DE4218669C1 - - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das in den Ansprüchen 15 bis 17 angegebene Protein mit der biologischen Aktivität einer β-Untereinheit eines Na⁺/Glucose-Cotransporters sowie ein Nuklearsäurefrag­ ment nach den Ansprüchen 1 bis 8, das eine Nukleotidsequenz enthält, die für selbiges Protein kodiert. Weiterhin betrifft die Erfindung einen rekombinanten Vektor, nach den Ansprüchen 9 bis 12, der das Nukleinsäurefragment ent­ hält, sowie eine Wirtszelle, nach den Ansprüchen 13 und 14, die diesen Vektor enthält. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstel­ lung des Proteins nach Anspruch 18 und die Verwendung obigen Proteins nach den Ansprüchen 19 bis 21.

Na⁺/Glucose-Cotransporter kommen bei Säugetieren bei­ spielsweise in Niere und Darm vor. Im Darm ist das Trans­ portprotein für die Glucoseaufnahme aus der Nahrung ver­ antwortlich. In der Niere transportiert es die filtrierte Glucose wieder ins Blut zurück. Wegen des unterschiedli­ chen Nahrungsangebotes im Darm und der unterschiedlichen Glucosekonzentration in den verschiedenen Abschnitten des Nierentubulus muß die Aktivität des Na⁺/Glucose- Cotransportproteins reguliert werden.

Es wurde gezeigt, daß der Na⁺/Glucose-Cotransporter Glucose sowohl bei sehr niedrigen als auch bei sehr hohen Glucosekonzentrationen effektiv transportieren kann.

Die Transporteigenschaften des Transportproteins können spezifisch innerhalb verschiedener Nierenabschnitte entsprechend den biologischen Erfordernissen reguliert werden. Eine Übersicht über die Transporteigenschaften verschiedener Glucosetransporter befindet sich in Annu. Rev. Biochem. 60, S. 757 ff, 1991.

Von Ikeda et al. wurde ausgehend von aus Kaninchendarm isolierter RNA ein Gen kloniert, das für ein Protein ko­ diert, welches in der Lage ist, Na⁺ zusammen mit Glucose zu transportieren (Ikeda T.S. et al., Membrane Biol. 110, 87-95, 1989). Weiterhin wurde das Gen für ein humanes Pro­ tein mit Na⁺/Glucose-Cotransporteigenschaften kloniert und als SGLT1 bezeichnet. Die Kaninchen- und humanen Klone be­ sitzen 85% Homologie auf Proteinebene. Die von diesen Genen kodierten Proteine führen einen Na⁺-abhängigen Glu­ cosetransport durch, der jedoch nicht regulierbar ist. Werden die Gene in Xenopus-Oocyten (Ikeda T.S. et al., Membrane Biol. 110, 87-95, 1989) oder Zellkulturzellen (Birnir, B. et al., Biochim. biophys. Acta 1048, 100-104, 1990) exprimiert, so findet man andere Transporteigen­ schaften als unter in vivo Bedingungen. Offensichtlich stellen die bekannten nicht regulierbaren Proteine nur einen Teil des kompletten regulierbaren Na⁺/Glucose- Cotransporters dar. Sie werden im folgenden als α-Untereinheiten bezeichnet.

Es würde einen großen medizinischen Fortschritt bedeuten, wenn man die Aktivität des Na⁺/Glucose-Cotransporters ge­ zielt beeinflussen könnte. So würde eine Hemmung des Na⁺/Glucose-Cotransporters im Darm die Glucoseaufnahme verhindern oder drastisch reduzieren. Dies wäre beispiels­ weise bei Diabetikern wünschenswert, da es den Bedarf an Insulin verringern und eine Lockerung der Diätvorschriften für den Diabetiker ermöglichen würde.

Eine Hemmung des Na⁺/Glucose-Cotransporters in der Niere könnte ebenfalls beim Diabetiker eingesetzt werden, um die bei der Insulintherapie erzielte Regulation des Blutgluco­ sespiegels zu verbessern. Dies wäre unter anderem deshalb wichtig, weil die bei Diabetes auftretenden Spätschädigun­ gen oft auf bisher nicht zu verhindernde, intermediär auf­ tretende Erhöhungen des Blutzuckerspiegels zurückzuführen sind. Bei einer Hemmung des Na⁺/Glucose-Cotransporters in der Niere käme es zu einer vermehrten Glucoseausscheidung im Harn und somit zu einer Verringerung der Glucosekonzen­ tration im Blut.

Eine Hemmung des Na⁺/Glucose-Cotransporters in Darm und Niere würde weiterhin zu einer erniedrigten Energieaufnah­ me im Darm und zu einem erheblichen Energieverlust in der Niere führen. Die Regulation der Transportleistung des Na⁺/Glucose-Cotransporters könnte somit auch in der Thera­ pie von Fettsucht eingesetzt werden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Protein bereitzustellen, das eine Regulation der Aktivität von Na⁺/Glucose-Cotransportern ermöglicht.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Pro­ tein mit der biologischen Aktivität einer β-Untereinheit eines Na⁺/Glucose-Cotransporters, das kodiert wird durch eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus einer DNA-Sequenz, die für die Aminosäuresequenz der Fig. 6 kodiert, und aus­ gewählt aus Nukleinsäuresequenzen, die mit dieser Sequenz hybridisieren und für ein Protein mit der biologischen Ak­ tivität der β-Untereinheit eines Na⁺/Glucose-Cotranspor­ ters kodieren.

Eine weitere Aufgabe besteht darin, ein Nukleinsäurefrag­ ment bereitzustellen, das für ein Protein der eingangs ge­ nannten Art kodiert.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Nuk­ leinsäurefragment, enthaltend eine Nukleotidsequenz, aus­ gewählt aus einer DNA-Sequenz, umfassend die Sequenz von Nukleotidposition 1 bis 4529 der Fig. 6, und ausgewählt aus Nukleinsäuresequenzen, bevorzugt DNA-Sequenzen, die mit der Sequenz aus Fig. 6 hybridisieren und für ein Pro­ tein mit der biologischen Aktivität der β-Untereinheit eines Na⁺/Glucose-Cotransporters kodieren.

Eine weitere Aufgabe besteht darin, einen rekombinanten Vektor, enthaltend das oben genannte Nukleinsäurefragment, bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch einen Vektor gemäßt Anspruch 9.

Eine weitere Aufgabe besteht darin, eine Wirtszelle zur Verfügung zu stellen, die den oben genannten Vektor ent­ hält.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Wirtszelle gemäß Anspruch 13.

Eine weitere Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung des eingangs genannten Proteins bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Ver­ fahren, umfassend Kultivieren einer Wirtszelle, enthaltend den oben genannten rekombinanten Vektor, und Isolieren des exprimierten Proteins.

Die Erfindung wird nachfolgend mit Bezug auf die Figuren 1 bis 8 näher erläutert.

Fig. 1: In vitro-Expression eines einzelnen Polypeptids durch Plasmid P20, wobei das Polypeptid spezifisch mit dem monoklonalen Antikörper R4A6 reagiert. Retikulozytenlysat mit (c, d) oder ohne L-(³⁵S)Methionin (a, b, e, f, g) wurde gemischt mit Wasser (P20 -) oder mit P20-cRNA (P20 +), bei 37°C inkubiert, und die Proben wurden für die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) verwen­ det. Das Gel wurde getrocknet und autoradiographiert (c, d), oder die Proteine wurden auf Nitrozellulose überführt und entweder mit Amidoschwarz gefärbt (a, b) oder dem mo­ noklonalen Antikörper R4A6 (e, f) oder einem IgM Antikör­ per als Kontrolle (g) exponiert.

Fig. 2: Verschiedene Effekte von P20 auf den Na⁺/Glucose- Cotransport in Xenopus-Oozyten mit hoher und niedriger en­ dogener Transportaktivität. Xenopus laevis-Oozyten mit niedriger Aktivität des vom Na⁺-Gradienden abhängigen D-Glucosetransports oder Methyl-α-D-Glucopyranosid (AMG)-Transports (a, b) und solche mit hoher Aktivität des endogenen Transports (c, d) wurden mit 50 µl Wasser (c) oder mit 50 µl Wasser, enthaltend 0,3 ng P20-cRNA, (P20) injiziert. Nach 48 h (18°C) Inkubation wurde die Aufnahme von 50 µM D-Glucose und von 50 µM AMG in der Anwesen­ heit bzw. Abwesenheit von Na⁺ gemessen. Ein repräsentati­ ves Experiment ist gezeigt. Na⁺-abhängige Aufnahmeraten von 10 Oozyten sind als Mittelwert +/- s.e.m. (Standardabweichung/n, wobei n = Zahl der Einzelmessungen angegeben.)

Fig. 3: Abhängigkeit des AMG-Transports, exprimiert in Xenopus-Oozyten, von der Menge an injizierter SGLT1-cRNA (a) und P20-cRNA, die mit SGLT1-cRNA (b, c) koinjiziert wurde. In (a) wurden verschiedene Mengen an SGLT1-cRNA injiziert, in b) wurden 0,15 ng SGLT1-cRNA pro Oozyte zusammen mit verschiedenen Mengen P20-cRNA injiziert, und in c) wurden 1,2 ng SGLT1-cRNA und verschiedene Mengen P20-cRNA injiziert.

Fig. 4: Vergleich der Glucoseabhängigkeit des Na⁺/Glucose-Cotransports nach Expression von SGLT1-cRNA oder von stöchiometrischen Mengen an SGLT1-cRNA und P20-cRNA.

Verschiedene Mengen an SGLT1-cRNA wurden allein pro Oozyte (a, 0,145 ng; b, 0,5 ng; c, 1,2 ng) injiziert oder zusammen mit einer stöchiometrischen Menge an P20-cRNA (a, 0,51 ng; b, 1,75 ng; c, 4,2 ng). In der Anwesenheit von Na⁺ und verschiedenen AMG-Konzentrationen wurde die AMG-Aufnahme in Oozyten, die mit cRNA und mit Wasser injiziert wurden, gemessen, und die exprimierten Aufnahmeraten wurden errechnet (Mittelwert +/- s.e.m. von 8 bis 10 Oozyten sind gezeigt). Die geraden Linien wurden angepaßt unter der Annahme, daß 1 Transportstelle vorhanden ist, während die Kurven unter der Annahme errechnet wurden, daß 2 Glucosetransportstellen vorhanden sind. Offene Symbole stellen Werte dar, die nach Injektion von SGLT1-cRNA allein erhalten wurden. V_max in pMol·mg^-1 x h^-1: (a Einfügung) 15,5 +/- 0,35, (b) 176,9 +/- 2,2, (c) 570,2 +/- 10,5; K_0,5 in µM: (a Einfügung) 117 +/- 6; (b) 122 +/- 3; (c) 126 +/- 5. Geschlossene Symbole stellen Werte dar, die nach Koinjektion von SGLT1-cRNA und P20- cRNA erhalten wurden. V_max (hohe Affinität) in pMol· Oocyte^-1·h^-1: (a) 116,0 +/- 2,5; (b) 56,5 +/- 1,0; (c) 66,5 +/- 3,5; V_max (niedrige Affinität) in pMol·Oocyte^-1 ·h^-1: (a) 454,0 +/- 1,0; (b) 513,5 +/- 1,5; (c) 502,0 +/- 44,0; K_0,5 (hohe Affinität) in µM: (a) 28,5 +/- 0,6; (b) 16,7 +/- 1,1; (c) 21,4 +/- 3,0; K_0,5 (niedrige Affinität) in mM: (a) 1,88 +/- 0,08; (b) 0,91 +/- 0,03; (c) 1,37 +/- 0,14.

Fig. 5: Vergleich der Glucoseabhängigkeit des Na⁺/Glucose-Cotransports nach Expression von SGLT1-cRNA oder von SGLT1-cRNA mit einem Überschuß an P20-cRNA. 0,3 ng SGLT1-cRNA (o) oder 0,3 ng SGLT1-cRNA + 8,5 ng P20-cRNA (·) wurden pro Oozyte injiziert. Die exprimierten Aufnahmeraten wurden wie in Fig. 4 gemessen und dargestellt. Injektion von SGLT1: V_max = 110 +/- 6 pMol· Oocyte^-1·h^-1, Km = 96 +/- 5 µM; Injektion von SGLT1 + P20: V_max = 124 +/- 7 pMol·Oozyte^-1·h^-1; Km = 92 +/- 5µM.

Fig. 6: Nukleotidsequenz und mutmaßliche Aminosäurese­ quenz von P20. Eine mögliche Translationsstartstelle (Nuk­ leotide 118 bis 127) und zwei Konsensus-Polyadenylie­ rungssignale (Nukleotide 1861-1866, 2922-2927) sind unterstrichen. Am C-Terminus sind 15 Aminosäuren einge­ rahmt, die eine membranüberspannende α-Helix bilden kön­ nen. Sechs potentielle N-Glycosylierungsstellen sind durch Kreise gekennzeichnet.

Fig. 7: Die Abbildung zeigt Gefrierschnitte durch den animalen Pol von Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis, die mit einem gegen die β-Untereinheit gerichte­ ten, monoklonalen Antikörper entwickelt wurden (R4A6). Der Antikörper wurde mit einer fluoreszierenden Substanz mar­ kiert und dann im Fluoreszensmikroskop nachgewiesen:

• a) zeigt eine Oozyte nach Injektion von cRNA, die für die α-Untereinheit kodiert. Hier sieht man eine schwache Antikörperreaktion in der Plasmamembran. Dies deutet darauf hin, daß die Oozyte eine endogene β-Untereinheit (P20-Protein) besitzt, die zusammen mit der zusätzlich exprimierten α-Untereinheit in die Membran eingebaut wird.
• b) zeigt eine Oozyte nach Koinjektion von cRNA der α-Untereinheit (SGLT1) und cRNA der α-Untereinheit (P20). Hier reagiert der gegen die β-Untereinheit gerichtete An­ tikörper deutlich mit der Plasmamembran.
• c) zeigt eine Kontrolloozyte, die mit Wasser injiziert wurde. Hier reagiert der Antikörper nicht.

Fig. 8: Die Abbildung zeigt einen Versuch, in dem nachge­ wiesen wird, daß die regulatorische β-Untereinheit des Na⁺/D-Glucose-Cotransporters auch im Dünndarm vorkommt. Mit von der Sequenz des P20-Klons abgeleiteten Oligonu­ kleotidprimern, welche den Positionen 793-811 (5′ GCTTTTG- GTCATTAGTAGT 3′) bzw. 1562-1578 (3′ GGATGTATTGGTACCTT 5′, Gegenstrang) in Fig. 6 entsprechen, wurden Polymerasekettenreaktionen an mRNA aus der Schweineniere (b), an mRNA aus dem Schweinedarm (c), an mRNA aus Schwei­ nemuskel (d) und an einer Kontrolle ohne mRNA (e) durchge­ führt; (a) zeigt den Molekulargewichtsmarker mit Fragment­ größe von 1150 bp, 1000 bp, 680 bp und 490 bp als untere 4 Banden. Der linke Teil der Abbildung (A) zeigt ein mit Ethidiumbromid gefärbtes Agarosegel, auf dem die entstan­ denen Reaktionsprodukte aufgetrennt wurden. Der rechte Teil der Abbildung (B) zeigt einen Parallelversuch, in dem die im Agarosegel getrennten Produkte auf Nylonfolie über­ tragen wurden und dann mit einem ebenfalls von der Sequenz des P20 abgeleiteten, aber in diesem Falle radioaktiv mar­ kierten Oligonukleotid, hybridisiert wurden. (Das radioak­ tiv markierte Oligonukleotid stammte aus der Region zwi­ schen den beiden zur PCR-Reaktion eingesetzten Oligonu­ kleotidprimern). Der Versuch zeigt, daß unter Benutzung der mRNA aus Schweineniere und Schweinedarm Transkripte der erwarteten Länge (786 bp) entstehen. Er beweist, daß im Schweinedarm ein Protein vorliegt, das der aus der Nie­ re klonierten β-Untereinheit sehr ähnlich oder mit diesem identisch ist.

Zum Isolieren des erfindungsgemäßen Proteins wurde ein monoklonaler Antikörper verwendet, der gegen den Na⁺/ Glucose-Cotransporter aus Schweineniere gerichtet ist, aber nicht mit dem bereits bekannten SGLT1-Protein rea­ giert. Dieser Antikörper (R4A6) stimuliert die Na⁺-abhängige Phlorizinbindung in Schweineniere und Rat­ tendarm (Haase, W. et al., Eur. J. Cell Biol. 52, 297-3009, 1990; Koepsell, H. et al., J. Biol. Chem. 263, 18419-18429, 1988). Er bindet bei Ratte, Schwein, Kanin­ chen und beim Menschen an ein Polypeptid mit einem Moleku­ largewicht von ungefähr 75 000, welches sich in der Bür­ stensaummembran von proximalen Nierentubuli befindet. Das antigene Polypeptid des R4A6 zeigt eine ähnliche immun­ histochemische Verteilung wie andere Antikörper, die gegen den Na⁺/Glucose-Cotransporter gerichtet sind (Haase, W. & Koepsell, H., Eur. J. Cell Biol 48, 360-374, 1989; Takata, K. et al., Histochem. Cytochem. 39, 287-298, 1991).

Mit dem oben genannten monoklonalen Antikörper R4A6 wurde eine cDNA-Expressionsbank abgesucht, die ausgehend von RNA aus Schweinenierenrinde hergestellt worden war. Ein positiver Klon (P20) mit einem cDNA Insert mit einer Länge von 4,5 kb wurde isoliert.

P20 hybridisiert nicht mit SGLT1-cDNA und mit cDNAs, die für Na⁺-unabhängige Glucosetransporter kodieren (James, D.E. et al., Nature 338, 83-87, 1989; Celenza, J.L. et al., Proc. Natn. Acad. Sci. U.S.A. 85, 2130-2134, 1988; Mueckler, M. & Lodish, H.F., Cell 44, 629-637, 1986).

P20 wurde unter Verwendung eines üblichen Retikulozyten­ lysats in vitro translatiert, um die Größe des von P20 ko­ dierten Polypeptids abzuschätzen und die Reaktivität gegen Kontrollantikörper zu testen. Nach Zugabe von P20-cRNA zu dem Retikulozytenlysat wurde ein einziges Polypeptid syn­ thetisiert, welches im SDS-Polyacrylamidgel bei einem appa- renten Molekulargewicht von 70 000 läuft und spezifisch mit dem monoklonalen Antikörper R4A6 reagiert (Fig. 1).

P20-cRNA wurde in Xenopus laevis-Oozyten injiziert, um die Wirkung des durch P20 kodierten Polypeptids auf den endo­ genen Na⁺/Glucose-Cotransport zu bestimmen. Übereinstim­ mend mit früheren Beobachtungen (Weber, W.-M. et al., Mem­ brane Biol. 111, 93-102, 1989) variiert der endogene Na⁺/Glucose-Cotransport beträchtlich in Abhängigkeit der verschiedenen Oozytenpräparationen. Folglich variierten die vom Na⁺-Gradienten abhängigen Aufnahmeraten von 50 µM D-Glucose bzw. Methyl-α-D-Glucopyranosid (AMG) zwi­ schen 0,5 +/- 0,1 bzw. 0,4 +/- 0,05 pMol·Oozyte^-1·h^-1 und 38 +/- 4 bzw. 1,9 +/- 0,2 pMol·Oocyte ·h^-1. Nach Injektion von 0,1 bis 0,5 ng P20-cRNA pro Oozyte war dann die vom Na⁺-Gradienten abhängige Aufnahme von 50 µM D-Glucose oder AMG erhöht, wenn die vom endogenen Na⁺-Gradienten abhängige D-Glucoseaufnahme (50 µM) von Oozyten, die mit Wasser injiziert wurden, niedriger war als 1,5 pMol·Oozyte 1·h^-1. Die Aufnahmerate war jedoch erniedrigt, wenn die endogene Aufnahme größer war als 9 pMol·Oozyte^-1·h^-1 (Fig. 2). Diese Effekte wurden auch beobachtet, wenn cRNA injiziert wurde, die nur von den Nukleotiden 1 bis 1826 von P20 kodiert wird (Fig. 6). Keine Effekte auf den endogenen Na⁺/Glucose-Cotransport wurden beobachtet, wenn Antisinn-cRNA von P20 injiziert wurde, oder wenn die Oozyten nach Injektion von Sinn-cRNA nur 3 h inkubiert wurden. Zum Testen der Spezifität wurden die Effekte von P20-cRNA auf den endogenen Na⁺ -L-Glutamat-Cotransport (Steffgen, J. et al., Biochim. Biophys. Acta 1066, 14-20, 1991) und auf die Na⁺/K⁺-Pumpe (Schmalzing, G. et al., W. Biochem. J. 297, 329-336, 1991) gemessen. Weder die vom Na⁺-Gradienten abhängige Aufnahme von L-Glutamat (gemessen bei verschiedenen Glutamat-Konzentrationen) noch die Ouabainbindung an die (Na⁺/K⁺)- ATPase oder die durch Ouabain-hemmbare Rb⁺-Aufnahme durch die (Na⁺/K⁺)- ATPase war verändert.

Weiterhin wurde untersucht, ob die Expression des Na⁺/Glucose-Cotransports durch Injektion von SGLT1-cRNA in Xenopus-Oozyten durch gleichzeitige Injektion von P20-cRNA verändert wurde. Die Injektion von SGLT1-cRNA in Oozyten führte zu einer drastischen Stimulation der AMG- und D-Glucoseaufnahme in der Anwesenheit von 110 mM Na⁺. Die Aufnahmeraten wurden um mehr als 95% bzw. 98% reduziert, wenn Na⁺ durch Tetramethylammonium ersetzt wurde bzw. wenn 100 µM Phlorizin zugegeben wurde.

Fig. 3a zeigt die Korrelation zwischen AMG-Transport und der Menge an injizierter SGLT1-cRNA. Koinjektionen von P20-cRNA mit SGLT1-cRNA, die mit vielen verschiedenen Oozytenpräparationen durchgeführt wurden, zeigten, daß die Effekte von P20 abhängig waren von der Gesamtmenge an injizierter SGLT1-cRNA und von dem Verhältnis zwischen der Menge an injizierter SGLT1-cRNA und P20-cRNA. P20-cRNA stimulierte den Transport von 50 µM AMG zwischen 2 bis 25-fach, wenn 0,2 ng oder weniger SGLT1-cRNA pro Oozyte injiziert wurden (10 Experimente, Molare Verhältnisse von P20-cRNA zu SGLT1-cRNA von 1,8 bis 4,5). Wenn die Menge der pro Oozyten injizierten SGLT1-cRNA und P20-cRNA zwischen 0,7 und 1,5 ng betrug, inhibierte die Koinjektion von P20-cRNA den Transport von 50 µM AMG zwischen 39% und 87% (s.e.m. 7%) (15 Experimente, Molare Verhältnisse von P20-cRNA zu SGLT1-cRNA von 1,6 bis 3,1). Bei der Messung der Aufnahme bei verschiedenen molaren Verhältnissen zwischen injizierter SGLT1-cRNA und P20-cRNA wurde bei ungefähr demselben stöchiometrischen Verhältnis zwischen den cRNAs eine maximale Stimulierung und Inhibierung der AMG-Aufnahme festgestellt (Fig. 3b, c). Dies ist ein deutlicher Hinweis darauf, daß die beobachteten, stimulierenden und inhibierenden Effekte aus einer spezifischen Wechselwirkung von SGLT1 und P20 hervorgehen, wobei angenommen werden darf, daß diese Wechselwirkung auf Proteinebene stattfindet, da beide Klone keine Nukleotidsequenzhomologie aufweisen.

Für die Bestimmung, ob die Wechselwirkung zwischen SGLT1 und P20 im Zytoplasma stattfindet und/oder ob das P20-Protein und SGLT1-Protein in der Plasmamembran wechselwirken, wurden die funktionellen Eigenschaften des Na⁺/Glucose-Cotransports verglichen, der durch SGLT1 und durch SGLT1 + P20 exprimiert wird.

Fig. 4 zeigt die Glucoseabhängigkeit der AMG-Aufnahme nach Injektion dreier verschiedener Mengen an SGLT1-cRNA allein und nach Koinjektion von SGLT1-cRNA mit einer fest­ gelegten stöchiometrischen Menge an P20-cRNA. Nach Injek­ tion verschiedener Mengen SGLT1-cRNA wurden Michaelis-Menten-Kinetiken mit K_m-Werten zwischen 96 +/- 5 und 126 +/- 5 µM erhalten. Mit ansteigenden Mengen inji­ zierter SGLT1-cRNA erhöhte sich V_max des Transports, wo­ hingegen der Km-Wert konstant blieb. Dies deutet darauf hin, daß die Eigenschaften des von SGLT1 exprimierten Transporters unabhängig von der Transporterdichte in der Membran sind. Die Koinjektion einer festgelegten stöchio­ metrischen Menge an P20-cRNA und SGLT1-cRNA hat zwei Ef­ fekte: 1. Einen Anstieg der Anzahl an funktionellen Trans­ portern (Anstieg von V_max), wenn niedrige Mengen an SGLT1-cRNA injiziert wurden, was zu einer submaximalen Ex­ pression führt (Fig. 4a, b). 2. Eine funktionelle Ände­ rung des Transporters in der Membran, was auf die Erzeu­ gung von Transportstellen mit hoher und niedriger Affini­ tät hinweist (Fig. 4a, b, c).

Folglich wurden mit verschiedenen Mengen einer stöchiome­ trischen Mischung von SGLT1-cRNA und P20-cRNA AMG-Transportstellen mit hoher und niedriger Affinität mit K_0,5-Werten von 17 bis 29 µM und 0,9 bis 1,9 µM erhalten (Fig. 4a, b, c). Die Expression einer Art von Glucosebin­ dungsstellen durch SGLT1 und von zwei Arten von Glucose­ bindungsstellen durch SGLT1 +/- P20 wurde gezeigt durch Wechselwirkung des kompetitiven Inhibitors Phlorizin mit Glucosebindungsstellen auf der extrazellulären Seite des Transporters (Koepsell, H. et al. , Membrane Biol. 114, 113-132, 1990). Nach Injektion von SGLT1-cRNA wurde eine Stelle für die Hemmung des AMG-Transports durch Phlorizin beobachtet (K_i = 5,0 +/- 0,1 µM), wohingegen Hemmungs­ stellen hoher und niedriger Affinität (K_i (hohe Affinität) = 0,27 +/- 0,01 µM, K_i (niedrige Affinität) = 29 +/- 6 µM) nach Injektion einer festgelegten stöchiometrischen Menge an SGLT1-cRNA und P20-cRNA unterschieden wurden.

Diese Werte zeigen, daß das SGLT1-Protein und das P20-Protein in der Membran wechselwirken. Die theoretische Möglichkeit, daß P20 die Funktion von SGLT1 indirekt über das Membranpotential oder über die Na⁺-Konzentration in den Oozyten verändert, kann dadurch ausgeschlossen werden, daß das Membranpotential und die intrazelluläre Na⁺-Konzentration in der Anwesenheit von Glucose durch P20-cRNA nicht verändert wurde. Die Beobachtung, daß P20-cRNA die durch SGLT1 exprimierte AMG-Aufnahme nicht verändert, wenn ein Überschuß an P20-cRNA koinjiziert wurde (Fig. 3b, c), ist ein Hinweis dafür, daß zwei P20-Polypeptide mit dem SGLT1-Protein (wahrscheinlich mit einem Dimer) wechselwirken, und daß die oben beschriebenen Effekte auf die Transporterkonzentration in der Membran und auf die Funktion der Transporter durch die Wechselwirkung eines P20-Polypeptids auf das SGLT1-Dimer hervorgerufen werden.

Das Experiment in Fig. 5 stimmt mit dieser Hypothese überein. Nach Koinjektion von SGLT1-cRNA und einem Über­ schuß an P20-cRNA wurde keine signifikante Stimulierung von V_max beobachtet, und die Glucoseabhängigkeit war unge­ fähr die gleiche wie nach Injektion von SGLT1-cRNA allein.

Weiterhin konnte im Rahmen der Erfindung nachgewiesen wer­ den, daß die vom Klon P20 kodierte β-Untereinheit an der diätischen Regulation des Na⁺/Glucose-Cotransporters be­ teiligt ist:

Mit RNA-Proben, die aus dem Dünndarm von a) zwei Wochen alten Schafen während der Stillzeit, b) von erwachsenen Schafen (2 Jahre alt) und c) von erwachsenen Schafen, die mit D-Glucose infundiert worden waren, isoliert worden wa­ ren, wurden Polymerasekettenreaktionen durchgeführt. Als Oligonukleotidprimer wurden die in der Legende zur Fig. 8 beschriebenen Primerpaare verwendet. Dabei ergab sich, daß nur bei den jungen Schafen (Gruppe a) und bei den mit Glu­ cose infudierten erwachsenen Schafen (Gruppe c) Reaktions­ produkte mit der zu erwartenden Länge entstanden.

Da von Shirazi-Beechey et al. (Journal of Physiology 437, 699-708, 1991) gezeigt werden konnte, daß der Na⁺-D-Glu­ cose-Cotransport im Darm von Schafen durch die zugeführte Nahrung reguliert wird, bedeutet das erzielte Ergebnis, daß die Menge der P20-mRNA unter in vivo-Bedingungen mit der Aktivität des Na⁺/Glucose-Cotransporters korreliert.

Die Nukleotidsequenz und die daraus abgeleitete Aminosäu­ resequenz von P20 ist in Fig. 6 gezeigt. Das offene Lese­ raster (ORF) beginnt an der EcoRI-Klonierungsstelle bei Nukleotidposition 1 und ist identisch mit dem offenen Le­ seraster eines β-Galaktosidase-Fusionsproteins in λ Zap-Phagen (Short, J.M. et al., Nucleic Acids Res. 16, 7583-7600, 1988). Von diesem offenen Leseraster leitet sich ein Protein mit 522 Aminosäuren ab mit einer Moleku­ larmasse von 56245 Da. Möglicherweise reicht das offene Leseraster über das 5′-Ende von P20 hinaus, d. h. P20 ent­ hält eventuell nicht die für die N-terminalen Aminosäuren des nativen Proteins kodierenden Nukleotide. In Retikulo­ zytenlysaten und Xenopus-Oozyten beginnt die Proteinsyn­ these wahrscheinlich an dem ersten ATG an der Nukleotidpo­ sition 125, denn eine Computeranalyse ergab, daß die Nu­ kleotide 118 bis 127 als Translationsinitiationssequenz in Eukaryonten dienen können (Staden, R., Nucleic Acids Res. 12, 505-519; Kozak, M., Nucleic Acids Res. 12, 857-872, 1984). Die 3′-nicht kodierende Region von P20 ist 2962 bp lang und enthält 2 Konsensus-Polyadenylierungssignale (AATAAA). Ein Vergleich der Nukleinsäuresequenz von P20 mit Datenbanken zeigt keine Homologie mit anderen Sequen­ zen. Eine Analyse der Hydrophobizität (Kyte, J. & Doo­ little, R.F., J. Molec. Biol. 157, 105-132, 1982) und der Sekundärstruktur (Garnier, J. et al., J. Molec. Biol. 120, 97-120, 1978) ergab, daß das P20-Protein relativ hydrophil ist und vermutlich drei größere α-helikale Bereiche be­ sitzt (Aminosäuren 2 bis 21, 247 bis 269 und 506 bis 520). Gemäß Rao und Argos (Rao, J.K.M. & Argos, P., Biochim. Biophys. Acta 869, 197-214, 1986) könnte die carboxytermi­ nale α-Helix membranüberspannend sein.

Das P20-Protein enthält 24% geladene Aminosäuren, die in Clustern angeordnet sind, und die am N-Terminus konzen­ triert sind. Weiterhin sind 6 N-verknüpfte Glycosylie­ rungsstellen vorhersagbar (Bause, E., Biochem. J. 209, 331-336, 1983). Alle Hinweise sprechen dafür, daß sich der überwiegende Teil des Proteins auf der Außenseite der Mem­ bran befindet. Diese Interpretation stimmt mit der Beob­ achtung überein, daß der Antikörper R4A6 an den extrazel­ lulären Teil des Na⁺/Glucose-Cotransporters bindet. Die Daten deuten darauf hin, daß der komplette Na⁺/Glucose-Cotransporter ein Heterooligomer ist, welches aus Polypeptiden des SGLT1- und P20-Typs besteht. SGLT1-Typ Polypeptide (α-Untereinheiten) stellen die mem­ branüberspannende Pumpe dar, während jedoch die physiolo­ gischen Eigenschaften des Transporters mit Transportstel­ len mit niedriger und hoher Affinität nur nach der Zusam­ mensetzung mit den P20-Typ Polypeptiden (β-Untereinheiten) erhalten werden.

Durch die Identifizierung und Isolierung der β-Untereinheit des Na⁺/Glucose-Cotransporters und die Auf­ klärung ihrer Primärstruktur ergibt sich erstmals die Mög­ lichkeit, die Aktivität des Na⁺/Glucose-Cotransporters in Niere und Darm zu beeinflussen. Während die α-Untereinheit ein integrales Membranprotein ist, welches nur an wenigen Stellen mit kurzen Abschnitten aus der Membran heraus­ reicht, handelt es sich bei der β-Untereinheit um ein Pro­ tein, welches an einem Ende mit der Zellmembran verankert ist und zu mehr als 90% aus der Membran in das Darmlumen bzw. in das Lumen des proximalen Nierentubulus hineinragt. Dieser extrazelluläre Teil ist einer Beeinflussung durch Pharmaka zugänglich. Da die β-Untereinheit die Aktivität des Na⁺/Glucose-Cotransporters reguliert, ist diese Trans­ portaktivität über die β-Untereinheit durch Pharmaka be­ einflußbar. Die β-Untereinheit kann für verschiedenartige pharmazeutische Wirkstoffe als Rezeptor dienen, wobei die Wirkstoffe leicht an die zugängliche β-Untereinheit binden können und so die Aktivität des Transports modulieren kön­ nen, wie dies beispielsweise durch Phlorizin möglich ist.

Neben der pharmakologischen Beeinflussung der Transport­ aktivität durch Wirkstoffe, die an das Transportprotein binden, ist auch eine genetische Beeinflussung möglich. So kann über die Regulatorsequenzen des Gens für die β-Untereinheit eine gezielte Hemmung der mRNA-Synthese dieses Proteins pharmakologisch erreicht werden. Dadurch wird weniger β-Untereinheit synthetisiert, und dies führt zu einem stark reduzierten Einbau von funktionsfähigen Na⁺/Glucose-Cotransportproteinen.

Unter einem Protein mit "der biologischen Aktivität einer β-Untereinheit" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Protein bzw. Polypeptid verstanden, das die Aktivität eines Na⁺/Glucose-Cotransporters in Abhängigkeit der Glucosekonzentration regulieren kann.

Eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend das erfindungsgemäße Protein kann nach dem üblichen Herstellungsverfahren erzeugt werden und umfaßt die üblichen Hilfs- und Trägerstoffe.

Wie oben erwähnt, haben die aus Kaninchen und Mensch iso­ lierten Nukleinsäurefragmente, die für die α-Untereinheit des Na⁺/Glucose-Cotransporters kodieren, eine hohe Se­ quenzhomologie. Dies trifft auch auf die in P20 enthaltene Sequenz und weitere Säugersequenzen (siehe Fig. 8) zu. Es ist daher möglich, unter Verwendung der hierin beschriebe­ nen cDNA und mittels der auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technologie angewandten Verfahren, wie beispielsweise angegeben in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Labora­ tory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989), weitere DNA-Sequenzen aus anderen Säuger­ arten, wie beispielsweise Mensch, zu isolieren, die für die β-Untereinheit des Na⁺/Glucose-Cotransporters kodie­ ren.

Die Tatsache, daß die aus dem Schwein klonierte regula­ torische β-Untereinheit des Na⁺/Glucose-Cotransporters auch in Niere und Darm von Menschen vorkommt, konnte mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion im Rahmen der vorlie­ genden Erfindung nachgewiesen werden:

Ausgehend von Gesamt-RNA, die aus menschlichem Darm und menschlicher Niere isoliert worden war, wurde zunächst cDNA hergestellt. Die synthetisierte cDNA wurde daraufhin in die Polymerasekettenreaktion eingesetzt, die mit folgenden Oligonukleotidprimern durchgeführt wurde:

• 1) 5′ CTTAATTCAGCAGGCGG 3′ (P20-Positionen 491-507) und
• 2) 3′ GGAACAGTAGGTCGAAG 5′ (P20-Positionen 1255-1271, Gegenstrang).

Die Reaktion wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, durchgeführt. Die Reaktionsansätze wurden anschließend auf Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt und mit Ethidiuminbromid gefärbt. Ein Vergleich mit Marker-DNk- Fragmenten zeigte, daß Reaktionsprodukte mit der zu er­ wartenden Länge (781 bp) entstanden. Dieses Ergebnis zeigte, daß im Darm und in der Niere von Menschen das erfindungsgemäße Protein ebenfalls vorkommt.

Die Expression der DNA-Sequenzen und das Isolieren der ex­ primierten Proteine anderer Säugerarten kann ebenfalls nach den üblichen Verfahren erfolgen, wie beispielsweise in dem oben angegebenen Laborhandbuch von Sambrook et al. beschrieben.

Die für die β-Untereinheit kodierenden Nukleinsäuren können neben natürlichen Ursprungs, wie genomische DNAs oder cDNAs, auch synthetischer Art, wie beispielsweise mit Hilfe automatischer Synthetisiervorrichtungen herstellbare DNA, wie auch semisynthetischer Natur sein.

Die Auswahl des Vektors zum Aufnehmen der für das erfindungsgemäße Protein kodierenden Nukleinsäure hängt von der verwendeten Wirtszelle ab und liegt im Bereich des fachmännischen Könnens. Geeignete Vektoren sind beispielsweise in dem oben angegebenen Laborhandbuch von Sambrook et al. aufgeführt.

Die rekombinanten Vektoren, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragmente tragen, können durch gängige Methoden, wie beispielsweise in Sambrook et al., siehe oben, beschrieben, in die entsprechenden Wirtszellen eingebracht werden. Als Wirtszellen kommen beispielsweise Mikroorganismen in Frage, wie z. B. Bakterien der Art E.coli und B.subtilis. Weiterhin können eukaryontische Or­ ganismen verwendet werden, wie z. B. Hefen. Es ist ebenso möglich, eukaryontische Zellkulturzellen oder kultivierte Insektenzellen zu verwenden. Nach Kultivieren der Wirts­ zellen, welche das erfindungsgemäße Nukleinsäurefragment enthalten, können nach üblichen Verfahren die rekombinan­ ten Proteine mit der biologischen Aktivität einer β-Untereinheit eines Na⁺/Glucose-Cotransporter durch die gängigen Methoden isoliert werden. Das erfindungsgemäße Protein kann zur pharmakologischen Beeinflussung der Na⁺/Glucose-Cotransportaktivität verwendet werden. So kann die erfindungsgemäße β-Untereinheit des Na⁺ /Glucose-Cotransporters zusammen mit der α-Untereinheit zu einem intakten Komplex zusammengesetzt, gereinigt und kristallisiert werden, um die Tertiärstruktur des Trans­ porters durch Röntgenstrukturuntersuchungen zu bestimmen. Auf der Basis dieser Daten können spezifische Wirkstoffe, die an Transporter binden, hergestellt werden. Das erfin­ dungsgemäße Protein ermöglicht somit erstmals die gezielte Herstellung eines an den Na⁺/Glucose-Cotransporter bin­ denden Liganden. Ein solcher Ligand kann zur Regulation der Aktivität eines Na⁺/Glucose-Cotransporters verwendet werden, z. B. zur Hemmung der Aktivität bei Diabetikern.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung

Beispiel 1 In vitro-Expression eines einzelnen Polypeptids durch P20, das spezifisch mit dem monoklonalen Antikörper R4A6 reagiert. Zur Präparation von Sinn-cRNA wurden gerei­ nigte Bluescript-Plasmide, die P20 enthalten, mit XhoI linearisiert und die mit 5′7meGppp5′G versehene cRNA wurde durch T3-Polymerase synthetisiert unter Verwendung des mCAP mRNA Capping Kits der Firma Stratagene. Die cRNA wurde gelöst in Diethyl­ pyrocarbonat (DEPC)-behandeltem Wasser und die cRNA-Konzentration wurde bestimmt (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). Für die in vitro-Translation wurden 45 µl Kaninchen-Retikulozytenlysat mit bzw. ohne L-(³⁵S) Methionin (15 µCi)) gemischt mit 5 µl Was­ ser ohne bzw. mit 0,9 µg P20-cRNA. Nach 1 h (37°C) Inku­ bation wurden 50 µl 125 mM Tris-HCI pH 6,8, 4% (w/v)SDS, 10% (w/v) β-Mercaptoethanol, 20% (w/v) Polyethylenglycol zugefügt, und Aliquots von 20 µl wurden für die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese verwendet. Western-blotting und die Immunreaktion mit 2 µg/ml Maus-IgM-Antikörper oder mit 2 µg/ml Maus-Myelom-IgM wurde durchgeführt, wie beschrieben in Koepsell, H. et al. (J. Biol. Chem. 263, 18419-18429, 1988).

Beispiel 2

Unterschiedliche Effekte von P20 auf den Na⁺ /Glucose-Cotransport in Xenopus-Oozyten mit niedriger und hoher endogener Transportaktivität.

Ausgewachsene Oozyten wurden nach Kollagenase-Behandlung (Schmalzing, G. et al., Biochem. J. 279, 329-336, 1991) gesammelt und 50 nl DEPC-behandeltes Wasser ohne bzw. mit cRNA wurden pro Oozyte injiziert. Zur Translation wurden die Oozyten 48 h (18°C) in 5 mM Hepes-Tris pH 7,8, 110 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂ (ORi)-Puffer, enthaltend 50 mg/l Gentamicin inkubiert. Die Glucoseaufnahme wurde gemessen durch Inkubation der Oozyten bei 22°C mit ORi-Puffer oder mit 5 mM Hepes-Tris pH 7,6, 110 mM Tetramethylammonium, 3 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂ (HT-Puffer), enthaltend D-(¹⁴C)Glucose oder D-(¹⁴C) AMG. Da die Glucoseaufnahme stets für 2 h linear war, wurden die Anfangsaufnahmeraten routinemäßig nach 1-stündiger Inkubation gemessen. Die Inkubation wurde durch eiskalten ORi- oder HT-Puffer gestoppt, und die Ra­ dioaktivität einzelner Oozyten wurde nach deren Auflösung in 5% (w/v) SDS gemessen.

Beispiel 3

Abhängigkeit des in Xenopus-Oozyten exprimierten AMG-Transports von der Menge an injizierter SGLT1-cRNA und von P20-cRNA, die mit SGLT1-cRNA koinjiziert wurde.

Der Transport von 50 µM AMG in Xenopus laevis-Oozyten wurde in der Anwesenheit von 110 mM Na⁺ (siehe Beispiel 2) gemessen und korrigiert um die AMG-Aufnahme, die in mit Wasser injizierten Oozyten gemessen wurde.

Beispiel 4

Nukleotidsequenz und davon abgeleitete Aminosäuresequenz von P20. Aus Schweinenierenrinde (Oberleithner, H. et al., Methods Enzymol. 191, 437-449, 1990) gereinigte mRNA wurde zur Herstellung einer cDNA-Bank in λ-Zap-Phagen (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auf­ lage, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989) unter Verwendung von Oligo-dT verwendet. Das Absuchen der Bank mit Antikörpern wurde mit dem monoklonalen Antikörper R4A6 unter der Verwendung eines mit Phosphatase gekoppelten zweiten Antikörpers (Sambrook, J. et al., Molecular Clo­ ning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989) durchgeführt. Ein positiver Plaque wurde isoliert und das pBluescript SK⁻-Plasmid (mit cDNA-Insert) wurde unter Verwendung des Helferphagen R408 ausgeschnitten. XL1-Blue-Zellen wurden transfiziert und die Plasmid-DNA wurde aus Flüssigkulturen (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989) gereinigt. Unter Verwendung der Dideoxynukleotid-Kettenabbruchmethode (Korneluk, R.G. et al., Gene 40, 317-323, 1985) wurden beide Stränge der doppelsträngigen Plasmid-DNA sequen­ ziert.

Beispiel 5

Polymerasekettenreaktion zum Nachweis von cDNA, die aus­ gehend von aus menschlichem Darm und menschlicher Niere isolierter RNA synthetisiert wird und zur P20-cDNA homo­ log ist.

Die PCR-Reaktion wurde in einem Reaktionsrahmen von 50 µl in Gegenwart von RNA aus Mensch; 67 mM Tris HCl pH 8,8; 6,7 mM MgCl₂; je 1 mM dNTPs; 0,17 mg/ml Rinderserumal­ bumin; je 20 pmol Primer durchgeführt.

Ablauf: 5 Minuten Denaturierung bei 94°C, Zugabe von 2,5 U Tag-Polymerase (hot start), 5 Minuten Annealing bei 45°C, 40 Minuten Reaktion bei 72°C (zur Synthese des DNA-Stranges); dann 35 Zyklen von je 1 Minute bei 94°C, 1,5 Minuten bei 48°C, 3 Minuten bei 72°C.

Claims (21)

1. Nukleinsäurefragment, enthaltend eine Nukleotidsequenz, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität einer β-Untereinheit eines Na⁺/Glucose-Cotransporters kodiert, wobei die Nukleotidsequenz ausgewählt wird aus einer DNA-Sequenz, umfassend eine Sequenz, die für die in Fig. 6 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert, und aus Nukleinsäuresequenzen, die mit dieser Sequenz hybridisieren und für ein Protein mit der biologischen Aktivität der β-Untereinheit eines Na⁺/Glucose-Cotransporters kodieren, wobei Fig. 6 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

2. Nukleinsäurefragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz für eine Aminosäuresequenz kodiert, die die in Fig. 6 gezeigte Aminosäuresequenz von Aminosäureposition 42 bis 522 umfaßt, wobei Fig. 6 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

3. Nukleinsäurefragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die DNA-Sequenz von Position 125 bis 1568 aus Fig. 6 oder eine Sequenz, die daran hybridisiert, umfaßt, wobei Fig. 6 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

4. Nukleinsäurefragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die DNA-Sequenz von Position 1 bis 1568 aus Fig. 6 oder eine Sequenz, die daran hybridisiert, umfaßt, wobei Fig. 6 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

5. Nukleinsäurefragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es synthetischen, semi-synthetischen oder natürlichen Ursprungs ist.

6. Nukleinsäurefragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz für eine β-Untereinheit eines Säuger-Na⁺/Glucose-Cotransporters kodiert.

7. Nukleinsäurefragment nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz für eine β-Untereinheit eines Schweine-Na⁺/Glucose-Cotransporters kodiert.

8. Nukleinsäurefragment nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz für eine β-Untereinheit eines menschlichen Na⁺/Glucose-Cotransporters kodiert.

9. Rekombinanter Vektor, enthaltend ein Nukleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 1 bis 8.

10. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Expressionsvektor ist.

11. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Expressionsvektor für Prokaryonten ist.

12. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Expressionsvektor für Eukaryonten ist.

13. Wirtszelle, enthaltend einen Vektor nach einem der Ansprüche 9 bis 12.

14. Wirtszelle nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie das Protein mit der biologischen Aktivität einer β-Untereinheit eines Na⁺/Glucose-Cotransporters exprimiert.

15. Protein mit der biologischen Aktivität einer β-Untereinheit eines Na⁺/Glucose-Cotransporters, das durch ein Nukleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 1 bis 8 kodiert wird.

16. Protein nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz von Aminosäureposition 42 bis 522 in Fig. 6, umfaßt, wobei Fig. 6 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

17. Protein nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz von Aminosäureposition 1 bis 522 in Fig. 6 umfaßt, wobei Fig. 6 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

18. Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der biologischen Aktivität einer β-Untereinheit eines Na⁺/Glucose-Cotransporters nach Anspruch 15, umfassend die Schritte Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 13 und Isolieren des exprimierten Proteins.

19. Verwendung des Proteins nach einem der Ansprüche 15 bis 17 als Rezeptor für einen pharmazeutischen Wirkstoff.

20. Verwendung des Proteins nach einem der Ansprüche 15 bis 17 zur Herstellung eines an einen Na⁺/Glucose-Cotransporter bindenden Liganden.

21. Verwendung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein Inhibitor des Na⁺/Glucose-Cotransporters ist.