CN111926036B

CN111926036B - 一种联合表达载体及其在玉米籽粒表达虾青素中的应用

Info

Publication number: CN111926036B
Application number: CN202011093167.9A
Authority: CN
Inventors: 柳小庆; 陈茹梅; 李素贞; 杨文竹; 周晓今
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Jiekang Biotechnology (Hainan) Co.,Ltd.
Priority date: 2020-10-14
Filing date: 2020-10-14
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2040-10-14
Also published as: CN111926036A

Abstract

本发明公开了一种联合表达载体及其在玉米籽粒表达虾青素中的应用。所述表达载体包括pBDEN‑CP‑BZ、pBDEN‑CP‑BZ‑LcyEi和pBDEN‑CP‑CH‑LcyEi。本发明将载体中携带的功能基因及启动子转入玉米，选育的玉米籽粒中虾青素高达100μg/g玉米籽粒干重，是原报道的7倍左右，且虾青素均是以高生物活性的反式虾青素为主，这种富含高品质反式虾青素的玉米新种质将为填补我国虾青素需求缺口开辟新的途径。

Description

一种联合表达载体及其在玉米籽粒表达虾青素中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种虾青素表达载体及其应用，并确定虾青素玉米最佳储存条件和生物利用的方法。

背景技术

虾青素是一种类胡萝卜素，存在于各种藻类、微生物和水生动物中，在高等植物中鲜有报道 (Cunningham and Gantt, 2011)。由于其出色的抗氧化能力和其他生物活性，虾青素作为一种营养补充剂广泛的应用于食品、饲料、保健品、药品和化妆品等产品中。虾青素在饲料工业中,可用作鲍鱼、鲟鱼、鲑鱼、虹鳟鱼、真鲷、甲壳类动物及观赏鱼类、各种禽类和生猪的饲料添加剂。根据体内和体外试验结果表明，虾青素对癌症、高血压、糖尿病、心血管、胃肠道、肝脏、神经退行性疾病和皮肤病等有潜在的积极影响 (Ambati et al.,2014)。欧盟早已批准将虾青素作为人类膳食补充剂，并且美国食品和药物管理局已批准将虾青素用作动物和鱼类饲料中的食物着色剂，我国也在食品和饲料添加剂中大量使用虾青素。然而，在目前的虾青素供应中，化学合成的工艺复杂技术难度大、生物活性低且有安全风险；酵母发酵来源的产量和生物活性低且成品中含糖量过高；雨生红球藻提取也存在技术门槛高、产量不高以及总体成本过高的问题。因此，建立一种高产低成本、生物活性高易操作的虾青素生产体系具有重要意义。

关于虾青素的基因工程研究率先在藻类和微生物中进行。在烟草、拟南芥等模式中均有成功进行的案例。玉米中也有一例关于虾青素基因工程的研究工作，该研究通过基因枪共转化的方式获得同时表达Crbkt和BrcrtZ （Brevundimonas sp., strain SD212）的转基因玉米籽粒积累16.8 μg/g干重的虾青素 (Farré et al., 2016)，但其存在转化方式带来的外源基因碎片化和基因分离的问题以及缺少对种质中的虾青素特性的评价，而我国在玉米中没有类似的研究服务于我国的虾青素市场需求。目前，华南农业大学刘耀光院士团队在水稻胚乳中成功重构了虾青素的代谢途径(Zhu et al., 2018)，其虾青素含量也只有16.0 μg/g水稻干重，远不能满足生产的需要。虾青素的微生物生产方法虽然能产出高虾青素含量，但是，生物活性确很低，如Gerhard Sandmann等通过传统突变和代谢工程结合的办法，产生了一株虾青素干重达到9mg/g的菌株，是已知的产量最高的红发夫酵母。然而，由于红发夫酵母产生的虾青素为（3R ,3′R）构型，抗氧化能力较低，限制了其在商业规模上的使用。专利201010150422.9 公开了一种虾青素生产菌株及其诱变筛选方法与应用，涉及一种微生物菌株及其获取方法。所述虾青素生产菌株为红法夫酵母的诱变菌株N1806-04。以红法夫酵母为出发菌株，采用酶法制备红法夫酵母原生质体，再通过NTG诱变及β-紫罗酮筛选等方法进行虾青素生产菌株的选育，获得虾青素生产菌株，连续传代5次后虾青素的产量稳定。将该虾青素生产菌株用发酵罐放大培养，其虾青素产量和含量分别可达500～600mg/L和5000～6300mg/kg，生物量可达80～110g/L。虽然上述微生物生产的虾青素含量远高于转基因植物种子中的含量，但是，其含有的活性反式虾青素含量低，且该虾青素只是细胞中的含量，还要提取出来才能应用于工业生产，提取的过程中虾青素活性又大量丧失，产率也不见得高于转基因植物的种子，而转基因玉米种子无需提取可以直接用于需要虾青素的饲料，比如高端水产养殖业的三文鱼配合饲料，虹鳟鱼饲料等，也可用于火烈鸟，家禽和宠物饲料等。另外，转基因玉米来源的虾青素没任何异味，藻类来源的有海腥味，酵母来源的有菌味。

发明内容

本发明的目的是提供一种联合表达载体，用于在玉米作物中表达，促进其高效表达虾青素。

本发明的目的还在于提供一种高效表达虾青素的玉米品种的选育方法。

本发明的目的还在于提供玉米源虾青素最佳储存条件和生物利用的方法。

一种虾青素表达载体，所述表达载体包括pBDEN-CP-BZ、 pBDEN-CP-BZ-LcyEi、pBDEN-CP-CH-LcyEi。

所述载体pBDEN-CP-BZ携带ZmPSY1、HpCrtZ、CrBKT、PaCrt1基因。

所述载体pBDEN-CP-BZ-LcyEi携带ZmPSY1、HpCrtZ、CrBKT、PaCrt1基因；以及抑制lcy-e表达的LcyEi序列。

所述载体pBDEN-CP-CH-LcyEi携带ZmPSY1、AdCBFD、AdHBFD、PaCrt1基因；以及抑制lcy-e表达的LcyEi序列。

一种高效表达反式虾青素的玉米品种的选育方法，将所述表达载体通过农杆菌介导的方法进行玉米转化，随后将获得的有虾青素合成的玉米转化材料分别与主栽品种的父母本自交系回交转育，获得稳定遗传的转基因玉米株系。

所述主栽品种为郑58、昌7-2、X335父本和X335母本。

玉米源虾青素的稳定储存条件，从上述高效表达反式虾青素的玉米品种中提取虾青素，然后在-20℃条件下保存；或者所述高效表达虾青素的玉米品种的种子保存于4℃条件下。

玉米源虾青素的应用，其作为畜禽养殖的饲料添加剂。

本发明的有益效果：本发明通过多个玉米籽粒特异性双向启动子驱动来源于玉米的基因ZmPSY1和水仙花来源的基因CrtI表达增加了β胡萝卜素的生物合成量，另外通过对lcy-e基因LcyEi干扰限制番茄红素流向α胡萝卜素合成途径，从而实现“开源”和“截流”双管齐下的策略，增加虾青素合成的前体物质供应。同时，通过多个玉米籽粒特异性双向启动子分别驱动来源莱茵衣藻和雨生红球藻的虾青素合成结构基因CrBKT、HpCrtZ和来源于夏侧金盏花中两个基因AdCBFD和 AdHBFD的表达，实现了虾青素高效生物合成，玉米籽粒中虾青素高达100 μg/g玉米籽粒干重，是原报道的7倍左右。而且虾青素的同分异构体形式和雨生红球藻一致，均是高生物活性的反式虾青素为主。这种富含高品质虾青素的玉米新种质将为填补我国虾青素需求缺口开辟新的途径。

附图说明

图1为中间载体pBDEN-mtp结构示意图。

图2 为表达载体pBDEN-CP-BZ结构示意图。

图3 为表达载体pBDEN-CP-BZ-LcyEi结构示意图。

图4为表达载体pBDEN-CP-CH-LcyEi结构示意图。

图5 为三种载体转基因选育的虾青素玉米。

图6 为在四个自交系背景下的BC4F1代pBDEN-CP-BZ-LcyEi虾青素玉米。

图7 为虾青素玉米中目的基因的PCR检测电泳图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

玉米（Zea mays L.）自交系郑58、昌7-2、X335父本和X335母本为本发明实施例中的回交转育母本，杂交种HiII玉米则为本发明实施例中的起始受体材料（公众可从北京德农种业有限公司处获得）；ZmPSY1、PaCrtI、CrBKT、HpCrtZ、AdCBFD、 AdHBFD和ZmLCY-E的序列均可在公共数据库NCBI获得。

实施例1、玉米单倍体幼胚鉴别方法

一、表达载体的构建

在公共数据库NCBI获取相关功能基因的序列后，通过对基因序列的密码子优化后，同义突变不需要的酶切位点，而后通过酶切连接的方式整合到使用农杆菌介导的遗传转化中间载体pBDEN-mtp（图1）上,形成系列的表达载体pBDEN-CP-BZ、 pBDEN-CP-BZ-LcyEi和pBDEN-CP-CH-LcyEi（图2-4）。

二、虾青素玉米材料的创制

以杂交种HiII玉米授粉后10天左右的玉米幼胚（1-1.5mm长）为起始材料，通过农杆菌介导的方法进行玉米转化，转化流程如下：

（1）、取授粉后10 天的Hi Ⅱ幼穗，首先用无菌水配制5％的次氯酸钠溶液对幼穗进行浸泡灭菌15min, 而后用无菌水浸泡清洗三次。

(2)、在无菌条件下，剥取长度在1.5mm-2.0mm 左右的幼胚置于加有乙酰丁香酮的液体侵染培养基( 培养基配方详见论文Molecular Breeding，2001 年，第8 卷，页码:323–333) 中。

(3)、将事先在具有相应抗性的YEB 固体培养基上在28℃培养4 天的含有目的表达载体的重组克隆菌体刮取适量重悬在加有乙酰丁香酮的液体侵染培养基中，28℃恒温摇床低速恢复培养至OD260到0.4-0.6。

(4)、用液体侵染培养基清洗剥好的幼胚两次，吸弃清洗液，加入OD260＝0.4-0.6的菌体颠倒混匀20 次，置于黑暗条件下静置5min。

(5)、吸弃菌液，并用液体侵染培养基清洗浸染的幼胚两次，连带第二次清洗液和幼胚一起倾倒在无筛选压的固体共培养基( 培养基配方详见论文Molecular Breeding，2001 年，第8 卷，页码:323–333) 上，将幼胚均匀分布在培养基上，并将幼胚的平滑面紧贴培养，弧形面朝上。

(6)、吸弃清洗液，将培养物置于25℃恒温箱黑暗条件下培养3 天。将共培养3 天后的幼胚在无菌条件下转移到无筛选压的固体恢复培养基上，28℃黑暗条件下培养7-10天。

(7)、将恢复培养长势良好且无菌的幼胚衍生物转移到具有basta 筛选压的筛选培养基上筛选28℃黑暗条件下培养1-2 个月，每2 周继代一次。

(8)、待有生长速度显著高于一般愈伤组织的抗性愈伤出现后，将其繁殖到一定后，将一定量的抗性愈伤转移到具有多种激素的分化培养基( 培养基配方详见论文Molecular Breeding，2001 年，第8 卷，页码:323–333) 上28℃黑暗条件下培养2 周左右，诱导形成胚状体。

(9)、将胚状体转移到固体生根培养基中，28℃光照条件下培养1 周左右。生根成苗，将小苗转移到盛有固体生根培养基的圆柱状培养管中，28℃光照条件下培养1 周左右。

(10)、再将展开2-3 片幼叶的试管苗转移到有营养土的营养钵中在光照培养箱培养1 周左右后即可转移到温室进一步培养并最终移栽到大田中。

三、虾青素玉米材料回交转育与分子检测

虾青素玉米材料获得后，首先观察授粉不同时期后玉米籽粒的外形，结果见图5。随后将有虾青素合成的后代材料分别与主栽品种的父母本自交系（郑58、昌7-2、X335父本和X335母本）进行回交转育，经过四代回交转育得到BC4F1株系(图6)。为了确定这些株系中是否含有目的基因，我们通过提取回交后代植株叶片的基因组DNA，而后利用特异性引物（见表1）通过PCR技术进行将检测，结果见图7，结果显示所以株系中都含有自己特有的目的基因。

表1.PCR检测所用到的引物列表

四、虾青素玉米材料种虾青素含量和种类的定量检测

为了确定虾青素玉米中虾青素含量和种类，我们采取高压液相色谱法（HPLC）来进行检测，虾青素标品购自sigma公司。虾青素玉米籽粒样品的前处理以及上机条件如下：

前处理：

（1）称取一定量的待测样品（玉米和饲料样品粉碎后称量，鸡蛋称取鲜重）

（2）加入提取液（甲醇：四氢呋喃=1：1，体积比），涡旋振荡1min

（3）60℃水浴锅中加热20min,取出振荡1min

（4）加入乙酸乙酯，振荡1min

（5）4000r/min离心5min，取上清

（6）10000r/min 离心10min,取上清

（7）过0.45μm滤膜，待上机。

色谱条件：

色谱柱：C30，250 mm ×4.6 nm，5μm

柱温：室温（或25℃）

紫外检测器：474nm

进样量：10 μL

流速：1.0 mL/min

流动相：采用等度洗脱，流动相A:B=90:10，流动相A（甲醇：叔丁基甲基醚，81：15）；流动相B（超纯水）。

发明人按照专利201410466752.7的方法制备虾青素，获得的虾青素粗品过本发明的色谱柱，并计算虾青素的含量。

目前，发明人得到全反式虾青素、13-顺式虾青素、9-顺式虾青素非常好的浓度线性。当分别加入这三种虾青素的标品0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml，分别得到其线性方程为y=243782x-26031; y=19578x-1715.4; y=59641x-6070.6,其相关系数R2均为0.999。其检测限分别为：0.005μg/ml；0.08μg/ml和0.03μg/ml。

按照虾青素在干玉米中的含量及在干菌体中的含量计算，虾青素含量如表2所示：

表2法夫酵母及虾青素玉米中虾青素的含量

由表2可以看出，虽然采用法夫酵母生产的总虾青素含量较高，但是，其生物活性高的反式虾青素含量低，总生物活性低。

五、玉米源虾青素稳定储存的条件

为了确定虾青素玉米在储存过程中温度对虾青素储存稳定性的影响，我们将来源相同的虾青素储存在常温、4度、-20度和-80度四种条件下7个月，而后检测玉米中虾青素的含量。从表3中可以看出，温度越低，虾青素的含量越高，无论是反式虾青素还是两种顺式虾青素的含量变化均是如此。因此，-20度保存虾青素是经济而又有效的储存方式。而4度保存条件则是对虾青素玉米这样的大宗原材料的最佳保存条件。

表3不同温度条件下储存7个月后虾青素玉米中虾青素的含量

六、玉米源虾青素的生物利用

为了确定虾青素玉米的生物活性，发明人通过蛋鸡饲喂试验来进行验证。将蛋鸡饲料中的普通玉米全部换成虾青素玉米，从而使饲料中的反式虾青素含量达到15mg/kg。同时，发明人将（四）制备的法夫酵母虾青素添加到普通饲料里作为对照（虾青素含量达到15mg/kg）。饲喂两周后，测定鸡蛋的重量。

表4两种虾青素饲喂后鸡蛋的重量

由表4可以看出法夫酵母虾青素饲喂组和虾青素玉米组饲喂后鸡蛋的重量均高于对照组，但虾青素玉米组饲喂后鸡蛋的增重较法夫酵母虾青素饲喂组高，证明虾青素玉米中虾青素的生物活性要高于法夫酵母虾青素饲喂组。

Claims

1.一种高效表达反式虾青素的玉米品种的选育方法，其特征在于，将表达载体通过农杆菌介导的方法进行玉米转化，随后将获得的有虾青素合成的玉米转化材料分别与主栽品种的父母本自交系回交转育，获得稳定遗传的转基因玉米株系；所述表达载体包括pBDEN-CP-BZ、pBDEN-CP-BZ-LcyEi、pBDEN-CP-CH-LcyEi；所述载体pBDEN-CP-BZ携带玉米的PSY1基因、雨生红球藻的CrtZ基因、莱茵衣藻的BKT基因、水仙花的CrtI基因；所述载体pBDEN-CP-BZ-LcyEi携带玉米的PSY1基因、雨生红球藻的CrtZ基因、莱茵衣藻的BKT基因、水仙花的CrtI基因；以及抑制lcy-e表达的LcyEi序列；所述载体pBDEN-CP-CH-LcyEi携带玉米的PSY1基因、夏侧金盏花的CBFD基因、夏侧金盏花的HBFD基因、水仙花的CrtI基因；以及抑制lcy-e表达的LcyEi序列。

2.根据权利要求1所述高效表达反式虾青素的玉米品种的选育方法，其特征在于，所述主栽品种为郑58、昌7-2、X335父本和X335母本。

3.一种玉米源虾青素的稳定储存方法，其特征在于，从权利要求1所述选育方法得到的高效表达反式虾青素的玉米品种中提取虾青素，然后在-20℃条件下保存；或者将权利要求1所述选育方法得到的高效表达反式虾青素的玉米品种的种子保存于4℃条件下。