ES2245807T3 - Quinasa humana de puntos de control, hcds1, composiciones y procedimientos. - Google Patents

Abstract

Vector de expresión de ADN que comprende una molécula aislada de ADN que posee la secuencia ácido nucleica representada en la Figura 1 (SEC ID nº:1). La presente invención se refiere al descubrimiento de un nuevo gen quinásico humano hCDS1 de control, proteína y constructos, y a procedimientos para la producción y utilización de hCDS1. En particular, la presente invención incluye una secuencia ácido nucleica que codifica hCDS1, que consiste en la secuencia ácido nucleica de SEC ID nº:1. En particular, la invención incluye la secuencia ácido nucleica entre la posición 66 y la 1694 de la secuencia ácido nucleica de SEC ID nº:1, que se traduce en la proteína hCDS1. La presente invención incluye asimismo los constructos ácido nucleicos, vectores, plásmidos, cósmidos y similares que contienen la secuencia ácido nucleica de SEC ID nº:1. En particular, la presente invención proporciona los constructos del vector ácido nucleico que contienen la secuencia nucleica de SEC ID nº:1, y que son capaces de expresar la proteína a partir de esta secuencia ácido nucleica. La presente invención incluye vectores ácido nucleicos que son apropiados para transformar a las células huéspedes procarióticas o eucarióticas, que son apropiados para incorporarse a vectores víricos, o apropiados para la expresión proteica in vitro. La presente invención incorpora además la secuencia ácido nucleica de SEC ID nº:1, en tándem con, o de otro modo, conjuntamente con ácidos nucleicos adicionales, para generar productos proteicos de fusión que contengan por lo menos el segmento funcional de la proteína codificada por el ácido de la SEC ID nº:1. La presente invención incluye asimismo el ácido nucleico de SEC ID nº:1 adaptado para su utilización como un transformante de ADN desnudo e incorporarlo y expresarlo en las células diana. La presente invención proporciona asimismo formulaciones de una molécula de ADN antisentido que son el complemento para la secuencia ácido nucleica de SEC ID Nº:1 y fragmentos suyos, si son complementarios a partes contiguas o discontinuas de la secuencia ácido nucleica de SEC ID nº:1.

Description

Quinasa humana de puntos de control, hCDS1, composiciones y procedimientos.

Antecedentes de la invención

La integridad del genoma es de capital importancia para una célula que se divide. En respuesta a la lesión del ADN, las células eucarióticas se basan en un sistema complejo de controles de verificación para retrasar la progresión del ciclo celular. El ciclo celular eucariótico normal se divide en 4 fases (secuencialmente G1, S, G2, M) que se correlacionan con distintas morfologías celulares y actividad bioquímica, y las células que se apartan del ciclo celular, se dice que están en el estado G0, no cíclico. Cuando las células que se encuentran realizando el ciclo celular se replican activamente la duplicación del ADN tiene lugar en la fase S, y la división activa de la célula ocurre en la fase M. Véase en general Benjamin Lewin, GENES VI (Oxford University Press, Oxford, GB, capítulo 36, 1997). El ADN está organizado en la célula eucariótica en niveles de organización sucesivamente más elevados, que dan lugar a la formación de cromosomas. Los cromosomas no sexuales se encuentran normalmente formando pares, y durante la división celular, el ADN de cada cromosoma se replica, dando lugar a cromátides pareadas (Véase generalmente Benjamin Lewin, GENES VI (Oxford University Press, Oxford, GB, capítulo 5, 1997).

Los retrasos de los puntos de control proporcionan tiempo para la reparación del ADN dañado, antes de su replicación en la fase S y antes de la segregación de las cromátides en la fase M (Hartwell y Weinert, 1989, Science, 246: 629-634). En muchos casos las vías de respuesta a la lesión del ADN provocan la detención, inhibiendo la actividad de las quinasas dependientes de la ciclina (Elledge, 1997, Science, 274: 1664-1671). En las células humanas, el retraso de G2 inducido por la alteración del ADN depende ampliamente de la fosforilación inhibitoria de Cdc2 (Blasina et al., 1997, Mol. Cell. Biol., 8:1-11; Jin et al., 1996, J. Cell. Biol., 134:963-970), y es por tanto probable que resulte de un cambio en la actividad de las quinasas y fosfatasas opuestas que actúan sobre Cdc2. Sin embargo, no existe evidencia de que la actividad de estas enzimas se altere sustancialmente en respuesta a la lesión del ADN (Poon et al., 1997, Cancer Res., 57: 5168-5178).

Tres proteínas distintas Cdc25 se expresan en las células humanas. La Cdc25A se requiere específicamente para la transición G1-S (Hoffmann et al., 1994, EMBO J., 13: 4302-4310; Jinno et al., 1994., EMBO J., 13:1549-1556), mientras que Cdc25B y Cdc25C son necesarias para la transición G2-M (Gabrielli et al., 1996, J. Cell Sci., 7: 1081-1093; Galaktionov et al, 1991, Cell, 67: 1181-1194; Millar et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10500-10504; Nishijima et al, 1997, J. Cell Biol., 138:1105-1116). La contribución exacta de Cdc25B y Cdc25C a la progresión de la fase M no se conoce.

Mucho de nuestro conocimiento actual sobre el punto de control se ha obtenido a partir de estudios que utilizaron levaduras de gemación (Saccharomyces cerevisiae) y de fisión (Schizosaccharomyces pombe). Diversas revisiones de nuestro conocimiento actual de los controles (de verificación) del ciclo celular en las levaduras y en los eucariotas superiores, se han publicado recientemente (Hartwell & Kastan, 1994, Science, 266:1821-1828, Murray, 1994, Current Biology, 6: 872-876; Elledge, 1996, Science, 274: 1664-1672; Kaufmann & Paules, 1996, FASEB J., 10: 238-247). En la levadura de fisión se han identificado seis productos génicos, rad1^{+}, rad3^{+}, rad9^{+}, rad17^{+}, rad26^{+}, y hus1^{+} como componentes de las vías de control (de verificación) que dependen tanto de la replicación del ADN como de la lesión de ADN. Además, cds1^{+} se ha identificado necesario para el control (de verificación) que depende de la replicación del ADN y rad27^{+}/chk1^{+} se ha identificado necesario para el control (de verificación) que depende de la lesión del ADN en las levaduras.

Varios de estos genes tienen homólogos estructurales en las levaduras de gemación y recientemente se ha sugerido su conservación ulterior a través de los eucariotas con la clonación de dos homólogos humanos de S. pombe rad3^{+}: ATM (mutado a ataxia telangiectasia) (Savitsky et al., 1995, Science, 268: 1749-1753) y ATR (ataxia telangiectasia y rad3^{+} relacionados) (Bentley et al, 1996, EMBO J., 15:6641-6651; Cimprich et al; 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 2850-2855) y de un homólogo humano de S. pombe rad9+ (Liebermann et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:13890-13885).

Mientras que se conoce mucho acerca de las proteínas y genes del (control) de verificación de la levadura, este conocimiento no predice completamente la existencia de genes o proteínas humanos correspondientes, o su función efectora en el control y regulación del ciclo celular humano.

Para desarrollar nuevos tratamientos más efectivos y terapéuticos para mejorar los efectos del cáncer, es importante identificar y caracterizar las proteínas humanas de control e identificar mediadores de su actividad.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al descubrimiento de un nuevo gen quinásico humano hCDS1 de control, proteína y constructos, y a procedimientos para la producción y utilización de hCDS1.

En particular, la presente invención incluye una secuencia ácido nucleica que codifica hCDS1, que consiste en la secuencia ácido nucleica de SEC ID nº:1. En particular, la invención incluye la secuencia ácido nucleica entre la posición 66 y la 1694 de la secuencia ácido nucleica de SEC ID nº:1, que se traduce en la proteína hCDS1. La presente invención incluye asimismo los constructos ácido nucleicos, vectores, plásmidos, cósmidos y similares que contienen la secuencia ácido nucleica de SEC ID nº:1. En particular, la presente invención proporciona los constructos del vector ácido nucleico que contienen la secuencia nucleica de SEC ID nº:1, y que son capaces de expresar la proteína a partir de esta secuencia ácido nucleica. La presente invención incluye vectores ácido nucleicos que son apropiados para transformar a las células huéspedes procarióticas o eucarióticas, que son apropiados para incorporarse a vectores víricos, o apropiados para la expresión proteica in vitro. La presente invención incorpora además la secuencia ácido nucleica de SEC ID nº:1, en tándem con, o de otro modo, conjuntamente con ácidos nucleicos adicionales, para generar productos proteicos de fusión que contengan por lo menos el segmento funcional de la proteína codificada por el ácido de la SEC ID nº:1. La presente invención incluye asimismo el ácido nucleico de SEC ID nº:1 adaptado para su utilización como un transformante de ADN desnudo e incorporarlo y expresarlo en las células diana. La presente invención proporciona asimismo formulaciones de una molécula de ADN antisentido que son el complemento para la secuencia ácido nucleica de SEC ID Nº:1 y fragmentos suyos, si son complementarios a partes contiguas o discontinuas de la secuencia ácido nucleica de SEC ID nº:1. La presente invención proporciona asimismo composiciones que incorporan nucleótidos modificados o componentes estructurales que codifican la secuencia ácido nucleica de SEC ID nº:1, su complemento o fragmentos suyos. Dichos nucleótidos modificados y ácidos nucleicos se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Verma et al., Ann. Rev. Biochem. 67: 99-134 (1988)). Así, la presente invención incluye ácidos nucleicos modificados que incorporan, por ejemplo, modificaciones del enlace internucleótido, modificaciones de las bases, modificaciones de los azúcares, marcadores no radioactivos, entrecruzamiento de ácidos nucleicos y estructuras alteradas que incluyen PNAs (ácidos nucleicos
polipeptídicos).

La presente invención proporciona la nueva proteína quinasa hCDS1 humana de control, que está formada por la secuencia aminoácida de SEC ID nº:2. La invención incluye la proteína hCDS1 producida mediante tecnología del ADN recombinante y que se expresa in vivo o in vitro. La invención incluye, de este modo, la proteína hCDS1 producida a pequeña o gran escala por células huésped transformadas. La invención incluye la proteína hCDS1 completa, en forma glicosilada o no, producida por células eucarióticas o procarióticas. La presente invención proporciona la proteína hCDS1 que se expresa a partir de células huésped de mamíferos, insectos, plantas, bacterias, hongos o de cualquier otra célula huésped apropiada. La presente invención incluye la proteína hCDS1 que se produce como un producto proteico de fusión, conjugado a un soporte sólido, o la proteína hCDS1 marcada con cualquier marcador químico, radioactivo, fluorescente o quimioluminiscente o detectable de otra forma. La presente invención proporciona asimismo la proteína hCDS1 aislada a partir de fuentes naturales y que gana en pureza respecto a la encontrada en la naturaleza. La presente invención proporciona asimismo formulaciones farmacéuticas de la proteína hCDS1 y formulaciones de la proteína hCDS1 en transportadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.

La presente invención incluye cualquier secuencia ácido nucleica que codifique la secuencia aminoácida de SEC ID nº:2, y las formas de realización de estas secuencias ácido nucleicas tal como se describen para la SEC ID nº:1, pues la codificación del ácido nucleico para generar cualquier secuencia ácido nucleica que codifique una proteína que tenga la secuencia aminoácida de SEC ID nº:2, puede ser predicha por el experto en la materia.

La presente invención incluye anticuerpos monoclonales o policlonales que se unen específicamente a la proteína hCDS1, generados por la inmunización de un mamífero con una proteína que tiene la secuencia aminoácida de SEC ID nº2 o fragmentos de la misma.

La presente invención incluye asimismo proteínas equivalentes en las que las sustituciones de aminoácidos en la secuencia de SEC ID nº2 que son razonablemente predecibles como equivalentes, sus formas de realización son tal como se describe para SEC ID nº2. Por ejemplo, los expertos en la materia entienden que los aminoácidos no polares (cadena lateral hidrofóbica) alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptófano, metionina; los aminoácidos polares no cargados, glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina; los aminoácidos polares cargados, ácido aspártico, ácido glutámico; y los aminoácidos básicos lisina, arginina e histidina, tendrán efectos funcionales predecibles cuando sean sustituidos. De este modo, la presente invención incluye asimismo ácidos nucleicos equivalentes que codifican dichas proteínas equivalentes y sus formas de realización, tal como se describe para SEC ID nº1.

La invención proporciona asimismo procedimientos para generar la proteína hCDS1, utilizando tecnología del ADN recombinante y el ácido nucleico apropiado que codifique la proteína hCDS1, proteína de fusión, o sus fragmentos. La invención proporciona la incorporación de una secuencia de un ácido nucleico apropiado en un vector de expresión apropiado, junto con la incorporación de cualesquiera elementos apropiados de control, tales como un promotor y/o un potenciador, que se expresen inducible o constitutivamente. La invención proporciona la utilización de vectores de expresión con o sin, por lo menos, un marcador seleccionable adicional o proteína que se exprese. La invención proporciona procedimientos en los que un vector de expresión construido apropiadamente se transforma o se introduce de otra forma en una célula huésped apropiada, expresándose la proteína mediante dicha célula huésped. Así, la presente invención proporciona asimismo las células huéspedes transformadas, que pueden producir la proteína hCDS1, proteína de fusión, o sus fragmentos.

El descubrimiento de que la hCDS1 actúa coordinadamente con Cdc25 en el punto de control de la lesión del ADN, permite la utilización de la invención en procedimientos para el tratamiento terapéutico de enfermedades que implican una función anormal en el punto de control de la lesión del ADN. La presente invención proporciona además la utilización de los compuestos de a presente invención como terapéutica para el tratamiento del cáncer. En particular, la presente invención permite la modificación específica de los puntos de control de la lesión de hCDS1-Cdc25 ADN en las células.

La presente invención incluye asimismo procedimientos para el rastreo de los compuestos de ensayo eficaces que afecten a la función del punto de control de las células eucariotas mediada por la hCDS1, comprendiendo dichos procedimientos poner en contacto con las células eucarióticas un compuesto de prueba c y detectar cualquier cambio en la expresión o función de hCDS1. De este modo, la invención incluye además el procedimiento de rastreo, en el que dicha detección del cambio en la expresión o función de hCDS1 se lleva a cabo ensayando la producción de ARNm hCDS1, o ensayando la expresión de la proteína hCDS1. En particular, la presente invención permite el rastreo de sustancias candidatas respecto a la eficacia para modificar el punto de control de la lesión del ADN rastreando cualquier cambio en la fosforilación de Cdc25, o actividad quinásica. Los compuestos o sustancias que se identifican mediante los ensayos de la invención, o los compuestos que corresponden a dichos compuestos o sustancias, pueden utilizarse para la preparación de la terapéutica farmacéutica.

Así, en una forma de realización, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que incluyen la proteína hCDS1, el ácido nucleico hCDS1 y los ácidos nucleicos antisentido hCDS1. Estas composiciones farmacéuticas pueden incluir además agentes quimioterapéuticos para utilizar en el tratamiento del cáncer, o administrarse en un régimen coordinado con la administración de otras terapias anticáncer. La presente invención, en una forma de realización, incluye, pues, procedimientos para una quimioterapia combinada que utiliza independientemente los medicamentos derivados de hCDS1, y en combinación con otros agentes quimioterapéuticos, y en una segunda forma de realización, como mezclas con otras terapéuticas anticáncer para la administración de dosis única.

Según un aspecto de la invención, se proporciona un ácido nucleico que codifica la proteína hCDS1 que posee la secuencia aminoácida que se muestra en la Figura 2 (SEC ID nº:2), o que codifica un fragmento funcional equivalente, o bioprecursor de dicha proteína. Preferentemente, el ácido nucleico puede ser una molécula de ADN tal como una molécula de ADN genómico y más preferentemente, incluso, una molécula de ADNc, pudiendo ser asimismo, sin embargo, ARN.

En una forma de realización preferida, un ácido nucleico que codifica la proteína hCDS1 comprende la secuencia ácido nucleica representada en la posición 66 a 1694 de la secuencia que se muestra en la Figura 1 (SEC ID nº:1), su complemento, o una secuencia ácido nucleica capaz de hibridizarse a cualquiera bajo condiciones de alta
restricción.

Las secuencias ácido nucleicas que se definen en la presente memoria, pueden, ventajosamente, ser capaces de hibridizarse bajo condiciones de baja restricción, a secuencias ácido nucleicas derivadas de miembros de la familia para identificar homólogos a partir de ellas, o alternativamente, identificar secuencias ácido nucleicas de otras especies.

Como será bien conocido por los expertos en la materia, debido a la degeneración del código genético, las secuencias ácido nucleicas según la invención, pueden incluir todavía allí sustituciones que codificarán aún la misma secuencia aminoácida.

Ventajosamente, los ácidos nucleicos según la invención pueden incorporarse a un vector de expresión y utilizarse seguidamente para transformar, transfectar o infectar una célula huésped apropiada. En dicho vector de expresión, el ácido nucleico según la invención está unido operativamente a una secuencia de control, tal como un promotor apropiado o similar, que asegura la expresión de las proteínas según la invención, en una célula huésped apropiada. El vector de expresión puede ser ventajosamente un plásmido, cósmido, virus u otro vector apropiado. El vector de expresión y la célula huésped transfectada, transformada o infectada con el vector, forma parte asimismo de la invención. Preferentemente, la célula huésped es una célula eucariótica o una bacteriana, e incluso, más preferentemente, una célula de mamífero o una célula de insecto. Las células huéspedes de mamífero son particularmente ventajosas, porque proporcionan las necesarias modificaciones postraduccionales a las proteínas que se expresan según la invención, tal como la glicosilación o similares, las cuales modificaciones confieren una actividad biológica óptima a las proteínas, que cuando se aíslan, pueden utilizarse ventajosamente en equipos diagnósticos o similares.

El vector de expresión que incluye dicho ácido nucleico según la invención, puede utilizarse ventajosamente in vivo, como por ejemplo, en la terapia génica.

Según otro aspecto de la invención, se proporcionan asimismo una célula, tejido u organismo no humano transgénicos, que comprende un transgén capaz de expresar la proteína hCDS1. la cual comprende la secuencia aminoácida que se muestra en la Figura 2 (SEC ID nº:2), o la secuencia aminoácida de un equivalente funcional o bioprecursor o fragmento suyo. El término "transgén capaz de expresión", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una secuencia ácido nucleica apropiada que conduce a la expresión de hCDS1 o de proteínas que tienen la misma función y/o actividad. El transgén puede incluir, por ejemplo, ácido nucleico genómico aislado de células humanas, ácido nucleico sintético, que incluye ADN integrado en el genoma o en un estado extracromosómico. Preferentemente, el transgén comprende la secuencia ácido nucleica que codifica las proteínas según la invención, tal como se describe en la presente memoria, o un fragmento funcional de dicho ácido nucleico. Se considerará que un fragmento funcional de dicho ácido nucleico significa un fragmento del gen que comprende dicho ácido nucleico que codifica las proteínas según la invención, o un equivalente funcional, derivado, o un derivado no funcional, tal como un mutante negativo dominante, o bioprecursor de dichas proteínas. Por ejemplo, será evidente para los expertos en la materia que las sustituciones nucleótidas o deleciones pueden utilizarse empleando técnicas rutinarias, que no afectan a la secuencia proteica codificada por dicho ácido nucleico, o que codifican una proteína funcional según la inven-
ción.

La proteína hCDS1 que se expresa por dicha célula transgénica, tejido u organismo no humano, o un equivalente funcional o bioprecursor de dicha proteína, forma parte asimismo de la presente invención.

Mediante la presente invención se proporciona además una molécula antisentido que puede hibridizar el ácido nucleico según la invención. Ventajosamente, la molécula antisentido según la invención, puede utilizarse como un medicamento, o en la preparación de un medicamento para tratar el cáncer y otras enfermedades proliferativas.

La presente invención proporciona ventajosamente, asimismo, secuencias ácido nucleicas de por lo menos 15 nucleótidos, aproximadamente, de un ácido nucleico según la invención, y preferentemente de 15 a 50 nucleótidos. Estas secuencias pueden utilizarse ventajosamente como sondas o iniciadores para empezar la replicación, o similares. Dichas secuencias ácido nucleicas pueden producirse según procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como la recombinación o la síntesis. Asimismo, pueden utilizarse en equipos diagnósticos o similares para detectar la presencia de cualquier formación duplex o triplex entre la sonda y cualquier ácido nucleico en la muestra.

Ventajosamente, las secuencias ácido nucleicas según la invención pueden obtenerse utilizando dichos medios recombinantes o sintéticos, como por ejemplo utilizando mecanismos de clonación PCR que implican generalmente la obtención de un par de iniciadores, que pueden ser aproximadamente de 15 a 50 nucleótidos, que abarquen una región del gen que se desea clonar, poniendo los iniciadores en contacto con ARNm, ADNc o ADN genómico de una célula humana, llevando a cabo una reacción en cadena de la polimerasa bajo condiciones que conducen a la ampliación de la región deseada (y si es necesario, llevando a cabo en primer lugar una etapa de transcripción inversa), aislando la región o fragmento amplificados y recuperando el ADN amplificado. Generalmente, dichas técnicas tal como se definen en la presente memoria son bien conocidas en la técnica, tal como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989). Ventajosamente, las variantes alélicas humanas del ácido nucleico según la invención pueden obtenerse, por ejemplo, sondeando genotecas de ADN genómico de una variedad de individuos, por ejemplo, de distintas poblaciones y otras técnicas genotípicas. Además, los ácidos nucleicos y las sondas según la invención pueden utilizarse para secuenciar el ADN de pacientes, empleando procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el procedimiento didesoxi de Sanger de finalización de la cadena, que puede detectar ventajosamente cualquier predisposición de un paciente a ciertos trastornos proliferativos.

La presente invención proporciona además proteínas aisladas que poseen secuencias aminoácidas tal como se muestran en la Figura 2 (SEC ID nº:2) o la secuencia aminoácida de un equivalente funcional, fragmento funcional o bioprecursor de dicha proteína, además de anticuerpos monoclonales o policlonales capaces de unirse a las secuencias aminoácidas, de estas proteínas o de sus fragmentos. Como será bien conocido por los expertos en la materia, las proteínas según la invención pueden incluir sustituciones conservadoras, deleciones o inserciones en las que la proteína comprende aminoácidos distintos de los que se muestran en la Figura 2; sustituciones, deleciones o inserciones que no afecten todavía a la actividad de las proteínas según la invención, o su capacidad para interaccionar en la vía del control de la verificación del ciclo celular humano.

Los fragmentos preferidos incluyen los que comprenden un epítopo de las proteínas según la invención. Los epítopos pueden determinarse utilizando, por ejemplo, técnicas de rastreo peptídico, tal como se describe en Geysen et al., Mol. Immunol., 23; 709-715 (1986).

Los anticuerpos según la invención pueden obtenerse según procedimientos que son conocidos por los expertos en la materia. Los anticuerpos monoclonales pueden preparase utilizando la tecnología convencional de los hibridomas, tal como se describe en Kohler F y Milstein C (1985), Nature 256, 495-497. Los anticuerpos policlonales pueden prepararse asimismo utilizando la tecnología convencional bien conocida por los expertos en la materia, y que comprende inocular a un animal huésped, tal como un ratón, una proteína o epítopo según la invención y recuperar el suero inmune. La presente invención incluye asimismo fragmentos de anticuerpos enteros que conservan su actividad de unión, tales como por ejemplo, fragmentos Fv, F(ab') y F(ab')2, así como anticuerpos de cadena única.

Ventajosamente, el ácido nucleico y/o las proteínas según la invención pueden incluirse en una composición farmacéutica, junto con un transportador, diluyente o excipiente aceptable farmacéuticamente. La composición farmacéutica que contiene dichos ácidos nucleicos según la invención, puede, por ejemplo, utilizarse en terapia génica. Dichos ácidos nucleicos, según la invención, pueden administrarse desprotegidos, o empaquetados en cápsulas proteicas, cápsulas lipídicas, liposomas, cápsulas basadas en membranas, proteínas víricas, virus completos, vectores celulares, huéspedes celulares bacterianos, huéspedes celulares alterados de mamíferos, u otros tales medios apropiados para la administración.

Mediante la presente invención se proporciona además un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de un ácido nucleico según la invención, en una muestra biológica, comprendiendo dicho procedimiento a) contactar dicha muestra con una sonda que comprende un ácido nucleico o sonda según la invención bajo condiciones de hibridización y b) detectar la presencia de hibridización, por ejemplo, por la presencia de cualquier formación dúplex o triples entre dicha sonda y cualquier ácido nucleico que se encuentre en dicha muestra. Las proteínas según la invención pueden detectarse asimismo a) contactando dicha muestra con un anticuerpo para un epítopo de una proteína según la invención, bajo condiciones que permitan la formación de un complejo antígeno-anticuerpo, b) controlando la presencia de cualquier complejo antígeno-anticuerpo.

La presente invención proporciona asimismo equipos para detectar dichos ácidos nucleicos y proteínas. Un equipo que detecte la presencia de un ácido nucleico según la invención en una muestra biológica, puede incluir (a) medios para poner en contacto la muestra con una sonda, que comprenden un ácido nucleico o una sonda según la invención, y medios para detectar la presencia de cualquier formación dúplex o triples entre dicha sonda y cualquier ácido nucleico que se encuentre en la muestra.

Asimismo, un equipo para detectar la presencia de una proteína según la invención en una muestra biológica, puede comprender (a) medios para poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo para un epítopo de una proteína según la invención, bajo condiciones que permitan la formación de un complejo anticuerpo-proteína, y medios para controlar dicha muestra respecto a la presencia de cualquier complejo proteína-anticuerpo.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento para determinar si un compuesto es un inhibidor o un activador de la expresión o actividad de las proteínas de la vía de control de la verificación del ciclo celular humano, comprendiendo dicho procedimiento el contacto de una célula que expresa las proteínas en dicha vía con dicho compuesto, y la comparación del nivel de expresión de cualquiera de las proteínas de la vía de punto de control de dicha célula, con una célula que no se haya puesto en contacto con dicho compuesto. Cualquier compuesto que se identifique puede utilizarse ventajosamente entonces como un medicamento o en la preparación de un medicamento para tratar el cáncer o los trastornos proliferativos. Alternativamente, los compuestos pueden incluirse en una composición farmacéutica junto con un transportador, diluyente o excipiente aceptable farmacéuticamente. Ventajosamente, cualquier compuesto que se identifique como un inhibidor de la vía de control de la verificación celular, puede incluirse en una composición farmacéutica junto con un agente citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico que altere el ADN, y un transportador, diluyente o excipiente aceptable farmacéuticamente. Así, el inhibidor del punto de control del ciclo celular humano puede potenciar el efecto quimioterapéutico de los agentes citotóxicos utilizados en, por ejemplo, la terapia anticáncer.

Mediante la presente invención, se proporciona asimismo un procedimiento para rastrear sustancias candidatas para la terapia anticáncer, comprendiendo dicho procedimiento a) proporcionar una proteína según la presente invención que muestre actividad quinásica junto con un substrato para dicha proteína, bajo condiciones tales que la quinasa ejerza su acción sobre el substrato, b) contactar la proteína y el substrato con una sustancia candidata, c) medir el grado de cualquier aumento o disminución en la actividad quinásica de la proteína, y d) seleccionar una sustancia candidato para proporcionar un aumento disminución en la actividad. Dicha sustancia candidato puede utilizarse asimismo como un medicamento en la preparación de medicamento para el tratamiento del cáncer o de otros trastornos celulares proliferativos.

La presente invención comprende asimismo un procedimiento para identificar otras proteínas activas en la vía de punto de control celular, comprendiendo dicho procedimiento a) contactar un extracto celular con un anticuerpo para un epítopo de una proteína según la invención, bajo condiciones apropiadas de unión, b) identificar cualquier complejo anticuerpo-proteína, y c) analizar el complejo para identificar cualquier proteína unida al anticuerpo o proteína que sea distinta a la proteína según la invención.

Otro procedimiento para identificar proteínas implicadas en la vía del punto de control celular, utiliza un sistema bihíbrido desarrollado en las levaduras por Chien et al., supra(1991). Esta técnica se basa en la reconstitución funcional in vivo de un factor de transcripción que activa un gen informador. Más particularmente, la técnica comprende suministrar a una célula huésped apropiada un constructo de ADN que incluye un gen informador bajo el control de un promotor regulado por un factor de transcripción que posee un dominio de unión al ADN y un dominio de activación, que expresa en la célula huésped una secuencia de un primer ADN híbrido que codifica una primera fusión de un fragmento o de la totalidad de una secuencia ácido nucleica según la invención, expresando dichos dominio de unión al ADN y dominio de activación del factor de transcripción en la célula huésped, por lo menos, una secuencia del segundo ADN híbrido que codifica proteínas putativas de unión para ser investigadas junto con el dominio de unión al ADN o el dominio de activación del factor de transcripción, que no se incorpora a la primera fusión; detectar cualquier unión de la proteína que se investiga con una proteína según la invención mediante la producción de cualquier producto del gen informador en la célula huésped; aislar opcionalmente las secuencias del segundo ADN híbrido que codifican la proteína de unión. En una forma de realización de este aspecto de la invención, el procedimiento puede comprender:

(a)

construir, por lo menos, dos vectores nucleotídicos, el primero de los cuales incluye un segmento nucleótido que codifica un dominio de unión al ADN de la proteína GAL4, unido operativamente a una secuencia ácido nucleica que codifica una proteína según la presente invención, y comprendiendo el segundo de ellos una secuencia nucleótida que codifica un dominio de unión de la proteína GAL4 unido operativamente a una secuencia nucleótida que codifica la proteína que va a ensayarse,

(b)

co-transformar cada uno de dichos vectores en una célula de levadura que es deficiente para la transcripción de genes que codifican proteínas que metabolizan la galactosa, en la que la interacción entre dicha proteína de prueba y la proteína según la invención, conduce a la transcripción de genes metabólicos de la galactosa.

Breve descripción de los dibujos

La invención puede entenderse más claramente haciendo referencia a los dibujos adjuntos, que son proporcionados únicamente a título de ejemplo, en los que:

La Figura 1 muestra la secuencia nucleótida de hCDS1 ADNc (SEC ID nº:1) en la que los residuos 66 a 1694 constituyen la región que codifica S y muestra las regiones 3' y 5' no traducidas (UTRs). Los códones de iniciación y finalización se muestran en negrita.

La Figura 2 muestra la secuencia aminoácida deducida de hCDS1 (SEC ID nº:2).

La Figura 3 muestra el alineamiento de la secuencia aminoácida de hCDS1 y S. pombe cds1 llevado a cabo utilizando el programa de alineamiento CLUSTALW y que se registró utilizando el programa GENEDOC. Los residuos en negro son idénticos entre las dos proteínas y los residuos en gris son similares.

Descripción detallada de las formas de realización preferidas

La presente invención incluye el aislamiento y la caracterización de un nuevo gen y proteína quinásicos humanos de control que se denomina hCDS1. La proteína y el gen hCDS1 muestran alguna similitud con un gen y proteína homólogos que se encontraron en S. pombe.

El gen S. pombe cds1^{+} se identificó por su capacidad para complementar un mutante de la ADN polimerasa á (Murakami & Okayama, 1995, Nature, 374:817-819). S. pombe cds1 fue capaz asimismo de suprimir la sensibilidad a la hidroxiurea (control que depende de la replicación del ADN) de las cepas mutantes rad1, rad3, rad9 de S. pombe, pero no la sensibilidad a UV (control que depende de la lesión del ADN). Esto muestra que S. pombe cds1 lleva a cabo su función de control durante la síntesis del ADN.

S. pombe cds1 es una proteína quinasa putativa que es similar en un 70% al gen RAD53 de control de S. cerevisiae. En S. cerevisiae los controles que dependen de la replicación del ADN y de la alteración del ADN están genéticamente separados al nivel de detección de las lesiones del ADN. Las dos vías convergen entonces en la proteína quinasa Rad53 que actúa potencialmente como un amplificador en la vía de la transducción de la señal. Este no parece ser el caso en S. pombe, donde las mismas proteínas están implicadas en la detección de todos los tipos de lesión, pero la transducción de la señal sigue vías separadas que implican proteína quinasas distintas; S. pombe cds1 para el control que depende de la replicación del ADN y Chk1/Rad27 para la vía que depende de la alteración del ADN. Se ha sugerido que la activación específica por parte de la quinasa cds1 de la fase S puede definir una subvía de la respuesta del control en S. pombe (Lindsay et al., 1998, Genes and Development, 12: 382-395).

S. pombe cds1 puede actuar a través de una interacción con la ADN polimerasa á para controlar el avance de la replicación del ADN o la integridad de los complejos de replicación. En Drosophila existe evidencia de una quinasa del peso molecular apropiado que se asocia con la ADN polimerasa \alpha (Peck et al., 1993, B.B.R.C., 190:325-331). Alternativamente, puede actuar a través de la fosforilación de p107^{weel} de forma análoga a Chk1, afectando en última instancia la actividad de las quinasas que dependen de la ciclina de la fase G1/S.

Muchos de los procedimientos y materiales para llevar a cabo las manipulaciones básicas de biología molecular tal como se describen en los ejemplos que siguen a continuación, se conocen en la técnica, y pueden encontrarse en referencias tales como Sambrook et al., Molecular Cloning, 2ª ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Berger et al., Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, Inc., (1987); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co,. Inc. (1986), Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 2ª ed., John Wiley & Sons, (1992); Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology, Vol 185, Academic Press, Inc., (1991); Guthrie et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Vol 194, Academic Press, Inc., (1991); McPherson et al., PCR Volume 1, Oxford University Press, (1991).

La invención en sus diversos aspectos, puede entenderse más fácilmente revisando los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1 Aislamiento de hCDS1

El aislamiento de hCDS1 se inició con una búsqueda de secuencias similares a S. pombe cds1+ utilizando el programa TBLASTN. Una secuencia marcada expresada en el hombre (EST nº 864164) se identificó en la base de datos LifeSeq® de propiedad (Incyte Pharmaceuticals Inc., Palo Alto, CA, USA). El análisis de la secuencia de la inserción de 1,3 kb reveló un marco de lectura abierto incompleto que era similar a S. pombe cds1. Mediante 5'RACE (amplificación rápida de los extremos de ADNc), utilizando un ADNc placentario humano Marathon Ready (Clontech), siguiendo las instrucciones del fabricante, se obtuvieron 650 nucleótidos aproximadamente de una nueva secuencia 5' ADN.

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Brevemente, los dos iniciadores específicos del gen hCDS1 utilizados para las reacciones PCR (reacción en cadena de la polimerasa) fueron

GSP3 5'-TTTTGCTGATGATCTTTATGGCTAC-3' (SEC ID nº:3) y

GSP4 5'-CACAGGCACCACTTCCAAGAGTTTT-3' (SEC ID nº:4).

A continuación, se amplificó un ORF completo para hCDS1 a partir de una genoteca ADNc del neuroblastoma SK-N-MC, utilizando los iniciadores PCR

5'-GGGCTCGAGAGCAGCGATGTCTCGGGAGTCGGATGT-3' (SEC ID nº:5) y

5'-GGCGGATCCTCGAGTCACAACACAGCAGCACACAC-3' (SEC ID nº:6).

El producto de amplificación se clonó entonces en un vector pCR2.1 (Invitrogen), determinándose la secuencia del ADN.

Se descubrió que la secuencia ácido nucleica de hCDS1 mostraba una homología del 47,8% con S. pombe cds1+ a nivel del ADN. Los códones de finalización se encontraban en los 3 marcos de lectura en los 120 nucleótidos inmediatamente 5' al codón de iniciación putativo de hCDS1, indicando que la región codificante completa se había aislado. Se encontró asimismo que partes de la secuencia se emparejaban con secuencias parciales que se habían encontrado en las bases de datos NCB1, ESTAA285249, secuencia genómica H55451, y el fragmento H55698 de 54 pares de bases.

El gen humano identificado y los vectores que codifican la secuencia ácido nucleica de hCDS1 se depositaron como plásmido HCDS1 ORF/pCR-Blunt con el nº de registro LMBP 3708; plásmido fragmento 5'RACE hCDS1/pGEM-Easy con el nº de registro LMBP 3710; y el plásmido fragmento 3' HCDS1 del clon 864164/pSPORT de Incyte depositado con el nº de registro LMBP 3709 depositado en las Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms (BCCM) en el Laboratorium Voor Moleculaire Biologies-Plasmidencollecte (LMBP) 35, B-9000 Gent, Bélgica, según las previsiones del Tratado de Budapest, el 28 de abril de 1997.

El perfil de expresión tisular de hCDS1 se examinó en transferencias Western de múltiples tejidos (Clontech) y en una transferencia Northern de una progenie celular cancerosa (Clontech), que se sondearon con ORF hCDS1. Se observó un único transcrito de 2,1 kb. La expresión no pudo detectarse mediante condiciones convencionales de hibridización de la transferencia Northern en todos los tejidos normales humanos que se examinaron. Sin embargo, se descubrió que la expresión era muy elevada en todas las progenies celulares cancerosas examinadas.

El gen hCDS1 se localizó en el cromosoma 22q11.2-q12, tal como se determinó utilizando el ORF completo como sonda para el análisis FISH (Hibridización Fluorescente in situ). La eficiencia de la hibridización fue aproximadamente del 62%, y bajo las condiciones que se emplearon, no se detectó ningún otro loci.

Brevemente, linfocitos que se aislaron de la sangre humana se cultivaron en medio \alpha-mínimo esencial (MEM) suplementado con suero fetal de ternera al 10% y fitohemaglutinina (PHA) a 37ºC durante 68 a 72 horas. Los cultivos de linfocitos se trataron con BrdU (0,18 mg/ml, Sigma) para sincronizar la población celular. Las células sincronizadas se lavaron tres veces con medio libre de suero para liberar el bloqueo y se volvieron a cultivar a 37ºC durante 6 horas en \alpha-MEM con timidina (2,5 \mug/ml Sigma). Las células se recuperaron y se prepararon portas utilizando procedimientos estándar que incluían tratamiento hipotónico, fijación y secado al aire. Los fragmentos de ADN que contenían el ORF completo de hCDS1 se purificaron en gel y se biotinilaron con dATP utilizando el equipo de marcaje BRL Bio Nick (15ºC, 1 hora) (Heng et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:9509- 9513).

Los portas se calentaron entonces en el horno a 55ºC durante 1 hora, y después de tratamiento con ARNasa, se desnatularizaron en formamida al 70% en 2xSSC durante 2 minutos a 70ºC, seguido por deshidratación con etanol. Las sondas se desnaturalizaron a 775ºC durante 5 minutos en una mezcla de hibridización formada por formamida al 50% y sulfato de dextrano al 10%. Las sondas se cargaron sobre los portas cromosómicos desnaturalizados. Después de hibridización nocturna, los portas se lavaron y se sometieron a detección. Las señales FISH y el patrón de bandas DAPI se registraron separadamente mediante fotografías, y la asignación de los datos de elaboración de mapas FISH con las bandas cromosómicas se obtuvo superponiendo las señalas FISH con los cromosomas con bandas DAPI (Heng & Tsui, 1994, Methods in Mol. Biol., 33:35-49).

Ejemplo 2 Caracterización de la proteína hCDS1

La secuencia ácido nucleica ADNc de hCDS1 predice un producto de traducción de 543 aminoácidos, con un peso molecular aproximado de 61 kDa. Este se aproxima al peso molecular aparente de la proteína endógena Cds1 en las células HeLa. La proteína hCDS1 predicha, es idéntica en un 28% a la proteína cds1 de S. pombe, idéntica en un 28% a RAD53 e idéntica en un 27% a la quinasa DUN1 de S. cerevisiae. La alineación secuencial de estos homólogos aparentes muestra varias regiones de similitud de la secuencia por fuera del dominio quinásico, que incluye la conservación del dominio Fork Head Associated (Hoffmann et al., 1995, Trends Biochem. Sci., 20: 347-9). La proteína humana muestra la misma estructura total que S. pombe DCSl y S. cerevisiae DUN1, pero a la que le falta la larga extensión terminal C que se encontró en RAD53. El análisis de transferencia Northern con hCDS1 identificó un único transcrito de 2,2 kb que se expresa en l el testículo y en 8 muestras examinadas de cáncer humano.

Brevemente, dos transferencias Northern tisulares múltiples (Clontech) y una transferencia Northern de una progenie celular cancerosa (Clontech) se hibridizaron con una sonda ADNc para hCDS1. La sonda corresponde al ORF completo descrito anteriormente. Los borrones (sometidos a transferencia), se lavaron en condiciones de alta restricción (0,1 x SSC, SDS al 0,1, 50ºC, 2 x 20 min) y se expusieron utilizando una película Kodak X-OMAT para autoradiografía con pantallas de intensificación a -70ºC.

Ejemplo 3 Ensayo de la actividad total de Cdc25

La posibilidad de que la defosforilación de Cdc2 esté regulada por disminución en presencia de lesión del ADN requirió un ensayo que permitiera el análisis de la actividad total de Cdc25. En presencia de EDTA, se descubrió que la Cdc2/Ciclina B de los extractos de células HeLa asíncronas, se inactivaba espontáneamente.

Brevemente, las células se lisaron en tampón de lisis que se había enfriado en hielo (50 mM Tris pH 7,4, que contenía 2 mM de cloruro magnésico, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, y 5 \mug/ml de leupeptina, pepstatina y aprotinina). Los lisados se purificaron mediante centrifugación a 10000 xg durante 10 minutos y la concentración proteica de los sobrenadantes se determinó utilizando el ensayo de Lowry. Se añadieron 10 mM de EDTA a los sobrenadantes (100 \mug en 60 \muL), iniciándose la reacción mediante incubación a 30ºC. Midiendo la actividad quinásica de la histona-H1 que estaba presente en los inmuno-precipitados de anti-Ciclina B, se midió la actividad de Cdc2/Ciclina B en distintos momentos del ensayo (Blasina et al., supra). Para las inmunotransferencias, 400 \mug de lisados celulares se inmunoprecipitaron utilizando anticuerpo anti-Ciclina B, que se resolvieron en un gel SDS-acrilamida al 11%. Se utilizó el anticuerpo monoclonal contra al motivo PSTAIRE de Cdc2 para detectar las distintas fosfo-formas de Cdc2.

La activación se correlaciona con la pérdida de la forma fosforilada-inhibida de Cdc2, que se visualiza como el tipo con una migración más lenta en los geles SDS-PAGE. La activación se evitó por el vanadato, un inhibidor de Cdc25 y de otras tirosin fosfatasas. Además, la reducción inmune con anti-suero específico para Cdc25C redujo mucho la activación de Cdc2/Ciclina B. No tuvo lugar un aumento en los niveles de Cdc2 o de la proteína Ciclina B, y la fosforilación por WEE1 y Myt1 fue bloqueada por la presencia de 10 mM de EDTA. Así, estos resultados demuestran que la activación de Cdc2 fue el resultado de la defosforilación. En los lisados de las células HeLa asíncronas, la actividad fosfatasa endógena de Cdc25 es suficiente para defosforilar y activar más del 80% de la Ciclina B/Cdc2 disponible en 30 minutos. El análisis de los lisados de las células HeLa en las que el ADN había sido dañado mediante exposición a 10 Gy de irradiación \tau una hora antes de la recuperación, mostró una reducción significativa en la tasa de activación de Cdc2, de tal forma que durante los 30 minutos de incubación, se activó menos del 25% de la Cdc2/Ciclina B disponible. La cantidad de Cdc2/Ciclina B en el complejo no se alteró significativamente y se activó en igual medida que el Cdc2/Ciclina B de control añadiendo GST-Cdc25 exógeno. La irradiación con 10 Gy condujo a una reducción de más de 3 veces en la tasa de defosforilación de Cdc2 en los 10 períodos examinados. Si la activación de Cdc25 medido anteriormente es parte de la respuesta de control de la lesión del ADN en las células humanas, podría esperarse entonces que las condiciones experimentales que anulan el control de la lesión del ADN bloquearan la inhibición de Cdc25 inducida por la radiación.

Ejemplo 4 Efecto control del hCDS1 de la lesión del ADN

Se sabe que la respuesta a la lesión del ADN en diversas células requiere varias quinasas relacionadas que están estructuralmente en relación con las quinasas PI-3. Un miembro por lo menos de la familia, la Proteína Quinasa-ADN, ha mostrado que es sensible a la wortmanina in vitro (Hawley et al., 1996, Genes and Dev., 10: 2383-8; Hartley et al., 1995, Cell, 82: 849-856). Así, se ensayó la posibilidad de que una quinasa sensible a la wortmanina actúe corriente arriba del retraso en la entrada en la fase M inducido por la radiación (Price et al., 1996, Cancer Research, 56:246-250). Las células HeLa pueden detenerse en la fase M mediante el nocodazol y la radiación provoca que las células se demoren en G2 previamente al punto de bloqueo de la Fase M sensible al nocodazol. Así, anotando el índice mitósico de las células que se cultivan en nocodazol, es posible determinar si se ha retrasado la entrada en la mitosis. Las células de control que se cultivaron en presencia de nocodazol durante 14 horas contenían el 60% de células mitósicas, ejerciendo poco efecto en este número la presencia de wortmanina. Sin embargo, la irradiación redujo sólo en un 10% el número de células que alcanzaron el punto de bloqueo del nocodazol. Al contrario, la irradiación en presencia de wortmanina tuvo sólo un efecto modesto. Estos resultados demuestran que la wortmanina anula el control G2 de la lesión del ADN en las células HeLa.

Se ensayaron entonces los efectos de la wortmanina sobre la inactivación de Cdc25 inducida por la radiación. La wortmanina tuvo un efecto pequeño sobre la activación de Cdc2/Ciclina B en los extractos preparados a partir de cultivos no irradiados, disminuyendo mucho, sin embargo, la disminución en la actividad de Cdc25 inducida por la irradiación.

El punto de control de G2 inducido por la radiación se anula asimismo en las progenies celulares derivadas de pacientes con el trastorno genético de la ataxia telangiectasia. Las células mutantes de la ataxia telangiectasia son defectuosas en los controles G1 y G2 después de exponerlas a muchos de los agentes que dañan el ADN, pero no a todos. (Canman et al., 1994, Cancer Research, 54: 5054-5058). La insuficiencia de las células carentes de AT para retrasar G1 se correlaciona con una insuficiencia para regular por aumento p53 (Kastan et al., 1992, Cell, 71: 587-589), y con insuficiencia para fosforilar y activar cAb1 (Baskaran et al., 1997, Nature, 387: 516-519; Shafman et al., 1997, Nature, 387: 520-523). La base molecular para la insuficiencia para retrasar G2 es desconocida. Las células deficientes en AT muestran respuestas muy reducidas a agentes que generan roturas cromosómicas, tales como rayos \tau ionizantes. Sorprendentemente, las células carentes de AT tienen respuestas casi normales después de la lesión de base que es generada por irradiación con una fuente de UV (Canman et al., 1994, Cancer Research, 54: 5054-5058; Painter et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 7315-7317: Zampetti-Bosseler et al., 1981, Int. J. Radiat. Biol., 39: 547-558). Se ensayaron los efectos de la irradiación UV y \tau sobre la actividad Cdc25 de las progenies celulares fibroblásticas humanas más AT y menos AT transformadas por SV40. Las células menos AT respondieron a la radiación UV con una fuerte reducción en la tasa a la que Cdc2 es defosforilada. Al contrario, la irradiación \tau tuvo solamente un efecto modesto sobre la tasa de defosforilación de Cdc2. En las células más AT la tasa de defosforilación de Cdc2 se redujo significativamente después de la radiación ionizante o de la radiación UV. Estos datos indican que el producto del gen ATM es necesario para la inactivación eficiente de Cdc25 después de irradiación \tau y demuestran una correlación entre la inactivación de Cdc25 y el retraso en la entrada en la fase M después de la lesión del ADN.

Los mediadores de la inactivación de Cdc25 que depende del control en las células humanas, constituyen dianas excelentes para generar terapéuticas o regímenes terapéuticos que potenciarán el tratamiento anticáncer, y reducirán los efectos secundarios en las células normales.

Para facilitar la caracterización bioquímica de hCDS1, 6 his-hCDS1 se expresó en células de insectos, se purificó por afinidad y se incubó en extractos de células HeLa en presencia de un sistema regenerador de ATP. Se añadió EDTA para inhibir la quinasa en el extracto, y se controló la tasa de defosforilación y la activación de Cdc2/Ciclina B.

Brevemente, se generaron virus recombinantes que codifican 6his-hCDS1, 6his-Chk1, 6his-Cdc2 y GST-Cdc25C utilizando el sistema de expresión Bac-to-Bac procedente de Gibco/BRL. Las proteínas de fusión-6 his se purificaron siguiendo el procedimiento descrito en Kumagai et al., (1995), Mol. Biol. Cell, 6: 199-213. Se incubaron perlas de GSH-sepharose durante 15 minutos en extractos Sf9; las perlas se recuperaron mediante centrifugación y se lavaron tres veces con tampón de lisis (50 mM Tris pH 8,0, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, NP40 al 0,1%, glicerol al 5%, \beta-mercaptoetanol al 0,1% e inhibidores de la proteasa). Las perlas se lavaron tres veces con tampón de ensayo para las quinasas (50 mM Tris pH 7,4, 10 mM MgCl_{2}) antes de las reacciones de fosforilación, o tres veces con el tampón de ensayo de fosfatasa (50 mM imidazol, pH 7,4., 5 mM EDTA y \beta-mercaptoetanol al 1%) antes de los ensayos de fosfatasa.

Se encontró que tanto 6his-Chk1 como 6his-hCDS1 reducían significativamente la activación de Cdc2/Ciclina B en estos ensayos. La reducción en la activación de Cdc2 dependía de la dosis y necesitaba ATP. La confirmación de que Cdc2 no era inhibido irreversiblemente por 6his-Chk1 o 6his-hCDS1 se mostró por la activación que tuvo lugar cuando se añadió GST-Cdc25C en exceso después del tratamiento quinásico. De este modo, tanto 6his-hCDS1 como 6his-Chk1 pueden remedar la regulación por disminución de Cdc25 inducida por la radiación que se apreció en los extractos. Estos experimentos utilizaron lisados de células HeLa que se habían purificado mediante centrifugación, y, por tanto, es improbable que los cambios en la localización subcelular puedan explicar la inactivación de Cdc25 (Peng et al., 1997, Science, 277: 1501-1505).

Ejemplo 5 Efecto directo de hCDS1 sobre CdC25

Mediante los ensayos de los lisados celulares no pudieron excluirse mecanismos indirectos de inhibición de Cdc25 por hCDS1, y por tanto, se utilizaron reactivos purificados por afinidad para determinar la fosforilación directa y la inhibición de la actividad GST-Cdc25 por hCDS1.

GST-Cdc25 se incubó con 6his-hCDS1, perlas de prueba, o 6his-Chk1 en presencia de 8^{-32P} ATP durante 15 minutos a 30ºC. Las proteínas se resolvieron mediante SDS-PAGE y se visualizaron mediante autoradiografía. GST-Cdc25 se fosforiló mediante 6his-Chk1 y 6his-hCDS1. Los ensayos se llevaron a cabo para determinar si la actividad fosfatasa de Cdc25 fue afectada por esta fosforilación.

GST-Cdc25 se ensayó respecto a su capacidad para activar la actividad histona-H1 quinasa de los precipitados inmunes Cdc2/Ciclina B. Se encontró que la fosforilación de GST-Cdc25 por 6his-hCDS1 inhibía la capacidad de GST-Cdc25 para activar Cdc2/Ciclina B. Así, estos datos demuestran que 6his-hCDS1 inactivó Cdc25 in vitro, y que Cdc25 es inactivado in vivo después de la lesión del ADN.

Ya que 6his-Chk1 se asocia con GST-Cdc25 y posee actividad histona H1 quinasa in vitro (Sanchez et al., 1997, Science, 277: 1497-1501), el análisis de la actividad quinasa de Cdc2/Ciclina B fue poco claro. Para ensayar los efectos GST-Chk1, se utilizó un ensayo en el que la defosforilación de Cdc2 se controló mediante la desaparición del tipo migrador más lento de Cdc2 al realizar el análisis de movilidad del gel.

Brevemente, el Cdc2 fosforilado se purificó a partir de las células Sf9 que se habían simultáneamente infectado con baculovirus recombinantes que codificaban 6his-Cdc2, 6his-Weel, 6his-Myt1 y GST-Ciclina B (Parker et al., 1992, Science, 257:1955-1957. El 6his-Cdc2 formando complejo con la Ciclina B se purificó utilizando perlas de GSH bajo las condiciones establecidas para GST-Cdc25, excepto en que 1 mM de VO_{4} se incluyó en el tampón de lisis. El análisis de la transferencia Western mostró que la infección cuádruple dio lugar a la fosforilación de la mayoría de Cdc2/GST-Ciclina B en uno o dos de los sitios inhibitorios. Estos ensayos de la fosfatasa se llevaron a cabo en presencia de 10 mM EDTA y la ausencia de ATP, condiciones que eliminan la posibilidad de que 6his-Chk1 fosforile directamente Cdc2 o la Ciclina B. GST-Cdc25 cataliza una reducción en las formas fosforiladas de Cdc2 que migran más lentamente. La fosforilación previa de GST-Cdc25 por 6his-Chk1, conduce a una reducción dependiente de la dosis en la actividad de GST-Cdc25. Estos datos confirman que Chk1 reguló negativamente la actividad de Cdc25 (Furnari et al., 1997, Science, 277: 1495-1497; Weinert, 1997, Science, 277:1450), y se amplían demostrando que la regulación negativa implica la inactivación de la actividad fosfatásica.

Ejemplo 6 Lesión del ADN y modificación de hCDS1

Como los datos anteriores han mostrado que 6his-hCDS1 inactiva Cdc25, y que la lesión del ADN está asociada con la inactivación de Cdc25, se llevó a cabo un ensayo para determinar si la lesión del ADN conduce a alguna modificación o activación de hCDS1. El antisuero producido contra 6his-hCDS1 se utilizó en los ensayos quinásicos del complejo inmune, utilizando lisados de células HeLa. Una débil señal que correspondía a hCDS1 se detectó en la muestra procedente de las células HeLa asíncronas; el aumento en la fosforilación de hCDS1 se apreció después de la irradiación.

Brevemente, se generaron anticuerpos para hCDS1 inmunizando un conejo con 6his-hCDS1 purificado a partir de las células Sf9 (Harlow et al., Antibodies (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1988). El antisuero resultante inmuno-precipita una quinasa activa del peso molecular esperado, a partir de las células Sf9 infectadas con el virus 6his-hCDS1, pero no a partir de las células Sf9 no infectadas, o de otras células infectadas con el virus 6his-Chk1.

Se confirmó que los resultados eran debidos a hCDS1 mediante la reprecipitación de la banda proteica después de la desnaturalización en SDS al 4%. La fosforilación in vitro se debe más probablemente a la autofosforilación, y el aumento de la señal refleja un aumento en la actividad después de la radiación. El aumento de la fosforilación in vitro de p64^{Cds1} sugiere que, como RAD53 y DUN1, hCDS1 se modifica en respuesta a la lesión del ADN.

El efecto de la detención de la síntesis del ADN sobre la fosforilación de p64^{Cds1} se examinó mediante ensayos posteriores. La hCDS1 de las células que se detuvieron en la replicación se comportó exactamente como la proteína de los cultivos asíncronos; no se apreció un aumento significativo en la fosforilación en respuesta a la timidina o a otros agentes que bloquean la replicación del ADN. El aumento de la fosforilación de p64^{Cds1} se detectó después de la irradiación de las células detenidas por la timidina. Se ensayó asimismo el efecto de lesionar el ADN en las células que se detienen predominantemente fuera de la fase S. Las células se cultivaron en presencia de nocodazol durante 20 horas antes de la irradiación. Se apreció otra vez una señal débil pero detectable en la muestra no irradiada. Sin embargo, la irradiación de las células detenidas por el nocodazol, condujo a un aumento de la fosforilación.

Estos hallazgos contrastan sorprendentemente con los resultados encontrados en las levaduras, en las que se encontró que la Cds1 de fisión estaba activada en respuesta al ADN replicado de modo incompleto (Boddy et al., 1998, Science, 280: 909-12; Lindsay et al., 1998, Genes and Dev., 12: 382-95). Los resultados en la presente memoria muestran un papel para el Cds1 humano más bien en el control de la lesión del ADN que en el control de la replicación, tal como se encontró anteriormente en las levaduras.

Ejemplo 7 Identificación del medicamento

Los ensayos de Cdc25 que se han descrito anteriormente son apropiados para utilizar en la identificación de agentes químicos que modificarán el control de la lesión del ADN mediado por hCDS1 y Cdc25, activando o inhibiendo la actividad. Así, un ensayo de rastreo típico utilizará condiciones similares que las descritas anteriormente, más la adición de un reactivo para ensayarse. El control de la actividad de los componentes del ensayo, es decir, la detección de la fosforilación tal como se ha descrito anteriormente, puede llevarse a cabo en comparación con las reacciones de control para detectar la potenciación o inhibición de la actividad.

Claramente, dichos ensayos son fácilmente adaptables a la detección y a aparatos mecánicos/automatizados. Conociendo los elementos fundamentales de las reacciones del ensayo, éste se adapta claramente a la utilización conjunta con aparatos automatizados de señal escasa y alto rendimiento que pueden incorporar un conjunto de portas microscópicos; o un conjunto de biochips celulares en conjunción con dispositivos de detección CCD y la utilización de una señal visible que se activa por la fosforilación u otra reacción relacionada con la actividad quinásica.

Ejemplo 8 Utilización terapéutica

La caracterización de hCDS1 y la dilucidación de que el papel para el Cds1 humano está más bien en el control de la lesión del ADN que en el control de la replicación, tal como se encontró anteriormente en las levaduras, permite la adaptación de este conocimiento a la preparación de medicamentos, y de procedimientos terapéuticos para actuar como un complemento para la quimioterapia del cáncer.

En particular, las formulaciones farmacéuticas de la presente invención que incorporan ADNc, ARN, moléculas antisentido, proteína hCDS1, anticuerpos contra la proteína hCDS1, u otras sustancias terapéuticas que corresponden a las identificadas en los ensayos de la invención, pueden administrarse conjuntamente con cualquier agente quimioterápico apropiado, para actuar como complemento respecto a la acción principal del agente quimioterápico. Por ejemplo, la utilización de medicamentos anticancerígenos tales como antimetabolitos, antibióticos, agentes alquilantes, inhibidores microtubulares, hormonas esteroideas y sus antagonistas, y otros, se dirige generalmente contra sitios metabólicos esenciales para la replicación celular. Mientras que idealmente estas sustancias intervendrán sólo en los procesos celulares propios de las células malignas, los medicamentos anticancerígenos disponibles habitualmente afectarán a todas las células proliferativas, tanto a las normales como a las malignas. De este modo, la quimioterapia habitual se ve dificultada por una abrupta curva dosis-respuesta para los efectos tanto tóxicos como terapéuticos. Por tanto, la coadministración de agentes quimioterapéuticos con los medicamentos basados en la hCDS1 e identificados por los ensayos de ésta en la presente invención, permitirá un aumento en la eliminación de las células malignas.

Un mecanismo para aumentar esta eliminación se lleva a cabo mediante la inhabilitación del control de la lesión del ADN de las células malignas, haciendo de este modo más efectiva la administración de los agentes quimioterapéuticos que alteran al ADN. La inhabilitación del control de la lesión del ADN puede realizarse modificando la respuesta de hCDS1, tal como se ha demostrado por los datos anteriores.

Así, la coadministración de una nueva terapéutica basada en hCDS1 en combinación con uno o varios agentes anticancerígenos, es considerada por la presente invención. Por ejemplo, dosis normales de los medicamentos anticancerígenos Citarabina, Fludarabina, 5-Fluorouracilo, 6-Mercaptopurina, Metotrexato, 6-Tioguanina, Bleomicina, Dactinomicina, Daunorubicina, Doxorubicina, Idarubicina, Plicamicina, Carmustina, Iomustina, Ciclofosfamida, Ifosfamida, Mecloroetamina, Streptozotocina, navelbina®, Paclitaxel, Vinblastina, Vincristina, Asparaginasa, Cisplatino, Carboplatino, Etoposido, Interferones, Procarbazina, eta, pueden administrarse con la cantidad apropiada del medicamento basado en hCDS1, de forma que a) se altere la duración del tiempo de administración, b) se altere el tiempo entre administraciones, c) se altere la eficacia del agente quimioterapéutico sobre las células malignas, o d) se alteren los efectos secundarios del agente quimioterapéutico sobre las células normales. Los efectos de la coadministración de los medicamentos basados en hCDS1 pueden ser cualquiera o la combinación de estos efectos además de los otros.

Típicamente, la destrucción de las células cancerosas por los agentes quimioterapéuticos sigue una cinética de primer orden, para un efecto logarítmico de eliminación. Así, la coadministración de terapéuticas basadas en hCDS1 se diseñará para potenciar este efecto logarítmico de eliminación. Típicamente, los protocolos de tratamiento quimioterapéutico requieren una combinación de medicamentos que actúen en distintas etapas de la vía metabólica, potenciando de esta forma la eliminación de las células malignas mientras que se mantienen niveles tóxicos bajos. Así, la co-administración de la terapéutica basada en hCDS1 se combinará idealmente con dichos protocolos, y mejorará su eficacia.

Finalmente, los procedimientos terapéuticos más efectivos combinarán la administración dirigida de medicamentos quimioterapéuticos y/o agentes que inhiben la MDR (resistencia multimedicamentosa), con la terapéutica basada en hCDS1, para hacer diana y eliminar específicamente las células cancerosas a través de la replicación no controlada propia de las células, sin reparación de la lesión del ADN y logrando, por lo tanto, una eventual muerte celular.

<110> The Scripps Research Institute et al.

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<120> Quinasa humana de puntos de control, hCDS1, composiciones y procedimientos

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<130> TSRI649.SPB

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<140>

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<141>

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<150> GB 9722320.0

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<151> 1997-10-22

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<160> 6

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 1858

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (66)..(1694)

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<400> 1

1

2

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<210> 2

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<211> 543

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

3

4

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<210> 3

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador GSP3 de PCR

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttttgctgat gatctttatg gctac

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25

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<210> 4

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador GSP4 de PCR

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

cacaggcacc acttccaaga gtttt

\hfill

25

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<210> 5

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador PCR

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

gggctcgaga gcagcgatgt ctcgggagtc ggatgt

\hfill

36

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<210> 6

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<211> 35

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador de PCR

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggcggatcct cgagtcacaa cacagcagca cacac

\hfill

35

Claims (26)

1. Vector de expresión de ADN que comprende una molécula aislada de ADN que posee la secuencia ácido nucleica representada en la Figura 1 (SEC ID nº:1).

2. Vector de expresión de ADN que comprende una molécula aislada de ADN que posee la secuencia ácido nucleica representada por los residuos 66 a 1694 de la secuencia ácido nucleica representada en la Figura 1 (SEC ID
nº:1).

3. Célula huésped transformada, transfectada o infectada con el vector según la reivindicación 1 ó 2.

4. Célula huésped según la reivindicación 3, que es una célula procariótica o eucariótica.

5. Célula huésped según la reivindicación 4, en la que dicha célula eucariótica es una célula de mamífero.

6. Célula huésped según la reivindicación 4, en la que dicha célula eucariótica es una célula de insecto.

7. Célula, tejido u organismo no humano transgénicos, que comprende un transgén capaz de expresar una proteína que tiene la secuencia aminoácida de la Figura 2 (SEC ID nº:2), o un equivalente funcional de dicha proteína, en la que dicho equivalente funcional comprende sustituciones, deleciones o inserciones conservadoras de la secuencia aminoácida de la Figura 2, de modo que dicha proteína comprende aminoácidos distintos de los de la secuencia aminoácida que se muestra en la Figura 2, las cuales sustituciones, deleciones o inserciones no afecten aún a la actividad de la proteína que tiene la secuencia de la Figura 2 (SEC ID nº:2), medida por la capacidad para interaccionar en la vía de control del ciclo celular humano, o un bioprecursor de dicha proteína, en la que dicho bioprecursor comprende la secuencia aminoácida de la Figura 2 (SEC ID nº:2).

8. Proteína que comprende la secuencia aminoácida de la Figura 2 (SEC ID nº:2) o un equivalente funcional de dicha proteína, en la que dicho equivalente funcional comprende sustituciones, deleciones o inserciones conservadoras de la secuencia aminoácida de la Figura 2, de modo que dicha proteína comprende aminoácidos distintos a los de la secuencia aminoácida representada en la Figura 2, las cuales sustituciones, deleciones o inserciones no afecten aún a la actividad de la proteína que tiene la secuencia de la Figura 2 (SEC ID nº:2), medida por la capacidad para interaccionar en la vía de puntos de control del ciclo celular humano, o un bioprecursor de dicha proteína, en la que dicho bioprecursor comprende la secuencia aminoácida de la Figura 2 (SEC ID nº:2) que se expresa a partir de una célula según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7.

9. Proteína aislada que posee la secuencia aminoácida de la Figura 2 (SEC ID nº:2) o un equivalente funcional de dicha proteína, en la que dicho equivalente funcional comprende sustituciones, deleciones o inserciones conservadoras de la secuencia aminoácida de la Figura 2, de modo que dicha proteína comprende aminoácidos distintos a los de la secuencia aminoácida que se muestra en la Figura 2, las cuales sustituciones, deleciones o inserciones no afecten aún a la actividad de la proteína que tiene la secuencia de la Figura 2 (SEC ID nº:2), medida por la capacidad para interaccionar en la vía de puntos de control del ciclo celular humano, o un bioprecursor de dicha proteína, en la que dicho bioprecursor comprende la secuencia aminoácida de la Figura 2 (SEC ID nº: 2).

10. Anticuerpo que se une específicamente a una proteína según las reivindicaciones 8 y 9.

11. Anticuerpo que se une específicamente a una proteína que tiene la secuencia aminoácida de la Figura 2 (SEC ID nº: 2).

12. Anticuerpo según la reivindicación 10, que es un anticuerpo monoclonal.

13. Proteína según la reivindicación 8 ó 9, para su utilización en el tratamiento del cáncer o de las enfermedades proliferativas.

14. Proteína según la reivindicación 8 ó 9, para su utilización en la preparación de un medicamento.

15. Medicamento que comprende una proteína según la reivindicación 8 ó 9.

16. Anticuerpo según la reivindicación 10, 11 ó 12 para su utilización en el tratamiento del cáncer o de las enfermedades proliferativas.

17. Anticuerpo según la reivindicación 10, 11, ó 12 para su utilización en la preparación de un medicamento.

18. Medicamento que comprende un anticuerpo según la reivindicación 10, 11 ó 12.

19. Procedimiento para identificar un compuesto como inhibidor o activador de la expresión de la proteína CDS1 de la vía de puntos de control del ciclo celular humano, que comprende la secuencia aminoácida representada en la Figura 2 (SEC ID nº: 2), comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto una célula que expresa las proteínas en dicha vía con dicho compuesto y comparar el nivel de expresión de la proteína CDS1 de la vía de puntos de control del ciclo celular humano de dicha célula, con una célula que no se haya puesto en contacto con dicho compuesto.

20. Procedimiento para el rastreo de sustancias candidato para la terapia anticancerosa, comprendiendo dicho procedimientos proporcionar una proteína según la reivindicación 8 ó 9 que exhibe actividad quinásica, junto con un substrato para dicha proteína, bajo condiciones tales que la quinasa actúe sobre el substrato, poniendo la proteína y el substrato en contacto con una sustancia candidato y midiendo el grado de cualquier aumento o disminución en la actividad quinásica de la proteína, y seleccionando una sustancia candidato que proporcione una disminución o aumento en dicha actividad quinásica.

21. Procedimiento para determinar si un compuesto modifica la actividad de la proteína CDS1 de la vía de puntos de control del ciclo celular humano que comprende la secuencia aminoácida representada en la Figura 2 (SEC ID nº :2), comprendiendo dicho procedimiento la etapa de combinar la proteína Cdc25 con la proteína Cds1 humana en presencia de ATP y un compuesto para ser ensayado, y detectando la actividad fosfatasa de la proteína Cdc25.

22. Procedimiento para el rastreo de sustancias candidato apropiadas para la terapia anticáncer, comprendiendo dicho procedimiento combinar una proteína que posee la secuencia de residuos aminoácidos que se muestra en la Figura 2 (SEC ID nº:2) y la proteína Cdc25 bajo condiciones de fosforilación, poner en contacto la combinación resultante con una sustancia candidato, determinar cualquier cambio en la actividad de fosforilación de la proteína Cdc25, y seleccionar una sustancia candidato que module dicha actividad de fosforilación.

23. Procedimiento in vitro para modificar la actividad de puntos de control de la lesión del ADN de una célula, que comprende administrar una cantidad efectiva de una proteína que tiene la secuencia aminoácida representada en la Figura 2 (SEC ID nº:2).

24. Procedimiento según la reivindicación 23, en el que dicha proteína es una proteína recombinante aislada.

25. Procedimiento según la reivindicación 23, en el que dicha proteína se administra en combinación con, por lo menos, otro agente quimioterápico.

26. Procedimiento según la reivindicación 23, en el que dicha célula es una célula cancerosa.