JP2002511486A - 化学活性成分の同定法および１−デソキシ−ｄ−キシルロース−５−リン酸の生合成経路を阻害する活性成分 - Google Patents
化学活性成分の同定法および１−デソキシ−ｄ−キシルロース−５−リン酸の生合成経路を阻害する活性成分Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、単細胞または多細胞寄生生物によって引起される感染性疾患の治療に適する化学活性剤の同定法に関する。この方法によれば、１−デソキシ−ｄ−キシルロース−５−リン酸代謝経路の一部を形成するタンパク質または同じ仕方で作用するその誘導体を、寄生生物に対する有効性について試験する活性薬剤と接触させ、タンパク質を阻害する活性薬剤またはその誘導体を選択する。本発明は、同定される活性薬剤、および寄生生物感染症の治療用の医薬を製造するためのそれらの使用にも関する。
Description
【０００１】 本発明は、単細胞または多細胞寄生生物によって引起される寄生虫病の治療に
適する活性成分の同定法に関する。医療および医薬産業は、本発明の応用分野で
ある。本発明は、タンパク質、タンパク質の断片、およびこれらのタンパク質ま
たはタンパク質の断片をコードするＤＮＡ配列、これらのＤＮＡ配列の使用であ
って、これらのタンパク質またはそれらの断片は単細胞または多細胞寄生生物に
作用する物質を同定するためのものであり、およびこの方法で同定した活性成分
、および医薬組成物を製造するためのそれらの使用にも関する。
適する活性成分の同定法に関する。医療および医薬産業は、本発明の応用分野で
ある。本発明は、タンパク質、タンパク質の断片、およびこれらのタンパク質ま
たはタンパク質の断片をコードするＤＮＡ配列、これらのＤＮＡ配列の使用であ
って、これらのタンパク質またはそれらの断片は単細胞または多細胞寄生生物に
作用する物質を同定するためのものであり、およびこの方法で同定した活性成分
、および医薬組成物を製造するためのそれらの使用にも関する。
【０００２】 寄生生物という用語は、蠕虫(Helminthes)および真猿亜目(anthropoidea)など
の単細胞寄生生物および多細胞寄生生物を包含する。これらは、ヒトおよび動物
で感染性疾患を引起す。本発明に関しては、寄生生物の厳密に科学的定義が用い
られるべきであり、すなわち単細胞寄生生物は原生動物を意味するものと理解す
べきである。
の単細胞寄生生物および多細胞寄生生物を包含する。これらは、ヒトおよび動物
で感染性疾患を引起す。本発明に関しては、寄生生物の厳密に科学的定義が用い
られるべきであり、すなわち単細胞寄生生物は原生動物を意味するものと理解す
べきである。
【０００３】 寄生虫病に対しては、多数の製剤が既に存在している。入手可能な製剤は、速
やかに耐性を持つようになるため、ヒトおよび動物の治療には既に役に立たなく
なりつつある。その結果、多くの地域では、クロロキンのような標準的な薬剤に
耐性を有するマラリア寄生生物に冒されている。ビルハルツ住血吸虫症の治療を
目的とする標準的製剤（プラジカンテル）に対する耐性の獲得についての報告も
知られている。これらの耐性の獲得および他の要因により、マラリアとビルハル
ツ住血吸虫症は既に熱帯地方において最も頻発する疾患の中に入っている。推定
３〜５億人がマラリアに罹っている。１年に２〜２．５百万人がマラリアで死亡
する。更に、メフロキンのような新薬は生産に非常に費用がかかり、また多くの
副作用を有する。従って、ヒトおよび動物の治療を目的とする医薬組成物が強く
望まれている。
やかに耐性を持つようになるため、ヒトおよび動物の治療には既に役に立たなく
なりつつある。その結果、多くの地域では、クロロキンのような標準的な薬剤に
耐性を有するマラリア寄生生物に冒されている。ビルハルツ住血吸虫症の治療を
目的とする標準的製剤（プラジカンテル）に対する耐性の獲得についての報告も
知られている。これらの耐性の獲得および他の要因により、マラリアとビルハル
ツ住血吸虫症は既に熱帯地方において最も頻発する疾患の中に入っている。推定
３〜５億人がマラリアに罹っている。１年に２〜２．５百万人がマラリアで死亡
する。更に、メフロキンのような新薬は生産に非常に費用がかかり、また多くの
副作用を有する。従って、ヒトおよび動物の治療を目的とする医薬組成物が強く
望まれている。
【０００４】 過去において、寄生生物、特にマラリアおよびビルハルツ住血吸虫症病原体に
対する化学療法組成物の開発が数多く試みられた。これらの試みの一つは、いわ
ゆるイソプレノイド生合成の阻害に関するものである。イソプレノイドは、個々
のイソプレン単位（イソペンテニル二リン酸）から形成され、細胞で重要な機能
を採用する分子である。これらとしては、ステロール、ユビキノン、および寄生
生物家庭(parasite household)にとって重要な他の分子が挙げられる。手続きの
方法は、この場合には真菌および哺乳類細胞で確立されたモデルに基づくもので
あった。真菌および哺乳類細胞では、サブユニットのイソペンテニル二リン酸は
、３個のアセチル−ＣｏＡ分子のＨＭＧ−ＣｏＡへの縮合によって形成される。
次に、ＨＭＧ−ＣｏＡは、ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼからメバロネートに転
換された後、中間体段階としてのメバロネートリン酸に続いてイソペンテニル二
リン酸に転換される（図７参照）。ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ阻害剤、例え
ばロバスタチン、シンバスタチンおよびプラバスタチンは、寄生生物の成長を阻
害するのに用いられている。ロバスタチンおよびシンバスタチンを極めて高用量
で用いることによってイン・ビトロでの阻害を行うことは可能であったが、イン
・ビボでの阻害には失敗した。住血吸虫に感染したマウスのロバスタチンによる
治療では、これらの害虫の産卵は阻害されたが、イン・ビボでこれらの害虫の幾
らかを破壊するには、極めて高濃度のロバスタチンを用いなければならなかった
。
対する化学療法組成物の開発が数多く試みられた。これらの試みの一つは、いわ
ゆるイソプレノイド生合成の阻害に関するものである。イソプレノイドは、個々
のイソプレン単位（イソペンテニル二リン酸）から形成され、細胞で重要な機能
を採用する分子である。これらとしては、ステロール、ユビキノン、および寄生
生物家庭(parasite household)にとって重要な他の分子が挙げられる。手続きの
方法は、この場合には真菌および哺乳類細胞で確立されたモデルに基づくもので
あった。真菌および哺乳類細胞では、サブユニットのイソペンテニル二リン酸は
、３個のアセチル−ＣｏＡ分子のＨＭＧ−ＣｏＡへの縮合によって形成される。
次に、ＨＭＧ−ＣｏＡは、ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼからメバロネートに転
換された後、中間体段階としてのメバロネートリン酸に続いてイソペンテニル二
リン酸に転換される（図７参照）。ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ阻害剤、例え
ばロバスタチン、シンバスタチンおよびプラバスタチンは、寄生生物の成長を阻
害するのに用いられている。ロバスタチンおよびシンバスタチンを極めて高用量
で用いることによってイン・ビトロでの阻害を行うことは可能であったが、イン
・ビボでの阻害には失敗した。住血吸虫に感染したマウスのロバスタチンによる
治療では、これらの害虫の産卵は阻害されたが、イン・ビボでこれらの害虫の幾
らかを破壊するには、極めて高濃度のロバスタチンを用いなければならなかった
。
【０００５】 意外なことには、寄生生物、特にマラリア原虫およびトリパノソーマ（マラリ
アおよび睡眠病の原因）は少なくとももう１つのイソプレノイドの合成の代謝経
路を有することが見出された。この代謝経路は、グリセルアルデヒド−３−リン
酸とピルベートの縮合により１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（Ｄ
ＯＸＰ）を生成することに基づいている。次いで、ＤＯＸＰは２−Ｃ−メチル−
Ｄ−エリトロース−４−リン酸に転換された後、中間体段階としての２−Ｃ−メ
チル−エリトリトール−４−リン酸を経てイソペンテニル二リン酸に転換される
。取り分け、ＤＯＸＰ−シンターゼおよびＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼ酵素
が、この代謝経路に関与している（図７参照）。現在までのところ、この代謝経
路は、植物、藻類および幾つかの細菌でしか報告されていない（Sprenger et al
., PNAS, 94 (1997), 12857-62、およびKuzuyama et al., Tetrahedron Letters
, 39 (1998), 4509-12）。
アおよび睡眠病の原因）は少なくとももう１つのイソプレノイドの合成の代謝経
路を有することが見出された。この代謝経路は、グリセルアルデヒド−３−リン
酸とピルベートの縮合により１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（Ｄ
ＯＸＰ）を生成することに基づいている。次いで、ＤＯＸＰは２−Ｃ−メチル−
Ｄ−エリトロース−４−リン酸に転換された後、中間体段階としての２−Ｃ−メ
チル−エリトリトール−４−リン酸を経てイソペンテニル二リン酸に転換される
。取り分け、ＤＯＸＰ−シンターゼおよびＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼ酵素
が、この代謝経路に関与している（図７参照）。現在までのところ、この代謝経
路は、植物、藻類および幾つかの細菌でしか報告されていない（Sprenger et al
., PNAS, 94 (1997), 12857-62、およびKuzuyama et al., Tetrahedron Letters
, 39 (1998), 4509-12）。
【０００６】 当業者に知られている手法による上記のＤＯＸＰ代謝経路、特に酵素ＤＯＸＰ
−シンターゼおよびＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼの阻害は、ヒトおよび動物
での単細胞および多細胞寄生生物によって引起される感染症の予防および治療に
適している。この代謝経路はヒトには見られないので、寄生生物の選択的化学療
法の標的として理論的に適しているものである。酵素デソキシキシルロース−５
−リン酸−シンターゼおよびデソキシキシルロース−５−リン酸−レダクトイソ
メラーゼが、化学療法の標的として特に適している。ヒトは基質およびその前駆
体もまたは酵素デソキシキシルロース−５−リン酸−レダクトイソメラーゼの生
成物またはその酵素自身も持たないので、マラリアのこの酵素の阻害は副作用が
特に低くかつ適当であることが確かめられた。
−シンターゼおよびＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼの阻害は、ヒトおよび動物
での単細胞および多細胞寄生生物によって引起される感染症の予防および治療に
適している。この代謝経路はヒトには見られないので、寄生生物の選択的化学療
法の標的として理論的に適しているものである。酵素デソキシキシルロース−５
−リン酸−シンターゼおよびデソキシキシルロース−５−リン酸−レダクトイソ
メラーゼが、化学療法の標的として特に適している。ヒトは基質およびその前駆
体もまたは酵素デソキシキシルロース−５−リン酸−レダクトイソメラーゼの生
成物またはその酵素自身も持たないので、マラリアのこの酵素の阻害は副作用が
特に低くかつ適当であることが確かめられた。
【０００７】 本発明は、ＤＯＸＰ代謝経路を阻害する活性成分を入手する方法、および単細
胞および多細胞寄生生物によって引起される感染性疾患の治療および予防用の医
薬組成物を製造するためのこれらの活性成分に関する。
胞および多細胞寄生生物によって引起される感染性疾患の治療および予防用の医
薬組成物を製造するためのこれらの活性成分に関する。
【０００８】 本発明の目的は、ヒトおよび動物の寄生生物疾患の治療のための活性成分を同
定する新規な方法を提供することである。もう一つの目的は、病原体を選択的に
破壊し、副作用が少ない医薬を入手する方法を開発することである。
定する新規な方法を提供することである。もう一つの目的は、病原体を選択的に
破壊し、副作用が少ない医薬を入手する方法を開発することである。
【０００９】 この目的は、請求項１に記載の方法によって達成される。本発明による方法お
よび見出された活性成分は、 いわゆる１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸代謝経路におけるイソ
プレノイド生合成が阻害される ことを特徴としている。
よび見出された活性成分は、 いわゆる１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸代謝経路におけるイソ
プレノイド生合成が阻害される ことを特徴としている。
【００１０】 上記の代謝経路はヒトおよび動物には存在せず、植物、藻類、幾つかの真正細
菌、およびマラリア寄生虫などの寄生生物のみに見られ、従って、この治療法は
、副作用の少ないものとして傑出したものである。
菌、およびマラリア寄生虫などの寄生生物のみに見られ、従って、この治療法は
、副作用の少ないものとして傑出したものである。
【００１１】 本発明は、更にこの代謝経路に関与する酵素およびこれらの酵素の断片にも関
する。これらの酵素は、活性成分の同定の目的で本発明による方法を行うのに適
したタンパク質である。本発明は、これらの酵素またはこれらの酵素の断片をコ
ードするＤＮＡ配列にも関する。
する。これらの酵素は、活性成分の同定の目的で本発明による方法を行うのに適
したタンパク質である。本発明は、これらの酵素またはこれらの酵素の断片をコ
ードするＤＮＡ配列にも関する。
【００１２】 本発明は、酵素またはその断片を同定し、組換え技術によりこの酵素またはそ
の断片を産生するための方法および抗体に関する。
の断片を産生するための方法および抗体に関する。
【００１３】 本発明は、これらの酵素またはその断片の使用、または単細胞または多細胞病
原体に対して活性な物質を同定するためのこれらの酵素またはこれらの酵素の断
片をコードするＤＮＡ配列の使用により、単細胞または多細胞病原体に対して活
性な物質を同定することにも関する。
原体に対して活性な物質を同定するためのこれらの酵素またはこれらの酵素の断
片をコードするＤＮＡ配列の使用により、単細胞または多細胞病原体に対して活
性な物質を同定することにも関する。
【００１４】 本発明は、本発明による酵素によって発見された活性成分にも関する。
【００１５】 本発明は、添付図面により更に詳細に説明される。
【００１６】 酵素ＤＯＸＰ−シンターゼおよびＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼのコード遺
伝子は、遺伝学的方法によって検出された（図１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ）。P. f
alciparumのゲノムからポリメラーゼ連鎖転換によってエンリッチメントした後
、これらの遺伝子を細菌プラスミドでクローニングし、そのヌクレオチド配列を
決定した。配列データーは、これらの遺伝子と、藻類、植物および細菌由来の相
当する遺伝子との高い相同性を示した。この非常に高い相同性は、３種類の遺伝
子がP. falciparumのＤＯＸＰ−シンターゼおよびＤＯＸＰ−レダクトイソメラ
ーゼ酵素をコードすることを示した。
伝子は、遺伝学的方法によって検出された（図１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ）。P. f
alciparumのゲノムからポリメラーゼ連鎖転換によってエンリッチメントした後
、これらの遺伝子を細菌プラスミドでクローニングし、そのヌクレオチド配列を
決定した。配列データーは、これらの遺伝子と、藻類、植物および細菌由来の相
当する遺伝子との高い相同性を示した。この非常に高い相同性は、３種類の遺伝
子がP. falciparumのＤＯＸＰ−シンターゼおよびＤＯＸＰ−レダクトイソメラ
ーゼ酵素をコードすることを示した。
【００１７】 異種系における発現の後、これらの酵素を組み換えタンパク質として精製し、
無細胞系で活性研究に用いた。ＤＯＸＰ−シンターゼの活性は、グリセルアルデ
ヒド−３−リン酸およびピルベートを１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リ
ン酸に転換することによって測定した。ＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼの活性
は、１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸をＮＡＤＰＨの存在下にて２
−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸に転換することによって測定し
た。ＮＡＤＰＨ濃度の変化は、パラメーター変動によって測定した。この方法は
、当業者に知られている。
無細胞系で活性研究に用いた。ＤＯＸＰ−シンターゼの活性は、グリセルアルデ
ヒド−３−リン酸およびピルベートを１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リ
ン酸に転換することによって測定した。ＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼの活性
は、１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸をＮＡＤＰＨの存在下にて２
−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸に転換することによって測定し
た。ＮＡＤＰＨ濃度の変化は、パラメーター変動によって測定した。この方法は
、当業者に知られている。
【００１８】 酵素は、これらをコードするＤＮＡ配列（図１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ）および
それから誘導されるアミノ酸配列（図３ａおよび３ｂ）によって定義することが
できる。しかしながら、個々の寄生生物の酵素は、寄生生物毎に異なる可能性が
ある。アミノ酸のこのような変動は、通常はアミノ酸置換である。しかしながら
、配列全体に対するアミノ酸の欠失、挿入および付加がある可能性もある。本発
明による酵素は大きさおよび型のいずれでも、これを発現する細胞および細胞の
型によって変化し、グリコシル化または非グリコシル化することができる。
それから誘導されるアミノ酸配列（図３ａおよび３ｂ）によって定義することが
できる。しかしながら、個々の寄生生物の酵素は、寄生生物毎に異なる可能性が
ある。アミノ酸のこのような変動は、通常はアミノ酸置換である。しかしながら
、配列全体に対するアミノ酸の欠失、挿入および付加がある可能性もある。本発
明による酵素は大きさおよび型のいずれでも、これを発現する細胞および細胞の
型によって変化し、グリコシル化または非グリコシル化することができる。
【００１９】 本発明による酵素、またはこれらの酵素の断片は、適当な発現系、例えば細菌
、特に原核発現系としてのE. coli、または真核発現系、特にＣＯＳ細胞またはD
ictyostelium discoideumでの本発明によるＤＮＡの発現によって産生される。
、特に原核発現系としてのE. coli、または真核発現系、特にＣＯＳ細胞またはD
ictyostelium discoideumでの本発明によるＤＮＡの発現によって産生される。
【００２０】 本発明による核酸配列により、任意の寄生生物のゲノムにおけるコード遺伝子
またはその変異体を調べ、これらを同定して、酵素に対して所望なコード遺伝子
を単離することができる。この種の方法およびこの目的に適当な方法は、当業者
に知られている。
またはその変異体を調べ、これらを同定して、酵素に対して所望なコード遺伝子
を単離することができる。この種の方法およびこの目的に適当な方法は、当業者
に知られている。
【００２１】 組換え技術の応用の結果、多数の酵素または酵素の断片の変異体を産生するこ
とができる。この種の誘導体は、例えば１種類以上のアミノ酸において置換、欠
失または付加によって修飾することができる。この誘導体形成は、例えば位置指
定突然変異誘発によることができる。この種の誘導体形成は、当業者が容易に行
うことができる。確実に酵素の特性が保持されるようにしなければならないだけ
である。従って、本発明のもう一つの主題は、ＤＯＸＰ代謝経路に関与する酵素
、特にＤＯＸＰ−シンターゼおよびＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼであって、
ａ） 外来ＤＮＡの原核または真核発現の産物であり、 ｂ） 図１ａ、１ｂ，２ａおよび２ｂの配列からコードされ、 ｃ） 成熟タンパク質をコードするＤＮＡ領域において、図１ａ、１ｂ，２ａお
よび２ｂに示されるＤＮＡ配列またはこれらのＤＮＡ配列の断片（図４ａおよび
４ｂ参照）とハイブリダイズするＤＮＡ配列からコードされ、または ｄ） 遺伝子コードの縮重なしにｂ）およびｃ）において定義された配列とハイ
ブリダイズし、同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
からコードされる ものである。
とができる。この種の誘導体は、例えば１種類以上のアミノ酸において置換、欠
失または付加によって修飾することができる。この誘導体形成は、例えば位置指
定突然変異誘発によることができる。この種の誘導体形成は、当業者が容易に行
うことができる。確実に酵素の特性が保持されるようにしなければならないだけ
である。従って、本発明のもう一つの主題は、ＤＯＸＰ代謝経路に関与する酵素
、特にＤＯＸＰ−シンターゼおよびＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼであって、
ａ） 外来ＤＮＡの原核または真核発現の産物であり、 ｂ） 図１ａ、１ｂ，２ａおよび２ｂの配列からコードされ、 ｃ） 成熟タンパク質をコードするＤＮＡ領域において、図１ａ、１ｂ，２ａお
よび２ｂに示されるＤＮＡ配列またはこれらのＤＮＡ配列の断片（図４ａおよび
４ｂ参照）とハイブリダイズするＤＮＡ配列からコードされ、または ｄ） 遺伝子コードの縮重なしにｂ）およびｃ）において定義された配列とハイ
ブリダイズし、同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
からコードされる ものである。
【００２２】 図１ａ、１ｂ，２ａおよび２ｂからのヌクレオチド、または遺伝子コードの縮
重により同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列からコ
ードされる酵素が好ましい。
重により同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列からコ
ードされる酵素が好ましい。
【００２３】 本発明による２種類の酵素（図３ａおよび３ｂの配列）は、単細胞および多細
胞寄生生物、特に単細胞寄生生物の特異タンパク質の新規な原型として見ること
ができる。
胞寄生生物、特に単細胞寄生生物の特異タンパク質の新規な原型として見ること
ができる。
【００２４】 本発明は、これらの酵素をコードし、 ａ） 図１ａ、１ｂ，２ａおよび２ｂに示されるＤＮＡ配列、またはそれらの相
補的配列、 ｂ） ａ）の配列の１つとハイブリダイズする核酸配列、 ｃ） 遺伝子コードの縮重なしにａ）またはｂ）に記載される配列の１つとハイ
ブリダイズする核酸配列 の群から選択される核酸配列に関する。
補的配列、 ｂ） ａ）の配列の１つとハイブリダイズする核酸配列、 ｃ） 遺伝子コードの縮重なしにａ）またはｂ）に記載される配列の１つとハイ
ブリダイズする核酸配列 の群から選択される核酸配列に関する。
【００２５】 本発明は、任意の寄生生物由来の酵素であって、本質的にピルベートとグリセ
ルアルデヒド−３−リン酸を縮合して１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リ
ン酸とし（ＤＯＸＰ−シンターゼ）、１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リ
ン酸を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸に転換する酵素（ＤＯ
ＸＰ−レダクトイソメラーゼ）にも関する。これらの酵素は、マラリア寄生虫由
来の酵素と同様に、相当する寄生生物のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライ
ブラリーが、当業者によく知られている方法によってマラリア寄生虫をコードす
る配列由来の酵素を含むハイブリダイゼーションプローブで、またはマラリア寄
生虫の酵素についてのＤＮＡおよびタンパク質配列を他の寄生生物の酵素と配列
比較することによってスクリーニングされるという点において得ることができる
。
ルアルデヒド−３−リン酸を縮合して１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リ
ン酸とし（ＤＯＸＰ−シンターゼ）、１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リ
ン酸を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸に転換する酵素（ＤＯ
ＸＰ−レダクトイソメラーゼ）にも関する。これらの酵素は、マラリア寄生虫由
来の酵素と同様に、相当する寄生生物のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライ
ブラリーが、当業者によく知られている方法によってマラリア寄生虫をコードす
る配列由来の酵素を含むハイブリダイゼーションプローブで、またはマラリア寄
生虫の酵素についてのＤＮＡおよびタンパク質配列を他の寄生生物の酵素と配列
比較することによってスクリーニングされるという点において得ることができる
。
【００２６】 核酸を用いて、本発明による酵素を、反復可能な方法で多量に得ることができ
る。この核酸は、原核および真核生物で発現させる目的で当業者によく知られて
いる方法によって適当な発現ベクターに組込まれる。この種の発現ベクターは、
好ましくは調整／誘導的促進剤を含む。次に、これらの組換えベクターを、既知
の方法によって適当な宿主細胞に導入して発現させ、形質転換、トランスフェク
ションまたは形質導入した宿主細胞を、異種遺伝子を発現することができる条件
下で培養する。適当な宿主細胞としては、原核細胞、例えばE. coli、および真
核細胞、特に酵母（例えば、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces
pombe、Pichia pastoris）、昆虫細胞（例えば、Drosophila melanogaster、例
えばＳ２細胞、Spodoptera frugiperda、Trichoplusia niの細胞系）、脊椎動物
細胞系、特にＣＨＯまたはＣＯＳ細胞のような奇形癌、および植物細胞系が挙げ
られる。
る。この核酸は、原核および真核生物で発現させる目的で当業者によく知られて
いる方法によって適当な発現ベクターに組込まれる。この種の発現ベクターは、
好ましくは調整／誘導的促進剤を含む。次に、これらの組換えベクターを、既知
の方法によって適当な宿主細胞に導入して発現させ、形質転換、トランスフェク
ションまたは形質導入した宿主細胞を、異種遺伝子を発現することができる条件
下で培養する。適当な宿主細胞としては、原核細胞、例えばE. coli、および真
核細胞、特に酵母（例えば、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces
pombe、Pichia pastoris）、昆虫細胞（例えば、Drosophila melanogaster、例
えばＳ２細胞、Spodoptera frugiperda、Trichoplusia niの細胞系）、脊椎動物
細胞系、特にＣＨＯまたはＣＯＳ細胞のような奇形癌、および植物細胞系が挙げ
られる。
【００２７】 本発明による酵素は、トランスジェニック植物および動物（例えば、マウス、
ヒツジ、ヤギ、ブタ、モルモット）で発現させることもできる。発現系を、当業
者に知られている手法によって配置し、生成した酵素が動物の乳で分離され、ま
たは容易に得られる植物部分（果実、葉、花、新芽および根の部分）から得るこ
とができるようにするのが有利である。
ヒツジ、ヤギ、ブタ、モルモット）で発現させることもできる。発現系を、当業
者に知られている手法によって配置し、生成した酵素が動物の乳で分離され、ま
たは容易に得られる植物部分（果実、葉、花、新芽および根の部分）から得るこ
とができるようにするのが有利である。
【００２８】 脊椎動物細胞系の発現ベクターとして特に適当なものは、パピローマウイルス
（例えば、ＳＶ４０）、レトロウイルス、シンドビスウイルス、サイトメガロウ
イルス、およびワクシニアウイルス由来の系である。昆虫細胞に特に適当なもの
は、バキュロウイルス系であり、植物にとって特に適当なものは、Agrobacteriu
m tumefaciensのｔｉプラスミドおよび核酸で被覆した粒子による細胞衝撃であ
る。
（例えば、ＳＶ４０）、レトロウイルス、シンドビスウイルス、サイトメガロウ
イルス、およびワクシニアウイルス由来の系である。昆虫細胞に特に適当なもの
は、バキュロウイルス系であり、植物にとって特に適当なものは、Agrobacteriu
m tumefaciensのｔｉプラスミドおよび核酸で被覆した粒子による細胞衝撃であ
る。
【００２９】 本発明による酵素の発現は、Dictyostelium discoideum、Polysphondylium pa
llidumおよびPhysarum polycephalumのような粘菌類が、それらの細胞を単純な
培地で経済的に多量に培養することができるから、特に重要である。Dictyostel
ium discoideumを用いると、この生物はPlasmodium falciparumのようなそれぞ
れのアミノ酸についてと同様なコドンを用い、また本発明による酵素の特に効果
的な生産が達成されるという点でも有利である。更に、誘導的促進剤（例えば、
食物の欠如による）が、Dictyostelium discoideumの発現ベクターについて知ら
れている。その結果、組換え酵素収率を更に増加することができる。
llidumおよびPhysarum polycephalumのような粘菌類が、それらの細胞を単純な
培地で経済的に多量に培養することができるから、特に重要である。Dictyostel
ium discoideumを用いると、この生物はPlasmodium falciparumのようなそれぞ
れのアミノ酸についてと同様なコドンを用い、また本発明による酵素の特に効果
的な生産が達成されるという点でも有利である。更に、誘導的促進剤（例えば、
食物の欠如による）が、Dictyostelium discoideumの発現ベクターについて知ら
れている。その結果、組換え酵素収率を更に増加することができる。
【００３０】 本発明による酵素の発現に特に適当なものは、宿主細胞、およびピルベートと
グリセルアルデヒド−３−リン酸を縮合して１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−
５−リン酸とし（ＤＯＸＰ−シンターゼ）、１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−
５−リン酸と反応して２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸とする
（ＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼ）固有酵素を持たない種類の生物である。こ
れは、古細菌、動物、真菌、粘菌および幾つかの真正細菌に当てはまる。組換え
酵素の検出および精製葉、これらの固有酵素活性の欠如によって実質的に促進さ
れる。更に、活性、および特に本発明による組換え酵素の活性の宿主細胞からの
粗抽出物中の様々な化合物および医薬組成物による阻害を経済的に測定すること
が初めて可能になる。
グリセルアルデヒド−３−リン酸を縮合して１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−
５−リン酸とし（ＤＯＸＰ−シンターゼ）、１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−
５−リン酸と反応して２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸とする
（ＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼ）固有酵素を持たない種類の生物である。こ
れは、古細菌、動物、真菌、粘菌および幾つかの真正細菌に当てはまる。組換え
酵素の検出および精製葉、これらの固有酵素活性の欠如によって実質的に促進さ
れる。更に、活性、および特に本発明による組換え酵素の活性の宿主細胞からの
粗抽出物中の様々な化合物および医薬組成物による阻害を経済的に測定すること
が初めて可能になる。
【００３１】 本発明による酵素は、翻訳後修飾およびポリペプチド鎖の純粋なフォールディ
ングを行おうとするときに、真核細胞で有利に発現される。更に、ゲノムＤＮＡ
配列の発現の際に、発現系の機能として、イントロンはＤＮＡをスプライシング
することによって除去され、酵素が寄生生物に特徴的なポリペプチド配列で産生
する。配列コードイントロンは、組換えＤＮＡ技術によって発現させたりまたは
実験的に挿入しようとするＤＮＡ配列から除去することもできる。
ングを行おうとするときに、真核細胞で有利に発現される。更に、ゲノムＤＮＡ
配列の発現の際に、発現系の機能として、イントロンはＤＮＡをスプライシング
することによって除去され、酵素が寄生生物に特徴的なポリペプチド配列で産生
する。配列コードイントロンは、組換えＤＮＡ技術によって発現させたりまたは
実験的に挿入しようとするＤＮＡ配列から除去することもできる。
【００３２】 タンパク質は、当業者に知られている方法によって宿主細胞または宿主細胞の
培養上清から単離することができる。酵素のイン・ビトロでの再活性化が必要な
こともある。
培養上清から単離することができる。酵素のイン・ビトロでの再活性化が必要な
こともある。
【００３３】 精製を促進するため、本発明による酵素または酵素の断片を様々なペプチド鎖
との融合タンパク質として発現することができる。オリゴ−ヒスチジン配列、お
よびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、チオレドキシンまたはカルモジュ
リン結合ペプチド由来の配列が、これに特に適している。組換え酵素の溶解性が
増加するので、チオレドキシンから誘導される配列との融合が原核発現には特に
適している。
との融合タンパク質として発現することができる。オリゴ−ヒスチジン配列、お
よびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、チオレドキシンまたはカルモジュ
リン結合ペプチド由来の配列が、これに特に適している。組換え酵素の溶解性が
増加するので、チオレドキシンから誘導される配列との融合が原核発現には特に
適している。
【００３４】 更に、本発明による酵素またはこの酵素の部分配列を、当業者に知られている
ペプチド鎖であって、組換え酵素が細胞外環境または宿主細胞の所定の区画に輸
送されるようにするもので発現することかできる。結果として、酵素の生物活性
の精製および検討を促進することができる。
ペプチド鎖であって、組換え酵素が細胞外環境または宿主細胞の所定の区画に輸
送されるようにするもので発現することかできる。結果として、酵素の生物活性
の精製および検討を促進することができる。
【００３５】 本発明による酵素の発現と共に、個々のコドンを変化させることが適当である
ことを示すことができる。寄生生物で用いられるコドンがタンパク質の最適合成
を確実に行うための異種発現系で用いられるコドンと異なるときには、コード領
域における塩基の特異的置換も適当である。例えば、複数の不安定化配列モチー
フＡＴＴＴＡがＤＮＡの３′領域に存在するときには、未翻訳の５′または３′
部分の欠失が適当であることもある。次に、これらは親核性物での好ましい発現
においては欠失されるべきである。この種の変化は、塩基の欠失、付加または置
換であり、これもまた本発明の主題である。
ことを示すことができる。寄生生物で用いられるコドンがタンパク質の最適合成
を確実に行うための異種発現系で用いられるコドンと異なるときには、コード領
域における塩基の特異的置換も適当である。例えば、複数の不安定化配列モチー
フＡＴＴＴＡがＤＮＡの３′領域に存在するときには、未翻訳の５′または３′
部分の欠失が適当であることもある。次に、これらは親核性物での好ましい発現
においては欠失されるべきである。この種の変化は、塩基の欠失、付加または置
換であり、これもまた本発明の主題である。
【００３６】 本発明による酵素は、イン・ビトロでの翻訳による当業者に知られている手法
によって標準化条件下で得ることもできる。これに適当な系は、ウサギの網状赤
血球および麦芽エキスである。また、イン・ビトロで転写されたｍＲＮＡを、ア
フリカツメガエルの卵母細胞に翻訳することもできる。
によって標準化条件下で得ることもできる。これに適当な系は、ウサギの網状赤
血球および麦芽エキスである。また、イン・ビトロで転写されたｍＲＮＡを、ア
フリカツメガエルの卵母細胞に翻訳することもできる。
【００３７】 化学合成により、配列が本発明による酵素のペプチド配列から誘導されるオリ
ゴおよびポリペプチドを製造することができる。配列を適当に選択すると、この
種のペプチドは、本発明による完全な酵素に特徴的な特徴を有する。この種のペ
プチドは、多量に製造することができ、かつ酵素活性の速度論、酵素活性の調整
、酵素の三次元構造、様々な化合物および医薬組成物による酵素活性の阻害、お
よび様々なリガンドの結合形状および結合親和性の研究に特に適している。
ゴおよびポリペプチドを製造することができる。配列を適当に選択すると、この
種のペプチドは、本発明による完全な酵素に特徴的な特徴を有する。この種のペ
プチドは、多量に製造することができ、かつ酵素活性の速度論、酵素活性の調整
、酵素の三次元構造、様々な化合物および医薬組成物による酵素活性の阻害、お
よび様々なリガンドの結合形状および結合親和性の研究に特に適している。
【００３８】 図１ａ、１ｂ、２ａおよび２ｂに示される配列または図４ａおよび４ｂに記載
の断片由来のヌクレオチドを有するＤＮＡは、本発明による酵素の組換え産生に
好ましく用いられる。
の断片由来のヌクレオチドを有するＤＮＡは、本発明による酵素の組換え産生に
好ましく用いられる。
【００３９】 本発明は、寄生生物から単離することによるＤＯＸＰ代謝経路に関与する酵素
、特にＤＯＸＰ−シンターゼおよびＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼ酵素の入手
法にも関する。これらの酵素は、クロマトグラフィー、電気泳動および当業者に
知られている他の方法によって寄生生物抽出物から単離される。これらの酵素は
それぞれの酵素活性または適当な抗体との反応性を測定することによって見出さ
れる。
、特にＤＯＸＰ−シンターゼおよびＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼ酵素の入手
法にも関する。これらの酵素は、クロマトグラフィー、電気泳動および当業者に
知られている他の方法によって寄生生物抽出物から単離される。これらの酵素は
それぞれの酵素活性または適当な抗体との反応性を測定することによって見出さ
れる。
【００４０】 組換え技術により酵素を産生する形質転換、トランスフェクションまたは形質
導入した宿主細胞の検出、およびタンパク質の精製は、これらの酵素に結合する
抗体によるのが好ましい。この種の抗体は、既知の方法による抗原または免疫原
としての本発明による酵素またはこの酵素の部分を用いて容易に得ることができ
る。
導入した宿主細胞の検出、およびタンパク質の精製は、これらの酵素に結合する
抗体によるのが好ましい。この種の抗体は、既知の方法による抗原または免疫原
としての本発明による酵素またはこの酵素の部分を用いて容易に得ることができ
る。
【００４１】 他の寄生生物の相同性または交差転換タンパク質は、本発明によるタンパク質
に対する抗体を用いて、例えばウェスタンブロット試験によって検出することが
できる。
に対する抗体を用いて、例えばウェスタンブロット試験によって検出することが
できる。
【００４２】 本発明は、ＤＯＸＰ酵素、特にＤＯＸＰ−シンターゼおよびＤＯＸＰ−レダク
トイソメラーゼ酵素の酵素活性の測定法にも関する。これは、既知の指示によっ
て測定することができる（Sprenger et al., PNAS, 94 (1997), 12857-62、およ
びKuzuyama et al., Tetrahedron Letters, 39 (1998), 4509-12）。この方法で
は、ピルベートとグリセルアルデヒド−３−リン酸を縮合して１−デソキシ−Ｄ
−キシルロース−５−リン酸とすること（ＤＯＸＰ−シンターゼ）、および１−
デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトー
ル−４−リン酸への転換（ＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼ）が検出される。本
発明は、上記酵素の活性を阻害する物質を得るためのこれらの測定法の使用にも
関する。
トイソメラーゼ酵素の酵素活性の測定法にも関する。これは、既知の指示によっ
て測定することができる（Sprenger et al., PNAS, 94 (1997), 12857-62、およ
びKuzuyama et al., Tetrahedron Letters, 39 (1998), 4509-12）。この方法で
は、ピルベートとグリセルアルデヒド−３−リン酸を縮合して１−デソキシ−Ｄ
−キシルロース−５−リン酸とすること（ＤＯＸＰ−シンターゼ）、および１−
デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトー
ル−４−リン酸への転換（ＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼ）が検出される。本
発明は、上記酵素の活性を阻害する物質を得るためのこれらの測定法の使用にも
関する。
【００４３】 組換え技術の応用によって、酵素または酵素の断片の多数の変体を生成するこ
とができる。この種の誘導体は、例えば１種類以上のアミノ酸において置換、欠
失または付加によって修飾することができる。誘導体は、例えば位置指定突然変
異誘発によって形成することができる。この種の変体は、当業者が容易に行うこ
とができるものである。酵素の特徴が確実に保持されるようにしなければならな
いだけである。
とができる。この種の誘導体は、例えば１種類以上のアミノ酸において置換、欠
失または付加によって修飾することができる。誘導体は、例えば位置指定突然変
異誘発によって形成することができる。この種の変体は、当業者が容易に行うこ
とができるものである。酵素の特徴が確実に保持されるようにしなければならな
いだけである。
【００４４】 本発明による酵素およびそれらの同族体を用いることにより、寄生生物に対す
る新規な特異活性成分を見出すことができる。
る新規な特異活性成分を見出すことができる。
【００４５】 特に、上記の検出法を、物質の抗寄生生物活性のスクリーニング用の適当な試
験キットに用いることができる。これらの方法としては、当業者に知られており
、植物相および動物相由来の、植物、藻類、細菌または動物由来の天然物質、お
よびそれらの誘導体、化学ライブラリー、および組合せ化学(combinatory chemi
stry)などの当業者に知られている技術によって編集されたライブラリーのスク
リーニングに適する方法が挙げられる(Pindur et al., Pharmazie in unserer Z
eit, 26 (1997), 24-30; Broach et al., Nature, 384 (1997), 14-6; Lack et
al., Chimia, 50 (1996), 445-7; Czarnik and Ellman, Accounts of Chemical
Research, 29 (1996); Chemical and Engineering News, 74 (1996), 28-73; Lo
rin et al., Chemical Reviews, 96 (1996), 555-600; Weber et al., Nachrich
ten aus Chemie, Technik und Laboratorium, 42 (1994), 698-702)。
験キットに用いることができる。これらの方法としては、当業者に知られており
、植物相および動物相由来の、植物、藻類、細菌または動物由来の天然物質、お
よびそれらの誘導体、化学ライブラリー、および組合せ化学(combinatory chemi
stry)などの当業者に知られている技術によって編集されたライブラリーのスク
リーニングに適する方法が挙げられる(Pindur et al., Pharmazie in unserer Z
eit, 26 (1997), 24-30; Broach et al., Nature, 384 (1997), 14-6; Lack et
al., Chimia, 50 (1996), 445-7; Czarnik and Ellman, Accounts of Chemical
Research, 29 (1996); Chemical and Engineering News, 74 (1996), 28-73; Lo
rin et al., Chemical Reviews, 96 (1996), 555-600; Weber et al., Nachrich
ten aus Chemie, Technik und Laboratorium, 42 (1994), 698-702)。
【００４６】 本発明は、タンパク質またはこれらのタンパク質の断片、例えば酵素活性を有
するまたは持たないタンパク質またはタンパク質の断片を当業者に知られている
手法で用い、タンパク質の構造の決定、特に酵素活性に対して阻害効果を有する
製剤の開発に適した結合部位の特性決定を行うことにも関する。
するまたは持たないタンパク質またはタンパク質の断片を当業者に知られている
手法で用い、タンパク質の構造の決定、特に酵素活性に対して阻害効果を有する
製剤の開発に適した結合部位の特性決定を行うことにも関する。
【００４７】 本発明によるタンパク質を用いて得た活性成分は、医薬および獣医薬にとって
極めて重要である。
極めて重要である。
【００４８】 本発明によるタンパク質によって見出された活性成分は、恒温動物の毒性の点
で好都合であり、ヒト、および畜産や家庭、飼育、動物園、実験室での飼育動物
、および実験やペット用の動物に見られる病原性寄生生物と戦うのに適している
。それらは、有害な寄生生物の発生の総てのまたは個々の段階、および耐性およ
び通常は感受性の寄生生物に対して有効である。寄生生物との戦いの結果、疾患
、死亡率、および性能（例えば、肉、乳、羊毛、皮膚、卵など）の減少は少なく
なるので、活性成分を用いることによって動物の畜産が一層容易かつコスト的に
一層効率的になる。
で好都合であり、ヒト、および畜産や家庭、飼育、動物園、実験室での飼育動物
、および実験やペット用の動物に見られる病原性寄生生物と戦うのに適している
。それらは、有害な寄生生物の発生の総てのまたは個々の段階、および耐性およ
び通常は感受性の寄生生物に対して有効である。寄生生物との戦いの結果、疾患
、死亡率、および性能（例えば、肉、乳、羊毛、皮膚、卵など）の減少は少なく
なるので、活性成分を用いることによって動物の畜産が一層容易かつコスト的に
一層効率的になる。
【００４９】 確立された分析法を包含する本発明によるこれらの方法を用いることによって
、ＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼの活性は３−（Ｎ−アセチル−Ｎ−ヒドロキ
シアミノ）プロピルホスホネートおよび３−（Ｎ−ホルミル−Ｎ−ヒドロキシア
ミノ）プロピルホスホネート（ホスミドマイシン）によって阻害されることを示
すことができた。これらの物質は、いずれもアシルヒドロキシアミノ−アルキル
ホスホン酸誘導体の化学ライブラリーに由来するものである。この群の化合物は
、従来は除草剤および殺菌剤として報告された（ＵＳ４６９３７４２号明細書、
ＤＥ２７３３６５８号明細書）。抗寄生生物活性を得るための系の効率を、本明
細書で示した。酵素分析の結果は、マラリア培養物（例参照）および動物実験（
例参照）のいずれでも確認することができた。これらの酵素分析によって見出さ
れた阻害剤は、イン・ビトロおよびイン・ビボでのマラリア寄生虫の成長を阻害
することができた。動物を８日間にわたって治療したところ、動物は治癒した。
アセチル形は、ホルミル形の３倍の効果を示した。細菌の成長を阻害するには実
質的に高濃度（１０００×まで）の３−（Ｎ−アセチル−Ｎ−ヒドロキシアミノ
）プロピルホスホネートが必要であったので、この結果は極めて意外なものであ
る。
、ＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼの活性は３−（Ｎ−アセチル−Ｎ−ヒドロキ
シアミノ）プロピルホスホネートおよび３−（Ｎ−ホルミル−Ｎ−ヒドロキシア
ミノ）プロピルホスホネート（ホスミドマイシン）によって阻害されることを示
すことができた。これらの物質は、いずれもアシルヒドロキシアミノ−アルキル
ホスホン酸誘導体の化学ライブラリーに由来するものである。この群の化合物は
、従来は除草剤および殺菌剤として報告された（ＵＳ４６９３７４２号明細書、
ＤＥ２７３３６５８号明細書）。抗寄生生物活性を得るための系の効率を、本明
細書で示した。酵素分析の結果は、マラリア培養物（例参照）および動物実験（
例参照）のいずれでも確認することができた。これらの酵素分析によって見出さ
れた阻害剤は、イン・ビトロおよびイン・ビボでのマラリア寄生虫の成長を阻害
することができた。動物を８日間にわたって治療したところ、動物は治癒した。
アセチル形は、ホルミル形の３倍の効果を示した。細菌の成長を阻害するには実
質的に高濃度（１０００×まで）の３−（Ｎ−アセチル−Ｎ−ヒドロキシアミノ
）プロピルホスホネートが必要であったので、この結果は極めて意外なものであ
る。
【００５０】 従って、本発明による方法は活性成分の同定に適しており、本発明による活性
成分は、寄生生物、真菌またはウイルスによって引起されるヒトおよび動物での
感染症の治療および予防的治療に適している。これらの化合物は、マラリアおよ
び睡眠病、並びにシャーガス病、トキソプラスマ症、アメーバ性赤痢、リーシュ
マン症、トリコモナス症、ニューモシスティス症、バランチジウム症、クリブト
スポリジウム症、肉胞子虫症、アカントアメーバ症、ネグレリア症、コクシジウ
ム症、ジアルジア鞭毛虫症、およびラムブル鞭毛虫症の病原体によって引起され
る感染症の予防薬として、およびその治療に適している。
成分は、寄生生物、真菌またはウイルスによって引起されるヒトおよび動物での
感染症の治療および予防的治療に適している。これらの化合物は、マラリアおよ
び睡眠病、並びにシャーガス病、トキソプラスマ症、アメーバ性赤痢、リーシュ
マン症、トリコモナス症、ニューモシスティス症、バランチジウム症、クリブト
スポリジウム症、肉胞子虫症、アカントアメーバ症、ネグレリア症、コクシジウ
ム症、ジアルジア鞭毛虫症、およびラムブル鞭毛虫症の病原体によって引起され
る感染症の予防薬として、およびその治療に適している。
【００５１】 本発明による方法および本発明による活性成分は、マラリア、睡眠病およびリ
ーシュマン症の治療に特に適している。
ーシュマン症の治療に特に適している。
【００５２】 本発明による活性成分は、細菌および植物の代謝経路の阻害にも適している。
従って、本発明によってＤＯＸＰ代謝経路の阻害剤として同定されている物質は
、除草剤としての使用、およびヒトおよび動物での細菌感染症の治療における使
用にも適している。
従って、本発明によってＤＯＸＰ代謝経路の阻害剤として同定されている物質は
、除草剤としての使用、およびヒトおよび動物での細菌感染症の治療における使
用にも適している。
【００５３】 治療に適当な家畜および飼育動物としては、哺乳類、例えばウシ、ウマ、ヒツ
ジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、水牛、ロバ、ウサギ、塩水および淡水魚、例えばマス
、鯉および鰻が挙げられる。適当な実験室動物および実験用動物としては、マウ
ス、ラット、モルモット、ゴールデンハムスター、イヌ、ネコおよびブタが挙げ
られる。適当なペットとしては、イヌおよびネコが挙げられる。適用は、予防お
よび治療用のいずれにすることもできる。活性成分の適用は、直接的であるか、
または腸内、非経口、皮内または鼻内のような当業者に知られている適当な製剤
の形態である。
ジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、水牛、ロバ、ウサギ、塩水および淡水魚、例えばマス
、鯉および鰻が挙げられる。適当な実験室動物および実験用動物としては、マウ
ス、ラット、モルモット、ゴールデンハムスター、イヌ、ネコおよびブタが挙げ
られる。適当なペットとしては、イヌおよびネコが挙げられる。適用は、予防お
よび治療用のいずれにすることもできる。活性成分の適用は、直接的であるか、
または腸内、非経口、皮内または鼻内のような当業者に知られている適当な製剤
の形態である。
【００５４】 本発明による活性成分は、当業者に知られている任意の感染防止薬と組み合わ
せて用いることができる。これらには、抗菌、抗寄生生物、抗ウイルスまたは殺
真菌作用を有する物質が挙げられる。これらの物質としては、レッドリスト(red
list)および専門家用文献（一般および特殊薬理学および毒物学(Allegemeine u
nd spezielle Pharmakolgie und Toxikologie)、Forth et al.著、BI-Wissensch
aftsverlag、Mannheim、１９９８年；抗生物質療法(Antibiotikatherapie)、Sim
on and Stille著、Schattauer-Verlag、Stuttgart、１９９３年）に記載されて
いる感染防止薬が挙げられる。
せて用いることができる。これらには、抗菌、抗寄生生物、抗ウイルスまたは殺
真菌作用を有する物質が挙げられる。これらの物質としては、レッドリスト(red
list)および専門家用文献（一般および特殊薬理学および毒物学(Allegemeine u
nd spezielle Pharmakolgie und Toxikologie)、Forth et al.著、BI-Wissensch
aftsverlag、Mannheim、１９９８年；抗生物質療法(Antibiotikatherapie)、Sim
on and Stille著、Schattauer-Verlag、Stuttgart、１９９３年）に記載されて
いる感染防止薬が挙げられる。
【００５５】 幾つかの寄生生物はメバロネート代謝経路およびＤＯＸＰ代謝経路の両方を有
するので、本発明はＤＯＸＰ代謝経路の阻害剤を、脂質の合成または吸収の阻害
剤、特にメバロネート代謝経路の阻害剤などの脂肪代謝経路を阻害する製剤との
組合せにも関する。酵素ＨＭＧ−ＣｏＡ−シンターゼの阻害剤、およびＨＭＧ−
ＣｏＡ−レダクターゼの阻害剤は、特に語る価値がある。ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダ
クターゼの阻害剤としては、特にロバスタチンおよび誘導体、メバスタチンおよ
び誘導体、コンパクチンおよび誘導体、シンバスタチンおよび誘導体、プラバス
タチンおよび誘導体、アトルバスタチンおよび誘導体、フルバスタチンおよび誘
導体、およびセリバスタチンおよび誘導体が挙げられる。
するので、本発明はＤＯＸＰ代謝経路の阻害剤を、脂質の合成または吸収の阻害
剤、特にメバロネート代謝経路の阻害剤などの脂肪代謝経路を阻害する製剤との
組合せにも関する。酵素ＨＭＧ−ＣｏＡ−シンターゼの阻害剤、およびＨＭＧ−
ＣｏＡ−レダクターゼの阻害剤は、特に語る価値がある。ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダ
クターゼの阻害剤としては、特にロバスタチンおよび誘導体、メバスタチンおよ
び誘導体、コンパクチンおよび誘導体、シンバスタチンおよび誘導体、プラバス
タチンおよび誘導体、アトルバスタチンおよび誘導体、フルバスタチンおよび誘
導体、およびセリバスタチンおよび誘導体が挙げられる。
【００５６】 例１ ＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼをコードするP. falciparumの遺伝子の発現ク
ローニング P. falciparumのＤＯＸ−レダクトイソメラーゼをコードする遺伝子を、マト
リックスとしてのゲノムＤＮＡの相当する配列のＰＣＲ増幅によってクローニン
グした。ゲノムＤＮＡを得るため、P. falciparum のHB3株をKerzentopf法によ
って培養した(Tranger und Jensen (1976), Science, 193, 673-675)。培地とし
て、ＲＰＭＩ１６４０（ＨＥＰＥＳおよびＬ−グルタミン含有、Gibco）に、１
０％ヒト血清、０．３μg／mlのゲンタマイシン、および０．１ｍＭのヒポキサ
ンチンを補足し、５％のヘマトクリットをヒト赤血球で調整した。培養体積がそ
れぞれ３５mlの１５個の培養皿を、約４％の寄生虫血症と共に用いて、ＤＮＡを
調製した。感染した赤血球を遠心分離によって回収し、キャリヤー緩衝液（５７
ｍＭ ＮａＣｌ、５８ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、７ｍＭ Ｋ２Ｈ
ＰＯ４、１１ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１４ｍＭグルコース）で２回洗浄した。寄生
生物を、細胞沈殿物を１０倍体積の１％サポニンをキャリヤー緩衝液に溶解した
もので氷上で５分間リーシスすることによって赤血球から放出させた（Kilejian
(1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4650-4653)。遊離した寄生生物を
、１％ＢＳＡをキャリヤー緩衝液に溶解したものを用いて遠心分離（１０分間、
１０，０００ｒｐｍ、４℃）によって２回洗浄した。得られた寄生生物からのＤ
ＮＡ調製は、標準的手続きによって行った。次に、寄生生物をプロテイナーゼＫ
で消化した。次に、分析物を、フェノール／クロロホルムで４回抽出し、ＤＮＡ
溶液をＴＥに対して一晩透析した後、イソプロパノールで沈澱した。下記のプラ
イマーをＰＣＲ増幅に用いた。 PfYAEMfor 5'-CAGAATTTCATATTACAAAATTAATAGATG-3' PfYAEMrev 5'-GTACTATGAAGAATTATGTTTGTTGTATAT-3'
ローニング P. falciparumのＤＯＸ−レダクトイソメラーゼをコードする遺伝子を、マト
リックスとしてのゲノムＤＮＡの相当する配列のＰＣＲ増幅によってクローニン
グした。ゲノムＤＮＡを得るため、P. falciparum のHB3株をKerzentopf法によ
って培養した(Tranger und Jensen (1976), Science, 193, 673-675)。培地とし
て、ＲＰＭＩ１６４０（ＨＥＰＥＳおよびＬ−グルタミン含有、Gibco）に、１
０％ヒト血清、０．３μg／mlのゲンタマイシン、および０．１ｍＭのヒポキサ
ンチンを補足し、５％のヘマトクリットをヒト赤血球で調整した。培養体積がそ
れぞれ３５mlの１５個の培養皿を、約４％の寄生虫血症と共に用いて、ＤＮＡを
調製した。感染した赤血球を遠心分離によって回収し、キャリヤー緩衝液（５７
ｍＭ ＮａＣｌ、５８ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、７ｍＭ Ｋ２Ｈ
ＰＯ４、１１ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１４ｍＭグルコース）で２回洗浄した。寄生
生物を、細胞沈殿物を１０倍体積の１％サポニンをキャリヤー緩衝液に溶解した
もので氷上で５分間リーシスすることによって赤血球から放出させた（Kilejian
(1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4650-4653)。遊離した寄生生物を
、１％ＢＳＡをキャリヤー緩衝液に溶解したものを用いて遠心分離（１０分間、
１０，０００ｒｐｍ、４℃）によって２回洗浄した。得られた寄生生物からのＤ
ＮＡ調製は、標準的手続きによって行った。次に、寄生生物をプロテイナーゼＫ
で消化した。次に、分析物を、フェノール／クロロホルムで４回抽出し、ＤＮＡ
溶液をＴＥに対して一晩透析した後、イソプロパノールで沈澱した。下記のプラ
イマーをＰＣＲ増幅に用いた。 PfYAEMfor 5'-CAGAATTTCATATTACAAAATTAATAGATG-3' PfYAEMrev 5'-GTACTATGAAGAATTATGTTTGTTGTATAT-3'
【００５７】 下記の分析法を、ＰＣＲ転換に用いた。 ３μl １０×ＰＣＲ緩衝液 ２．４μl ２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２．４μl ２５ｍＭ ｄＮＴＰ ２μl ＤＮＡマトリックス（０．２μg／ml） ２μlプライマー１（７．５μＭ） ２μlプライマー２（７．５μＭ） ０．２μl ｔａｇ−ポリメラーゼ（５Ｕ／μl） １６μl Ｈ２Ｏ
【００５８】 増幅は、下記のプロフィールで行った。 ３サイクル： ９６℃、１分 ４８℃、１分 ７２℃、３分 ３２サイクル： ９５℃、４０秒 ４８℃、１分 ７２℃、３分
【００５９】 最後のサイクルの後、分析物を７２℃で更に１０分間インキュベーションし、
総ての生成物を伸張した。この種の４個の分析物のＰＣＲ生成物を合わせて、０
．７％アガロースゲルを用いて精製した。アガロースブロックからのＤＮＡの溶
出は、「ＤＮＡ抽出用キット」(Millipore, Cat. No. S667)を用いて行った。溶
出したＤＮＡをエタノールで沈澱し、１０μl Ｈ２Ｏに吸収させた。次に、Ｐ
ＣＲ生成物を、ＴＡクローニングキット（イン・ビトロ遺伝子）を用いて製造業
者の指示に従ってクローニングした。インサート−ＤＮＡ ２０mgを用いて、連
結分析を行った。所望な組換えプラスミドを有する細菌のコロニーを、分析的プ
ラスミド調製およびプラスミドのＥｃｏＲＩ消化によって同定した。次に、クロ
ーニングしたＰＣＲ生成物を、標準の、前進および復帰プライマーを用いて配列
決定し、Walkings プライマー法を用いて完成した。
総ての生成物を伸張した。この種の４個の分析物のＰＣＲ生成物を合わせて、０
．７％アガロースゲルを用いて精製した。アガロースブロックからのＤＮＡの溶
出は、「ＤＮＡ抽出用キット」(Millipore, Cat. No. S667)を用いて行った。溶
出したＤＮＡをエタノールで沈澱し、１０μl Ｈ２Ｏに吸収させた。次に、Ｐ
ＣＲ生成物を、ＴＡクローニングキット（イン・ビトロ遺伝子）を用いて製造業
者の指示に従ってクローニングした。インサート−ＤＮＡ ２０mgを用いて、連
結分析を行った。所望な組換えプラスミドを有する細菌のコロニーを、分析的プ
ラスミド調製およびプラスミドのＥｃｏＲＩ消化によって同定した。次に、クロ
ーニングしたＰＣＲ生成物を、標準の、前進および復帰プライマーを用いて配列
決定し、Walkings プライマー法を用いて完成した。
【００６０】 ｐＣＲ２．１ベクターにおいて相当する配向で存在するＰＣＲ生成物を、発現
ベクターｐＢＫ−ＣＭＶ(Stratagene)で再クローニングし、ＣＯＳ−７細胞で発
現した。再クローニングは、２個のベクターのポリリンカーで見られる制限酵素
ＮｏｔＩおよびＢａｍＩの交差部分を介して行った。ＣＯＳ−７細胞のトランス
フェクションのため、ＰＣＲ生成物をインサートとして有する発現ベクターを、
アニオン交換クロマトグラフィー(Qiagen)により調製規模で生成した。
ベクターｐＢＫ−ＣＭＶ(Stratagene)で再クローニングし、ＣＯＳ−７細胞で発
現した。再クローニングは、２個のベクターのポリリンカーで見られる制限酵素
ＮｏｔＩおよびＢａｍＩの交差部分を介して行った。ＣＯＳ−７細胞のトランス
フェクションのため、ＰＣＲ生成物をインサートとして有する発現ベクターを、
アニオン交換クロマトグラフィー(Qiagen)により調製規模で生成した。
【００６１】 クローニングに用いた総ての方法は、J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniat
is (1989), 分子クローニング：実験室便覧、第２版(Molecular cloning: a lab
oratory manual, 2nd edition)、Cold Spring Habor Laboratory Press、Cold S
pring Habor、米国に詳細に記載されている。
is (1989), 分子クローニング：実験室便覧、第２版(Molecular cloning: a lab
oratory manual, 2nd edition)、Cold Spring Habor Laboratory Press、Cold S
pring Habor、米国に詳細に記載されている。
【００６２】 ＣＯＳ−７細胞は、標準的条件下にて１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で培養
した。細胞培養ボトル当たり、培地３０mlとした。１日前に分割しておいた集密
度約５０％の細胞を用いて、トランスフェクションを行った。ＤＯＴＡＰ(Boehr
inger)を、トランスフェクション試薬として用いた。ＤＮＡ溶液（０．５μg／m
l）４０μlを、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）１１０μlと混合した。Ｄ
ＯＴＡＰ１００μlも、ポリスチレン転換容器で２３０μlの２０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ（ｐＨ７．４）と混合した。次いで、ＤＮＡ溶液をＤＯＴＰ溶液に採取し、室
温で１５分間インキュベーションした。次に、分析物を培地２０mlと混合し、Ｃ
ＯＳ−７細胞の培地をこの混合物に代えた。翌日、細胞を、新鮮な培地と共に新
たな細胞培養ボトル に移した。更に４８時間インキュベーションした後、トラ
ンスフェクションしたＣＯＳ−７細胞を回収した。細胞をこの目的のために粉砕
し、分析緩衝液（１００ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＭｎＣ
ｌ２）中で遠心分離によって３回洗浄した。細胞を極少量の分析緩衝液に再懸濁
し、３回凍結（液体窒素中）および融解を行うことによって消化した。細胞断片
を１．５ml転換容器中で遠心分離し（１３，０００ｒｐｍ，１０分間，４℃）、
上清を用いて直ちに酵素活性を測定し、または酵素を精製した。
した。細胞培養ボトル当たり、培地３０mlとした。１日前に分割しておいた集密
度約５０％の細胞を用いて、トランスフェクションを行った。ＤＯＴＡＰ(Boehr
inger)を、トランスフェクション試薬として用いた。ＤＮＡ溶液（０．５μg／m
l）４０μlを、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）１１０μlと混合した。Ｄ
ＯＴＡＰ１００μlも、ポリスチレン転換容器で２３０μlの２０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ（ｐＨ７．４）と混合した。次いで、ＤＮＡ溶液をＤＯＴＰ溶液に採取し、室
温で１５分間インキュベーションした。次に、分析物を培地２０mlと混合し、Ｃ
ＯＳ−７細胞の培地をこの混合物に代えた。翌日、細胞を、新鮮な培地と共に新
たな細胞培養ボトル に移した。更に４８時間インキュベーションした後、トラ
ンスフェクションしたＣＯＳ−７細胞を回収した。細胞をこの目的のために粉砕
し、分析緩衝液（１００ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＭｎＣ
ｌ２）中で遠心分離によって３回洗浄した。細胞を極少量の分析緩衝液に再懸濁
し、３回凍結（液体窒素中）および融解を行うことによって消化した。細胞断片
を１．５ml転換容器中で遠心分離し（１３，０００ｒｐｍ，１０分間，４℃）、
上清を用いて直ちに酵素活性を測定し、または酵素を精製した。
【００６３】 例２ P. falciparumの組換えＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼの精製 ＣＯＳ−７細胞でP. falciparumの組換えＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼを
精製して、かなり均質にし、更に正確に特性決定を行った。精製はアフィニティ
ークロマトグラフィーおよびゲル浸透クロマトグラフィー段階で行った。P. fal
ciparumのＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼに対する抗体を、適当なアフィニテ
ィークロマトグラフィーカラムの生成のために製造した。一部は、特に高い抗原
効果が予測されるＤＮＡ配列から誘導されるアミノ酸配列からも選択した。適当
なペプチドを合成して、ウサギの免疫に用いた。得られる抗血清の品質は、合成
ペプチドとの反応性およびウェスタンブロット試験によって確かめた。ウェスタ
ンブロット試験(BM Western Blotting Kit, Boehringer)については、P. falcip
arumおよび組換えＣＯＳ細胞からの抽出物を用いた。
精製して、かなり均質にし、更に正確に特性決定を行った。精製はアフィニティ
ークロマトグラフィーおよびゲル浸透クロマトグラフィー段階で行った。P. fal
ciparumのＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼに対する抗体を、適当なアフィニテ
ィークロマトグラフィーカラムの生成のために製造した。一部は、特に高い抗原
効果が予測されるＤＮＡ配列から誘導されるアミノ酸配列からも選択した。適当
なペプチドを合成して、ウサギの免疫に用いた。得られる抗血清の品質は、合成
ペプチドとの反応性およびウェスタンブロット試験によって確かめた。ウェスタ
ンブロット試験(BM Western Blotting Kit, Boehringer)については、P. falcip
arumおよび組換えＣＯＳ細胞からの抽出物を用いた。
【００６４】 低分子アミンを除去するための抗血清をＰＢＳに対して透析し、アフィニティ
ークロマトグラフィーカラムを生成した。抗体をプロテインＡ−セファロースに
結合させ、ＤＭＰ(IgG Orientation Kit, Pierce)を用いる架橋によって共有的
にカップリングした。タンパク質抽出物は、例１で記載したように、トランスフ
ェクションしたＣＯＳ−７細胞を有する５５個の細胞培養ボトルから得て、分析
緩衝液で平衡にしたカラムに載荷した。分析緩衝液で過剰に洗浄した後、カラム
を溶出緩衝液（１００ｍＭ ＧｌｙｃｉｎＨＣｌ（ｐＨ２．８），０．４％ＣＨ
ＡＰＳ）で溶出した。溶出物は、直ちに１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）で
中和した。主画分を、ウェスタンブロット分析によって同定した。ビオチン化抗
体を検出に用いて、カラムから少量溶出した抗体による崩壊を回避した。主画分
を合わせて、分析緩衝液に対して透析し、限外濾過（３０Ｋｄａ，Amicon）によ
って濃縮した。分析緩衝液を投入および溶出緩衝液として用いてゲル浸透クロマ
トグラフィー(Superdex 200, Pharmacia)によって、更に精製を行った。主画分
を上記と同様にして同定し、合わせて、濃縮し、２０％グリセロールと反応させ
、−７０℃で凍結した。還元条件および銀染色(Gel Code Silver Stain Kit, Pi
erce)下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％アクリルアミド）の結果として、P. falc
iparumの精製したＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼは、５４ｋＤａの均一バンド
として示された。
ークロマトグラフィーカラムを生成した。抗体をプロテインＡ−セファロースに
結合させ、ＤＭＰ(IgG Orientation Kit, Pierce)を用いる架橋によって共有的
にカップリングした。タンパク質抽出物は、例１で記載したように、トランスフ
ェクションしたＣＯＳ−７細胞を有する５５個の細胞培養ボトルから得て、分析
緩衝液で平衡にしたカラムに載荷した。分析緩衝液で過剰に洗浄した後、カラム
を溶出緩衝液（１００ｍＭ ＧｌｙｃｉｎＨＣｌ（ｐＨ２．８），０．４％ＣＨ
ＡＰＳ）で溶出した。溶出物は、直ちに１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）で
中和した。主画分を、ウェスタンブロット分析によって同定した。ビオチン化抗
体を検出に用いて、カラムから少量溶出した抗体による崩壊を回避した。主画分
を合わせて、分析緩衝液に対して透析し、限外濾過（３０Ｋｄａ，Amicon）によ
って濃縮した。分析緩衝液を投入および溶出緩衝液として用いてゲル浸透クロマ
トグラフィー(Superdex 200, Pharmacia)によって、更に精製を行った。主画分
を上記と同様にして同定し、合わせて、濃縮し、２０％グリセロールと反応させ
、−７０℃で凍結した。還元条件および銀染色(Gel Code Silver Stain Kit, Pi
erce)下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％アクリルアミド）の結果として、P. falc
iparumの精製したＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼは、５４ｋＤａの均一バンド
として示された。
【００６５】 例３ 精製した酵素の活性の測定および阻害剤のスクリーニング 精製した酵素のＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼ活性を、イン・ビトロ試験装
置で確かめた。０．３ｍＭ ＮＡＤＰＨ、０．３ｍＭ ＤＯＸＰおよび１０μg
の組換え酵素を含む分析緩衝液１００μlを、典型的な試験分析に用いた。転換
は、ＤＯＸＰを完全な分析物に添加することによって開始した。ＮＡＤＰＨの酸
化は、３７℃の微量石英セルで３４０nmで光度法によって行った。この試験装置
を用いて、P. falciparumの組換えＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼの様々な物
質による阻害を示した。１μＭの３−（Ｎ−ホルミル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）
−プロピル−ホスホン酸一ナトリウム塩および１μＭの３−（Ｎ−アセチル−Ｎ
−ヒドロキシアミノ）−プロピル−ホスホン酸一ナトリウム塩を転換分析物に加
えたところ、３４０nmの吸収には変化が見られなかった。これらの条件下では、
P. falciparumのＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼは完全に阻害された。
置で確かめた。０．３ｍＭ ＮＡＤＰＨ、０．３ｍＭ ＤＯＸＰおよび１０μg
の組換え酵素を含む分析緩衝液１００μlを、典型的な試験分析に用いた。転換
は、ＤＯＸＰを完全な分析物に添加することによって開始した。ＮＡＤＰＨの酸
化は、３７℃の微量石英セルで３４０nmで光度法によって行った。この試験装置
を用いて、P. falciparumの組換えＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼの様々な物
質による阻害を示した。１μＭの３−（Ｎ−ホルミル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）
−プロピル−ホスホン酸一ナトリウム塩および１μＭの３−（Ｎ−アセチル−Ｎ
−ヒドロキシアミノ）−プロピル−ホスホン酸一ナトリウム塩を転換分析物に加
えたところ、３４０nmの吸収には変化が見られなかった。これらの条件下では、
P. falciparumのＤＯＸＰ−レダクトイソメラーゼは完全に阻害された。
【００６６】 例４ イン・ビボでのマラリアに対する物質の有効性の試験 様々な誘導体を、改良ピーターズ試験によって試験した。物質を、半数致死量
（ＬＤ５０）の１／４を加えた。試験分析において、１０匹のマウスに、マウス
マラリアの病原体であるPlasmodium vinckeiiを感染させた。感染が血液検査に
よって確認されたならば、４匹のマウスを治療し、治療を行わなかった６匹のマ
ウスは対照として用いた。１〜１０００mg／kg／日の３−（Ｎ−ホルミル−Ｎ−
ヒドロキシアミノ）−プロピル−ホスホン酸一ナトリウム塩で３日間治療したと
ころ、マウスの血液中の寄生生物は破壊された。治療群では、１日後だけでも生
存寄生生物は見られなかった。対照マウスは、寄生虫血症に感染した５日後には
、＞８０％が抹殺されねばならなかった。治療マウスは、治療終了後８週目でも
寄生生物は見られなかった。追加の実験では、５０mg／kg／日の３−（Ｎ−ホル
ミル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）−プロピル−ホスホン酸一ナトリウム塩は、寄生
虫血症のマウスの８０％で有効であった。これらのマウスでも、１日後には生存
寄生生物は見られなかった。３−（Ｎ−ホルミル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）−プ
ロピル−ホスホン酸一ナトリウム塩および３−（Ｎ−アセチル−Ｎ−ヒドロキシ
アミノ）−プロピル−ホスホン酸一ナトリウム塩についての他の結果を、図５に
示す。
（ＬＤ５０）の１／４を加えた。試験分析において、１０匹のマウスに、マウス
マラリアの病原体であるPlasmodium vinckeiiを感染させた。感染が血液検査に
よって確認されたならば、４匹のマウスを治療し、治療を行わなかった６匹のマ
ウスは対照として用いた。１〜１０００mg／kg／日の３−（Ｎ−ホルミル−Ｎ−
ヒドロキシアミノ）−プロピル−ホスホン酸一ナトリウム塩で３日間治療したと
ころ、マウスの血液中の寄生生物は破壊された。治療群では、１日後だけでも生
存寄生生物は見られなかった。対照マウスは、寄生虫血症に感染した５日後には
、＞８０％が抹殺されねばならなかった。治療マウスは、治療終了後８週目でも
寄生生物は見られなかった。追加の実験では、５０mg／kg／日の３−（Ｎ−ホル
ミル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）−プロピル−ホスホン酸一ナトリウム塩は、寄生
虫血症のマウスの８０％で有効であった。これらのマウスでも、１日後には生存
寄生生物は見られなかった。３−（Ｎ−ホルミル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）−プ
ロピル−ホスホン酸一ナトリウム塩および３−（Ｎ−アセチル−Ｎ−ヒドロキシ
アミノ）−プロピル−ホスホン酸一ナトリウム塩についての他の結果を、図５に
示す。
【００６７】 例５ 感染マウスを用いる実験でのマラリアの防御 イン・ビボでのマラリアに対する化合物の有効性を、体重が２０〜２５ｇの雄
マウスを用いて試験した。感染の１日前に、４匹のマウスに５０mg／kgの３−（
Ｎ−ホルミル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）−プロピル−ホスホン酸一ナトリウム塩
を腹腔内投与した。次に、マウスにPlasmodium vinckeiiを感染させた。物質で
前処理しなかったマウスは、対照として用いた。処理マウスには感染が見られな
かったが、対照マウスは、８０％以上が寄生虫血症で５日後には死亡した。処理
マウスには、感染から８週間後には寄生生物は見られなかった。
マウスを用いて試験した。感染の１日前に、４匹のマウスに５０mg／kgの３−（
Ｎ−ホルミル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）−プロピル−ホスホン酸一ナトリウム塩
を腹腔内投与した。次に、マウスにPlasmodium vinckeiiを感染させた。物質で
前処理しなかったマウスは、対照として用いた。処理マウスには感染が見られな
かったが、対照マウスは、８０％以上が寄生虫血症で５日後には死亡した。処理
マウスには、感染から８週間後には寄生生物は見られなかった。
【００６８】 例６ ＩＣ５０（寄生生物の成長力が半分まで減少する濃度）測定の原理によるマラリ
ア寄生虫の成長のイン・ビトロでの阻害 ＩＣ５０値を測定するため、マラリア寄生虫を、最初は阻害剤の存在下で完全
４８時間サイクル培養し、次の２４時間で生存率を［３Ｈ］−ヒポキサンチン挿
入によって測定した。３−（Ｎ−ホルミル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）−プロピル
−ホスホン酸一ナトリウム塩の希釈列を、１０倍濃縮した２０μl分量でマイク
ロタイタープレートに入れた。次に、寄生生物の培地懸濁液１８０μlをそれぞ
れのウェルに加えた。約０．４％寄生虫血症および２％ヘマトクリットの非同期
培養物を用いた。次に、マイクロタイタープレートを、４８時間インキュベーシ
ョンした。次いで、３０μlの［３Ｈ］−ヒポキサンチンをそれぞれのウェルに
加えた。２４時間インキュベーションした後、細胞を回収し、取込まれた放射能
を測定した。他のマラリア薬に対して既知の耐性を有するＨＢ３、Ａ２およびＤ
ｄ２株を用いた結果を、図６ａ、６ｂおよび６ｃに示す。いずれの菌株でも、Ｉ
Ｃ５０値は０．５μＭを下回っている。これらの菌株の耐性は、 Plasmodium falciparum HB3（ホンデュラス）は、ピリメタミンに耐性である
。 Plasmodium falciparum Dd2（インドシナ）は、クロロキン、キニン、ピリメ
タミン、シクログアニルおよびスルファドキシンに耐性である。 Plasmodium falciparum A2（ガンビア）は、クロロキンおよびシクログアニル
に耐性である。
ア寄生虫の成長のイン・ビトロでの阻害 ＩＣ５０値を測定するため、マラリア寄生虫を、最初は阻害剤の存在下で完全
４８時間サイクル培養し、次の２４時間で生存率を［３Ｈ］−ヒポキサンチン挿
入によって測定した。３−（Ｎ−ホルミル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）−プロピル
−ホスホン酸一ナトリウム塩の希釈列を、１０倍濃縮した２０μl分量でマイク
ロタイタープレートに入れた。次に、寄生生物の培地懸濁液１８０μlをそれぞ
れのウェルに加えた。約０．４％寄生虫血症および２％ヘマトクリットの非同期
培養物を用いた。次に、マイクロタイタープレートを、４８時間インキュベーシ
ョンした。次いで、３０μlの［３Ｈ］−ヒポキサンチンをそれぞれのウェルに
加えた。２４時間インキュベーションした後、細胞を回収し、取込まれた放射能
を測定した。他のマラリア薬に対して既知の耐性を有するＨＢ３、Ａ２およびＤ
ｄ２株を用いた結果を、図６ａ、６ｂおよび６ｃに示す。いずれの菌株でも、Ｉ
Ｃ５０値は０．５μＭを下回っている。これらの菌株の耐性は、 Plasmodium falciparum HB3（ホンデュラス）は、ピリメタミンに耐性である
。 Plasmodium falciparum Dd2（インドシナ）は、クロロキン、キニン、ピリメ
タミン、シクログアニルおよびスルファドキシンに耐性である。 Plasmodium falciparum A2（ガンビア）は、クロロキンおよびシクログアニル
に耐性である。
【００６９】 交差耐性は、抗マラリア製剤には見られなかった。
【００７０】
【配列表】
【図１ａ】 Plasmodium falciparum 由来のタンパク質１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−
５−リン酸−レダクトイソメラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列。
５−リン酸−レダクトイソメラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列。
【図１ｂ】 Plasmodium falciparum 由来のタンパク質１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−
５−リン酸−シンターゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列。
５−リン酸−シンターゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列。
【図２ａ】 Plasmodium falciparum 由来のタンパク質１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−
５−リン酸−レダクトイソメラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列およ
び相当するアミノ酸配列。
５−リン酸−レダクトイソメラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列およ
び相当するアミノ酸配列。
【図２ｂ】 Plasmodium falciparum 由来のタンパク質１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−
５−リン酸−シンターゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列および相当する
アミノ酸配列。
５−リン酸−シンターゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列および相当する
アミノ酸配列。
【図３ａ】 Plasmodium falciparum 由来のタンパク質１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−
５−リン酸−レダクトイソメラーゼのアミノ酸配列。
５−リン酸−レダクトイソメラーゼのアミノ酸配列。
【図３ｂ】 Plasmodium falciparum 由来のタンパク質１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−
５−リン酸−シンターゼのアミノ酸配列。
５−リン酸−シンターゼのアミノ酸配列。
【図４ａ】 図１ｂに記載のヌクレオチド配列からの詳細。
【図４ｂ】 図２ｂに記載の相当するアミノ酸配列を有するヌクレオチド配列からの詳細。
【図４ｃ】 図３ｂに記載のアミノ酸配列からの詳細。
【図５】 物質をそれぞれ３用量での治療の４日後の寄生虫血症値についてのイン・ビボ
データー。 ホルミル：３−（Ｎ−ホルミル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）−プロピル−ホスホ
ン酸一ナトリウム塩に相当し、 アセチル：３−（Ｎ−アセチル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）−プロピル−ホスホ
ン酸一ナトリウム塩に相当する。
データー。 ホルミル：３−（Ｎ−ホルミル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）−プロピル−ホスホ
ン酸一ナトリウム塩に相当し、 アセチル：３−（Ｎ−アセチル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）−プロピル−ホスホ
ン酸一ナトリウム塩に相当する。
【図６ａ】 ３−（Ｎ−ホルミル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）−プロピル−ホスホン酸一ナト
リウム塩（白丸）および３−（Ｎ−アセチル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）−プロピ
ル−ホスホン酸一ナトリウム塩（黒丸）をＨＢ３株について添加した後のP. fal
ciparumの成長の阻害。
リウム塩（白丸）および３−（Ｎ−アセチル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）−プロピ
ル−ホスホン酸一ナトリウム塩（黒丸）をＨＢ３株について添加した後のP. fal
ciparumの成長の阻害。
【図６ｂ】 ３−（Ｎ−ホルミル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）−プロピル−ホスホン酸一ナト
リウム塩（白丸）および３−（Ｎ−アセチル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）−プロピ
ル−ホスホン酸一ナトリウム塩（黒丸）をＡ２株について添加した後のP. falci
parumの成長の阻害。
リウム塩（白丸）および３−（Ｎ−アセチル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）−プロピ
ル−ホスホン酸一ナトリウム塩（黒丸）をＡ２株について添加した後のP. falci
parumの成長の阻害。
【図６ｃ】 ３−（Ｎ−ホルミル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）−プロピル−ホスホン酸一ナト
リウム塩（白丸）および３−（Ｎ−アセチル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）−プロピ
ル−ホスホン酸一ナトリウム塩（黒丸）をＤｄ２株について添加した後のP. fal
ciparumの成長の阻害。
リウム塩（白丸）および３−（Ｎ−アセチル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）−プロピ
ル−ホスホン酸一ナトリウム塩（黒丸）をＤｄ２株について添加した後のP. fal
ciparumの成長の阻害。
【図７】 古典的アセテート／メバロネート生合成経路と、代替ＤＯＸ−Ｐ−生合成経路
との比較。
との比較。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１１月３０日（２０００．１１．３０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 33/00 Ａ６１Ｐ 33/00 33/02 33/02 33/06 33/06 33/10 33/10 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 16/00 Ｃ０７Ｋ 16/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/90 9/90 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ａ６１Ｋ 31/662 Ｃ１２Ｑ 1/68 31:366） //(Ａ６１Ｋ 31/662 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 31:366） 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 １９８ ２８ ０９７．１ (32)優先日 平成10年６月24日(1998．6．24) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９８ ３１ ６３７．２ (32)優先日 平成10年７月15日(1998．7．15) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９８ ３１ ６３９．９ (32)優先日 平成10年７月15日(1998．7．15) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９８ ３１ ６３８．０ (32)優先日 平成10年７月15日(1998．7．15) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９８ ４３ ２７９．８ (32)優先日 平成10年９月22日(1998．9．22) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＳＧ，ＳＫ，ＴＲ，ＵＳ
Claims (33)
- 【請求項１】 単細胞または多細胞寄生生物によって引起される感染性疾患の治療に適する化
学活性成分を得る方法であって、１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸
の代謝経路に関与するタンパク質または同様に作用するその誘導体を、寄生生物
に関する活性を検討する活性成分と接触させ、タンパク質またはその誘導体を阻
害する活性成分を選択することを特徴とする、方法。 - 【請求項２】 タンパク質が、下記段階ａ）〜ｉ）： ａ） グリセルアルデヒドおよびピルベートを１−デソキシ−Ｄ−キシルロース
に転換する、 ｂ） グリセルアルデヒド−３−リン酸およびピルベートをイソペンテニル二リ
ン酸形態に転換する、 ｃ） １−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸を形成する、 ｄ） グリセルアルデヒド−３−リン酸およびピルベートを１−デソキシ−Ｄ−
キシルロース−５−リン酸形態に転換する、 ｅ） １−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸を転換する、 ｆ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸を形成する、 ｇ） １−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エ
リトリトール−４−リン酸に転換する、 ｈ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸を転換する、 ｉ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸をイソペンテニル二リ
ン酸に転換する の少なくとも１つに関与している、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 活性成分が、関与する酵素または関与する補助因子の生産、特に、酵素１−デ
ソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸−シンターゼまたは１−デソキシ−Ｄ−
キシルロース−５−リン酸−レダクトイソメラーゼの転換、を阻害し、または関
与する酵素または関与する補助因子の分解を促進する、請求項１または２に記載
の方法。 - 【請求項４】 １−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸−シンターゼ活性を有するまた
は有さないタンパク質であって、１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸
代謝経路に関与し、ａ）図１ｂおよび２ｂに示されるＤＮＡ配列からコードされ
るか、またはｂ）図１ｂまたは２ｂに示されるＤＮＡ配列または成熟タンパク質
をコードするＤＮＡ領域におけるこれらのＤＮＡ配列の断片とハイブリダイズす
るＤＮＡ配列からコードされるタンパク質。 - 【請求項５】 １−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸−レダクトイソメラーゼ活性を
有するまたは有さないタンパク質であって、１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−
５−リン酸代謝経路に関与し、ａ）図１ｂおよび２ｂに示されるＤＮＡ配列から
コードされるか、またはｂ）図１ｂまたは２ｂに示されるＤＮＡ配列または成熟
タンパク質をコードするＤＮＡ領域におけるこれらのＤＮＡ配列の断片とハイブ
リダイズするＤＮＡ配列からコードされることを特徴とするタンパク質。 - 【請求項６】 寄生生物の培養上清からまたは消化した寄生生物からクロマトグラフィーおよ
び電気泳動法による精製により得ることができることを特徴とする、請求項４ま
たは５に記載のタンパク質、および１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン
酸代謝経路に関与するタンパク質。 - 【請求項７】 ａ）外来ＤＮＡの原核または真核発現の生成物であり、ｂ）配列１ａ、１ｂ、
２ａまたは２ｂからコードされ、または図１ａ、１ｂ、２ａまたは２ｂに示され
るＤＮＡ配列または成熟タンパク質をコードするＤＮＡ領域におけるこれらのＤ
ＮＡ配列の断片とハイブリダイズするＤＮＡ配列からコードされ、またはｃ）遺
伝子コードの縮重なしにｂ）において定義された配列とハイブリダイズし、かつ
対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列からコード
される、請求項４〜６のいずれか１項に記載のタンパク質。 - 【請求項８】 配列２ａ、２ｂ、３ａ、または３ｂのアミノ酸からなる、請求項４〜７のいず
れか１項に記載のタンパク質。 - 【請求項９】 タンパク質が１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸−シンターゼまた
は１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸−レダクトイソメラーゼである
、請求項４〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。 - 【請求項１０】 ａ）図１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂに示されるＤＮＡ配列、または相補的ＤＮＡ配
列、ｂ）ａ）からの配列とハイブリダイズする核酸配列、ｃ）遺伝子コードの縮
重なしにａ）またはｂ）に記載される配列の１つとハイブリダイズする核酸配列
の群から選択される、請求項４〜９のいずれか１項に記載のタンパク質をコード
する核酸。 - 【請求項１１】 図１ａに示される配列、図１ｂに示される配列、図２ａに示される配列、およ
び図２ｂに示される配列からなる群から選択される配列を有することを特徴とす
る、ＤＮＡ。 - 【請求項１２】 請求項４〜９のいずれか１項に記載のタンパク質をコードし、かつ形質転換し
た微生物または形質転換した真核細胞または動物または植物でタンパク質コード
ＤＮＡを発現するＤＮＡを含む組換え発現ベクター。 - 【請求項１３】 請求項４〜９のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするＤＮＡでトラン
スフェクションされ、かつ上記タンパク質を産生することができる、宿主細胞、
特に原核宿主細胞、真核宿主細胞、動物および植物。 - 【請求項１４】 E. coliまたは哺乳類細胞系である、請求項１３に記載の宿主細胞。
- 【請求項１５】 原核または真核生物のトランスフェクションのための、請求項４〜９のいずれ
か１項に記載のタンパク質をコードするＤＮＡの使用。 - 【請求項１６】 タンパク質が、クロマトグラフィーおよび電気泳動法によって、寄生生物また
は寄生生物培養物の培養上清から得られる、請求項１〜３のいずれか１項に記載
の方法。 - 【請求項１７】 タンパク質が、適当な宿主細胞中で請求項４〜９のいずれか１項に記載のタン
パク質をコードするＤＮＡの発現、および宿主細胞または宿主細胞の培養上清か
らのタンパク質の単離によって組換え的に産生される、請求項１〜３および１６
のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１８】 請求項４〜８のいずれか１項に記載の１−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−
リン酸代謝経路由来のタンパク質に結合する抗体を産生するための抗原または免
疫原としての、このタンパク質の使用。 - 【請求項１９】 イン・ビトロでの免疫法によって、または動物を請求項１〜１８のいずれか１
項に記載のタンパク質で免役し、免役した動物の血清または脾臓細胞から抗体を
得ることによって得ることができる、請求項４〜９のいずれか１項に記載の１−
デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸代謝経路由来のタンパク質に対する抗
体。 - 【請求項２０】 抗寄生生物的に作用する物質を同定するための、請求項４〜９のいずれか１項
に記載のタンパク質の使用。 - 【請求項２１】 抗寄生生物的に作用する物質を同定するための、請求項１９に記載の抗体の使
用。 - 【請求項２２】 検討を行う試料を、ａ）図１ａおよびｂに示されるＤＮＡ配列またはその相補
的配列、ｂ）ａ）の配列の１つとハイブリダイズする核酸からなる群から選択さ
れる核酸プローブとともにインキュベーションし、核酸プローブを試料の核酸と
ともにインキュベーションし、そしてハイブリダイゼーションが場合によっては
核酸プローブの他の結合相手によって検出される、請求項４〜９のいずれか１項
に記載のタンパク質をコードする核酸の同定法。 - 【請求項２３】 検出される核酸を検出前に増幅する、請求項２３に記載の方法。
- 【請求項２４】 抗寄生生物的に作用する物質を同定するための、請求項１〜２３のいずれか１
項に記載のタンパク質を用いる試験装置。 - 【請求項２５】 請求項２４に記載の試験装置を用いて同定されることを特徴とする、単細胞ま
たは多細胞寄生生物によって引起される感染性疾患を治療するための医薬組成物
を製造するための活性成分。 - 【請求項２６】 請求項２４に記載の試験装置を用いて同定されることを特徴とする、細菌によ
って引起される感染性疾患を治療するための除草剤または医薬組成物を製造する
ための活性成分。 - 【請求項２７】 １−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸代謝経路の酵素または補助因子
を阻害することを特徴とする、単細胞または多細胞寄生生物によって引起される
感染性疾患を治療するための医薬組成物を製造するための活性成分。 - 【請求項２８】 活性成分が、下記の段階ａ）〜ｉ）： ａ） グリセルアルデヒドおよびピルベートを１−デソキシ−Ｄ−キシルロース
に転換する、 ｂ） グリセルアルデヒド−３−リン酸およびピルベートをイソペンテニル二リ
ン酸形態に転換する、 ｃ） １−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸を形成する、 ｄ） グリセルアルデヒド−３−リン酸およびピルベートを１−デソキシ−Ｄ−
キシルロース−５−リン酸形態に転換する、 ｅ） １−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸を転換する、 ｆ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸を形成する、 ｇ） １−デソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エ
リトリトール−４−リン酸に転換する、 ｈ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸を転換する、 ｉ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸をイソペンテニル二リ
ン酸に転換する の少なくとも１つを阻害する、請求項２５または２７に記載の活性成分。 - 【請求項２９】 活性成分が、関与する酵素または関与する補助因子の産生、特に、酵素１−デ
ソキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸−シンターゼまたは１−デソキシ−Ｄ−
キシルロース−５−リン酸−レダクトイソメラーゼの転換、を阻害し、または関
与する酵素または関与する補助因子の分解を促進する、請求項２５、２７または
２８のいずれか１項に記載の活性成分。 - 【請求項３０】 活性成分が３−（Ｎ−アセチル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）−プロピルホスホネ
ートまたは３−（Ｎ−ホルミル−Ｎ−ヒドロキシアミノ）−プロピル−ホスホネ
ートである、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の活性成分。 - 【請求項３１】 単細胞または多細胞寄生生物によって引起される感染性疾患、特にマラリア、
睡眠病およびリーシュマニア症、を治療するための医薬組成物を製造するための
、請求項２５、２７〜３０のいずれか１項に記載の活性成分の使用。 - 【請求項３２】 医薬組成物が、脂肪代謝経路、コレステロール合成、またはコレステロール吸
収の阻害剤からなる群からの１または複数の成分を更に含んでなる、請求項３１
に記載の使用。 - 【請求項３３】 脂肪代謝の阻害剤がＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ阻害剤またはＨＭＧ−Ｃｏ
Ａ−シンターゼ阻害剤であり、特にロバスタチン、メバスタチン、コンパクチン
、シンバスタチン、プラバスタチン、アトルバスタチン、フルバスタチン、およ
びセリバスタチンである、請求項３２に記載の使用。
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