタケ菌、ホンシメジ菌等の菌根菌から抽出すれ
ばよい。使用する菌糸体としては、液体培養又は固体培
養したものや、子実体の一部を用いればよい。該リボソ
ームＲＮＡ及び該ＤＮＡの抽出は、通常の方法、例えば
サムブルックらの方法（Sambrook、1989、Molecular Cl
oning Cold Spring Harbor Laboratory Press 、以下、
Mol.Clon.と略す）等により行うことができるが、可能
な限り分解されていない高純度の核酸の得られる方法で
あれば、いかなる方法を用いてもよい。

【０００４】ＤＮＡの塩基配列は、当業者に周知の方法
で決定すればよい。例えばＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖
反応、Saiki ら、1985、Science 230. 1350 〜1354) で
増幅後、適当なプラスミドに挿入し、該プラスミドで大
腸菌を形質転換してクローン化した後、大腸菌の増殖に
よりプラスミドを増幅して、該プラスミドに挿入された
リボソームＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列をジデ
オキシ法（Sanger、1977、Proc. Natl. Acad. Sci. 74
：373)で決定すればよい。リボソームＲＮＡの部分塩
基配列の決定は、逆転写酵素を使用した方法により決定
できる。また、ｃＤＮＡの一部をＰＣＲで増幅後、ＤＮ
Ａポリメラーゼを用いて直接に配列を決定してもよい。
また化学的な塩基配列の決定法を使用してもよい。上記
の様にして得られたＤＮＡもしくはＲＮＡの塩基配列を
比較することにより、菌根菌由来の核酸における菌根菌
に固有の配列を見出し、該配列に相補的な１０数個以
上、好ましくは１６〜２０塩基のＤＮＡを選択して、菌
根菌に固有な核酸と特異的に結合するＤＮＡとすればよ
い。該ＤＮＡは全自動のＤＮＡ合成機（例えば、Applie
d Biosystems社製、380B等) で化学的に合成すればよ
い。

【０００５】本発明のＤＮＡプローブは、上記のオリゴ
ヌクレオチドを含み、菌根菌の検出用として使用できる
プローブである。該ＤＮＡプローブは、周知のいずれか
の方法によって検出可能であればよいが、一般的には、
一つ以上の標識原子または基により標識されていること
が好ましい。本発明のＤＮＡプローブに使用される標識
の例としては、当業者に周知の標識である³²Ｐ、³⁵Ｓの
様な放射性原子；ビオチン基あるいはアビジン類；又は
酵素等を挙げることができる。抗原抗体系を利用する場
合には抗原を含んでもよい。本発明のＤＮＡプローブの
好ましい一態様として、³²Ｐ放射性標識化若しくは³⁵Ｓ
放射性標識化ＤＮＡプローブを挙げることができる。こ
れらの標識化ＤＮＡプローブも本発明の範囲に包含され
る。標識化ＤＮＡプローブの製造方法としては、例えば
上記ＤＮＡの製造後に、５’末端に放射性の燐酸基を導
入する方法；３’末端に放射性の燐酸基、またはビオチ
ンを結合したヌクレオチドを転移させて標識する方法；
オリゴヌクレオチドの製造時に５’末端にアミノ基を導
入した後、蛍光物質で修飾するか、酵素を結合する方法
を挙げることができるが、これらの方法に限定されるこ
とはない。５’末端または３’末端にビオチンが結合し
たＤＮＡプローブは、当業者に周知の方法で自動的合成
が可能である。

【０００６】本発明のＤＮＡプローブの使用方法として
は、キノコの菌糸もしくは子実体から抽出した核酸を、
直接又はＰＣＲ法で増幅し高分子膜にブロットして固定
した後、本発明のＤＮＡプローブをハイブリダイズさせ
ればよい。本発明のＤＮＡプローブのハイブリダイゼー
ションに使用される支持体としては、薄膜、粉末、粒状
物、ゲル、ビーズ、繊維等の他、分散液、エマルジョン
等を挙げることができる。これらは適当なカラムに充填
して使用してもよい。これらのうち薄膜が好ましく、例
えばニトロセルローズ膜、ナイロン膜を使用すればよ
い。菌根菌由来のＤＮＡのうち、本発明のＤＮＡプロー
ブと相補的配列を有し菌根菌に固有の核酸は、本発明の
ＤＮＡプローブと相補的に強固に結合する。ＤＮＡプロ
ーブが放射性標識されている場合は、Ｘ線フィルムまた
は印画紙に密着させてオートラジオグラフィーを行えば
よい。また、本発明の好ましい態様であるビオチン化Ｄ
ＮＡプローブは、蛍光色素または酵素を結合したアビヂ
ンと強固な複合体を形成するので、直接的に、または酵
素反応の後に発色により光学的に検出が可能となる。後
者の場合には、アビヂン又はストレプトアビヂンに結合
された酵素パーオキシダーゼまたはアルカリホスファタ
ーゼを用いて、着色反応または発光反応により検出すれ
ばよい。検出のために使用される酵素としては上記の酵
素の他に、一般的な要件として、(1) 常温及び使用温度
において充分な安定性を有すること；(2) 直接的又は間
接的なプローブとの結合による活性の低下の無いこと；
(3) 検出感度を満足する基質に対する高い活性を有する
こと；及び(4) 使用に耐える高純度の試薬が入手可能で
あるか、入手可能な試薬から容易に調製出来ること等の
条件を備えている限り、いかなる酵素を用いてもよい。

【０００７】例えば、検出用の酵素としてパーオキシダ
ーゼを使用する場合には、基質としてジアミノベンヂジ
ン又は４−クロロナフトール等の水可溶性基質を用い、
過酸化水素の存在で反応させて水不溶性の着色化合物を
形成させればよい。ジアミノベンヂジンを使用した場合
には褐色物質が生成し、４−クロロナフトールを使用し
た場合には紫色物質が生成するので、目的に応じて適宜
選択すればよい。また、酵素としてアルカリホスファタ
ーゼを使用する場合には、基質としては５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリルホスフェート（BCIP) とニト
ロブル−テトラゾリウム（NBT)を用いて発色させて可視
化すればよい。以上の検出方法は、本発明のＤＮＡプロ
ーブの使用方法を説明する目的で例示的に挙げられたも
のであり、本発明のＤＮＡプローブの使用方法はこれら
に限定されることはない。例えば、本発明のＤＮＡプロ
ーブの本来の特性、すなわち菌根菌の核酸に固有の配列
に相補的に結合する性質を利用し、菌根菌の核酸の特異
配列とのみ作用する特異プライマーとして、核酸の合成
反応に関与することを確認してもよい。この際、核酸が
リボソームＲＮＡの場合には逆転写酵素の特異プライマ
ーとして、染色体ＤＮＡの場合にはＤＮＡポリメラーゼ
又は逆転写酵素の特異プライマーとして作用することを
確認すればよい。また、ＤＮＡポリメラーゼとして耐熱
性の酵素を使用する場合には、いわゆるＰＣＲ法により
目的の菌の核酸を大量に増幅し得るので、このような場
合には単なる蛍光染色によっても検出可能である。

【０００８】

【発明の効果】本発明のＤＮＡプローブは、菌根菌由来
の核酸のうち18Ｓr ＲＮＡや該ＲＮＡをコードするＤＮ
Ａに存在する菌根菌に固有の核酸配列に対して特異的に
結合するので、菌根菌を迅速かつ簡易に検出することが
できるので有用である。また、菌根菌の菌糸が松等の宿
主植物の根に活着ないし増殖しているか否かを正確に判
定することができる。

【実施例】以下に本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されること
はない。 実施例１ マツタケ菌検出用ＤＮＡプローブ １）挿入ＤＮＡの調製 マツタケ菌保存菌株IFONo.6918, No.6924 、及びホンシ
メジ菌分離菌株Ls.No.１を特開昭56-106524号公報記載
の培地（0.２５％酵母エキス、0.２５％バクトソイト
ン、２％ブドウ糖）に液体培養し、菌糸を培地一面に生
育させて菌糸を集菌した後、液体窒素により直ちに凍結
させた。その菌糸体を液体窒素中でホモジナイザー（日
本精機株式会社製）により毎分１万回転で粉砕した。粉
砕された菌糸体を、５容のＳＴＥ（Mol. Clon.記載の0.
1M NaCl, 10mM Tris・塩酸(pH8.0)/1mM EDTA) で抽出し
た。抽出液をフェノール処理した後、遠心分離でフェノ
ールを除去し、残ったフェノールをクロロフォルムで抽
出除去した。その後、２容のアルコールを加えてＤＮＡ
等を沈澱させ分離した。

【０００９】上記のＤＮＡ等を少量のＴＥ(10mM Tris・
塩酸(pH8.0)/1mM EDTA) に溶解し、ＤＮase を失活させ
たＲＮase ＡでＲＮＡを分解し、アルコールを２〜３容
加えてＤＮＡを沈澱させた後、沈澱を遠心分離した。Ｄ
ＮＡの沈澱を７０％のアルコールで洗浄して遠心分離し
た。沈澱を軽く真空乾燥し適当量のＴＥに溶解して鋳型
のＤＮＡとした。下記の表１に記載された２種のプライ
マー：

【表１】 プライマー１ ＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＣＣＧ （酵母１８Ｓr ＲＮＡ（１２６６−１２８０）に相当） プライマー２ ＣＣＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＴＡＣ （酵母１８Ｓr ＲＮＡc （１７９０−１７７５）に相
当、但しＣは相補鎖） 及び上記の鋳型ＤＮＡを用い、マツタケ菌他の１８Ｓr
ＲＮＡ遺伝子の部分ＤＮＡを９４℃で１分間、５５℃で
1.５分間、さらに７２℃で2.５分間にわたり４０サイク
ルのＰＣＲ反応で増幅した。一部を１％の寒天ゲルによ
る電気泳動で目的のＤＮＡ断片であることを確認し、残
余はガラス粉末（Gene clean：フナコシ株式会社製）の
吸脱着で精製した。バイオ１０１社（Bio101社）の標準
仕様（Double Gene Clean Method) に従い、ＤＮＡポリ
メラーゼＩとポリヌクレオチドキナーゼを用いて平滑化
と５’側燐酸付加を行い、ガラス粉末（Gene clean) の
吸脱着で精製した。

【００１０】２）ベクターの調製 市販のｐＵＣ１８ＤＮＡ（東洋紡株式会社製）５０μｇ
を、制限酵素ＳｍａＩ（２５０ユニット）を用いて３０
℃で１時間分解した。フェノール及びクロロホルム処理
を行った後、エタノール沈澱によりＤＮＡを精製した。
得られたＤＮＡを大腸菌のアルカリフォスファターゼ
（１６ユニット）を用いて６５℃で３０分脱燐酸分解し
た。フェノール及びクロロホルム処理の後、エタノール
沈澱又はガラス粉末（Gene clean) の吸脱着で精製し
た。 ３）ライゲーション反応 制限酵素ＳｍａＩで切断し脱燐酸したｐＵＣ１８ベクタ
ーＤＮＡ（約３３ng）と、ＰＣＲで増幅平滑化した５２
５塩基の挿入ＤＮＡを混合して凍結乾燥した。ライゲー
ション溶液Ａ（宝酒造株式会社のライゲーション キッ
ト）４μｌを加えよく溶解し、ライゲーション溶液Ｂ
（0.５μｌ）を加えて４℃で１６時間以上にわたり長時
間反応させた。 ４）トランスホーメーション 氷冷したプラスチックチューブ（Falcon2059) にライゲ
ーションした上記ＤＮＡを加え、凍結保存された大腸菌
コンピテントセルＤＨ５（東洋紡株式会社製）を氷水中
で融解した溶液５０μｌを加えて氷中で３０分間放置し
た。その後、４２℃のヒートショックを３０秒間行い、
氷水中で２分間放置した。ＳＯＣ培地（東洋紡株式会社
製ＤＨ５に添付の培地）４５０μｌを加えて、３７℃で
１時間振盪培養した。

【００１１】この間に、それぞれ２％のＸ−Ｇａｌ及び
ＩＰＴＧ５０μｌを、１％寒天平板、１００μｇ／mlア
ンピシリン入りＬＢ（１リットル中、バクトトリプトン
１０ｇ、バクト酵母エキス５ｇ、NaCl１０ｇを含む）平
板に塗布した。これらの寒天平板に上記の培養液２００
μｌを塗布し、３７℃で１晩培養した後、青色のコロニ
ーの中に散在する白色のコロニーを竹串で採取した。 ５）組み換えプラスミドの抽出精製 １５mlのプラスチックチューブ中に1.５mlの滅菌ＬＢ培
地を加え、上記の白色コロニーを植菌した後、３７度で
一晩培養した。培養混液を1.５mlのプラスチックチュー
ブに移して８０００回転で３分間遠心した。上澄液を注
意深く除去し、残渣に１０μｌの蒸留水を加えて懸濁し
た。それぞれ２００μｌの0.２ＮNaOH、１％ＳＤＳを加
え、チューブを上下に転倒させて穏やかに混合溶菌し
た。次に１８０μｌの３Ｍ酢酸ソーダ（pH5.２）を加え
て同様に混合し、析出した高分子を遠心分離した。上澄
を４００μｌ採取し、それぞれ２００μｌのフェノー
ル、クロロホルムを加えて良く攪拌した後、遠心分離し
た。上澄を分離し、２倍容のアルコールを加えて−２０
度以下で１０分間以上放置した後、遠心沈澱した。さら
に７０％のアルコールで良く洗浄した後、再度遠心分離
した。上澄を注意深く除去した後、残渣を短時間真空乾
燥した。 ６）挿入ＤＮＡの確認 上記のプラスミドＤＮＡを２０μｇ／mlのＲＮase １０
０μｌに溶解し、２μｌの該溶液をマイクロチューブに
とり、１０倍濃度のＨ緩衝液（１μｌ）、それぞれ0.５
μｌの制限酵素ＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩ溶液、蒸留水５
μｌを混合して３７度で２〜４時間にわたり分解した。
反応混液に着色指示薬２μｌを加えてエチジウムブロミ
ド（0.５μｇ／ml）を含有する寒天ゲルで電気泳動し
た。紫外線ランプの照射下で写真撮影を行い、目的の大
きさのＤＮＡが挿入されていることを確認した。

【００１２】７）塩基配列決定用プラスミドの増幅精製 目的の組換え体コロニーを３mlのＬＢ培地で一晩培養
し、集菌してリゾチーム溶液で処理した後、ＳＤＳ−Na
OHで溶菌させた。酢酸カリウム緩衝液で酸性にした後フ
ェノール処理し、エタノール沈澱によりプラスミドＤＮ
Ａを単離した。該ＤＮＡを少量のＴＥ溶液に溶解してＲ
Ｎase Ａで処理した後、２０％ＰＥＧ−2.５ＭNaClを３
／５容加えてプラスミドを沈澱させた。７０％エタノー
ルで洗った後、残渣を真空乾燥した。得られたＤＮＡを
少量のＴＥ溶液に溶解して塩基配列決定用のプラスミド
溶液とした。前記工程６と同様の操作によりアガロース
ゲル電気泳動を行い、挿入プラスミドを確認した。ま
た、ＩＰＴＧとＸgal の寒天平板でクロンの再確認をし
た。 ８）塩基配列の決定 上記のプラスミド溶液を１／４容の２ＮNaOHで変性させ
た後、３Ｍの酢酸ソーダ（pH4.５）３／８容で酸性と
し、３倍量のエタノールを加えて沈澱させた。７０％の
エタノールで洗って真空乾燥した。残渣を蒸留水に溶解
し、プライマーとアンニーリングバッファーを加えて６
５℃に２分間保ち、その後に徐冷してアンニーリングさ
せた。ラベリングミックス、³⁵Ｓラベル化ｄＣＴＰ、及
びＴ７−ＤＮＡポリメラーゼを加えてラベリング反応を
行った。予め分注した４種のシーケンスミックスにラベ
リング反応液を加えてシーケンス反応を行い、反応停止
液を加えて反応を停止させた。４６％の尿素を含む６％
のアクリルアミドゲルで電気泳動した後、Ｘ線フィルム
（Amersham,Hyper film MP) を用いてオートラジオグラ
フィを行い、現像フィルムから塩基配列を読み取った。
逆プライマーを使用して同様に塩基配列を読み取り、全
配列の決定を行った。

【００１３】９）特異配列の探索 上記の様にして決定したマツタケ菌とホンシメジ菌の１
８ＳのリボゾームＲＮＡをコードする遺伝子ＤＮＡの部
分塩基配列を用いて、ホモロジイ検索により相互に相違
する可変配列を探索した。 １０）配列特異オリゴヌクレオチドプローブの作成 上記の可変配列を中心にオリゴプローブとして最適の特
異配列を含む１０ないし１００塩基、好ましくは１５〜
２０塩基のＤＮＡ配列を設計して、オリゴヌクレオチド
を全自動のＤＮＡ合成機（ＡＢＩ３８０Ｂ）で合成した
（表２参照）。ポリヌクレオチドキナーゼを用いて得ら
れたオリゴヌクレオチドの５′末端を³²Ｐ放射性ラベル
した。 １１）マツタケ菌ＤＮＡプローブの特異性 前記工程１のＰＣＲで増幅したマツタケ菌及びホンシメ
ジ菌と、菌根菌由来ではないコントロールＤＮＡのＤＮ
Ａ部分鎖を、１％の寒天ゲルで電気泳動した後、ニトロ
セルローズフィルターにサザンブロット法により移行さ
せた。フィルターを１×ＳＳＣ（150 mM NaCl,15mMクエ
ン酸ナトリウム）で洗浄した後に風乾し、７５℃で２時
間乾熱した。ＤＮＡを固定したフィルターを、ハイブリ
ダイゼーション緩衝液（６×SSC ．５×デンハーツ液，
１％ SDS，200 μｇ／mlサケ精子DNA)を用いて３７℃で
６時間にわたりハイブリダイゼーションさせた。その
後、上記の³²Ｐ放射性ラベル化ＤＮＡプローブを加えて
３７℃でハイブリダイゼーションを行った。

【００１４】１％のＳＤＳ（Sodium Dodecyl Sulfate)
を含む２×ＳＳＣを用いて３７℃で３回洗浄し、Ｘ線フ
ィルム（アマシャムHyper film MP ）に対して１晩にわ
たりオートラジオグラフィを行い、マツタケ菌検出用Ｄ
ＮＡプローブがホンシメジ菌及びコントロールのＤＮＡ
部分鎖とクロス反応をしないことを確認した。 １２）各種の培養菌糸のＤＮＡを用いた特異性確認 松の根に菌根を作る可能性のある各種のキノコ菌（例え
ばアミタケやヌメリイグチ）の培養菌糸のＤＮＡを抽出
した。ＤＮＡが微量の場合には、必要に応じて工程１に
記載されたＰＣＲで増幅後、該ＤＮＡプローブが目的の
菌とのみ反応することを上記工程１１と同様の方法によ
り確認した。 １３）実地の試料によるプローブの実用性確認 マツタケ子実体及びマツタケ菌が寄主の植物である松の
根と形成するシロの土からＤＮＡを抽出し、上記の工程
１１と同様の方法でプローブの実用性を確認した。

【表２】 プローブ 塩基配列 ＭＰ１ ＡＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＣＡＡ ＭＰ２ ＴＣＡＡＡＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＧ ＭＰ３ ＡＧＣＴＴＣＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＧＧ

【００１５】実施例２ １）ビオチン標識化マツタケ菌検出用ＤＮＡプローブ作
成 実施例１の工程１０に記載されたＤＮＡプローブの合成
に際し、最終段階でビオチンホスホアミダイト（アマシ
ャム社製）を導入してＤＮＡプローブをビオチン標識化
した。 Ｂｉｏ−ＭＰ１ Biotin−ＡＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＣＡＡ Ｂｉｏ−ＭＰ２ Biotin−ＴＣＡＡＡＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＧ Ｂｉｏ−ＭＰ３ Biotin−ＡＧＣＴＴＣＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＧＧ ２）ビオチン標識化ＤＮＡプローブ特異性確認 実施例１の工程１１において、³²Ｐラベルのプローブの
代わりにビオチン標識化ＤＮＡプローブ（約0.５pmol／
cm² ）を使用した。サザンブロット後に乾燥したナイロ
ン膜を、ハイブリダイゼーション緩衝液（５×SSPE、５
×デンハーツ液、0.５％トリトンＸ−100 ）を用いて４
２℃で１５分予備処理し、上記のビオチン標識化ＤＮＡ
プローブを加えて更に４２℃で３時間にわたりハイブリ
ダイゼーションさせた。膜を４２℃で５分間にわたり、
洗浄液（５×SSPE、0.１％トリトンＸ−100 ）で２回洗
浄した。得られた膜を１μｌ／mlのストレプトアビジン
西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＢＲＬ）を含む緩衝液
（１Ｍ尿素，１％デキストラン硫酸，５％トリトンＸ−
100 ，PBS ）で３時間インキュベートした。同じ緩衝液
で５分間の洗浄を２回行った後、酵素反応緩衝液（0.１
Ｍクエン酸ナトリウム，pH５）を用いて膜を１回洗浄
し、次に、0.５mg／mlのＴＭＢ（テトラメチルベンヂジ
ン）を含む同一緩衝液で１０分間にわたりプレインキュ
ベーションを行なった。その後、３０％の過酸化水素水
（0.５μｌ／ml）を加えて発色させた。この結果、ビオ
チン標識化マツタケ菌検出用ＤＮＡプローブは、ホンシ
メジ菌及びコントロールＤＮＡ部分鎖とクロス反応をし
ないことが確認された。

【００１６】３）各種の培養菌糸のＤＮＡを用いた特異
性の確認 マツタケ菌およびホンシメジ菌の他に、マツタケのシロ
のできる環境に発生するキノコであるアミタケ菌、ヌメ
リイグチ菌、マツタケ菌の近縁菌であるアメリカマツタ
ケ菌、バカマツタケ菌、マツタケモドキ菌、ニセマツタ
ケ菌の培養菌糸のＤＮＡに対する特異性を、Ｐｌｅｘ検
出キット（ミリポア社製）を用いてミリポア社のマニュ
アルに基づいて確認した。実施例１の11）の工程に従っ
て、上記のキノコの培養菌糸のＤＮＡをＰＣＲで増幅し
た後、１％の寒天ゲルで電気泳動し、ナイロン膜 Immob
ilon-S（ミリポア社製）に一晩キャピラリーブロットし
て移行させた。ナイロン膜を７５℃で１５分間にわたり
真空乾燥した後、紫外線を照射してＤＮＡ断片を膜にク
ロスリンクさせ、Ｂｉｏ−ＭＰ１を６４℃でハイブリダ
イズさせた。洗浄液で２〜３回洗浄し、ストレプトアビ
ジン溶液で処理した後、洗浄液でさらに２〜３回洗浄し
て、ビオチンアルカリフォスファターゼ溶液で処理し
た。アルカリ性洗浄液で２〜３回洗浄し、基質のＬｕｍ
ｉｇｅｎ−ＰＰＤで発光させた。発光処理後、１５〜３
０分後にＸ線フィルム（ＦｕｊｉＲＸ）に２〜１０分感
光させた。現像処理により、マツタケ菌の２株とアメリ
カマツタケ菌のみに相当する箇所に黒化したバンドが出
現した。Ｂｉｏ−ＭＰ1 マツタケ特異プローブは、実用
に供しうる特異性の高いプローブであることが確認でき
た。Ｂｉｏ−ＭＰ１と同様にして、ナイロン膜にクロス
リンクした各種のキノコのＰＣＲ産物のＤＮＡ断片に対
して、Ｂｉｏ−ＭＰ２を５７℃で、Ｂｉｏ−ＭＰ３を５
２℃でそれぞれハイブリダイズさせ、同様に処理するこ
とにより各プローブの特異性を確認した。その結果、Ｂ
ｉｏ−ＭＰ２およびＢｉｏ−ＭＰ３は、共にマツタケの
発生環境に発生するホンシメジ、アミタケ、ヌメリイグ
チのＤＮＡとはほとんどハイブリダイズしないが、Ｂｉ
ｏ−ＭＰ２はマツタケ近縁菌のＤＮＡとほとんど同程度
にハイブリダイズし、Ｂｉｏ−ＭＰ３はマツタケ近縁菌
のＤＮＡと程度の差はあるがハイブリダイズすることが
確認された。

【００１７】実施例３ １）³²Ｐ標識化ホンシメジ検出用ＤＮＡプローブの作成 実施例１のマツタケ検出用ＤＮＡプローブと同様の方法
により、ホンシメジ菌に固有の配列を見いだし、該配列
に相補的なＤＮＡ配列を含むＤＮＡプローブを製造した
（表３参照）。その後、実施例１と同様の方法により該
ＤＮＡプローブを³²Ｐ標識化した。 ２）上記のＤＮＡプローブについて、実施例１の工程１
１と同様の方法によりホンシメジ菌に固有の核酸を検出
できるＤＮＡプローブであることを確認した。 実施例４ １）ビチオン標識化ホンシメジ検出用ＤＮＡプローブの
作成 実施例２と同様の方法により、ビオチン標識化ホンシメ
ジ検出用ＤＮＡプローブを製造した。 ２）実施例２の工程２と同様の方法により、ビオチン標
識化ホンシメジ菌検出用ＤＮＡプローブを核酸試料とハ
イブリダイゼーションし、洗浄後の膜をＢＲＬ社のキッ
ト（Photo Gene) を用いてブロックした後、ストレプト
アビジンアルカリホスファターゼとインキュベートし
た。検出試薬で処理した後、Ｘ線フィルム（アマシャム
Hyper Film) に対して３０分間露光して現像した。この
結果、本発明のホンシメジ菌検出用ＤＮＡプローブはマ
ツタケ菌及びコントロールＤＮＡと交差しないＤＮＡプ
ローブであることが確認できた。

【表３】 プローブ 塩基配列 ＳＰ１ ＡＧＣＣＧＧＣＧＡＣＣＡＧＣＣＧＡＡ ＳＰ２ ＴＣＣＣＣＧＡＡＧＣＣＧＧＴＣＣＧＡＡＧ ＳＰ３ ＡＡＣＴＴＣＣＣＡＧＣＡＡＣＧＧＧＧ

【００１８】実施例５ 下記のマツタケ特異プライマーを製造した。 ｃＭＰＲ１ ＧＧＣＴＴＴＴＧＣＴＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣ ＭＰＲ２ ＧＧＣＴＣＣＴＣＡＡＡＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧ ＭＰＲ３ ＧＣＴＴＣＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＧＧＴＧＣＣ ｃＭＰＲ１はＭＰ１のマツタケ特異塩基配列を含む配列
の相補配列を有するＤＮＡである。ｃＭＰＲ１、ＭＰＲ
２、およびＭＰＲ３は、ＰＣＲのプライマーとして有効
に作用するように、３′末端にＧ、Ｃが連続しているＤ
ＮＡである。 １）マツタケ特異プライマーｃＭＰＲ１とＭＰＲ２によ
るＰＣＲ プライマーｃＭＰＲ１とＭＰＲ２の組み合わせによるＰ
ＣＲを、マツタケ菌の２株とその近縁菌アメリカマツタ
ケ菌、バカマツタケ菌、マツタケモドキ菌、ニセマツタ
ケ菌、および菌根菌のアミタケ菌、ホンジメジ菌、ヌメ
リイグチ菌、腐生菌のエノキタケ菌、マンネンタケ菌、
ナメコ菌のＤＮＡを鋳型にして、９５℃の変性１分、６
５℃のアニール1.５分、７２℃の伸長反応2.５分の条件
で３５サイクル行った。ＰＣＲの結果増幅された３４３
塩基対のＤＮＡ断片を１％の寒天ゲルで電気泳動し、エ
チジウムブロマイドで染色した後、紫外線照射下でＤＮ
Ａ断片の有無を目視し、さらに写真撮影することにより
確認した。この結果、ＰＣＲにおいてマツタケ特異プラ
イマーｃＭＰＲ１とＭＰＲ２を組み合わせて用いると、
マツタケ近縁菌のＤＮＡはマツタケ菌とほぼ同等に増幅
されるが、他の菌根菌および腐生菌のＤＮＡは、ほとん
ど増幅されないことが認められた。

【００１９】２）マツタケ特異プライマーｃＭＰＲ１と
ＭＰＲ３によるＰＣＲ 上記のキノコ菌のＤＮＡを鋳型にして、９５℃の変性１
分、７３℃のアニール伸長反応３分の条件で３５サイク
ルのＰＣＲを行った。ＰＣＲの結果増幅された３７０塩
基対のＤＮＡ断片を上記と同様に確認した。この結果、
マツタケ特異プライマーｃＭＰＲ１とＭＰＲ３の組み合
わせを用いた極めて高いアニール温度を特徴とするＰＣ
Ｒでは、菌根菌および腐生菌のＤＮＡはほとんど増幅さ
れず、また、マツタケ近縁菌についてもアメリカマツタ
ケ菌のＤＮＡを除いて明らかにマツタケ菌のＤＮＡと増
幅の度合いが異なることが認められた。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：rＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AGCCAGCGGC CAGCAA 配列番号：２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：rＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TCAAAGCCAA TCCGGAG 配列番号：３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：rＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AGCTTCTCAG CAATAAGG 配列番号：４ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：rＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AGCCGGCGAC CAGCCGAA 配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：rＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TCCCCGAAGC CGGTCCGAAG 配列番号：６ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：rＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AACTTCCCAG CAACGGGG 配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：rＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GGCTTTTGCT GGCCGCTGGC 配列番号：８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：rＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GGCTCCTCAA AGCCAATCCG G 配列番号：９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：rＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GCTTCTCAGC AATAAGGTGC C

フロントページの続き (56)参考文献 Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｓｏｉｌ，Ｖｏ ｌ．116，ｐ．１−７（1989) Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｅｃｏｓｙ ｓｔｅｍｓ Ｅｎｖｉｒｏｎ．，Ｎｏ. 28，ｐ．431−435（1989)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１〜３から選択されるDNA塩
   基配列からなるマツタケ菌検出用DNAプローブ。
2. 【請求項２】 配列番号：１〜３から選択されるDNA塩
   基配列の相補鎖であるマツタケ菌検出用DNAプローブ。
3. 【請求項３】 配列番号：７〜９から選択されるDNA塩
   基配列からなるマツタケ菌検出用DNAプローブ。
4. 【請求項４】 配列番号：７〜９から選択されるDNA塩
   基配列からなる、マツタケ菌DNAをPCR法により増幅して
   マツタケ菌を検出するためのプライマー。