JP2001520037A - 新規なヒトチェックポイントキナーゼ、ｈＣＤＳ１、組成物および方法 - Google Patents
新規なヒトチェックポイントキナーゼ、ｈＣＤＳ１、組成物および方法Info
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- JP2001520037A JP2001520037A JP2000517068A JP2000517068A JP2001520037A JP 2001520037 A JP2001520037 A JP 2001520037A JP 2000517068 A JP2000517068 A JP 2000517068A JP 2000517068 A JP2000517068 A JP 2000517068A JP 2001520037 A JP2001520037 A JP 2001520037A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
(57)【要約】
本発明は、新規なヒトチェックポイントキナーゼ遺伝子、ｈＣＤＳ１、翻訳されたタンパク質、組成物、方法およびキットを提供する。
Description
【０００１】 発明の背景 分裂中の細胞にとって、ゲノムの統合性は最も重要である。ＤＮＡ損傷への応
答において、真核細胞は細胞周期の進行を遅らせるチェックポイント制御の複合
システムに頼っている。正常な真核細胞の周期は、４つの時期（順にＧ１、Ｓ、
Ｇ２、Ｍ）に分けられ、これらの時期は異なる細胞形態および生化学的活性に関
連しており、細胞周期から逸脱した細胞はＧ０または非周期状態にあると言われ
る。細胞周期内の細胞が活発に複製を行っているとき、Ｓ期においてＤＮＡの複
製が起こり、Ｍ期において細胞の活発な分裂が起こる。一般には、ベンジャミン
・レーヴィン（Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ）の「遺伝子第６版（ＧＥＮＥＳ ＶＩ ）」（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒ
ｄ， ＧＢ， Ｃｈａｐｔｅｒ ３６， １９９７）を参照のこと。ＤＮＡは真
核細胞内において、連続してさらに高度な有機体に組織されて、最終的には染色
体が形成される。非性染色体は通常は対をなして存在し、細胞分裂の間に、各染
色体のＤＮＡが複製されて対になった染色分体が生じる［一般には、ベンジャミ
ン・レーヴィンの「遺伝子第６版」（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐ
ｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ＧＢ， Ｃｈａｐｔｅｒ ５， １９９７）を参
照のこと］。
答において、真核細胞は細胞周期の進行を遅らせるチェックポイント制御の複合
システムに頼っている。正常な真核細胞の周期は、４つの時期（順にＧ１、Ｓ、
Ｇ２、Ｍ）に分けられ、これらの時期は異なる細胞形態および生化学的活性に関
連しており、細胞周期から逸脱した細胞はＧ０または非周期状態にあると言われ
る。細胞周期内の細胞が活発に複製を行っているとき、Ｓ期においてＤＮＡの複
製が起こり、Ｍ期において細胞の活発な分裂が起こる。一般には、ベンジャミン
・レーヴィン（Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ）の「遺伝子第６版（ＧＥＮＥＳ ＶＩ ）」（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒ
ｄ， ＧＢ， Ｃｈａｐｔｅｒ ３６， １９９７）を参照のこと。ＤＮＡは真
核細胞内において、連続してさらに高度な有機体に組織されて、最終的には染色
体が形成される。非性染色体は通常は対をなして存在し、細胞分裂の間に、各染
色体のＤＮＡが複製されて対になった染色分体が生じる［一般には、ベンジャミ
ン・レーヴィンの「遺伝子第６版」（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐ
ｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ＧＢ， Ｃｈａｐｔｅｒ ５， １９９７）を参
照のこと］。
【０００２】 チェックポイント遅延は、Ｓ期におけるＤＮＡの複製前ならびにＭ期における
染色分体の分離前に、損傷したＤＮＡを修復するための時間を提供する（Ｈａｒ
ｔｗｅｌｌ ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒｔ， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４
６： ６２９−６３４）。多くの場合において、ＤＮＡ損傷の反応経路は、サイ
クリン依存性キナーゼの活性を阻害することによる細胞周期停止をもたらす（Ｅ
ｌｌｅｄｇｅ， １９９７， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７４： １６６４−１６７
１）。ヒトの細胞において、ＤＮＡ損傷によって誘導されるＧ２遅延は、Ｃｄｃ
２の阻害的リン酸化に大いに依存し（Ｂｌａｓｉｎａら， １９９７， Ｍｏｌ ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ， ８： １−１１； Ｊｉｎら， １９９６， Ｊ ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ， １３４： ９６３−９７０）、したがってＣｄｃ
２に作用する対抗キナーゼおよびホスファターゼの活性における変化に起因する
ようである。しかしながら、これらの酵素の活性が実際にＤＮＡ損傷に応答して
変化するという証拠は得られていない（Ｐｏｏｎら， １９９７， Ｃａｎｃｅ ｒ Ｒｅｓ． ， ５７： ５１６８−５１７８）。
染色分体の分離前に、損傷したＤＮＡを修復するための時間を提供する（Ｈａｒ
ｔｗｅｌｌ ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒｔ， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４
６： ６２９−６３４）。多くの場合において、ＤＮＡ損傷の反応経路は、サイ
クリン依存性キナーゼの活性を阻害することによる細胞周期停止をもたらす（Ｅ
ｌｌｅｄｇｅ， １９９７， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７４： １６６４−１６７
１）。ヒトの細胞において、ＤＮＡ損傷によって誘導されるＧ２遅延は、Ｃｄｃ
２の阻害的リン酸化に大いに依存し（Ｂｌａｓｉｎａら， １９９７， Ｍｏｌ ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ， ８： １−１１； Ｊｉｎら， １９９６， Ｊ ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ， １３４： ９６３−９７０）、したがってＣｄｃ
２に作用する対抗キナーゼおよびホスファターゼの活性における変化に起因する
ようである。しかしながら、これらの酵素の活性が実際にＤＮＡ損傷に応答して
変化するという証拠は得られていない（Ｐｏｏｎら， １９９７， Ｃａｎｃｅ ｒ Ｒｅｓ． ， ５７： ５１６８−５１７８）。
【０００３】 ヒト細胞内においては、３つの異なるＣｄｃ２５タンパク質が発現される。Ｃ
ｄｃ２５ＡはＧ１−Ｓ間の遷移に特に必要とされ（Ｈｏｆｆｍａｎｎら， １９
９４， ＥＭＢＯ Ｊ．， １３： ４３０２−４３１０； Ｊｉｎｎｏら，
１９９４， ＥＭＢＯ Ｊ．， １３： １５４９−１５５６）、Ｃｄｃ２５Ｂ
およびＣｄｃ２５Ｃは、Ｇ２−Ｍ間の遷移に必要とされる（Ｇａｂｒｉｅｌｌｉ
ら， １９９６， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．， ７： １０８１−１０９３；
Ｇａｌａｋｔｉｏｎｏｖら， １９９１， Ｃｅｌｌ， ６７： １１８１−
１１９４； Ｍｉｌｌａｒら， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ， ８８： １０５００−１０５０４； Ｎｉｓｈｉｊ
ｉｍａら， １９９７， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １３８： １１０５
−１１１６）。Ｍ期の進行に対するＣｄｃ２５ＢおよびＣｄｃ２５Ｃの正確な寄
与については知られていない。
ｄｃ２５ＡはＧ１−Ｓ間の遷移に特に必要とされ（Ｈｏｆｆｍａｎｎら， １９
９４， ＥＭＢＯ Ｊ．， １３： ４３０２−４３１０； Ｊｉｎｎｏら，
１９９４， ＥＭＢＯ Ｊ．， １３： １５４９−１５５６）、Ｃｄｃ２５Ｂ
およびＣｄｃ２５Ｃは、Ｇ２−Ｍ間の遷移に必要とされる（Ｇａｂｒｉｅｌｌｉ
ら， １９９６， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．， ７： １０８１−１０９３；
Ｇａｌａｋｔｉｏｎｏｖら， １９９１， Ｃｅｌｌ， ６７： １１８１−
１１９４； Ｍｉｌｌａｒら， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ， ８８： １０５００−１０５０４； Ｎｉｓｈｉｊ
ｉｍａら， １９９７， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １３８： １１０５
−１１１６）。Ｍ期の進行に対するＣｄｃ２５ＢおよびＣｄｃ２５Ｃの正確な寄
与については知られていない。
【０００４】 チェックポイント制御に関する我の現在の知識の殆どは、出芽酵母（サッカロ
マイセス・セルビシアエ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）および分裂酵母（シゾサッカロマイセス・ポンベ：Ｓｃｉｚｏｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）を用いた研究から得られたものである。我々が現在
の認識している酵母およびより高等な真核生物における細胞周期チェックポイン
トに関する報告の多くは、最近発行されたものである（Ｈａｒｔｗｅｌｌ ＆
Ｋａｓｔａｎ， １９９４， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６６： １８２１−１８２
８； Ｍｕｒｒａｙ， １９９４， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ６：
８７２−８７６； Ｅｌｌｅｄｇｅ， １９９６， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７
４： １６６４−１６７２； Ｋａｕｆｍａｎｎ ＆ Ｐａｕｌｅｓ， １９９
６， ＦＡＳＥＢ Ｊ．， １０： ２３８−２４７）。分裂酵母において、６
つの遺伝子産物ｒａｄ１＋、ｒａｄ３＋、ｒａｄ９＋、ｒａｄ１７＋、ｒａｄ２
６＋、およびｈｕｓ１＋が、ＤＮＡ損傷依存性およびＤＮＡ複製依存性チェック
ポイント経路の両方の構成要素として同定されている。さらに、ｃｄｓ１＋は、
ＤＮＡ複製依存性チェックポイントのために必要であることが確認されており、
ｒａｄ２７＋／ｃｈｋ１＋は、酵母ＤＮＡ損傷依存性チェックポイントのために
必要であることが確認されている。
マイセス・セルビシアエ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）および分裂酵母（シゾサッカロマイセス・ポンベ：Ｓｃｉｚｏｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）を用いた研究から得られたものである。我々が現在
の認識している酵母およびより高等な真核生物における細胞周期チェックポイン
トに関する報告の多くは、最近発行されたものである（Ｈａｒｔｗｅｌｌ ＆
Ｋａｓｔａｎ， １９９４， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６６： １８２１−１８２
８； Ｍｕｒｒａｙ， １９９４， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ６：
８７２−８７６； Ｅｌｌｅｄｇｅ， １９９６， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７
４： １６６４−１６７２； Ｋａｕｆｍａｎｎ ＆ Ｐａｕｌｅｓ， １９９
６， ＦＡＳＥＢ Ｊ．， １０： ２３８−２４７）。分裂酵母において、６
つの遺伝子産物ｒａｄ１＋、ｒａｄ３＋、ｒａｄ９＋、ｒａｄ１７＋、ｒａｄ２
６＋、およびｈｕｓ１＋が、ＤＮＡ損傷依存性およびＤＮＡ複製依存性チェック
ポイント経路の両方の構成要素として同定されている。さらに、ｃｄｓ１＋は、
ＤＮＡ複製依存性チェックポイントのために必要であることが確認されており、
ｒａｄ２７＋／ｃｈｋ１＋は、酵母ＤＮＡ損傷依存性チェックポイントのために
必要であることが確認されている。
【０００５】 これらの遺伝子のいくつかは、出芽酵母内において構造的相同性を有しており
、また最近になって、Ｓ．ｐｏｍｂｅ ｒａｄ３＋の２種のヒトホモログ、すな
わち、ＡＴＭ（毛細管拡張性運動失調変異体）（Ｓａｖｉｔｓｋｙら， １９９
５， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２６８： １７４９−１７５３）およびＡＴＲ（毛細
管拡張性運動失調およびｒａｄ３＋に関係する）（Ｂｅｎｔｌｅｙら、 １９９
６， ＥＭＢＯ Ｊ．， １５： ６６４１−６６５１； Ｃｉｍｐｒｉｃｈら
， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，
９３： ２８５０−２８５５）のクローニング、ならびにＳ．ｐｏｍｂｅ ｒａ
ｄ９＋のヒトホモログ（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎ ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ）のクローニングにより、さらなる真
核生物間における保存性が示唆されてきた。
、また最近になって、Ｓ．ｐｏｍｂｅ ｒａｄ３＋の２種のヒトホモログ、すな
わち、ＡＴＭ（毛細管拡張性運動失調変異体）（Ｓａｖｉｔｓｋｙら， １９９
５， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２６８： １７４９−１７５３）およびＡＴＲ（毛細
管拡張性運動失調およびｒａｄ３＋に関係する）（Ｂｅｎｔｌｅｙら、 １９９
６， ＥＭＢＯ Ｊ．， １５： ６６４１−６６５１； Ｃｉｍｐｒｉｃｈら
， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，
９３： ２８５０−２８５５）のクローニング、ならびにＳ．ｐｏｍｂｅ ｒａ
ｄ９＋のヒトホモログ（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎ ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ）のクローニングにより、さらなる真
核生物間における保存性が示唆されてきた。
【０００６】 酵母のチェックポイントタンパク質および遺伝子については多くのことが知ら
れているが、そうした知識は、対応するヒトの遺伝子またはタンパク質の存在、
あるいはヒト細胞周期の制御や調節におけるそれらのエフェクター機能を完全に
予期するものではない。
れているが、そうした知識は、対応するヒトの遺伝子またはタンパク質の存在、
あるいはヒト細胞周期の制御や調節におけるそれらのエフェクター機能を完全に
予期するものではない。
【０００７】 癌の影響を改善するための新しい、より効果的な治療および治療薬を開発する
ためには、ヒトチェックポイントタンパク質を同定してその特徴を調べ、それら
の活性のメディエーターを同定することが重要になってくる。
ためには、ヒトチェックポイントタンパク質を同定してその特徴を調べ、それら
の活性のメディエーターを同定することが重要になってくる。
【０００８】 （発明の要約） 本発明は、新規なヒトチェックポイントキナーゼ遺伝子ｈＣＤＳ１、タンパク
質、およびｈＣＤＳ１の生産および使用のための構築物および方法を目的として
いる。
質、およびｈＣＤＳ１の生産および使用のための構築物および方法を目的として
いる。
【０００９】 詳細には、本発明は、配列番号１の核酸配列からなるｈＣＤＳ１をコードする
核酸配列を包含する。詳細には、本発明は、ｈＣＤＳ１タンパク質に翻訳される
配列番号１の核酸配列の６６位〜１６９５位の核酸配列を包含する。本発明はま
た、配列番号１の核酸配列を含む核酸構築物、ベクター、プラスミド、コスミド
なども包含する。詳細には、本発明は、配列番号１の核酸配列を含み、該核酸配
列からタンパク質を発現することのできる核酸ベクター構築物を提供する。本発
明は、真核細胞または原核細胞に関わらず、宿主細胞の形質転換に適するか、ウ
ィルスベクターへの組込みに適するか、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏ（試験管内）
におけるタンパク質の発現に適する核酸ベクターを包含する。本発明はさらに、
配列番号１の核酸によってコードされるタンパク質の少なくとも機能性フラグメ
ントを含む融合タンパク質産物を生産するために、別の核酸配列と縦列させるか
、あるいは他の方法で結合させた、配列番号１の核酸配列を実現する。本発明は
さらに、標的細胞中への組込みと発現のための裸のＤＮＡ形質転換体として使用
するように適用された配列番号１の核酸配列をも包含する。本発明はまた、配列
番号１の核酸配列の連続部分または不連続部分のいずれに相補的であるかに関わ
らず、配列番号１の核酸配列およびそのフラグメントに相補的な、アンチセンス
ＤＮＡ分子調製物を提供する。本発明はまた、配列番号１の核酸配列、その相補
体、またはそのフラグメントをコードする修飾されたヌクレオチドまたはバック
ボーン成分を混合した組成物も提供する。そのような修飾されたヌクレオチドお
よび核酸は、当該技術分野において周知である［たとえば、ヴェルマ（Ｖｅｒｍ
ａ）らのＡｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７： ９９−１３４（１９
９８）を参照のこと］。したがって本発明は、たとえばヌクレオチド間連結修飾
、塩基修飾、糖修飾、非放射性ラベル、核酸架橋、ＰＮＡｓ（ポリペプチド核酸
）を含むバックボーンの改変などを組み込んだ、修飾された核酸を包含する。
核酸配列を包含する。詳細には、本発明は、ｈＣＤＳ１タンパク質に翻訳される
配列番号１の核酸配列の６６位〜１６９５位の核酸配列を包含する。本発明はま
た、配列番号１の核酸配列を含む核酸構築物、ベクター、プラスミド、コスミド
なども包含する。詳細には、本発明は、配列番号１の核酸配列を含み、該核酸配
列からタンパク質を発現することのできる核酸ベクター構築物を提供する。本発
明は、真核細胞または原核細胞に関わらず、宿主細胞の形質転換に適するか、ウ
ィルスベクターへの組込みに適するか、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏ（試験管内）
におけるタンパク質の発現に適する核酸ベクターを包含する。本発明はさらに、
配列番号１の核酸によってコードされるタンパク質の少なくとも機能性フラグメ
ントを含む融合タンパク質産物を生産するために、別の核酸配列と縦列させるか
、あるいは他の方法で結合させた、配列番号１の核酸配列を実現する。本発明は
さらに、標的細胞中への組込みと発現のための裸のＤＮＡ形質転換体として使用
するように適用された配列番号１の核酸配列をも包含する。本発明はまた、配列
番号１の核酸配列の連続部分または不連続部分のいずれに相補的であるかに関わ
らず、配列番号１の核酸配列およびそのフラグメントに相補的な、アンチセンス
ＤＮＡ分子調製物を提供する。本発明はまた、配列番号１の核酸配列、その相補
体、またはそのフラグメントをコードする修飾されたヌクレオチドまたはバック
ボーン成分を混合した組成物も提供する。そのような修飾されたヌクレオチドお
よび核酸は、当該技術分野において周知である［たとえば、ヴェルマ（Ｖｅｒｍ
ａ）らのＡｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７： ９９−１３４（１９
９８）を参照のこと］。したがって本発明は、たとえばヌクレオチド間連結修飾
、塩基修飾、糖修飾、非放射性ラベル、核酸架橋、ＰＮＡｓ（ポリペプチド核酸
）を含むバックボーンの改変などを組み込んだ、修飾された核酸を包含する。
【００１０】 本発明は、配列番号２のアミノ酸配列から成る新規なヒトチェックポイントキ
ナーゼタンパク質ｈＣＤＳ１を提供する。本発明は、組み換えＤＮＡ技術によっ
て生産され、ｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）またはｉｎ ｖｉｔｒｏ（試験管内）で
発現されるｈＣＤＳ１タンパク質を包含する。したがって、本発明は、形質転換
された宿主細胞による少量または大量生産によって生産されるｈＣＤＳ１タンパ
ク質を包含する。本発明は、真核細胞または原核細胞のいずれかによって生産さ
れる、グリコシル化された、またはグリコシル化されていない、いずれかの型の
完全ｈＣＤＳ１タンパク質を包含する。本発明は、哺乳動物、昆虫、植物、細菌
、真菌、またはあらゆる他の適切な宿主細胞から発現されるｈＣＤＳ１タンパク
質を提供する。本発明は、融合タンパク質産物、固体支持体に結合されたもの、
あるいは、化学的、放射性、蛍光、化学発光、もしくは他の検出可能なマーカー
によって標識されたｈＣＤＳ１タンパク質を包含する。本発明はまた、天然の供
給源から単離され、天然において認められるよりも純度が高められたｈＣＤＳ１
タンパク質を提供する。本発明はまた、ｈＣＤＳ１タンパク質の薬学的調製物、
および薬学的に許容しうる担体または賦形剤中のｈＣＤＳ１タンパク質調製物を
提供する。
ナーゼタンパク質ｈＣＤＳ１を提供する。本発明は、組み換えＤＮＡ技術によっ
て生産され、ｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）またはｉｎ ｖｉｔｒｏ（試験管内）で
発現されるｈＣＤＳ１タンパク質を包含する。したがって、本発明は、形質転換
された宿主細胞による少量または大量生産によって生産されるｈＣＤＳ１タンパ
ク質を包含する。本発明は、真核細胞または原核細胞のいずれかによって生産さ
れる、グリコシル化された、またはグリコシル化されていない、いずれかの型の
完全ｈＣＤＳ１タンパク質を包含する。本発明は、哺乳動物、昆虫、植物、細菌
、真菌、またはあらゆる他の適切な宿主細胞から発現されるｈＣＤＳ１タンパク
質を提供する。本発明は、融合タンパク質産物、固体支持体に結合されたもの、
あるいは、化学的、放射性、蛍光、化学発光、もしくは他の検出可能なマーカー
によって標識されたｈＣＤＳ１タンパク質を包含する。本発明はまた、天然の供
給源から単離され、天然において認められるよりも純度が高められたｈＣＤＳ１
タンパク質を提供する。本発明はまた、ｈＣＤＳ１タンパク質の薬学的調製物、
および薬学的に許容しうる担体または賦形剤中のｈＣＤＳ１タンパク質調製物を
提供する。
【００１１】 配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするあらゆる核酸配列
を生み出す核酸コードが当業者によって予測可能であるので、本発明は、配列番
号２のアミノ酸配列をコードするあらゆる核酸配列、ならびに配列番号１で表現
されるような核酸配列の実施形態を包含する。
を生み出す核酸コードが当業者によって予測可能であるので、本発明は、配列番
号２のアミノ酸配列をコードするあらゆる核酸配列、ならびに配列番号１で表現
されるような核酸配列の実施形態を包含する。
【００１２】 本発明は、ｈＣＤＳ１タンパク質に特異的に結合する抗体を包含し、該抗体は
、配列番号２のアミノ酸配列またはそのフラグメントを有するタンパク質で哺乳
動物を免疫化することにより生産される、ポリクローナルまたはモノクローナル
のいずれかの抗体である。
、配列番号２のアミノ酸配列またはそのフラグメントを有するタンパク質で哺乳
動物を免疫化することにより生産される、ポリクローナルまたはモノクローナル
のいずれかの抗体である。
【００１３】 本発明はまた、無理なく同等物であると予測されうるアミノ酸置換を配列番号
２の配列内に有し、その実施形態が配列番号２として示される同等のタンパク質
を包含する。たとえば、非極性（疎水性側鎖）アミノ酸であるアラニン、バリン
、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メ
チオニン、非荷電の極性アミノ酸であるグリシン、セリン、スレオニン、システ
イン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、荷電した極性アミノ酸であるアス
パラギン酸、グルタミン酸、塩基性アミノ酸であるリシン、アルギニン、および
ヒスチジンは、置換されることにより、機能的に予測がつく効果を有することが
当業者によって認識されている。したがって、本発明はまた、そのような同等の
タンパク質をコードする同等の核酸であって、その実施形態が配列番号１に記載
されている同等の核酸を包含する。
２の配列内に有し、その実施形態が配列番号２として示される同等のタンパク質
を包含する。たとえば、非極性（疎水性側鎖）アミノ酸であるアラニン、バリン
、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メ
チオニン、非荷電の極性アミノ酸であるグリシン、セリン、スレオニン、システ
イン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、荷電した極性アミノ酸であるアス
パラギン酸、グルタミン酸、塩基性アミノ酸であるリシン、アルギニン、および
ヒスチジンは、置換されることにより、機能的に予測がつく効果を有することが
当業者によって認識されている。したがって、本発明はまた、そのような同等の
タンパク質をコードする同等の核酸であって、その実施形態が配列番号１に記載
されている同等の核酸を包含する。
【００１４】 本発明はまた、組み換えＤＮＡ技術と、ｈＣＤＳ１タンパク質、融合タンパク
質またはそのフラグメントをコードする適切な核酸とを用いて、ｈＣＤＳ１タン
パク質を生産する方法も提供する。本発明はまた、適切な核酸配列を、プロモー
タ、エンハンサーなどの、誘導可能であるかあるいは構造的に発現される適切な
制御要素を統合した、適切な発現ベクターに組み込むことを提供する。本発明は
、少なくとも１つの追加の選択可能なマーカーまたは発現可能なタンパク質を有
するか、あるいは有しない発現ベクターの使用を提供する。本発明は、適切に構
築された発現ベクターが、形質転換もしくは他の方法により適切な宿主細胞に導
入され、そのような宿主細胞によってタンパク質が発現されるような方法を提供
する。したがって、本発明はまた、ｈＣＤＳ１タンパク質、融合タンパク質、ま
たはそのフラグメントを生産することのできる形質転換された宿主細胞も提供す
る。
質またはそのフラグメントをコードする適切な核酸とを用いて、ｈＣＤＳ１タン
パク質を生産する方法も提供する。本発明はまた、適切な核酸配列を、プロモー
タ、エンハンサーなどの、誘導可能であるかあるいは構造的に発現される適切な
制御要素を統合した、適切な発現ベクターに組み込むことを提供する。本発明は
、少なくとも１つの追加の選択可能なマーカーまたは発現可能なタンパク質を有
するか、あるいは有しない発現ベクターの使用を提供する。本発明は、適切に構
築された発現ベクターが、形質転換もしくは他の方法により適切な宿主細胞に導
入され、そのような宿主細胞によってタンパク質が発現されるような方法を提供
する。したがって、本発明はまた、ｈＣＤＳ１タンパク質、融合タンパク質、ま
たはそのフラグメントを生産することのできる形質転換された宿主細胞も提供す
る。
【００１５】 ｈＣＤＳ１がＤＮＡ損傷チェックポイントにおいてＣｄｓ２５と協同的に作用
するという知見から、異常ＤＮＡ損傷チェックポイント機能を伴う疾患の治療方
法において、本発明の化合物を使用することが可能になる。本発明はさらに、癌
治療のための治療薬としての本発明の化合物の使用を提供する。詳細には、本発
明は、細胞内におけるｈＣＤＳ１−Ｃｄｃ２５ＤＮＡ損傷の特異的修飾を可能に
する。
するという知見から、異常ＤＮＡ損傷チェックポイント機能を伴う疾患の治療方
法において、本発明の化合物を使用することが可能になる。本発明はさらに、癌
治療のための治療薬としての本発明の化合物の使用を提供する。詳細には、本発
明は、細胞内におけるｈＣＤＳ１−Ｃｄｃ２５ＤＮＡ損傷の特異的修飾を可能に
する。
【００１６】 本発明はまた、真核細胞のｈＣＤＳ１媒介性チェックポイント機能に影響を与
える試験化合物の効力をスクリーニングするための方法も包含し、該方法は、試
験化合物を真核細胞に接触させることと、ｈＣＤＳ１の発現または機能における
変化を検出することとを含む。したがって、本発明はさらに、前記ｈＣＤＳ１の
発現または機能における変化の検出を、ｈＣＤＳ１のｍＲＮＡをアッセイするか
、あるいはｈＣＤＳ１タンパク質の発現をアッセイすることによって達成するこ
とを特徴とするスクリーニング方法を包含する。詳細には、本発明によれば、Ｃ
ｄｃ２５のリン酸化またはキナーゼ活性におけるあらゆる変化をスクリーニング
することにより、ＤＮＡ損傷チェックポイントを修飾する候補物質の効力をスク
リーニングすることができる。本発明のアッセイによって同定される化合物また
は物質、あるいはそのような化合物または物質に対応する化合物は、薬学的治療
薬の製造のために使用することができる。
える試験化合物の効力をスクリーニングするための方法も包含し、該方法は、試
験化合物を真核細胞に接触させることと、ｈＣＤＳ１の発現または機能における
変化を検出することとを含む。したがって、本発明はさらに、前記ｈＣＤＳ１の
発現または機能における変化の検出を、ｈＣＤＳ１のｍＲＮＡをアッセイするか
、あるいはｈＣＤＳ１タンパク質の発現をアッセイすることによって達成するこ
とを特徴とするスクリーニング方法を包含する。詳細には、本発明によれば、Ｃ
ｄｃ２５のリン酸化またはキナーゼ活性におけるあらゆる変化をスクリーニング
することにより、ＤＮＡ損傷チェックポイントを修飾する候補物質の効力をスク
リーニングすることができる。本発明のアッセイによって同定される化合物また
は物質、あるいはそのような化合物または物質に対応する化合物は、薬学的治療
薬の製造のために使用することができる。
【００１７】 したがって、本発明は１つの実施形態において、ｈＣＤＳ１タンパク質、ｈＣ
ＤＳ１核酸、ｈＣＤＳ１アンチセンス核酸を含む薬学的組成物を提供する。他の
実施形態において、本発明は、本発明のアッセイにより薬学的製剤中の治療薬と
して適していると同定された化合物または物質を提供する。これらの薬学的組成
物は、癌治療において使用するための他の化学治療薬を含んでいてもよく、ある
いは他の抗癌治療薬の投与と連係した投与計画において投与されてもよい。した
がって、本発明は１つの実施形態において、ｈＣＤＳ１誘導薬剤を単独および他
の化学治療薬と組みあわせて使用する組合せ化学療法のための方法を包含し、ま
た第２の実施形態において、一回投与のために他の抗癌治療薬との混合物を包含
する。
ＤＳ１核酸、ｈＣＤＳ１アンチセンス核酸を含む薬学的組成物を提供する。他の
実施形態において、本発明は、本発明のアッセイにより薬学的製剤中の治療薬と
して適していると同定された化合物または物質を提供する。これらの薬学的組成
物は、癌治療において使用するための他の化学治療薬を含んでいてもよく、ある
いは他の抗癌治療薬の投与と連係した投与計画において投与されてもよい。した
がって、本発明は１つの実施形態において、ｈＣＤＳ１誘導薬剤を単独および他
の化学治療薬と組みあわせて使用する組合せ化学療法のための方法を包含し、ま
た第２の実施形態において、一回投与のために他の抗癌治療薬との混合物を包含
する。
【００１８】 本発明の１つの態様によれば、図２に示されるアミノ酸配列（配列番号２）を
有するｈＣＤＳ１タンパク質をコードする、あるいは前記タンパク質の同等の機
能的フラグメントまたは生物前駆体をコードする核酸が提供される。好ましくは
、核酸はゲノムＤＮＡ分子などのＤＮＡ分子であってもよく、より好ましくはｃ
ＤＮＡ分子であってもよいが、ＲＮＡであってもよい。
有するｈＣＤＳ１タンパク質をコードする、あるいは前記タンパク質の同等の機
能的フラグメントまたは生物前駆体をコードする核酸が提供される。好ましくは
、核酸はゲノムＤＮＡ分子などのＤＮＡ分子であってもよく、より好ましくはｃ
ＤＮＡ分子であってもよいが、ＲＮＡであってもよい。
【００１９】 好ましい実施形態において、ｈＣＤＳ１タンパク質をコードする核酸は、図１
に示される核酸配列（配列番号１）の６６位〜１６９４位で表される核酸配列、
その相補体、あるいは高い緊縮条件下でもいずれかにハイブリダイズできる核酸
を含む。
に示される核酸配列（配列番号１）の６６位〜１６９４位で表される核酸配列、
その相補体、あるいは高い緊縮条件下でもいずれかにハイブリダイズできる核酸
を含む。
【００２０】 ここで定義する核酸は、低い緊縮条件下においても、ファミリーのメンバーに
由来する核酸配列とハイブリダイズすることができ、それらからのホモログであ
るのか、あるいは別の種に由来する核酸配列であるのかを確認することができる
。
由来する核酸配列とハイブリダイズすることができ、それらからのホモログであ
るのか、あるいは別の種に由来する核酸配列であるのかを確認することができる
。
【００２１】 当業者にとって周知であるように、遺伝子コードの縮重により、本発明に従う
核酸配列は、その内部に同一のアミノ酸配列をコードする置換を含んでいてもよ
い。
核酸配列は、その内部に同一のアミノ酸配列をコードする置換を含んでいてもよ
い。
【００２２】 有利には、本発明に従う核酸配列は、発現ベクターに組み込まれ、適切な宿主
細胞を形質転換、トランスフェクション、または感染させるために使用されても
よい。そのような発現ベクターにおいて、本発明に従う核酸は、本発明に従うタ
ンパク質を適切な宿主細胞内で確実に発現させる制御配列、たとえば適切なプロ
モータなどに機能的に連結されている。発現ベクターは、有利にはプラスミド、
コスミド、ウィルスまたは他の適切なベクターとすることができる。発現ベクタ
ー、および、ベクターによる形質転換、トランスフェクションまたは感染を受け
た宿主細胞もまた、本発明の一部を構成する。好ましくは、宿主細胞は真核細胞
または細菌細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞または昆虫細胞である。哺
乳動物宿主細胞は、本発明に従う発現タンパク質に対して必要な翻訳後修飾、た
とえばグリコシル化などを行うことができるので特に有利であり、これらの修飾
は、前記タンパク質に対して最適な生物学的活性を付与し、単離されたときに、
診断キットなどにおいて有利に用いられることができる。
細胞を形質転換、トランスフェクション、または感染させるために使用されても
よい。そのような発現ベクターにおいて、本発明に従う核酸は、本発明に従うタ
ンパク質を適切な宿主細胞内で確実に発現させる制御配列、たとえば適切なプロ
モータなどに機能的に連結されている。発現ベクターは、有利にはプラスミド、
コスミド、ウィルスまたは他の適切なベクターとすることができる。発現ベクタ
ー、および、ベクターによる形質転換、トランスフェクションまたは感染を受け
た宿主細胞もまた、本発明の一部を構成する。好ましくは、宿主細胞は真核細胞
または細菌細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞または昆虫細胞である。哺
乳動物宿主細胞は、本発明に従う発現タンパク質に対して必要な翻訳後修飾、た
とえばグリコシル化などを行うことができるので特に有利であり、これらの修飾
は、前記タンパク質に対して最適な生物学的活性を付与し、単離されたときに、
診断キットなどにおいて有利に用いられることができる。
【００２３】 本発明に従う前記核酸配列を含む発現ベクターは、たとえば遺伝子治療などの
、ｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）において有利に用いることができる。
、ｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）において有利に用いることができる。
【００２４】 本発明のさらなる態様に従えば、ｈＣＤＳ１タンパク質を発現することができ
る形質転換遺伝子を含む形質転換細胞、組織または生物体が提供され、該タンパ
ク質は、図２に示されるアミノ酸配列（配列番号２）あるいはその機能的同等物
または生物前駆体またはフラグメントのアミノ酸配列を含む。本明細書中で用い
る「発現することのできる形質転換遺伝子」という用語は、同一の機能および／
または活性を有するｈＣＤＳ１またはタンパク質を発現する適切な核酸配列を意
味する。形質転換遺伝子は、例えば、ゲノムに組み込まれたＤＮＡまたは染色体
外状態におかれたＤＮＡを含んだ、ヒト細胞から単離されたゲノム核酸または合
成核酸を含む。好ましくは、形質転換遺伝子は、本明細書中で記載したような本
発明に従うタンパク質をコードする核酸配列、または前記核酸の機能的フラグメ
ントを含む。前記核酸の機能的フラグメントは、本発明に従うタンパク質、ある
いは前記タンパク質の機能的同等物、誘導体、または優性の負の突然変異株など
の非機能的誘導体、あるいは前記タンパク質の生物前駆体をコードする核酸を含
む遺伝子フラグメントのことを意味すると認識すべきである。たとえば、前記核
酸配列によってコードされるタンパク質の配列に影響を与えず、本発明に従う機
能的タンパク質をコードするような、常套的な技術による核酸の置換または欠失
を用いても良いことは、当業者によって容易に理解されるであろう。
る形質転換遺伝子を含む形質転換細胞、組織または生物体が提供され、該タンパ
ク質は、図２に示されるアミノ酸配列（配列番号２）あるいはその機能的同等物
または生物前駆体またはフラグメントのアミノ酸配列を含む。本明細書中で用い
る「発現することのできる形質転換遺伝子」という用語は、同一の機能および／
または活性を有するｈＣＤＳ１またはタンパク質を発現する適切な核酸配列を意
味する。形質転換遺伝子は、例えば、ゲノムに組み込まれたＤＮＡまたは染色体
外状態におかれたＤＮＡを含んだ、ヒト細胞から単離されたゲノム核酸または合
成核酸を含む。好ましくは、形質転換遺伝子は、本明細書中で記載したような本
発明に従うタンパク質をコードする核酸配列、または前記核酸の機能的フラグメ
ントを含む。前記核酸の機能的フラグメントは、本発明に従うタンパク質、ある
いは前記タンパク質の機能的同等物、誘導体、または優性の負の突然変異株など
の非機能的誘導体、あるいは前記タンパク質の生物前駆体をコードする核酸を含
む遺伝子フラグメントのことを意味すると認識すべきである。たとえば、前記核
酸配列によってコードされるタンパク質の配列に影響を与えず、本発明に従う機
能的タンパク質をコードするような、常套的な技術による核酸の置換または欠失
を用いても良いことは、当業者によって容易に理解されるであろう。
【００２５】 前記形質転換細胞、組織または生物体によって発現されるｈＣＤＳ１タンパク
質、あるいは前記タンパク質の機能的同等物または生物前駆体もまた、本発明の
一部を構成する。
質、あるいは前記タンパク質の機能的同等物または生物前駆体もまた、本発明の
一部を構成する。
【００２６】 さらに本発明により、本発明に従う核酸とハイブリダイズすることのできるア
ンチセンス分子が提供される。有利には、本発明に従うアンチセンス分子は、医
薬品として、あるいは癌および他の増殖性の病気の治療のための医薬品の製造に
おいて使用されてもよい。
ンチセンス分子が提供される。有利には、本発明に従うアンチセンス分子は、医
薬品として、あるいは癌および他の増殖性の病気の治療のための医薬品の製造に
おいて使用されてもよい。
【００２７】 本発明は、有利には、本発明に従う核酸配列の少なくとも１５個のヌクレオチ
ドから成る核酸配列、好ましくは１５〜５０個のヌクレオチドから成る核酸配列
を提供する。これらの配列は、複製などを開始させるためのプローブまたはプラ
イマーとしても有利に使用することができる。そのような核酸配列は、組み換え
または合成などの手段による、当該技術分野において周知に方法に従って生産し
てもよい。またそのような核酸配列は、本発明に従う核酸配列の存在を検出する
ための診断キットなどにおいて使用してもよい。これらの試験は一般に、プロー
ブをハイブリッド形成条件下において試料と接触させることと、プローブと試料
中の核酸との間に形成された二重らせんまたは三重らせんの存在を検出すること
とを含む。
ドから成る核酸配列、好ましくは１５〜５０個のヌクレオチドから成る核酸配列
を提供する。これらの配列は、複製などを開始させるためのプローブまたはプラ
イマーとしても有利に使用することができる。そのような核酸配列は、組み換え
または合成などの手段による、当該技術分野において周知に方法に従って生産し
てもよい。またそのような核酸配列は、本発明に従う核酸配列の存在を検出する
ための診断キットなどにおいて使用してもよい。これらの試験は一般に、プロー
ブをハイブリッド形成条件下において試料と接触させることと、プローブと試料
中の核酸との間に形成された二重らせんまたは三重らせんの存在を検出すること
とを含む。
【００２８】 有利には、本発明に従う核酸配列は、たとえばＰＣＲ（鎖長延長反応）クロー
ニング機構などを用いるような組み換えまたは合成手段によって生産することが
でき、該ＰＣＲクローニング機構は、一般には、クローン化が望まれる遺伝子の
部位に対する約１５〜５０個のヌクレオチドであってもよい一対のプライマーを
作製することと、前記プライマーをヒトからのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはゲノ
ムＤＮＡに接触させることと、所望の部位の増幅を引き起こす条件でのポリメラ
ーゼ鎖長延長反応を行う（必要であれば、最初に逆転写ステップを行う）ことと
、増幅された部位またはフラグメントを単離することと、増幅されたＤＮＡを回
収することとを含む。一般に、ここで定義した上記のような技術は、サンブロッ
ク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らによる「分子クローニング−実験室マニュアル（Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ， １９８９）」に記載されているように、当該技術分野において周知である。
有利には、本発明に従う核酸のヒト対立遺伝子変異体は、一例として、たとえば
異なる集団に由来する個体範囲からのゲノムＤＮＡライブラリーのプロービング
または他の遺伝子型決定技術によって得ることができる。さらに、本発明に従う
核酸およびプローブは、たとえばサンガージデオキシ鎖終結法などの当該技術分
野において周知の方法を用いて、患者からのゲノムＤＮＡの配列決定を行うこと
ができ、これにより、特定の増殖性障害に対する患者のあらゆる素質を有利に確
認することができる。
ニング機構などを用いるような組み換えまたは合成手段によって生産することが
でき、該ＰＣＲクローニング機構は、一般には、クローン化が望まれる遺伝子の
部位に対する約１５〜５０個のヌクレオチドであってもよい一対のプライマーを
作製することと、前記プライマーをヒトからのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはゲノ
ムＤＮＡに接触させることと、所望の部位の増幅を引き起こす条件でのポリメラ
ーゼ鎖長延長反応を行う（必要であれば、最初に逆転写ステップを行う）ことと
、増幅された部位またはフラグメントを単離することと、増幅されたＤＮＡを回
収することとを含む。一般に、ここで定義した上記のような技術は、サンブロッ
ク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らによる「分子クローニング−実験室マニュアル（Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ， １９８９）」に記載されているように、当該技術分野において周知である。
有利には、本発明に従う核酸のヒト対立遺伝子変異体は、一例として、たとえば
異なる集団に由来する個体範囲からのゲノムＤＮＡライブラリーのプロービング
または他の遺伝子型決定技術によって得ることができる。さらに、本発明に従う
核酸およびプローブは、たとえばサンガージデオキシ鎖終結法などの当該技術分
野において周知の方法を用いて、患者からのゲノムＤＮＡの配列決定を行うこと
ができ、これにより、特定の増殖性障害に対する患者のあらゆる素質を有利に確
認することができる。
【００２９】 本発明によれば、図２に示されるようなアミノ酸配列（配列番号２）、あるい
は機能的に同等な機能的フラグメントのアミノ酸配列を有するタンパク質、ある
いは前記タンパク質の生物前駆体、ならびに、これらのタンパク質またはそのフ
ラグメントのアミノ酸配列に結合するこのできるモノクローナルまたはポリクロ
ーナル抗体が提供される。当業者によって周知のように、本発明に従うタンパク
質は、保存性置換、欠失または挿入を含んでいてもよく、これにおいて、タンパ
ク質は図２に開示されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含んでいるが、
上記置換、欠失または挿入は、本発明に従うタンパク質の活性や該タンパク質の
ヒト細胞周期チェックポイント経路における相互作用能力に影響を及ぼすことは
ない。
は機能的に同等な機能的フラグメントのアミノ酸配列を有するタンパク質、ある
いは前記タンパク質の生物前駆体、ならびに、これらのタンパク質またはそのフ
ラグメントのアミノ酸配列に結合するこのできるモノクローナルまたはポリクロ
ーナル抗体が提供される。当業者によって周知のように、本発明に従うタンパク
質は、保存性置換、欠失または挿入を含んでいてもよく、これにおいて、タンパ
ク質は図２に開示されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含んでいるが、
上記置換、欠失または挿入は、本発明に従うタンパク質の活性や該タンパク質の
ヒト細胞周期チェックポイント経路における相互作用能力に影響を及ぼすことは
ない。
【００３０】 好ましいフラグメントとしては、本発明に従うタンパク質のエピトープを含む
ものが含まれる。エピトープは、たとえばゲイセン（Ｇｅｙｓｅｎ）らによるＭ ｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ， ２３； ７０９−７１５（１９８６）に記載され
ているようなペプチド走査技術を用いて決定することができる。
ものが含まれる。エピトープは、たとえばゲイセン（Ｇｅｙｓｅｎ）らによるＭ ｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ， ２３； ７０９−７１５（１９８６）に記載され
ているようなペプチド走査技術を用いて決定することができる。
【００３１】 本発明に従う抗体は、当業者によって周知の技術に従って生産することができ
る。モノクローナル抗体は、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）Ｆとミルスタイン（Ｍｉ
ｌｓｔｅｉｎ）Ｃによって、Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５−４９７（１９８
５）に記載されているような、従来のハイブリドーマ技術を用いて調製すること
ができる。ポリクローナル抗体もまた当業者周知の従来の技術を用いて調製する
ことができ、該技術は、マウスなどの宿主動物に本発明に従うタンパク質または
エピトープを接種することと、免疫血清を回収することとを含む。本発明はまた
、結合活性を維持している全抗体のフラグメント、たとえばＦｖ、Ｆ（ａｂ’）
およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびに一本鎖抗体も包含する。
る。モノクローナル抗体は、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）Ｆとミルスタイン（Ｍｉ
ｌｓｔｅｉｎ）Ｃによって、Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５−４９７（１９８
５）に記載されているような、従来のハイブリドーマ技術を用いて調製すること
ができる。ポリクローナル抗体もまた当業者周知の従来の技術を用いて調製する
ことができ、該技術は、マウスなどの宿主動物に本発明に従うタンパク質または
エピトープを接種することと、免疫血清を回収することとを含む。本発明はまた
、結合活性を維持している全抗体のフラグメント、たとえばＦｖ、Ｆ（ａｂ’）
およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびに一本鎖抗体も包含する。
【００３２】 有利には、本発明に従う核酸および／またはタンパク質は、薬学的組成物内に
、該組成物のための薬学的に許容されうる担体、希釈剤または賦形剤とともに含
まれていてもよい。本発明に従う前記核酸を含む薬学的組成物は、たとえば遺伝
子治療において使用することもできる。本発明に従うそのような核酸は、裸の状
態、あるいはタンパク質カプセル、脂質カプセル、リポソーム、膜を基剤にした
カプセル、ウィルスタンパク質、全ウィルス、細胞ベクター、細菌細胞宿主、改
変哺乳動物細胞、または投与のための適切な手段内に包装した状態で投与するこ
とができる。
、該組成物のための薬学的に許容されうる担体、希釈剤または賦形剤とともに含
まれていてもよい。本発明に従う前記核酸を含む薬学的組成物は、たとえば遺伝
子治療において使用することもできる。本発明に従うそのような核酸は、裸の状
態、あるいはタンパク質カプセル、脂質カプセル、リポソーム、膜を基剤にした
カプセル、ウィルスタンパク質、全ウィルス、細胞ベクター、細菌細胞宿主、改
変哺乳動物細胞、または投与のための適切な手段内に包装した状態で投与するこ
とができる。
【００３３】 本発明によれば、本発明に従う核酸が生物試料中に存在するか否かを検出する
ための方法がさらに提供され、該方法は、ａ）前記試料をハイブリッド形成条件
下において、本発明に従う核酸またはプローブを含むプローブと接触させること
と、ｂ）たとえば、前記プローブと試料中に存在する核酸との間の二重らせんま
たは三重らせんの存在により、ハイブリッド形成の有無を検出することとを含む
。本発明に従うタンパク質は、ａ）前記試料を、抗体−抗原複合体の形成を可能
にする条件下で、本発明に従うタンパク質のエピトープに対する抗体と接触させ
ることと、ｂ）抗体−抗原複合体の存在をモニターすることとによって、検出さ
れてもよい。
ための方法がさらに提供され、該方法は、ａ）前記試料をハイブリッド形成条件
下において、本発明に従う核酸またはプローブを含むプローブと接触させること
と、ｂ）たとえば、前記プローブと試料中に存在する核酸との間の二重らせんま
たは三重らせんの存在により、ハイブリッド形成の有無を検出することとを含む
。本発明に従うタンパク質は、ａ）前記試料を、抗体−抗原複合体の形成を可能
にする条件下で、本発明に従うタンパク質のエピトープに対する抗体と接触させ
ることと、ｂ）抗体−抗原複合体の存在をモニターすることとによって、検出さ
れてもよい。
【００３４】 前記核酸およびタンパク質を検出するためのキットもまた、本発明によって提
供される。生物試料中の本発明の核酸の存在を検出するためのキットは、（ａ）
試料を本発明に従う核酸またはプローブを含むプローブと接触させるための手段
と、前記プローブと試料中に存在するあらゆる核酸との間の、二重らせんまたは
三重らせんの存在を検出するための手段とを含んでいてもよい。
供される。生物試料中の本発明の核酸の存在を検出するためのキットは、（ａ）
試料を本発明に従う核酸またはプローブを含むプローブと接触させるための手段
と、前記プローブと試料中に存在するあらゆる核酸との間の、二重らせんまたは
三重らせんの存在を検出するための手段とを含んでいてもよい。
【００３５】 同様に、生物試料中の本発明に従うタンパク質の存在を検出するためのキット
は、（ａ）前記試料を、抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で、本発明
に従うタンパク質のエピトープに対する抗体と接触させるための手段と、前記試
料中の抗体−抗原複合体の存在をモニターするための手段とを含んでいてもよい
。
は、（ａ）前記試料を、抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で、本発明
に従うタンパク質のエピトープに対する抗体と接触させるための手段と、前記試
料中の抗体−抗原複合体の存在をモニターするための手段とを含んでいてもよい
。
【００３６】 本発明のさらなる態様は、ある化合物が、ヒト細胞周期チェックポイント経路
のタンパク質の発現または活性に対する、阻害剤または促進剤のいずれであるか
を決定する方法を提供し、該方法は、前記経路内のタンパク質を発現している細
胞を前記化合物に接触させることと、チェックポイント経路のいずれかのタンパ
ク質の発現レベルを、前記細胞と前記化合物に接触させていない細胞との間で比
較することとを含む。同定されたどの化合物も、癌または増殖性障害の治療のた
めの医薬品として、あるいは医薬品の調製において有利に使用することができる
。あるいは、そのような化合物は、薬学的組成物内に、該薬学的組成物のための
薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤とともに含まれていてもよい。有
利には、細胞チェックポイント経路の阻害剤であると同定されたあらゆる化合物
は、本発明に従う薬学的組成物内に、ＤＮＡ損傷化学治療薬などの細胞障害性物
質と、該薬学的組成物のための薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤と
ともに含まれていてもよい。したがって、ヒト細胞周期チェックポイント阻害剤
は、たとえば抗癌治療において用いられる細胞障害性物質の化学治療効果を高め
ると考えられる。
のタンパク質の発現または活性に対する、阻害剤または促進剤のいずれであるか
を決定する方法を提供し、該方法は、前記経路内のタンパク質を発現している細
胞を前記化合物に接触させることと、チェックポイント経路のいずれかのタンパ
ク質の発現レベルを、前記細胞と前記化合物に接触させていない細胞との間で比
較することとを含む。同定されたどの化合物も、癌または増殖性障害の治療のた
めの医薬品として、あるいは医薬品の調製において有利に使用することができる
。あるいは、そのような化合物は、薬学的組成物内に、該薬学的組成物のための
薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤とともに含まれていてもよい。有
利には、細胞チェックポイント経路の阻害剤であると同定されたあらゆる化合物
は、本発明に従う薬学的組成物内に、ＤＮＡ損傷化学治療薬などの細胞障害性物
質と、該薬学的組成物のための薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤と
ともに含まれていてもよい。したがって、ヒト細胞周期チェックポイント阻害剤
は、たとえば抗癌治療において用いられる細胞障害性物質の化学治療効果を高め
ると考えられる。
【００３７】 本発明によれば、抗癌治療に対する候補物質をスクリーニングする方法も提供
され、該方法は、ａ）キナーゼ活性を提示している本発明に従うタンパク質を、
前記タンパク質に対する基質とともに、キナーゼが該基質に作用するような条件
下で提供することと、ｂ）タンパク質および基質を候補物質と接触させることと
、ｃ）タンパク質のキナーゼ活性の増加または減少の程度を測定することと、ｄ
）活性の減少または増加を引き起こす候補物質を選択することとを含む。そのよ
うな候補物質は、癌または増殖性の細胞障害の治療のための医薬品として、ある
いは医薬品の調製において使用することができる。
され、該方法は、ａ）キナーゼ活性を提示している本発明に従うタンパク質を、
前記タンパク質に対する基質とともに、キナーゼが該基質に作用するような条件
下で提供することと、ｂ）タンパク質および基質を候補物質と接触させることと
、ｃ）タンパク質のキナーゼ活性の増加または減少の程度を測定することと、ｄ
）活性の減少または増加を引き起こす候補物質を選択することとを含む。そのよ
うな候補物質は、癌または増殖性の細胞障害の治療のための医薬品として、ある
いは医薬品の調製において使用することができる。
【００３８】 本発明はまた、細胞チェックポイント経路において活性を示す他のタンパク質
を同定するための方法も含み、該方法は、ａ）細胞抽出物を、適当な結合条件下
において、本発明に従うタンパク質のエピトープに対する抗体と接触させること
と、ｂ）抗体−タンパク質複合体を同定することと、ｃ）複合体を分析して、抗
体に結合したタンパク質、または本発明に従うタンパク質以外のタンパク質を同
定することとを含む。
を同定するための方法も含み、該方法は、ａ）細胞抽出物を、適当な結合条件下
において、本発明に従うタンパク質のエピトープに対する抗体と接触させること
と、ｂ）抗体−タンパク質複合体を同定することと、ｃ）複合体を分析して、抗
体に結合したタンパク質、または本発明に従うタンパク質以外のタンパク質を同
定することとを含む。
【００３９】 細胞チェックポイント経路に包含されるタンパク質を同定するための他の方法
は、上記チエン（Ｃｈｉｅｎ）ら（１９９１）によって開発された、酵母におけ
る２ハイブリッド系を利用する。この技術は、レポーター遺伝子を活性化する転
写因子のｉｎ ｖｉｖｏ再構築における機能に依存している。より詳細には、こ
の技術は、ＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとを有する転写因子によって調
節されたプロモータの制御下にあるレポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物を有す
る適当な宿主細胞を与えることと、本発明に従う核酸配列のフラグメントまたは
全体と前記転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかとの
間の第１の融合物をコードする、第１の交雑ＤＮＡ配列を、宿主細胞中において
発現させることと、第１の融合物には組み込まれていない転写因子のＤＮＡ結合
ドメインまたは活性化ドメインとともに評価すべき推定結合タンパク質をコード
する、少なくとも一つの第２の交雑ＤＮＡ配列を、宿主細胞中において発現させ
ることと、宿主細胞中のレポータ遺伝子産物の産生を検出することにより、評価
するタンパク質の本発明によるタンパク質への結合を検出することと、任意に、
結合タンパク質をコードする第２の交雑ＤＮＡ配列を単離することとを含む。本
発明のこの態様の一実施形態として、本方法は以下の（ａ）および（ｂ）を含ん
で構成される。
は、上記チエン（Ｃｈｉｅｎ）ら（１９９１）によって開発された、酵母におけ
る２ハイブリッド系を利用する。この技術は、レポーター遺伝子を活性化する転
写因子のｉｎ ｖｉｖｏ再構築における機能に依存している。より詳細には、こ
の技術は、ＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとを有する転写因子によって調
節されたプロモータの制御下にあるレポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物を有す
る適当な宿主細胞を与えることと、本発明に従う核酸配列のフラグメントまたは
全体と前記転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかとの
間の第１の融合物をコードする、第１の交雑ＤＮＡ配列を、宿主細胞中において
発現させることと、第１の融合物には組み込まれていない転写因子のＤＮＡ結合
ドメインまたは活性化ドメインとともに評価すべき推定結合タンパク質をコード
する、少なくとも一つの第２の交雑ＤＮＡ配列を、宿主細胞中において発現させ
ることと、宿主細胞中のレポータ遺伝子産物の産生を検出することにより、評価
するタンパク質の本発明によるタンパク質への結合を検出することと、任意に、
結合タンパク質をコードする第２の交雑ＤＮＡ配列を単離することとを含む。本
発明のこの態様の一実施形態として、本方法は以下の（ａ）および（ｂ）を含ん
で構成される。
【００４０】 （ａ）少なくとも２つのヌクレオチドベクターを構築する。第１のヌクレオチド
ベクターは、本発明に従うタンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結され
た、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチドセグメ
ントを含み、第２のベクターは、試験すべきタンパク質をコードする核酸配列に
機能的に連結された、ＧＡＬ４のタンパク質結合ドメインをコードする核酸配列
を含む。
ベクターは、本発明に従うタンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結され
た、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチドセグメ
ントを含み、第２のベクターは、試験すべきタンパク質をコードする核酸配列に
機能的に連結された、ＧＡＬ４のタンパク質結合ドメインをコードする核酸配列
を含む。
【００４１】 （ｂ）ガラクトース代謝タンパク質をコードする遺伝子の転写に欠損を有した酵
母細胞中に、前記ベクターのそれぞれを同時形質転換により導入する、これによ
り、前記試験タンパク質と本発明に従うタンパク質との相互作用によりガラクト
ース代謝遺伝子が転写される。
母細胞中に、前記ベクターのそれぞれを同時形質転換により導入する、これによ
り、前記試験タンパク質と本発明に従うタンパク質との相互作用によりガラクト
ース代謝遺伝子が転写される。
【００４２】 （好適な実施形態の詳細な説明） 本発明は、添付の図面を参照して、例示のためだけに与えられる以下の実施例
からより明確に理解されるであろう。
からより明確に理解されるであろう。
【００４３】 本発明は、新規なヒトチェックポイントキナーゼ遺伝子およびｈＣＤＳ１と呼
ばれるタンパク質の単離とキャラクタリゼーションを包含する。ｈＣＤＳ１遺伝
子およびタンパク質は、Ｓ．ｐｏｍｂｅ内に見つけられる相同遺伝子およびタン
パク質と類似性を示す。
ばれるタンパク質の単離とキャラクタリゼーションを包含する。ｈＣＤＳ１遺伝
子およびタンパク質は、Ｓ．ｐｏｍｂｅ内に見つけられる相同遺伝子およびタン
パク質と類似性を示す。
【００４４】 Ｓ．ｐｏｍｂｅのｃｄｓ１＋遺伝子は、ＤＮＡポリメラーゼα変異体を補足す
る能力により同定された（Ｍｕｒａｋａｍｉ ＆ Ｏｋａｙａｍａ， １９９５
， Ｎａｔｕｒｅ， ３７４： ８１７−８１９）。Ｓ．ｐｏｍｂｅのｃｄｓ１
は、Ｓ．ｐｏｍｂｅ株のｒａｄ１、ｒａｄ３およびｒａｄ９変異株のヒドロキシ
尿素感受性（ＤＮＡ複製依存性チェックポイント）を抑制することもできたが、
紫外線感受性（ＤＮＡ損傷依存性チェックポイント）を抑制することはできなか
った。このことは、Ｓ．ｐｏｍｂｅのｃｄｓ１がＤＮＡ合成中のチェックポイン
ト機能を遂行していることを示す。
る能力により同定された（Ｍｕｒａｋａｍｉ ＆ Ｏｋａｙａｍａ， １９９５
， Ｎａｔｕｒｅ， ３７４： ８１７−８１９）。Ｓ．ｐｏｍｂｅのｃｄｓ１
は、Ｓ．ｐｏｍｂｅ株のｒａｄ１、ｒａｄ３およびｒａｄ９変異株のヒドロキシ
尿素感受性（ＤＮＡ複製依存性チェックポイント）を抑制することもできたが、
紫外線感受性（ＤＮＡ損傷依存性チェックポイント）を抑制することはできなか
った。このことは、Ｓ．ｐｏｍｂｅのｃｄｓ１がＤＮＡ合成中のチェックポイン
ト機能を遂行していることを示す。
【００４５】 Ｓ．ｐｏｍｂｅのｃｄｓ１は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのチェックポイント
遺伝子ＲＡＤ５３と７０％の類似性を有する推定タンパク質キナーゼである。Ｓ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ＤＮＡ損傷依存性チェックポイントおよびＤ
ＮＡ複製依存性チェックポイントは、ＤＮＡ損傷の検出レベルにおいて遺伝学的
に別個である。２つの経路は、１つのシグナル伝達経路における増幅因子として
潜在的に作用するＲａｄ５３タンパク質キナーゼに収束する。このことは、同一
のタンパク質が全てのタイプの損傷の検出に関与するが、シグナル伝達が、異な
るタンパク質キナーゼであるＤＮＡ複製依存性チェックポイントのためのＳ．ｐ
ｏｍｂｅのｃｄｓ１およびＤＮＡ損傷依存性経路のためのＣｈｋ１／Ｒａｄ２７
を包含する別個の経路に分かれるような、Ｓ．ｐｏｍｂｅの場合には当てはまら
ないようである。ｃｄｓ１キナーゼのＳ期特異的活性化は、Ｓ．ｐｏｍｂｅにお
けるチェックポイント反応の副経路を規定すると示唆されてきた（Ｌｉｎｄｓａ
ｙら， １９９８， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， １２：
３８２−３９５）。
遺伝子ＲＡＤ５３と７０％の類似性を有する推定タンパク質キナーゼである。Ｓ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ＤＮＡ損傷依存性チェックポイントおよびＤ
ＮＡ複製依存性チェックポイントは、ＤＮＡ損傷の検出レベルにおいて遺伝学的
に別個である。２つの経路は、１つのシグナル伝達経路における増幅因子として
潜在的に作用するＲａｄ５３タンパク質キナーゼに収束する。このことは、同一
のタンパク質が全てのタイプの損傷の検出に関与するが、シグナル伝達が、異な
るタンパク質キナーゼであるＤＮＡ複製依存性チェックポイントのためのＳ．ｐ
ｏｍｂｅのｃｄｓ１およびＤＮＡ損傷依存性経路のためのＣｈｋ１／Ｒａｄ２７
を包含する別個の経路に分かれるような、Ｓ．ｐｏｍｂｅの場合には当てはまら
ないようである。ｃｄｓ１キナーゼのＳ期特異的活性化は、Ｓ．ｐｏｍｂｅにお
けるチェックポイント反応の副経路を規定すると示唆されてきた（Ｌｉｎｄｓａ
ｙら， １９９８， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， １２：
３８２−３９５）。
【００４６】 Ｓ．ｐｏｍｂｅのｃｄｓ１は、ＤＮＡポリメラーゼαとの相互作用を介して、
ＤＮＡ複製の進行または複製複合体の完全性を監視する働きをするかもしれない
。このことは、ショウジョウバエにおいて、ＤＮＡポリメラーゼαに関連する適
切な分子量のキナーゼに対して証明されている（Ｐｅｃｋら， １９９３， Ｂ ．Ｂ．Ｒ．Ｃ． ， １９０： ３２５−３３１）。あるいは、上記タンパク質は
、最終的にはＧ１／Ｓ期のサイクリン依存性キナーゼの活性に影響を及ぼすＣｈ
ｋ１と同様の様式で、ｐ１０７ｗｅｅｌのリン酸化を介して作用するかもしれな
い。
ＤＮＡ複製の進行または複製複合体の完全性を監視する働きをするかもしれない
。このことは、ショウジョウバエにおいて、ＤＮＡポリメラーゼαに関連する適
切な分子量のキナーゼに対して証明されている（Ｐｅｃｋら， １９９３， Ｂ ．Ｂ．Ｒ．Ｃ． ， １９０： ３２５−３３１）。あるいは、上記タンパク質は
、最終的にはＧ１／Ｓ期のサイクリン依存性キナーゼの活性に影響を及ぼすＣｈ
ｋ１と同様の様式で、ｐ１０７ｗｅｅｌのリン酸化を介して作用するかもしれな
い。
【００４７】 以下の実施例に記載するような基本的な分子生物学的操作を実施するための方
法および材料は、当該技術分野において周知であり、以下に示す引例の中に記載
されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，
２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）； Ｂｅｒｇｅｒら， Ｇｕｉｄｅ ｔ ｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １５２， Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．，（１９８７）； Ｄａｖｉｓら， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ， Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．（１９８６
）； Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，（１９９２）； Ｇｏｅｄｄｅｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ ｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，
Ｖｏｌ． １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．，（１９９
１）； Ｇｕｔｈｒｉｅら， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １９４， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
， Ｉｎｃ．，（１９９１）； ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら， ＰＣＲ Ｖｏｌｕｍ ｅ １ ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）。
法および材料は、当該技術分野において周知であり、以下に示す引例の中に記載
されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，
２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）； Ｂｅｒｇｅｒら， Ｇｕｉｄｅ ｔ ｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １５２， Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．，（１９８７）； Ｄａｖｉｓら， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ， Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．（１９８６
）； Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，（１９９２）； Ｇｏｅｄｄｅｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ ｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，
Ｖｏｌ． １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．，（１９９
１）； Ｇｕｔｈｒｉｅら， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １９４， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
， Ｉｎｃ．，（１９９１）； ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら， ＰＣＲ Ｖｏｌｕｍ ｅ １ ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）。
【００４８】 本発明のいくつかの態様は、以下に示す実施例を検討することにより、より容
易に理解することができる。
易に理解することができる。
【００４９】
実施例１ ｈＣＤＳ１の単離 ｈＣＤＳ１の単離は、ＴＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて、Ｓ．ｐｏｍｂｅ
ｃｄｓ１＋に類似する配列を探すことから開始した。ヒトの発現配列タグ（ＥＳ
Ｔ： ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ）（ＥＳＴ番号：８６４
１６４）を、工業所有権によって保護されているＬｉｆｅＳｅｑ（登録商標）デ
ータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．， Ｐ
ａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）において同定した。１．３ｋｂ挿入配列
の配列分析により、この配列は、Ｓ．ｐｏｍｂｅ ｃｄｓ１に類似した不完全な
オープンリーディングフレームであることが判明した。新規な５’ＤＮＡ配列の
約６５０のヌクレオチドは、マラソン・レディ（Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ
）ヒト胎盤ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造者の指示に従って用いて、５’
ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）により得た。
ｃｄｓ１＋に類似する配列を探すことから開始した。ヒトの発現配列タグ（ＥＳ
Ｔ： ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ）（ＥＳＴ番号：８６４
１６４）を、工業所有権によって保護されているＬｉｆｅＳｅｑ（登録商標）デ
ータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．， Ｐ
ａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）において同定した。１．３ｋｂ挿入配列
の配列分析により、この配列は、Ｓ．ｐｏｍｂｅ ｃｄｓ１に類似した不完全な
オープンリーディングフレームであることが判明した。新規な５’ＤＮＡ配列の
約６５０のヌクレオチドは、マラソン・レディ（Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ
）ヒト胎盤ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造者の指示に従って用いて、５’
ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）により得た。
【００５０】 概要を説明すると、ネスト（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）
反応のためには、以下の２つのｈＣＤＳ１遺伝子特異的プライマーを用いた。
反応のためには、以下の２つのｈＣＤＳ１遺伝子特異的プライマーを用いた。
【００５１】 ＧＳＰ３ ５’−ＴＴＴＴＧＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＴＴＡＴＧＧＣＴＡＣ−３
’（配列番号３）、および ＧＳＰ４ ５’−ＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＴＣＣＡＡＧＡＧＴＴＴＴ−３
’（配列番号４）。
’（配列番号３）、および ＧＳＰ４ ５’−ＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＴＣＣＡＡＧＡＧＴＴＴＴ−３
’（配列番号４）。
【００５２】 次に、ｈＣＤＳ１に対する完全なＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）を
、以下に示すＰＣＲプライマーを用いて、ヒトＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経芽腫ｃＤＮＡ
ライブラリーから増幅した。
、以下に示すＰＣＲプライマーを用いて、ヒトＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経芽腫ｃＤＮＡ
ライブラリーから増幅した。
【００５３】 ５’−ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＡＧＣＡＧＣＧＡＴＧＴＣＴＣＧＧＧＡＧＴＣＧＧ
ＡＴＧＴ−３’（配列番号５）、および ５’−ＧＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡ
ＣＡＣ−３’（配列番号６）。
ＡＴＧＴ−３’（配列番号５）、および ５’−ＧＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡ
ＣＡＣ−３’（配列番号６）。
【００５４】 次に、増幅産物をｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニ
ングし、ＤＮＡ配列を決定した。
ングし、ＤＮＡ配列を決定した。
【００５５】 ｈＣＤＳ１の核酸配列は、Ｓ．ｐｏｍｂｅ ｃｄｓ１＋に対してＤＮＡレベル
で４７．８％の同一性を示すことが分かった。終止コドンは、３つ全ての読み取
り枠において、５’末端直後から推定ｈＣＤＳ１開始コドンまでの１２０ヌクレ
オチド内に存在しており、完全なコード領域が単離されたことが示された。配列
の一部は、ＮＣＢＩデータベース、ＥＳＴ ＡＡ２８５２９、ゲノム配列Ｈ５５
４５１、および５４塩基対フラグメントＨ５５６９８内に見られる部分配列と一
致することが分かった。
で４７．８％の同一性を示すことが分かった。終止コドンは、３つ全ての読み取
り枠において、５’末端直後から推定ｈＣＤＳ１開始コドンまでの１２０ヌクレ
オチド内に存在しており、完全なコード領域が単離されたことが示された。配列
の一部は、ＮＣＢＩデータベース、ＥＳＴ ＡＡ２８５２９、ゲノム配列Ｈ５５
４５１、および５４塩基対フラグメントＨ５５６９８内に見られる部分配列と一
致することが分かった。
【００５６】 ｈＣＤＳ１核酸配列をコードする同定されたヒト遺伝子およびベクターは、プ
ラスミドＨＣＤＳ１ ＯＲＦ／ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（受託番号：ＬＭＢＰ３７０
８）、プラスミドＨＣＤＳ１ ５’ＲＡＣＥフラグメント／ｐＧＥＭ−Ｅａｓｙ
（受託番号：ＬＭＢＰ３７１０）、およびプラスミドＨＣＤＳ１ ３’フラグメ
ントＩｎｃｙｔｅ ｃｌｏｎｅ８６４１６４／ｐＳＰＯＲＴ（受託番号：ＬＭＢ
Ｐ３７０９）として、１９９７年４月２８日付ブダペスト条約の規定に従って、
分子生物学研究所−プラスミド収集室（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ Ｖｏｏｒ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ−Ｐｌａｓｍｉｄｅｎｃｏｌｌｅ
ｃｔｅ）（Ｂ−９０００ヘント、ベルギー）におかれたＢＣＣＭ（Ｂｅｌｇｉａ
ｎ Ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ−
ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に寄託した。
ラスミドＨＣＤＳ１ ＯＲＦ／ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（受託番号：ＬＭＢＰ３７０
８）、プラスミドＨＣＤＳ１ ５’ＲＡＣＥフラグメント／ｐＧＥＭ−Ｅａｓｙ
（受託番号：ＬＭＢＰ３７１０）、およびプラスミドＨＣＤＳ１ ３’フラグメ
ントＩｎｃｙｔｅ ｃｌｏｎｅ８６４１６４／ｐＳＰＯＲＴ（受託番号：ＬＭＢ
Ｐ３７０９）として、１９９７年４月２８日付ブダペスト条約の規定に従って、
分子生物学研究所−プラスミド収集室（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ Ｖｏｏｒ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ−Ｐｌａｓｍｉｄｅｎｃｏｌｌｅ
ｃｔｅ）（Ｂ−９０００ヘント、ベルギー）におかれたＢＣＣＭ（Ｂｅｌｇｉａ
ｎ Ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ−
ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に寄託した。
【００５７】 ｈＣＤＳ１の組織発現プロファイルは、ｈＣＤＳ１ ＯＲＦをプローブに用い
た、複数の組織のノーザン・ブロッティング（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）および癌細胞
系のノーザン・ブロッティング（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により調べた。約２．１ｋ
ｂの単一の転写産物が観察された。調べた全ての正常ヒト組織において、従来の
ノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーション条件で発現を検出することはでき
なかった。しかしながら、調べた全てのガン細胞系において発現が大幅に高めら
れていることが分かった。
た、複数の組織のノーザン・ブロッティング（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）および癌細胞
系のノーザン・ブロッティング（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により調べた。約２．１ｋ
ｂの単一の転写産物が観察された。調べた全ての正常ヒト組織において、従来の
ノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーション条件で発現を検出することはでき
なかった。しかしながら、調べた全てのガン細胞系において発現が大幅に高めら
れていることが分かった。
【００５８】 ｈＣＤＳ１遺伝子は、染色体２２ｑ１１．２−ｑ１２に局在していたことが、
完全なＯＲＦをＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）分析の
ためのプローブとして用いることにより確認された。ハイブリダイゼーション効
率は約６２％であり、使用した条件においては他のいかなる遺伝子座も検出され
なかった。
完全なＯＲＦをＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）分析の
ためのプローブとして用いることにより確認された。ハイブリダイゼーション効
率は約６２％であり、使用した条件においては他のいかなる遺伝子座も検出され
なかった。
【００５９】 概要を説明すると、ヒト血液から単離したリンパ球を、１０％ウシ胎児血清お
よびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を添加したα−最小必須培地（ＭＥＭ）中
、３７℃で６８〜７２時間培養した。リンパ球培養物をＢｒｄＵ（０．１８ｍｇ
／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）で処理して、細胞集団を同調化した。この同調化細胞を血
清を含まない培地で３回洗浄して塊を解離させ、チミジン（２．５μｇ／ｍｌ，
Ｓｉｇｍａ）を添加したα−ＭＥＭ中、３７℃で６時間再培養した。細胞を回収
し、低張処理、固定および風乾を含む標準的な方法を用いてスライドを作成した
。ｈＣＤＳ１完全ＯＲＦを含むＤＮＡフラグメントをゲル精製し、ＢＲＬ Ｂｉ
ｏＮｉｃｋラベリングキットを用いてｄＡＴＰでビオチニル化（１５℃、１時間
）した（Ｈｅｎｇら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓ ｃｉ． ＵＳＡ ． ８９： ９５０９−９５１３）。
よびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を添加したα−最小必須培地（ＭＥＭ）中
、３７℃で６８〜７２時間培養した。リンパ球培養物をＢｒｄＵ（０．１８ｍｇ
／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）で処理して、細胞集団を同調化した。この同調化細胞を血
清を含まない培地で３回洗浄して塊を解離させ、チミジン（２．５μｇ／ｍｌ，
Ｓｉｇｍａ）を添加したα−ＭＥＭ中、３７℃で６時間再培養した。細胞を回収
し、低張処理、固定および風乾を含む標準的な方法を用いてスライドを作成した
。ｈＣＤＳ１完全ＯＲＦを含むＤＮＡフラグメントをゲル精製し、ＢＲＬ Ｂｉ
ｏＮｉｃｋラベリングキットを用いてｄＡＴＰでビオチニル化（１５℃、１時間
）した（Ｈｅｎｇら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓ ｃｉ． ＵＳＡ ． ８９： ９５０９−９５１３）。
【００６０】 次にスライドを５５℃で１時間加熱乾燥し、ＲＮａｓｅ処理を行った後、スラ
イドを２×ＳＳＣに溶解した７０％ホルムアミド中、７０℃で２分間変性させ、
その後、エタノールで脱水を行った。プローブは、５０％ホルムアミドと１０％
硫酸デキストランとから成るハイブリダイゼーション・ミックス中、７５℃で５
分間変性させた。プローブを変性させた染色体スライド上に適用した。一晩ハイ
ブリダイゼーションを行った後、スライドを洗浄し、検出を行った。ＦＩＳＨシ
グナルおよびＤＡＰＩバンドパターンを、写真撮影により別々に記録し、ＦＩＳ
Ｈマッピングデータの染色体バンドへの割当ては、ＦＩＳＨシグナルをＤＡＰＩ
バンド化染色体に重ね合わせることにより行った（Ｈｅｎｇ ＆ Ｔｓｕｉ，
１９９４， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ３３： ３５−
４９）。
イドを２×ＳＳＣに溶解した７０％ホルムアミド中、７０℃で２分間変性させ、
その後、エタノールで脱水を行った。プローブは、５０％ホルムアミドと１０％
硫酸デキストランとから成るハイブリダイゼーション・ミックス中、７５℃で５
分間変性させた。プローブを変性させた染色体スライド上に適用した。一晩ハイ
ブリダイゼーションを行った後、スライドを洗浄し、検出を行った。ＦＩＳＨシ
グナルおよびＤＡＰＩバンドパターンを、写真撮影により別々に記録し、ＦＩＳ
Ｈマッピングデータの染色体バンドへの割当ては、ＦＩＳＨシグナルをＤＡＰＩ
バンド化染色体に重ね合わせることにより行った（Ｈｅｎｇ ＆ Ｔｓｕｉ，
１９９４， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ３３： ３５−
４９）。
【００６１】 実施例２ ｈＣＤＳ１タンパク質の特徴づけ ｈＣＤＳ１核酸配列ｃＤＮＡからは、約６１ｋＤａの分子量を有する５４３ア
ミノ酸の翻訳産物が予測される。これは、ヒーラ細胞における内在Ｃｄｓ１タン
パク質の見かけの分子量に近い。予測されるｈＣＤＳ１タンパク質は、Ｓ．ｐｏ
ｍｂｅのｃｄｓ１タンパク質に対しては２８％の同一性、ＲＡＤ５３に対しては
２８％の同一性、またＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤＵＮ１キナーゼに対しては
２７％の同一性を有する。これらの見かけ上のホモログの配列アライメントによ
り、キナーゼドメイン外に、フォークヘッド会合ドメイン（Ｆｏｒｋ Ｈｅａｄ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｏｍａｉｎ）（Ｈｏｆｆｍａｎら， １９９５， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ， ２０： ３４７−９）の保存領
域を含むいくつかの配列の類似する領域が示された。ヒトタンパク質は、ＲＡＤ
５３において見られるような長いＣ末端延長部を欠失しているという点で、Ｓ．
ｐｏｍｂｅＣＤＳ１およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＤＵＮ１と同様の全体構造
を示している。ｈＣＤＳ１によるノーザン・ブロッティング分析により、試験し
た精巣および８つのヒト癌試料内で発現される約２．２ｋｂの単一の転写産物が
同定された。
ミノ酸の翻訳産物が予測される。これは、ヒーラ細胞における内在Ｃｄｓ１タン
パク質の見かけの分子量に近い。予測されるｈＣＤＳ１タンパク質は、Ｓ．ｐｏ
ｍｂｅのｃｄｓ１タンパク質に対しては２８％の同一性、ＲＡＤ５３に対しては
２８％の同一性、またＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤＵＮ１キナーゼに対しては
２７％の同一性を有する。これらの見かけ上のホモログの配列アライメントによ
り、キナーゼドメイン外に、フォークヘッド会合ドメイン（Ｆｏｒｋ Ｈｅａｄ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｏｍａｉｎ）（Ｈｏｆｆｍａｎら， １９９５， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ， ２０： ３４７−９）の保存領
域を含むいくつかの配列の類似する領域が示された。ヒトタンパク質は、ＲＡＤ
５３において見られるような長いＣ末端延長部を欠失しているという点で、Ｓ．
ｐｏｍｂｅＣＤＳ１およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＤＵＮ１と同様の全体構造
を示している。ｈＣＤＳ１によるノーザン・ブロッティング分析により、試験し
た精巣および８つのヒト癌試料内で発現される約２．２ｋｂの単一の転写産物が
同定された。
【００６２】 概要を説明すると、２つの多重組織のノーザン・ブロット（Ｃｏｎｔｅｃｈ）
とガン細胞系のノーザン・ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ｈＣＤＳ１に対す
るｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。このプローブは、上述の完全なＯ
ＲＦに対応する。ブロットを非常に厳重に洗浄し（０．１×ＳＳＣ，０．１％Ｓ
ＤＳ，５０℃，２×２０分間）、増感紙を組み合わせたコダックＸ−ＯＭＡＴオ
ートラジオグラフィーフィルムを用いて、−７０℃で露光した。
とガン細胞系のノーザン・ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ｈＣＤＳ１に対す
るｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。このプローブは、上述の完全なＯ
ＲＦに対応する。ブロットを非常に厳重に洗浄し（０．１×ＳＳＣ，０．１％Ｓ
ＤＳ，５０℃，２×２０分間）、増感紙を組み合わせたコダックＸ−ＯＭＡＴオ
ートラジオグラフィーフィルムを用いて、−７０℃で露光した。
【００６３】 実施例３ Ｃｄｃ２５全活性分析 ＤＮＡ損傷の存在下においてＣｄｃ２の脱リン酸化が抑制されているという可
能性から、Ｃｄｃ２５の全活性を調べるための分析が必要となった。ＥＤＴＡの
存在下において、非同調ヒーラ細胞抽出物からのＣｄｃ２／サイクリンＢが、自
発的に不活性化することが分かった。
能性から、Ｃｄｃ２５の全活性を調べるための分析が必要となった。ＥＤＴＡの
存在下において、非同調ヒーラ細胞抽出物からのＣｄｃ２／サイクリンＢが、自
発的に不活性化することが分かった。
【００６４】 概要を説明すると、細胞を氷冷溶菌緩衝液（２ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ
フェニルメチルスルホニルフルオリド、および５μｇ／ｍｌロイペプチン、ペプ
スタチンおよびアプロチニンを含有する５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４）中に溶解
した。溶菌液を１０，０００×ｇで１０分間遠心分離することにより透明化し、
上清のタンパク質濃度をローリーアッセイにより決定した。１０ｍＭ ＥＤＴＡ
を上清（６０μＬ中１００μｇ）に加え、３０℃でインキュベートすることによ
り反応を開始させた。抗サイクリンＢ免疫沈降物中のヒストン−Ｈ１キナーゼ活
性を測定することにより、検定時間ごとにＣｄｃ２／サイクリンＢの活性を検定
した（上記Ｂｌａｓｉｎａら）。イムノブロッティングのために、４００μｇの
細胞溶菌液を、抗サイクリンＢ抗体を用いて免疫沈降させ、１１％のアクリルア
ミド−ＳＤＳゲル上で分離した。Ｃｄｃ２のＰＳＴＡＩＲＥモチーフに対するモ
ノクローナル抗体を、Ｃｄｃ２の異なるリン酸型を検出するために使用した。
フェニルメチルスルホニルフルオリド、および５μｇ／ｍｌロイペプチン、ペプ
スタチンおよびアプロチニンを含有する５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４）中に溶解
した。溶菌液を１０，０００×ｇで１０分間遠心分離することにより透明化し、
上清のタンパク質濃度をローリーアッセイにより決定した。１０ｍＭ ＥＤＴＡ
を上清（６０μＬ中１００μｇ）に加え、３０℃でインキュベートすることによ
り反応を開始させた。抗サイクリンＢ免疫沈降物中のヒストン−Ｈ１キナーゼ活
性を測定することにより、検定時間ごとにＣｄｃ２／サイクリンＢの活性を検定
した（上記Ｂｌａｓｉｎａら）。イムノブロッティングのために、４００μｇの
細胞溶菌液を、抗サイクリンＢ抗体を用いて免疫沈降させ、１１％のアクリルア
ミド−ＳＤＳゲル上で分離した。Ｃｄｃ２のＰＳＴＡＩＲＥモチーフに対するモ
ノクローナル抗体を、Ｃｄｃ２の異なるリン酸型を検出するために使用した。
【００６５】 活性化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の移動度の遅い種として可視化される阻害
リン酸化型のＣｄｃ２の損失に相関する。活性化は、Ｃｄｃ２５および他のチロ
シンホスファターゼの阻害剤であるバナジン酸塩によって阻害される。さらに、
Ｃｄｃ２５Ｃ特異的抗血清による免疫枯渇により、Ｃｄｃ２／サイクリンＢの活
性化が大幅に減少した。Ｃｄｃ２またはサイクリンＢタンパク質のレベルの増加
は見られなかったが、１０ｍＭ ＥＤＴＡを存在させることにより、ＷＥＥ１お
よびＭｙｔ１によるリン酸化は阻害された。このように上記の結果は、Ｃｄｃ２
の活性化が脱リン酸化の結果として起こることを実証した。非同調ヒーラ細胞の
溶菌液において、内在Ｃｄｃ２５ホスファターゼ活性は、３０分以内に利用可能
なサイクリンＢ／Ｃｄｃ２の８０％以上を脱リン酸化し、活性化するのに十分な
ものである。回収１時間前に１０Ｇｙのτ照射に暴露することによりＤＮＡを損
傷させておいたヒーラ細胞の溶菌液を分析したところ、３０分のインキュベーシ
ョンの間に利用可能なＣｄｃ２／サイクリンＢの２５％未満しか活性化されない
というように、Ｃｄｃ２の活性化速度が顕著に減少していることが分かった。複
合体中のＣｄｃ２／サイクリンＢの量に顕著な変化は無く、外来ＧＳＴ−Ｃｄｃ
２５を加えることにより、対照のＣｄｃ２／サイクリンＢと同程度に活性化され
た。１０Ｇｙ照射により、調べた１０の経時点において、Ｃｄｃ２脱リン酸化の
速度が３倍以上も減少した。上で測定したＣｄｃ２５の不活性化が、ヒト細胞に
おけるＤＮＡ損傷チェックポイント反応の一部であるとすれば、ＤＮＡ損傷チェ
ックポイントを無効にする実験条件は、Ｃｄｃ２５の照射誘導阻害を阻止するも
のと考えられるであろう。
リン酸化型のＣｄｃ２の損失に相関する。活性化は、Ｃｄｃ２５および他のチロ
シンホスファターゼの阻害剤であるバナジン酸塩によって阻害される。さらに、
Ｃｄｃ２５Ｃ特異的抗血清による免疫枯渇により、Ｃｄｃ２／サイクリンＢの活
性化が大幅に減少した。Ｃｄｃ２またはサイクリンＢタンパク質のレベルの増加
は見られなかったが、１０ｍＭ ＥＤＴＡを存在させることにより、ＷＥＥ１お
よびＭｙｔ１によるリン酸化は阻害された。このように上記の結果は、Ｃｄｃ２
の活性化が脱リン酸化の結果として起こることを実証した。非同調ヒーラ細胞の
溶菌液において、内在Ｃｄｃ２５ホスファターゼ活性は、３０分以内に利用可能
なサイクリンＢ／Ｃｄｃ２の８０％以上を脱リン酸化し、活性化するのに十分な
ものである。回収１時間前に１０Ｇｙのτ照射に暴露することによりＤＮＡを損
傷させておいたヒーラ細胞の溶菌液を分析したところ、３０分のインキュベーシ
ョンの間に利用可能なＣｄｃ２／サイクリンＢの２５％未満しか活性化されない
というように、Ｃｄｃ２の活性化速度が顕著に減少していることが分かった。複
合体中のＣｄｃ２／サイクリンＢの量に顕著な変化は無く、外来ＧＳＴ−Ｃｄｃ
２５を加えることにより、対照のＣｄｃ２／サイクリンＢと同程度に活性化され
た。１０Ｇｙ照射により、調べた１０の経時点において、Ｃｄｃ２脱リン酸化の
速度が３倍以上も減少した。上で測定したＣｄｃ２５の不活性化が、ヒト細胞に
おけるＤＮＡ損傷チェックポイント反応の一部であるとすれば、ＤＮＡ損傷チェ
ックポイントを無効にする実験条件は、Ｃｄｃ２５の照射誘導阻害を阻止するも
のと考えられるであろう。
【００６６】 実施例４ ｈＣＤＳ１のＤＮＡ損傷チェックポイント効果 様々な細胞におけるＤＮＡ損傷反応は、構造的にＰＩ−３キナーゼに関連する
種々の関連キナーゼを必要とすることが知られている。このファミリーの少なく
とも１つのメンバーであるＤＮＡ−タンパク質キナーゼは、ｉｎ ｖｉｔｒｏに
おいてウォルトマンニンに対して感受性であることが分かっている（Ｈａｗｌｅ
ｙら， １９９６， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．， １０： ２３８３−８
； Ｈａｒｔｌｅｙら， １９９５， Ｃｅｌｌ， ８２： ８４９−８５６）
。したがって、ｗｏｒｔｍａｎｎｎｉｎ感受性キナーゼが、Ｍ期入口における照
射誘導遅延の上流で作用したという可能性について調べた（Ｐｒｉｃｅら， １
９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５６： ２４６−２５０）。ヒ
ーラ細胞はＭ期においてノコダゾールによって停止されることができ、照射はノ
コダゾール感受性Ｍ期遮断点よりも前のＧ２において、細胞の遅延を引き起こす
。したがって、ノコダゾール中で培養された細胞の分裂指数を評価することによ
り、有糸分裂に入るのが遅れたかどうかを決定することができる。ノコダゾール
の存在下で１４時間培養した対照細胞は、６０％の有糸分裂細胞を含んでおり、
ウォルトマンニンの存在はこの数字に殆ど影響を及ぼさなかった。しかしながら
、照射を行ったところ、ノコダゾール遮断点まで到達した細胞の数はわずか１０
％まで減少した。これらの結果は、ウォルトマンニンがヒーラ細胞中のＤＮＡ損
傷Ｇ２チェックポイントを無効にすることを実証した。
種々の関連キナーゼを必要とすることが知られている。このファミリーの少なく
とも１つのメンバーであるＤＮＡ−タンパク質キナーゼは、ｉｎ ｖｉｔｒｏに
おいてウォルトマンニンに対して感受性であることが分かっている（Ｈａｗｌｅ
ｙら， １９９６， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．， １０： ２３８３−８
； Ｈａｒｔｌｅｙら， １９９５， Ｃｅｌｌ， ８２： ８４９−８５６）
。したがって、ｗｏｒｔｍａｎｎｎｉｎ感受性キナーゼが、Ｍ期入口における照
射誘導遅延の上流で作用したという可能性について調べた（Ｐｒｉｃｅら， １
９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５６： ２４６−２５０）。ヒ
ーラ細胞はＭ期においてノコダゾールによって停止されることができ、照射はノ
コダゾール感受性Ｍ期遮断点よりも前のＧ２において、細胞の遅延を引き起こす
。したがって、ノコダゾール中で培養された細胞の分裂指数を評価することによ
り、有糸分裂に入るのが遅れたかどうかを決定することができる。ノコダゾール
の存在下で１４時間培養した対照細胞は、６０％の有糸分裂細胞を含んでおり、
ウォルトマンニンの存在はこの数字に殆ど影響を及ぼさなかった。しかしながら
、照射を行ったところ、ノコダゾール遮断点まで到達した細胞の数はわずか１０
％まで減少した。これらの結果は、ウォルトマンニンがヒーラ細胞中のＤＮＡ損
傷Ｇ２チェックポイントを無効にすることを実証した。
【００６７】 Ｃｄｃ２５の照射誘導性不活性化に対するウォルトマンニンの影響を調べた。
ウォルトマンニンは、非照射の培養物から調製された抽出物中のＣｄｃ２／サイ
クリンＢの活性化には殆ど影響を及ぼさなかったが、照射誘導によるＣｄｃ２５
活性の低下を大幅に減少させた。
ウォルトマンニンは、非照射の培養物から調製された抽出物中のＣｄｃ２／サイ
クリンＢの活性化には殆ど影響を及ぼさなかったが、照射誘導によるＣｄｃ２５
活性の低下を大幅に減少させた。
【００６８】 照射誘導性Ｇ２チェックポイントは、遺伝的障害毛細管拡張性運動失調を患っ
た患者から得た細胞系においても、無効にされた。毛細管拡張性運動失調変異細
胞（ＡＴＭ）は、Ｇ１およびＧ２の両方のチェックポイントに欠損があり、全て
ではないにせよ多くのＤＮＡに損傷を与える物質に暴露される（Ｃａｎｍａｎら
， １９９４， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５４： ５０５４−５０
５８）。Ｇ１を遅延させるＡＴ欠損細胞の損傷は、ｐ５３を正に調節する損傷（
Ｋａｓｔａｎら， １９９２， Ｃｅｌｌ， ７１： ５８７−５８９）、なら
びにｃＡｂ１をリン酸化および活性化する損傷（Ｂａｓｋａｒａｎら， １９９
７， Ｎａｔｕｒｅ， ３８７： ５１６−５１９； Ｓｈａｆｍａｎら， １
９９７， Ｎａｔｕｒｅ， ３８７： ５２０−５２３）と相関している。Ｇ２
を遅延させる損傷に対する分子的根拠は知られていない。ＡＴ欠損細胞では、染
色体の破損を引き起こす物質、たとえばイオン化τ線などに対する反応性が大幅
に減少していた。特筆すべきは、ＡＴ欠損細胞は、紫外線源による照射によって
発生する塩基損傷の結果として、正常に近い反応を示すということである（Ｃａ
ｎｍａｎら， １９９４， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５４： ５０
５４−５０５８； Ｐａｉｎｔｅｒら， １９８０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ， ７７： ７３１５−７３１７； Ｚａｍｐ
ｅｔｔｉ−Ｂｏｓｓｅｌｅｒら， １９８１， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｒａｄｉａｔ ． Ｂｉｏｌ． ， ３９： ５４７−５５８）。紫外線およびτ照射が、ＡＴ（
＋：プラス）およびＡＴ（−：マイナス）のＳＶ４０形質転換ヒト線維芽細胞系
のＣｄｃ２５活性に及ばす影響を調べた。ＡＴ（−）細胞は、紫外線照射に対し
て、Ｃｄｃ２が脱リン酸化される速度が劇的に減少するという反応を見せた。こ
れに対し、τ照射はＣｄｃ２の脱リン酸化速度に対して穏やかな影響しか与えな
かった。ＡＴ（＋）細胞においては、イオン化照射または紫外線照射のいずれを
行った場合でも、Ｃｄｃ２の脱リン酸化速度が著しく低下するという結果が得ら
れた。これらのデータは、ＡＴＭ遺伝子産物が、τ照射の結果として起こるＣｄ
ｃ２５の効率的な不活性化に必要とされていることを示し、Ｃｄｃ２５の不活性
化と、ＤＮＡ損傷の結果として起こるＭ期の始まりの遅れとの間の相関関係を実
証するものである。
た患者から得た細胞系においても、無効にされた。毛細管拡張性運動失調変異細
胞（ＡＴＭ）は、Ｇ１およびＧ２の両方のチェックポイントに欠損があり、全て
ではないにせよ多くのＤＮＡに損傷を与える物質に暴露される（Ｃａｎｍａｎら
， １９９４， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５４： ５０５４−５０
５８）。Ｇ１を遅延させるＡＴ欠損細胞の損傷は、ｐ５３を正に調節する損傷（
Ｋａｓｔａｎら， １９９２， Ｃｅｌｌ， ７１： ５８７−５８９）、なら
びにｃＡｂ１をリン酸化および活性化する損傷（Ｂａｓｋａｒａｎら， １９９
７， Ｎａｔｕｒｅ， ３８７： ５１６−５１９； Ｓｈａｆｍａｎら， １
９９７， Ｎａｔｕｒｅ， ３８７： ５２０−５２３）と相関している。Ｇ２
を遅延させる損傷に対する分子的根拠は知られていない。ＡＴ欠損細胞では、染
色体の破損を引き起こす物質、たとえばイオン化τ線などに対する反応性が大幅
に減少していた。特筆すべきは、ＡＴ欠損細胞は、紫外線源による照射によって
発生する塩基損傷の結果として、正常に近い反応を示すということである（Ｃａ
ｎｍａｎら， １９９４， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５４： ５０
５４−５０５８； Ｐａｉｎｔｅｒら， １９８０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ， ７７： ７３１５−７３１７； Ｚａｍｐ
ｅｔｔｉ−Ｂｏｓｓｅｌｅｒら， １９８１， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｒａｄｉａｔ ． Ｂｉｏｌ． ， ３９： ５４７−５５８）。紫外線およびτ照射が、ＡＴ（
＋：プラス）およびＡＴ（−：マイナス）のＳＶ４０形質転換ヒト線維芽細胞系
のＣｄｃ２５活性に及ばす影響を調べた。ＡＴ（−）細胞は、紫外線照射に対し
て、Ｃｄｃ２が脱リン酸化される速度が劇的に減少するという反応を見せた。こ
れに対し、τ照射はＣｄｃ２の脱リン酸化速度に対して穏やかな影響しか与えな
かった。ＡＴ（＋）細胞においては、イオン化照射または紫外線照射のいずれを
行った場合でも、Ｃｄｃ２の脱リン酸化速度が著しく低下するという結果が得ら
れた。これらのデータは、ＡＴＭ遺伝子産物が、τ照射の結果として起こるＣｄ
ｃ２５の効率的な不活性化に必要とされていることを示し、Ｃｄｃ２５の不活性
化と、ＤＮＡ損傷の結果として起こるＭ期の始まりの遅れとの間の相関関係を実
証するものである。
【００６９】 ヒト細胞におけるＣｄｃ２５のチェックポイント依存性不活性化の媒介物は、
抗癌治療を促進し、正常な細胞への副作用を減らす治療法または治療計画を生み
出すための格好のターゲットである。
抗癌治療を促進し、正常な細胞への副作用を減らす治療法または治療計画を生み
出すための格好のターゲットである。
【００７０】 ｈＣＤＳ１の生化学的特徴づけを容易に行うために、６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１を
昆虫細胞内で発現させ、アフィニティー精製し、ＡＴＰ再生系の存在下にヒーラ
細胞の抽出物中でインキュベートした。抽出物中のキナーゼを阻害するためにＥ
ＤＴＡを加え、Ｃｄｃ２／サイクリンＢの脱リン酸化および活性化の速度をモニ
ターした。
昆虫細胞内で発現させ、アフィニティー精製し、ＡＴＰ再生系の存在下にヒーラ
細胞の抽出物中でインキュベートした。抽出物中のキナーゼを阻害するためにＥ
ＤＴＡを加え、Ｃｄｃ２／サイクリンＢの脱リン酸化および活性化の速度をモニ
ターした。
【００７１】 概要を説明すると、６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１、６ｈｉｓ−Ｃｈｋ１、６ｈｉｓ−
Ｃｄｃ２およびＧＳＴ−Ｃｄｃ２５Ｃをコードする組み換えウィルスを、Ｇｉｂ
ｃｏ／ＢＲＬから入手したＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ発現系を用いて作製した。６ｈ
ｉｓ−融合タンパク質は、クマガイ（ｋｕｍａｇａｉ）ら（Ｋｕｍａｇａｉら，
（１９９５）， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ， ６： １９９−２１３）
に記載されているような方法に従って精製した。ＧＳＨ−セファロースビーズを
、Ｓｆ９抽出物中で１５分間インキュベートし、ビーズを遠心分離により回収し
、溶菌緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０），５ｍＭ ＥＤＴＡ，１５０ｍＭ
ＮａＣｌ，０．１％ ＮＰ４０，５％グリセロール，０．１％β−メルカプト
エタノールおよびプロテアーゼ阻害剤）で３回洗浄した。ビーズは、リン酸化反
応の前にキナーゼアッセイ緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４），１０ｍＭ塩
化マグネシウム）で３回、あるいは、ホスファターゼアッセイの前にホスファタ
ーゼアッセイ緩衝液（５０ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．４），５ｍＭ ＥＤＴＡ
および０．１％β−メルカプトエタノール）で３回のいずれかの洗浄を行った。
Ｃｄｃ２およびＧＳＴ−Ｃｄｃ２５Ｃをコードする組み換えウィルスを、Ｇｉｂ
ｃｏ／ＢＲＬから入手したＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ発現系を用いて作製した。６ｈ
ｉｓ−融合タンパク質は、クマガイ（ｋｕｍａｇａｉ）ら（Ｋｕｍａｇａｉら，
（１９９５）， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ， ６： １９９−２１３）
に記載されているような方法に従って精製した。ＧＳＨ−セファロースビーズを
、Ｓｆ９抽出物中で１５分間インキュベートし、ビーズを遠心分離により回収し
、溶菌緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０），５ｍＭ ＥＤＴＡ，１５０ｍＭ
ＮａＣｌ，０．１％ ＮＰ４０，５％グリセロール，０．１％β−メルカプト
エタノールおよびプロテアーゼ阻害剤）で３回洗浄した。ビーズは、リン酸化反
応の前にキナーゼアッセイ緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４），１０ｍＭ塩
化マグネシウム）で３回、あるいは、ホスファターゼアッセイの前にホスファタ
ーゼアッセイ緩衝液（５０ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．４），５ｍＭ ＥＤＴＡ
および０．１％β−メルカプトエタノール）で３回のいずれかの洗浄を行った。
【００７２】 これらのアッセイにおいて、６ｈｉｓ−Ｃｈｋ１および６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１
のいずれもＣｄｃ２／サイクリンＢの活性化を著しく減少させることが分かった
。Ｃｄｃ２の活性化の減少は用量に依存し、ＡＴＰを必要とした。Ｃｄｃ２は６
ｈｉｓ−Ｃｈｋ１または６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１によって不可逆的に阻害されない
という事実が、キナーゼ処理後に過剰のＣＳＴ−Ｃｄｃ２５Ｃを加えた際に活性
化が生じたことから確証された。したがって、６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１と６ｈｉｓ
−Ｃｈｋ１のいずれも、抽出物中で見られるＣｄｃ２５の照射誘導性の負の調節
を模倣することができる。これらの実験では遠心分離によって透明化にしたヒー
ラ細胞溶菌液を用いたので、細胞下画分における変化がＣｄｃ２５の活性化の原
因であるとは考えにくい（Ｐｅｎｇら， １９９７， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７
７： １５０１−１５０５）。
のいずれもＣｄｃ２／サイクリンＢの活性化を著しく減少させることが分かった
。Ｃｄｃ２の活性化の減少は用量に依存し、ＡＴＰを必要とした。Ｃｄｃ２は６
ｈｉｓ−Ｃｈｋ１または６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１によって不可逆的に阻害されない
という事実が、キナーゼ処理後に過剰のＣＳＴ−Ｃｄｃ２５Ｃを加えた際に活性
化が生じたことから確証された。したがって、６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１と６ｈｉｓ
−Ｃｈｋ１のいずれも、抽出物中で見られるＣｄｃ２５の照射誘導性の負の調節
を模倣することができる。これらの実験では遠心分離によって透明化にしたヒー
ラ細胞溶菌液を用いたので、細胞下画分における変化がＣｄｃ２５の活性化の原
因であるとは考えにくい（Ｐｅｎｇら， １９９７， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７
７： １５０１−１５０５）。
【００７３】 実施例５ Ｃｄｃ２５に対するｈＣＤＳ１の直接的影響 ｈＣＤＳ１によるＣｄｃ２５阻害の間接的メカニズムを細胞溶菌液のアッセイ
からは除外することができなかったので、アフィニティー精製した試薬を用いて
、ｈＣＤＳ１による直接的リン酸化とＧＳＴ−Ｃｄｃ２５活性の阻害を調べた。
からは除外することができなかったので、アフィニティー精製した試薬を用いて
、ｈＣＤＳ１による直接的リン酸化とＧＳＴ−Ｃｄｃ２５活性の阻害を調べた。
【００７４】 ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５を、τ―３２Ｐ ＡＴＰの存在下に、６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ
１、偽ビーズ、または６ｈｉｓ−Ｃｈｋ１のいずれかと共に、３０℃で１５分間
インキュベートした。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、オートラジ
オグラフィーにより可視化した。ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５は、６ｈｉｓ−Ｃｈｋ１お
よび６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１によってリン酸化した。Ｃｄｃ２５ホスファターゼ活
性がこのリン酸化によって影響されたかどうかを決定するためのアッセイを行っ
た。
１、偽ビーズ、または６ｈｉｓ−Ｃｈｋ１のいずれかと共に、３０℃で１５分間
インキュベートした。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、オートラジ
オグラフィーにより可視化した。ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５は、６ｈｉｓ−Ｃｈｋ１お
よび６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１によってリン酸化した。Ｃｄｃ２５ホスファターゼ活
性がこのリン酸化によって影響されたかどうかを決定するためのアッセイを行っ
た。
【００７５】 ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５の、Ｃｄｃ２／サイクリンＢ免疫沈降物のヒストン−Ｈ１
キナーゼ活性を活性化する能力について評価した。６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１による
ＧＳＴ―Ｃｄｃ２５のリン酸化が、ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５のＣｄｃ２／サイクリン
Ｂ活性化能を阻害していることが分かった。したがって、これらのデータから、
６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＣｄｃ２５を不活性化し、Ｃ
ｄｃ２５はｉｎ ｖｉｖｏにおいてはＤＮＡ損傷の結果として不活性化されるこ
とが実証された。
キナーゼ活性を活性化する能力について評価した。６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１による
ＧＳＴ―Ｃｄｃ２５のリン酸化が、ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５のＣｄｃ２／サイクリン
Ｂ活性化能を阻害していることが分かった。したがって、これらのデータから、
６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＣｄｃ２５を不活性化し、Ｃ
ｄｃ２５はｉｎ ｖｉｖｏにおいてはＤＮＡ損傷の結果として不活性化されるこ
とが実証された。
【００７６】 ６ｈｉｓ−Ｃｈｋ１はＧＳＴ−Ｃｄｃ２５と会合し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおい
てヒストン−Ｈ１キナーゼ活性を有するので（Ｓａｎｃｈｅｚら， １９９７，
Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７７： １４９７−１５０１）、Ｃｄｃ２／サイクリン
Ｂキナーゼ活性の分析結果が分かりにくいものであった。ＧＳＴ−Ｃｈｋ１の効
果を試験するために、ゲル移動度の解析で遅い移動度を示すＣｄｃ２の種の消失
からＣｄｃ２脱リン酸化をモニターするというアッセイを使用した。
てヒストン−Ｈ１キナーゼ活性を有するので（Ｓａｎｃｈｅｚら， １９９７，
Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７７： １４９７−１５０１）、Ｃｄｃ２／サイクリン
Ｂキナーゼ活性の分析結果が分かりにくいものであった。ＧＳＴ−Ｃｈｋ１の効
果を試験するために、ゲル移動度の解析で遅い移動度を示すＣｄｃ２の種の消失
からＣｄｃ２脱リン酸化をモニターするというアッセイを使用した。
【００７７】 概要を説明すると、リン酸化されたＣｄｃ２を、６ｈｉｓ−Ｃｄｃ２，６ｈｉ
ｓ−Ｗｅｅｌ，６ｈｉｓ−Ｍｙｔ１およびＧＳＴ−サイクリンＢ（Ｐａｒｋｅｒ
ら， １９９２， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５７： １９９５−１９５７）をコー
ドする組み換えバキュロウィルスで同時感染を行ったＳｆ９細胞から精製した。
サイクリンＢに複合化された６ｈｉｓ−Ｃｄｃ２は、溶菌緩衝液に１ｍＭ ＶＯ ４ を含めたこと以外は、ＧＳＴ−Ｃｄｃ２のための条件と同じ条件下でＧＳＨビ
ーズを用いて精製した。ウェスタンブロット分析からは、四重感染の結果として
、大多数のＣｄｃ２／ＧＳＴ−サイクリンＢが一方または両方の阻害部位におい
てリン酸化されていることが示された。これらのホスファターゼアッセイは、１
０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下、およびＡＴＰ非存在下において、６ｈｉｓ−Ｃｈｋ
１がＣｄｃ２またはサイクリンＢを直接リン酸化する可能性を除去する条件下で
実施した。ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５は、Ｃｄｃ２の遅い移動度のリン酸化された型の
還元を触媒する。６ｈｉｓ−Ｃｈｋ１によって予めＧＳＴ−Ｃｄｃ２５をリン酸
化しておくことにより、ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５活性の用量依存性減少が起こる。こ
れらのデータは、Ｃｈｋ１がＣｄｃ２５活性の負の調節を行うことを裏付けるも
のであり（Ｆｕｒｎａｒｉら， １９９７， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７７： １
４９５−１４９７； Ｗｅｉｎｅｒｔ １９９７， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７７
： １４５０）、このことを、負の調節はホスファターゼ活性の不活性化を包含
することを実証することにより拡張するものである。
ｓ−Ｗｅｅｌ，６ｈｉｓ−Ｍｙｔ１およびＧＳＴ−サイクリンＢ（Ｐａｒｋｅｒ
ら， １９９２， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５７： １９９５−１９５７）をコー
ドする組み換えバキュロウィルスで同時感染を行ったＳｆ９細胞から精製した。
サイクリンＢに複合化された６ｈｉｓ−Ｃｄｃ２は、溶菌緩衝液に１ｍＭ ＶＯ ４ を含めたこと以外は、ＧＳＴ−Ｃｄｃ２のための条件と同じ条件下でＧＳＨビ
ーズを用いて精製した。ウェスタンブロット分析からは、四重感染の結果として
、大多数のＣｄｃ２／ＧＳＴ−サイクリンＢが一方または両方の阻害部位におい
てリン酸化されていることが示された。これらのホスファターゼアッセイは、１
０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下、およびＡＴＰ非存在下において、６ｈｉｓ−Ｃｈｋ
１がＣｄｃ２またはサイクリンＢを直接リン酸化する可能性を除去する条件下で
実施した。ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５は、Ｃｄｃ２の遅い移動度のリン酸化された型の
還元を触媒する。６ｈｉｓ−Ｃｈｋ１によって予めＧＳＴ−Ｃｄｃ２５をリン酸
化しておくことにより、ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５活性の用量依存性減少が起こる。こ
れらのデータは、Ｃｈｋ１がＣｄｃ２５活性の負の調節を行うことを裏付けるも
のであり（Ｆｕｒｎａｒｉら， １９９７， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７７： １
４９５−１４９７； Ｗｅｉｎｅｒｔ １９９７， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７７
： １４５０）、このことを、負の調節はホスファターゼ活性の不活性化を包含
することを実証することにより拡張するものである。
【００７８】 実施例６ ｈＣＤＳ１のＤＮＡ損傷および修飾 前のデータから、６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１がＣｄｃ２５を不活性化すること、お
よびＤＮＡ損傷がＣｄｃ２５の不活性化に関連していることが示されたので、Ｄ
ＮＡ損傷がｈＣＤＳ１に何らかの修飾または活性化をもたらすのかどうかを調べ
るためのアッセイを行った。６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１に対する抗血清を、ヒーラ細
胞溶菌液を用いた免疫複合体キナーゼアッセイにおいて使用した。ｈＣＤＳ１に
対する弱いシグナルが、非同調ヒーラ細胞からの試料中で検出され、照射の結果
としてｈＣＤＳ１のリン酸化の上昇が見られた。
よびＤＮＡ損傷がＣｄｃ２５の不活性化に関連していることが示されたので、Ｄ
ＮＡ損傷がｈＣＤＳ１に何らかの修飾または活性化をもたらすのかどうかを調べ
るためのアッセイを行った。６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１に対する抗血清を、ヒーラ細
胞溶菌液を用いた免疫複合体キナーゼアッセイにおいて使用した。ｈＣＤＳ１に
対する弱いシグナルが、非同調ヒーラ細胞からの試料中で検出され、照射の結果
としてｈＣＤＳ１のリン酸化の上昇が見られた。
【００７９】 概要を説明すると、Ｓｆ９細胞から精製した６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１でウサギを
免疫化することにより、ｈＣＤＳ１に対する抗体を生産した（Ｈａｒｌｏｗら，
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， １９９８）。結果として生じた抗血清は、
６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１ウィルスで感染させたＳｆ９細胞から得た予想分子量の活
性キナーゼを免疫沈降させたが、非感染Ｓｆ９細胞または６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１
で感染させた他の細胞から得た予想分子量の活性キナーゼを免疫沈降させること
はなかった。
免疫化することにより、ｈＣＤＳ１に対する抗体を生産した（Ｈａｒｌｏｗら，
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， １９９８）。結果として生じた抗血清は、
６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１ウィルスで感染させたＳｆ９細胞から得た予想分子量の活
性キナーゼを免疫沈降させたが、非感染Ｓｆ９細胞または６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１
で感染させた他の細胞から得た予想分子量の活性キナーゼを免疫沈降させること
はなかった。
【００８０】 ４％ＳＤＳ中で変性させた後にタンパク質バンドを再沈降させることにより、
これらの結果がｈＣＤＳ１によるものであることが確認された。ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏリン酸化は、自己リン酸化によるものである可能性が最も高く、シグナルの増
加は照射による活性の増加を反映している。ｐ６４Ｃｄｓ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ
リン酸化の増加は、ＲＡＤ５３およびＤＵＮ１と同様に、ｈＣＤＳ１がＤＮＡ損
傷に応答して修飾されたことを示唆する。
これらの結果がｈＣＤＳ１によるものであることが確認された。ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏリン酸化は、自己リン酸化によるものである可能性が最も高く、シグナルの増
加は照射による活性の増加を反映している。ｐ６４Ｃｄｓ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ
リン酸化の増加は、ＲＡＤ５３およびＤＵＮ１と同様に、ｈＣＤＳ１がＤＮＡ損
傷に応答して修飾されたことを示唆する。
【００８１】 ＤＮＡ合成の抑制がｐ６４Ｃｄｓ１のリン酸化に与える影響について、更なる
アッセイによって調べた。複製が停止された細胞から得たｈＣＤＳ１は、非同調
培養から得られたタンパク質と厳密に同じ挙動を示したが、チミジンまたはＤＮ
Ａ複製を阻止する他の物質に反応してリン酸化が著しく増加することはなかった
。ｐ６４Ｃｄｓ１のリン酸化の増加は、チミジン停止された細胞を照射した場合
に検出された。Ｓ期外でほとんどが停止された細胞中のＤＮＡ損傷の影響を試験
した。細胞を照射前にノコダゾールの存在下に２０時間培養した。この場合も、
弱いが検出可能なシグナルが照射されていない試料中に見られた。しかしながら
、ノコダゾール停止細胞ではリン酸化が増加した。
アッセイによって調べた。複製が停止された細胞から得たｈＣＤＳ１は、非同調
培養から得られたタンパク質と厳密に同じ挙動を示したが、チミジンまたはＤＮ
Ａ複製を阻止する他の物質に反応してリン酸化が著しく増加することはなかった
。ｐ６４Ｃｄｓ１のリン酸化の増加は、チミジン停止された細胞を照射した場合
に検出された。Ｓ期外でほとんどが停止された細胞中のＤＮＡ損傷の影響を試験
した。細胞を照射前にノコダゾールの存在下に２０時間培養した。この場合も、
弱いが検出可能なシグナルが照射されていない試料中に見られた。しかしながら
、ノコダゾール停止細胞ではリン酸化が増加した。
【００８２】 これらの知見は、分裂酵母のＣｄｓ１が不完全に複製されたＤＮＡに応答して
活性化されるという酵母において得られた知見とは、驚くほど対照的である（Ｂ
ｏｄｄｙら， １９９８， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８０： ９０９−１２； Ｌ
ｉｎｄｓａｙら， １９９８， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．， １２： ３
８２−９５）。この結果は、ヒトＣｄｓ１が、酵母において以前に確認されてい
るような複製チェックポイントよりもむしろ、ＤＮＡ損傷チェックポイントにお
ける役割を果たしていることを示すものである。
活性化されるという酵母において得られた知見とは、驚くほど対照的である（Ｂ
ｏｄｄｙら， １９９８， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８０： ９０９−１２； Ｌ
ｉｎｄｓａｙら， １９９８， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．， １２： ３
８２−９５）。この結果は、ヒトＣｄｓ１が、酵母において以前に確認されてい
るような複製チェックポイントよりもむしろ、ＤＮＡ損傷チェックポイントにお
ける役割を果たしていることを示すものである。
【００８３】 実施例７ 薬物同定 上述のＣｄｃ２５アッセイは、活性が増強されるまたは阻害されることでｈＣ
ＤＳ１およびＣｄｃ２５が調節するＤＮＡ損傷チェックポイントを修飾すると考
えられる化学物質の同定に適切に用いられる。したがって、典型的なスクリーニ
ングアッセイは、上述と同様の条件を使用し、試験すべき物質を加えて実施する
。アッセイ化合物の活性のモニタリング、すなわち上述のようなリン酸化の検出
は、活性の促進と阻害の両方を検出するために対照反応との比較において実施す
ることができる。
ＤＳ１およびＣｄｃ２５が調節するＤＮＡ損傷チェックポイントを修飾すると考
えられる化学物質の同定に適切に用いられる。したがって、典型的なスクリーニ
ングアッセイは、上述と同様の条件を使用し、試験すべき物質を加えて実施する
。アッセイ化合物の活性のモニタリング、すなわち上述のようなリン酸化の検出
は、活性の促進と阻害の両方を検出するために対照反応との比較において実施す
ることができる。
【００８４】 明らかに、そのようなアッセイは、機械的／自動化装置および検出に容易に適
用することができる。このアッセイは、公知のアッセイ反応の基本的要素に、自
動高出力低信号装置を組み合わせて使用するのに適しており、該自動高出力低信
号装置は、顕微鏡スライドアレイ、またはＣＣＤ検出装置と組み合わせた細胞バ
イオチップアレイを搭載していてもよく、リン酸化またはキナーゼ活性に対する
他の反応によってトリガーされる信号を使用する。
用することができる。このアッセイは、公知のアッセイ反応の基本的要素に、自
動高出力低信号装置を組み合わせて使用するのに適しており、該自動高出力低信
号装置は、顕微鏡スライドアレイ、またはＣＣＤ検出装置と組み合わせた細胞バ
イオチップアレイを搭載していてもよく、リン酸化またはキナーゼ活性に対する
他の反応によってトリガーされる信号を使用する。
【００８５】 実施例８ 治療的用途 ｈＣＤＳ１のキャラクタリゼーション、ならびに、ヒトＣｄｓ１が、酵母にお
いて確認されているような複製チェックポイントよりもむしろ、ＤＮＡ損傷チェ
ックポイントにおける役割を果たしていることが解明されたことから、この知識
を癌の化学治療薬に対する付加成分として作用する薬剤の製造および治療方法に
適用することができる。
いて確認されているような複製チェックポイントよりもむしろ、ＤＮＡ損傷チェ
ックポイントにおける役割を果たしていることが解明されたことから、この知識
を癌の化学治療薬に対する付加成分として作用する薬剤の製造および治療方法に
適用することができる。
【００８６】 特に、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス分子、ｈＣＤＳ１タンパク質、ｈＣＤ
Ｓ１タンパク質に対する抗体、あるいは本発明のアッセイにおいて同定されたも
のに対応する薬剤を組み合わせた本発明の薬学的製剤は、化学治療薬の主作用に
対する付加成分として作用させるために、適切な化学剤と組み合わせて投与する
ことができる。たとえば、抗代謝、抗菌、アルキル化剤、微小管阻害剤、ステロ
イドホルモンやそれらのアンタゴニスト、および他の薬剤などの抗癌薬の使用は
、一般に細胞の複製に必須の代謝部位に向けて行われる。これらの薬物は理想的
には、悪性腫瘍細胞の独特な細胞過程にのみ介入すべきであるが、現在利用可能
な抗癌薬は、正常および悪性腫瘍のすべての増殖細胞に対して影響を与える。し
たがって、現行の化学治療は、毒性および治療的効果の両方に対する急峻な用量
−反応曲線によって阻まれている。したがって、本発明のｈＣＤＳ１を主成分と
する薬物および本発明のｈＣＤＳ１アッセイによって同定された薬物を、化学治
療薬とともに投与することにより、悪性腫瘍細胞の死滅を促進させることができ
る。
Ｓ１タンパク質に対する抗体、あるいは本発明のアッセイにおいて同定されたも
のに対応する薬剤を組み合わせた本発明の薬学的製剤は、化学治療薬の主作用に
対する付加成分として作用させるために、適切な化学剤と組み合わせて投与する
ことができる。たとえば、抗代謝、抗菌、アルキル化剤、微小管阻害剤、ステロ
イドホルモンやそれらのアンタゴニスト、および他の薬剤などの抗癌薬の使用は
、一般に細胞の複製に必須の代謝部位に向けて行われる。これらの薬物は理想的
には、悪性腫瘍細胞の独特な細胞過程にのみ介入すべきであるが、現在利用可能
な抗癌薬は、正常および悪性腫瘍のすべての増殖細胞に対して影響を与える。し
たがって、現行の化学治療は、毒性および治療的効果の両方に対する急峻な用量
−反応曲線によって阻まれている。したがって、本発明のｈＣＤＳ１を主成分と
する薬物および本発明のｈＣＤＳ１アッセイによって同定された薬物を、化学治
療薬とともに投与することにより、悪性腫瘍細胞の死滅を促進させることができ
る。
【００８７】 死滅の促進に対する１つのメカニズムは、悪性腫瘍細胞のＤＮＡ損傷チェック
ポイント制御を無効にして、ＤＮＡの損傷を引き起こす化学治療薬の投与の効率
を上げることにより、成し遂げられる。ＤＮＡ損傷制御チェックポイントは、上
で実証したｈＣＤＳ１反応を修飾することにより、無効にすることができる。
ポイント制御を無効にして、ＤＮＡの損傷を引き起こす化学治療薬の投与の効率
を上げることにより、成し遂げられる。ＤＮＡ損傷制御チェックポイントは、上
で実証したｈＣＤＳ１反応を修飾することにより、無効にすることができる。
【００８８】 したがって、新規なｈＣＤＳ１に基づいた治療薬をいずれか１つまたは複数の
抗癌剤と組み合わせて投与することを、本発明は予想している。たとえば、シト
ラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、メトト
レキサート、６−チオグアニン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノル
ビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、プリカマイシン、カルムスチン、イオ
ムスチン、シクロホスホアミド、イホスファミド、メクロロエタミン、ストレプ
トゾトシン、ナベルビン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、
アスパラギナーゼ、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、インターフェ
ロン、プロカルバジンなどの抗癌剤の正常用量を、適当な量のｈＣＤＳ１に基づ
いた薬物とともに、ａ）投与時間の長さを変える、ｂ）投与間隔を変える、ｃ）
腫瘍細胞に対する化学治療薬の効力を変える、あるいはｄ）正常な細胞に対する
化学治療剤の副作用を変えるように、投与することができる。ｈＣＤＳ１に基づ
いた薬物の同時投与の効果は、他のものに加えてこれらの効果の１つまたは組合
せであり得る。
抗癌剤と組み合わせて投与することを、本発明は予想している。たとえば、シト
ラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、メトト
レキサート、６−チオグアニン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノル
ビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、プリカマイシン、カルムスチン、イオ
ムスチン、シクロホスホアミド、イホスファミド、メクロロエタミン、ストレプ
トゾトシン、ナベルビン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、
アスパラギナーゼ、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、インターフェ
ロン、プロカルバジンなどの抗癌剤の正常用量を、適当な量のｈＣＤＳ１に基づ
いた薬物とともに、ａ）投与時間の長さを変える、ｂ）投与間隔を変える、ｃ）
腫瘍細胞に対する化学治療薬の効力を変える、あるいはｄ）正常な細胞に対する
化学治療剤の副作用を変えるように、投与することができる。ｈＣＤＳ１に基づ
いた薬物の同時投与の効果は、他のものに加えてこれらの効果の１つまたは組合
せであり得る。
【００８９】 典型的には、化学治療薬による癌細胞の破壊は、対数死滅効果に対する一次動
力学に従う。したがって、ｈＣＤＳ１に基づく治療薬の同時投与は、対数死滅効
果を促進するように設計される。典型的には、化学療法の治療プロトコールは、
代謝経路の異なる段階において作用する薬物の組合せを必要とし、これにより毒
性を低く保ちながら死滅を促進する。したがって、ｈＣＤＳ１に基づいた治療薬
の同時投与は、そうしたプロトコールと理想的に組み合わされて、その効力を高
めることができる。
力学に従う。したがって、ｈＣＤＳ１に基づく治療薬の同時投与は、対数死滅効
果を促進するように設計される。典型的には、化学療法の治療プロトコールは、
代謝経路の異なる段階において作用する薬物の組合せを必要とし、これにより毒
性を低く保ちながら死滅を促進する。したがって、ｈＣＤＳ１に基づいた治療薬
の同時投与は、そうしたプロトコールと理想的に組み合わされて、その効力を高
めることができる。
【００９０】 最終的に、最も効果的な治療方法は、化学治療薬および／またはＭＤＲ（多薬
剤耐性）阻害剤とｈＣＤＳ１に基づく治療薬とを一緒に特定のターゲットに標的
を絞って投与して、ＤＮＡ損傷の修復を伴わない細胞自らの非制御複製を介して
悪性腫瘍細胞を消滅させ、結果的に細胞死滅を高めるというものであろう。
剤耐性）阻害剤とｈＣＤＳ１に基づく治療薬とを一緒に特定のターゲットに標的
を絞って投与して、ＤＮＡ損傷の修復を伴わない細胞自らの非制御複製を介して
悪性腫瘍細胞を消滅させ、結果的に細胞死滅を高めるというものであろう。
【００９１】 上記の議論および実施例は、本発明を説明することを意図したものであり、限
定するものと解釈すべきでない。本発明の精神および範囲内において、さらに他
の変形も可能であり、当業者にとってそれらは容易に理解されるであろう。
定するものと解釈すべきでない。本発明の精神および範囲内において、さらに他
の変形も可能であり、当業者にとってそれらは容易に理解されるであろう。
【配列表】
【図１】 ｈＣＤＳ１の核酸配列（配列番号１）を示す図であり、残基番号６６〜１６９
４がコード領域であり、３’および５’が非翻訳領域（ＵＴＲ）である。開始お
よび終結コドンは太字で示されている。
４がコード領域であり、３’および５’が非翻訳領域（ＵＴＲ）である。開始お
よび終結コドンは太字で示されている。
【図２】 ｈＣＤＳ１の推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図３】 ｈＣＤＳ１とＳ．ｐｏｍｂｅ ｃｄｓ１のアミノ酸配列アライメントを示す図
である。このアライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアライメントプログラムを用
いて行い、ＧＥＮＥＤＯＣプログラムを用いて注釈を付けた。黒色で陰付けした
部分は、２つのタンパク質間で同一であるものを示し、灰色で陰付けした部分は
両タンパク質間で類似するものを示す。
である。このアライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアライメントプログラムを用
いて行い、ＧＥＮＥＤＯＣプログラムを用いて注釈を付けた。黒色で陰付けした
部分は、２つのタンパク質間で同一であるものを示し、灰色で陰付けした部分は
両タンパク質間で類似するものを示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年７月１０日（２０００．７．１０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】 詳細には、本発明は、配列番号１の核酸配列からなるｈＣＤＳ１をコードする
核酸配列を包含する。詳細には、本発明は、ｈＣＤＳ１タンパク質に翻訳される
配列番号１の核酸配列の６６位〜１６９４位の核酸配列を包含する。本発明はま
た、配列番号１の核酸配列を含む核酸構築物、ベクター、プラスミド、コスミド
なども包含する。詳細には、本発明は、配列番号１の核酸配列を含み、該核酸配
列からタンパク質を発現することのできる核酸ベクター構築物を提供する。本発
明は、真核細胞または原核細胞に関わらず、宿主細胞の形質転換に適するか、ウ
ィルスベクターへの組込みに適するか、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏ（試験管内）
におけるタンパク質の発現に適する核酸ベクターを包含する。本発明はさらに、
配列番号１の核酸によってコードされるタンパク質の少なくとも機能性フラグメ
ントを含む融合タンパク質産物を生産するために、別の核酸配列と縦列させるか
、あるいは他の方法で結合させた、配列番号１の核酸配列を実現する。本発明は
さらに、標的細胞中への組込みと発現のための裸のＤＮＡ形質転換体として使用
するように適用された配列番号１の核酸配列をも包含する。本発明はまた、配列
番号１の核酸配列の連続部分または不連続部分のいずれに相補的であるかに関わ
らず、配列番号１の核酸配列およびそのフラグメントに相補的な、アンチセンス
ＤＮＡ分子調製物を提供する。本発明はまた、配列番号１の核酸配列、その相補
体、またはそのフラグメントをコードする修飾されたヌクレオチドまたはバック
ボーン成分を混合した組成物も提供する。そのような修飾されたヌクレオチドお
よび核酸は、当該技術分野において周知である［たとえば、ヴェルマ（Ｖｅｒｍ
ａ）らのＡｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７： ９９−１３４（１９
９８）を参照のこと］。したがって本発明は、たとえばヌクレオチド間連結修飾
、塩基修飾、糖修飾、非放射性ラベル、核酸架橋、ＰＮＡｓ（ポリペプチド核酸
）を含むバックボーンの改変などを組み込んだ、修飾された核酸を包含する。
核酸配列を包含する。詳細には、本発明は、ｈＣＤＳ１タンパク質に翻訳される
配列番号１の核酸配列の６６位〜１６９４位の核酸配列を包含する。本発明はま
た、配列番号１の核酸配列を含む核酸構築物、ベクター、プラスミド、コスミド
なども包含する。詳細には、本発明は、配列番号１の核酸配列を含み、該核酸配
列からタンパク質を発現することのできる核酸ベクター構築物を提供する。本発
明は、真核細胞または原核細胞に関わらず、宿主細胞の形質転換に適するか、ウ
ィルスベクターへの組込みに適するか、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏ（試験管内）
におけるタンパク質の発現に適する核酸ベクターを包含する。本発明はさらに、
配列番号１の核酸によってコードされるタンパク質の少なくとも機能性フラグメ
ントを含む融合タンパク質産物を生産するために、別の核酸配列と縦列させるか
、あるいは他の方法で結合させた、配列番号１の核酸配列を実現する。本発明は
さらに、標的細胞中への組込みと発現のための裸のＤＮＡ形質転換体として使用
するように適用された配列番号１の核酸配列をも包含する。本発明はまた、配列
番号１の核酸配列の連続部分または不連続部分のいずれに相補的であるかに関わ
らず、配列番号１の核酸配列およびそのフラグメントに相補的な、アンチセンス
ＤＮＡ分子調製物を提供する。本発明はまた、配列番号１の核酸配列、その相補
体、またはそのフラグメントをコードする修飾されたヌクレオチドまたはバック
ボーン成分を混合した組成物も提供する。そのような修飾されたヌクレオチドお
よび核酸は、当該技術分野において周知である［たとえば、ヴェルマ（Ｖｅｒｍ
ａ）らのＡｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７： ９９−１３４（１９
９８）を参照のこと］。したがって本発明は、たとえばヌクレオチド間連結修飾
、塩基修飾、糖修飾、非放射性ラベル、核酸架橋、ＰＮＡｓ（ポリペプチド核酸
）を含むバックボーンの改変などを組み込んだ、修飾された核酸を包含する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１４】 本発明はまた、組み換えＤＮＡ技術と、ｈＣＤＳ１タンパク質、融合タンパク
質またはそのフラグメントをコードする適切な核酸とを用いて、ｈＣＤＳ１タン
パク質を生産する方法も提供する。本発明はまた、適切な核酸配列を、プロモー
タ、及び／またはエンハンサーなどの、誘導可能であるかあるいは構造的に発現
される適切な制御要素を統合した、適切な発現ベクターに組み込むことを提供す
る。本発明は、少なくとも１つの追加の選択可能なマーカーまたは発現可能なタ
ンパク質を有するか、あるいは有しない発現ベクターの使用を提供する。本発明
は、適切に構築された発現ベクターが、形質転換もしくは他の方法により適切な
宿主細胞に導入され、そのような宿主細胞によってタンパク質が発現されるよう
な方法を提供する。したがって、本発明はまた、ｈＣＤＳ１タンパク質、融合タ
ンパク質、またはそのフラグメントを生産することのできる形質転換された宿主
細胞も提供する。
質またはそのフラグメントをコードする適切な核酸とを用いて、ｈＣＤＳ１タン
パク質を生産する方法も提供する。本発明はまた、適切な核酸配列を、プロモー
タ、及び／またはエンハンサーなどの、誘導可能であるかあるいは構造的に発現
される適切な制御要素を統合した、適切な発現ベクターに組み込むことを提供す
る。本発明は、少なくとも１つの追加の選択可能なマーカーまたは発現可能なタ
ンパク質を有するか、あるいは有しない発現ベクターの使用を提供する。本発明
は、適切に構築された発現ベクターが、形質転換もしくは他の方法により適切な
宿主細胞に導入され、そのような宿主細胞によってタンパク質が発現されるよう
な方法を提供する。したがって、本発明はまた、ｈＣＤＳ１タンパク質、融合タ
ンパク質、またはそのフラグメントを生産することのできる形質転換された宿主
細胞も提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３２】 有利には、本発明に従う核酸および／またはタンパク質は、薬学的組成物内に
、該組成物のための薬学的に許容されうる担体、希釈剤または賦形剤とともに含
まれていてもよい。本発明に従う前記核酸を含む薬学的組成物は、たとえば遺伝
子治療において使用することもできる。本発明に従うそのような核酸は、裸の状
態、あるいはタンパク質カプセル、脂質カプセル、リポソーム、膜を基剤にした
カプセル、ウィルスタンパク質、全ウィルス、細胞ベクター、細菌細胞宿主、改
変哺乳動物細胞、または他の投与のための適切な手段内に包装した状態で投与す
ることができる。
、該組成物のための薬学的に許容されうる担体、希釈剤または賦形剤とともに含
まれていてもよい。本発明に従う前記核酸を含む薬学的組成物は、たとえば遺伝
子治療において使用することもできる。本発明に従うそのような核酸は、裸の状
態、あるいはタンパク質カプセル、脂質カプセル、リポソーム、膜を基剤にした
カプセル、ウィルスタンパク質、全ウィルス、細胞ベクター、細菌細胞宿主、改
変哺乳動物細胞、または他の投与のための適切な手段内に包装した状態で投与す
ることができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３７】 本発明によれば、抗癌治療に対する候補物質をスクリーニングする方法も提供
され、該方法は、ａ）キナーゼ活性を提示している本発明に従うタンパク質を、
前記タンパク質に対する基質とともに、キナーゼが該基質に作用するような条件
下で提供することと、ｂ）タンパク質および基質を候補物質と接触させることと
、ｃ）タンパク質のキナーゼ活性の増加または減少の程度を測定することと、及
びｄ）活性の減少または増加を引き起こす候補物質を選択することとを含む。そ
のような候補物質は、癌または増殖性の細胞障害の治療のための医薬品として、
あるいは医薬品の調製において使用することができる。
され、該方法は、ａ）キナーゼ活性を提示している本発明に従うタンパク質を、
前記タンパク質に対する基質とともに、キナーゼが該基質に作用するような条件
下で提供することと、ｂ）タンパク質および基質を候補物質と接触させることと
、ｃ）タンパク質のキナーゼ活性の増加または減少の程度を測定することと、及
びｄ）活性の減少または増加を引き起こす候補物質を選択することとを含む。そ
のような候補物質は、癌または増殖性の細胞障害の治療のための医薬品として、
あるいは医薬品の調製において使用することができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６８】 照射誘導性Ｇ２チェックポイントは、遺伝的障害毛細管拡張性運動失調を患っ
た患者から得た細胞系においても、無効にされた。毛細管拡張性運動失調変異細
胞は、Ｇ１およびＧ２の両方のチェックポイントに欠損があり、全てではないに
せよ多くのＤＮＡに損傷を与える物質に暴露される（Ｃａｎｍａｎら， １９９
４， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５４： ５０５４−５０５８）。Ｇ
１を遅延させるＡＴ欠損細胞の損傷は、ｐ５３を正に調節する損傷（Ｋａｓｔａ
ｎら， １９９２， Ｃｅｌｌ， ７１： ５８７−５８９）、ならびにｃＡｂ
１をリン酸化および活性化する損傷（Ｂａｓｋａｒａｎら， １９９７， Ｎａ ｔｕｒｅ ， ３８７： ５１６−５１９； Ｓｈａｆｍａｎら， １９９７，
Ｎａｔｕｒｅ， ３８７： ５２０−５２３）と相関している。Ｇ２を遅延させ
る損傷に対する分子的根拠は知られていない。ＡＴ欠損細胞では、染色体の破損
を引き起こす物質、たとえばイオン化τ線などに対する反応性が大幅に減少して
いた。特筆すべきは、ＡＴ欠損細胞は、紫外線源による照射によって発生する塩
基損傷の結果として、正常に近い反応を示すということである（Ｃａｎｍａｎら
， １９９４， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５４： ５０５４−５０
５８； Ｐａｉｎｔｅｒら， １９８０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ， ７７： ７３１５−７３１７； Ｚａｍｐｅｔｔｉ−
Ｂｏｓｓｅｌｅｒら， １９８１， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｒａｄｉａｔ． Ｂｉｏ ｌ． ， ３９： ５４７−５５８）。紫外線およびτ照射が、ＡＴ（＋：プラス
）およびＡＴ（−：マイナス）のＳＶ４０形質転換ヒト線維芽細胞系のＣｄｃ２
５活性に及ばす影響を調べた。ＡＴ（−）細胞は、紫外線照射に対して、Ｃｄｃ
２が脱リン酸化される速度が劇的に減少するという反応を見せた。これに対し、
τ照射はＣｄｃ２の脱リン酸化速度に対して穏やかな影響しか与えなかった。Ａ
Ｔ（＋）細胞においては、イオン化照射または紫外線照射のいずれを行った場合
でも、Ｃｄｃ２の脱リン酸化速度が著しく低下するという結果が得られた。これ
らのデータは、ＡＴＭ遺伝子産物が、τ照射の結果として起こるＣｄｃ２５の効
率的な不活性化に必要とされていることを示し、Ｃｄｃ２５の不活性化と、ＤＮ
Ａ損傷の結果として起こるＭ期の始まりの遅れとの間の相関関係を実証するもの
である。
た患者から得た細胞系においても、無効にされた。毛細管拡張性運動失調変異細
胞は、Ｇ１およびＧ２の両方のチェックポイントに欠損があり、全てではないに
せよ多くのＤＮＡに損傷を与える物質に暴露される（Ｃａｎｍａｎら， １９９
４， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５４： ５０５４−５０５８）。Ｇ
１を遅延させるＡＴ欠損細胞の損傷は、ｐ５３を正に調節する損傷（Ｋａｓｔａ
ｎら， １９９２， Ｃｅｌｌ， ７１： ５８７−５８９）、ならびにｃＡｂ
１をリン酸化および活性化する損傷（Ｂａｓｋａｒａｎら， １９９７， Ｎａ ｔｕｒｅ ， ３８７： ５１６−５１９； Ｓｈａｆｍａｎら， １９９７，
Ｎａｔｕｒｅ， ３８７： ５２０−５２３）と相関している。Ｇ２を遅延させ
る損傷に対する分子的根拠は知られていない。ＡＴ欠損細胞では、染色体の破損
を引き起こす物質、たとえばイオン化τ線などに対する反応性が大幅に減少して
いた。特筆すべきは、ＡＴ欠損細胞は、紫外線源による照射によって発生する塩
基損傷の結果として、正常に近い反応を示すということである（Ｃａｎｍａｎら
， １９９４， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５４： ５０５４−５０
５８； Ｐａｉｎｔｅｒら， １９８０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ， ７７： ７３１５−７３１７； Ｚａｍｐｅｔｔｉ−
Ｂｏｓｓｅｌｅｒら， １９８１， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｒａｄｉａｔ． Ｂｉｏ ｌ． ， ３９： ５４７−５５８）。紫外線およびτ照射が、ＡＴ（＋：プラス
）およびＡＴ（−：マイナス）のＳＶ４０形質転換ヒト線維芽細胞系のＣｄｃ２
５活性に及ばす影響を調べた。ＡＴ（−）細胞は、紫外線照射に対して、Ｃｄｃ
２が脱リン酸化される速度が劇的に減少するという反応を見せた。これに対し、
τ照射はＣｄｃ２の脱リン酸化速度に対して穏やかな影響しか与えなかった。Ａ
Ｔ（＋）細胞においては、イオン化照射または紫外線照射のいずれを行った場合
でも、Ｃｄｃ２の脱リン酸化速度が著しく低下するという結果が得られた。これ
らのデータは、ＡＴＭ遺伝子産物が、τ照射の結果として起こるＣｄｃ２５の効
率的な不活性化に必要とされていることを示し、Ｃｄｃ２５の不活性化と、ＤＮ
Ａ損傷の結果として起こるＭ期の始まりの遅れとの間の相関関係を実証するもの
である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７４】 ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５を、γ―３２Ｐ ＡＴＰの存在下に、６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ
１、偽ビーズ、または６ｈｉｓ−Ｃｈｋ１のいずれかと共に、３０℃で１５分間
インキュベートした。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、オートラジ
オグラフィーにより可視化した。ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５は、６ｈｉｓ−Ｃｈｋ１お
よび６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１によってリン酸化した。Ｃｄｃ２５ホスファターゼ活
性がこのリン酸化によって影響されたかどうかを決定するためのアッセイを行っ
た。
１、偽ビーズ、または６ｈｉｓ−Ｃｈｋ１のいずれかと共に、３０℃で１５分間
インキュベートした。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、オートラジ
オグラフィーにより可視化した。ＧＳＴ−Ｃｄｃ２５は、６ｈｉｓ−Ｃｈｋ１お
よび６ｈｉｓ−ｈＣＤＳ１によってリン酸化した。Ｃｄｃ２５ホスファターゼ活
性がこのリン酸化によって影響されたかどうかを決定するためのアッセイを行っ
た。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８８】 したがって、新規なｈＣＤＳ１に基づいた治療薬をいずれか１つまたは複数の
抗癌剤と組み合わせて投与することを、本発明は予想している。たとえば、シト
ラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、メトト
レキサート、６−チオグアニン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノル
ビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、プリカマイシン、カルムスチン、イオ
ムスチン、シクロホスホアミド、イホスファミド、メクロロエタミン、ストレプ
トゾトシン、ナベルビン（登録商標）、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビン
クリスチン、アスパラギナーゼ、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、
インターフェロン、プロカルバジンなどの抗癌剤の正常用量を、適当な量のｈＣ
ＤＳ１に基づいた薬物とともに、ａ）投与時間の長さを変える、ｂ）投与間隔を
変える、ｃ）腫瘍細胞に対する化学治療薬の効力を変える、あるいはｄ）正常な
細胞に対する化学治療剤の副作用を変えるように、投与することができる。ｈＣ
ＤＳ１に基づいた薬物の同時投与の効果は、他のものに加えてこれらの効果の１
つまたは組合せであり得る。
抗癌剤と組み合わせて投与することを、本発明は予想している。たとえば、シト
ラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、メトト
レキサート、６−チオグアニン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノル
ビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、プリカマイシン、カルムスチン、イオ
ムスチン、シクロホスホアミド、イホスファミド、メクロロエタミン、ストレプ
トゾトシン、ナベルビン（登録商標）、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビン
クリスチン、アスパラギナーゼ、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、
インターフェロン、プロカルバジンなどの抗癌剤の正常用量を、適当な量のｈＣ
ＤＳ１に基づいた薬物とともに、ａ）投与時間の長さを変える、ｂ）投与間隔を
変える、ｃ）腫瘍細胞に対する化学治療薬の効力を変える、あるいはｄ）正常な
細胞に対する化学治療剤の副作用を変えるように、投与することができる。ｈＣ
ＤＳ１に基づいた薬物の同時投与の効果は、他のものに加えてこれらの効果の１
つまたは組合せであり得る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】 ｈＣＤＳ１のｃＤＮＡの核酸配列（配列番号１）を示す図であり、残基番号６
６〜１６９４がコード領域であり、３’および５’が非翻訳領域（ＵＴＲ）であ
る。開始および終結コドンは太字で示されている。
６〜１６９４がコード領域であり、３’および５’が非翻訳領域（ＵＴＲ）であ
る。開始および終結コドンは太字で示されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 パーカー，アンドリユー・イー イギリス国、チエシヤー・エス・ケー・ 10・４・テイー・ジー、マクルズフイール ド、オールダリー・パーク、メアサイド・ ８・エイ・エフ・22、ゼネカ・フアーマシ ユーテイカルズ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA10 CA04 CA09 HA17 4B050 CC03 DD11 LL01 4B063 QA01 QA13 QQ02 QQ42 QQ53 QR55 QS34 4C084 AA02 AA13 BA35 CA53 DC50 NA14 ZB262
Claims (19)
- 【請求項１】 図１の核酸配列（配列番号１）の６６位〜１６９４位に示さ
れる核酸配列を有する、ＨＣＤＳ１をコードする単離された核酸。 - 【請求項２】 図２のアミノ酸配列（配列番号２）を有するタンパク質をコ
ードする、あるいはその機能的同等物、フラグメントまたは該タンパク質の生物
前駆体をコードする単離された核酸。 - 【請求項３】 ＤＮＡ分子であることを特徴とする請求項２に記載の核酸。
- 【請求項４】 前記ＤＮＡ分子がｃＤＮＡであることを特徴とする請求項３
に記載の核酸。 - 【請求項５】 図１の核酸配列（配列番号１）の６６位〜１６９４位に示さ
れる核酸配列を有する請求項３または４のいずれかに記載の核酸、あるいは該核
酸の相補体、あるいは緊縮条件下において該核酸にハイブリダイズすることので
きる配列、あるいはその相補体。 - 【請求項６】緊縮条件下において、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸と
ハイブリダイズすることのできる配列を含むアンチセンス分子。 - 【請求項７】前記核酸は、ヌクレオチド間連結修飾、ヌクレオチド塩基修飾
、ヌクレオチド糖修飾、非放射性ラベル、核酸架橋、およびペプチド核酸修飾か
らなる群より選択される修飾を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに
記載の核酸。 - 【請求項８】 癌または他の増殖性疾患の治療において使用するための、請
求項１〜７のいずれかに記載の核酸。 - 【請求項９】 医薬品の製造において使用するための、請求項１〜７のいず
れかに記載の核酸。 - 【請求項１０】 医薬品の製造において使用するための、請求項１〜７のい
ずれかに記載の核酸の使用。 - 【請求項１１】 請求項１〜７に記載の核酸を、薬学的に許容しうる担体、
希釈剤または賦形剤とともに含む薬学的組成物。 - 【請求項１２】 請求項１〜７に記載の核酸を、薬学的に許容しうる担体、
希釈剤または賦形剤とともに含む薬学的組成物の、癌または他の増殖性疾患の治
療のための使用。 - 【請求項１３】 癌または増殖性疾患の治療方法であって、前記治療方法は
、請求項１〜７に記載の核酸を治療を必要としている患者に投与する段階を含む
ことを特徴とする方法。 - 【請求項１４】 癌また増殖性疾患の治療方法であって、前記治療方法は、
請求項１〜７に記載の核酸とともに、薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦
形剤を含む組成物を、治療を必要としている患者に投与する段階を含むことを特
徴とする方法。 - 【請求項１５】 請求項１〜７のいずれかによって定義される核酸の少なく
とも１５ヌクレオチドのフラグメントを含むことを特徴とする核酸プローブ。 - 【請求項１６】 生物試料中に請求項１の核酸が存在するか否かを検出する
方法であって、該方法は、前記試料を、ハイブリダイゼーション条件下において
、請求項１〜７のいずれかに記載の核酸を含むプローブまたは請求項１５に記載
のプローブと接触させることと、前記プローブと前記試料中に存在する核酸との
間に形成された二重らせんまたは三重らせんの存在を検出することとを含むこと
を特徴とする方法。 - 【請求項１７】 ＬＭＢＰ３７０８の同定特性を有する単離されたプラスミ
ド。 - 【請求項１８】 ＬＭＢＰ３７１０の同定特性を有する単離されたプラスミ
ド。 - 【請求項１９】 ＬＭＢＰ３７０９の同定特性を有する単離されたプラスミ
ド。
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|---|---|---|---|
| GBGB9722320.0A GB9722320D0 (en) | 1997-10-22 | 1997-10-22 | Human cell cycle checkpoint proteins |
| GB9722320.0 | 1997-10-22 | ||
| PCT/EP1998/006982 WO1999020747A2 (en) | 1997-10-22 | 1998-10-21 | HUMAN CHECKPOINT KINASE, hCDS1, COMPOSITIONS AND METHODS |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001520037A true JP2001520037A (ja) | 2001-10-30 |
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ID=10820925
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000521208A Expired - Fee Related JP4261050B2 (ja) | 1997-10-22 | 1998-10-21 | ヒト・チェックポイントキナーゼｈｃｄｓ１の組成物および方法 |
| JP2000517068A Expired - Lifetime JP4418103B2 (ja) | 1997-10-22 | 1998-10-21 | 新規なヒトチェックポイントキナーゼ、ｈＣＤＳ１、組成物および方法 |
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|---|---|---|---|
| JP2000521208A Expired - Fee Related JP4261050B2 (ja) | 1997-10-22 | 1998-10-21 | ヒト・チェックポイントキナーゼｈｃｄｓ１の組成物および方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (2) | EP1025237B1 (ja) |
| JP (2) | JP4261050B2 (ja) |
| AT (2) | ATE304052T1 (ja) |
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| DK (2) | DK1025237T3 (ja) |
| ES (2) | ES2245807T3 (ja) |
| GB (1) | GB9722320D0 (ja) |
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| NZ (2) | NZ503983A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| CA2331152A1 (en) * | 1998-06-23 | 1999-12-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Cell cycle regulating factor |
| GB9827430D0 (en) * | 1998-12-11 | 1999-02-03 | Ludwig Inst Cancer Res | Differential expression in primary breast cancer |
| WO2001061016A2 (en) * | 2000-02-18 | 2001-08-23 | Lexicon Genetics Incorporated | Human kinases and polynucleotides encoding the same |
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| FR2812945B1 (fr) * | 2000-08-10 | 2002-10-04 | Aventis Pharma Sa | Utilisation de la proteine grf1 et cellules exprimant la proteine grf1 pour le criblage de molecules |
| US6372468B1 (en) | 2000-09-14 | 2002-04-16 | Pe Corporation (Ny) | Isolated human kinase proteins, nucleic acid molecules encoding human kinase proteins, and uses thereof |
| WO2002048328A2 (en) * | 2000-12-14 | 2002-06-20 | Pe Corporation (Ny) | Isolated human kinase proteins, their encoding nucleic acid molecules, and uses thereof |
| WO2002051858A2 (en) * | 2000-12-22 | 2002-07-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of chk2 expression |
| US6451538B1 (en) * | 2000-12-22 | 2002-09-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of CHK2 expression |
| WO2002059325A2 (en) * | 2000-12-27 | 2002-08-01 | Lexicon Genetics Incorporated | Human kinases and polynucleotides encoding the same |
| EP1224942A1 (en) * | 2001-01-23 | 2002-07-24 | Bernhard Dr. Nieswandt | Use of JAQ1 (monoclonal antibody anti GPVI) as a medicament for the protection against thrombotic diseases |
| ATE404564T1 (de) * | 2003-01-09 | 2008-08-15 | Pfizer | Diazepinoindolderivate als kinaseinhibitoren |
| BRPI0413876A (pt) * | 2003-08-29 | 2006-10-24 | Pfizer | tienopiridin-fenilacetamidas e seus derivados úteis como agentes antiangiogênicos |
| BRPI0414011A (pt) * | 2003-08-29 | 2006-10-24 | Pfizer | naftalencarboxamidas e seus derivados úteis como novos agentes antiangiogênicos |
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| PL322876A1 (en) * | 1995-11-16 | 1998-03-02 | Icos Corp | Pik type kinase of cellular cycle control point: materials and methods |
| US5744349A (en) * | 1996-03-05 | 1998-04-28 | Washington University | DNA sequences encoding human Myt1 kinase |
| US6218109B1 (en) * | 1997-09-05 | 2001-04-17 | Baylor College Of Medicine | Mammalian checkpoint genes and proteins |
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