CN102083985B - 参与红薯中类胡萝卜素累积的IbOrange基因 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及来自红薯的与类胡萝卜素累积有关的IbOrange蛋白、编码该蛋白的基因、含有该基因的重组载体、用重组载体转化的宿主细胞和用于扩增IbOrange基因的引物对。根据本发明，通过IbOrange基因增加类胡萝卜素的产量，预期可以培育出既具有改善的功能活性，又对环境应力具有强抵抗力的作物。
Description
技术领域
本发明涉及源自含有大量类胡萝卜素的“Shinwhangmi”甘薯的Orange基因。更具体地，本发明涉及通过控制基因表达能够提高类胡萝卜素产量的蛋白质，其是通过控制与类胡萝卜素的生物合成有关并且参与成色素细胞中的类胡萝卜素累积的基因以及编码所述蛋白质的基因完成的。
背景技术
甘薯(Ipomoea batatas L.Lam)为一种能够在相对贫瘠的土壤中种植的块根作物，其每公顷的产量高达约30吨。因此，其通常作为人类食用的食物和牲畜的饲料。特别地，在干物质中大约70％为淀粉，甘薯早已被用于获取醇的原材料，现在也是被认为作为是一种环保型的作物，其可作为一种替代能源而使用，即用于生产生物乙醇。
由于近年急剧的工业化和人口增长，世界各地的环境和粮食问题尤为突出。因此，目前人们正在积极开发能够抵抗荒漠区、污染区或寒冷区等等的极端环境条件的农业作物。特别地，为了开发具有产业优势并可在上述恶劣环境区域中种植的甘薯，目前人们正基于分子培育方法，开发具有抵抗恶劣条件的环境的转基因甘薯(Limet al.Mol Breeding 19，227-239，2007)。
根据世界卫生组织(WHO)的报道，有超过十亿的儿童患有维生素A缺乏症，由此造成每年超过50万儿童失明。β-胡萝卜素是维生素A的前体化合物。鉴于β-胡萝卜素具有的作为营养加强剂和食物援助的生理活性，关于食品中类胡萝卜素的积累代谢研究对于提高其营养价值是一个重要的研究课题。β-胡萝卜素被认为是具有较高抗氧化活性的物质，不仅因为其生理活性，而且因为其在植物自身在对抗氧化应激的防御机制中起到的关键作用。最近，人们发现，类胡萝卜素的生物合成受一种植物激素ABA的影响。因此，有必要进一步研究以确定这些抗氧化物质和环境压力间的关系。
同时，康奈尔大学(美国)的Lu等人报告指出：突变Orange基因与菜花的成色素细胞中的类胡萝卜素的累积有关(Lu S等，2006 Plant Cell.18：3594-3605，2006)。
发明详述
技术问题
本发明系针对上述需要而设计。本发明的发明人从具有高含量的类胡萝卜素的“Shinwhangmi”甘薯中克隆了Orange基因。因此，在对大肠杆菌中的重组蛋白的生成进行确认之后，本发明得以完成。
技术方案
为了解决上述问题，本发明提供了来源于甘薯的与类胡萝卜素累积相关的IbOrange蛋白。
进一步地，本发明提供编码IbOrange蛋白质的基因。
进一步地，本发明提供包含IbOrange基因的重组载体。
进一步地，本发明提供用所述重组载体转化的宿主细胞。
更进一步地，本发明提供为IbOrange基因的扩增设计的引物对。
发明效果
根据本发明，能够确定的是Orange蛋白质的表达和源于“Shinwhangmi”甘薯的Orange基因由诸如ABA、乙烯磷、茉莉酸甲酯、水杨酸等与植物干旱应激和防御机制有关的植物激素诱导。因此，可以预期的是，通过由IbOrange基因提高类胡萝卜素的含量，能够开发出不仅具有改进功能而且对环境压力具有抵抗力的植物。
附图说明
图1表示源自甘薯(“Shinwhangmi”)的Orange基因的核苷酸序列和由此推测出的氨基酸序列。下划线区域表示质粒定位信号，由942bp组成的cDNA编码由313个氨基酸组成的蛋白质。
图2表示由本发明的甘薯(Ipomoea batatas)的IbOrange基因推测出orange蛋白质的氨基酸序列，其中也记载来自其它各种植物的氨基酸序列用于比对(牵牛花、番茄、葡萄、黄豆、大豆、棉花、拟南芥、花椰菜、高粱、玉米、水稻和大麦)。
图3表示由本发明的甘薯(Ipomoea batatas)的IbOrange推断的氨基酸序列和来自其它各种植物(牵牛花、番茄、葡萄、黄豆、大豆、棉花、拟南芥、花椰菜、高粱、玉米、水稻和大麦)的Orange基因间的基因相似性关联。
图4表示由RT-PCR测定的本发明的IbOrange基因的表达类型以及各种种类的甘薯的电泳。在该图中，分别地，Ym表示“Yoolmi”，Jm表示“Shinjami”并且Hm表示“Shinwhangmi”。
图5表示由RT-PCR测定的本发明的IbOrange基因的表达类型以及甘薯的各部分的电泳。特别地，L表示叶子，S表示茎，其它包括贮藏根、须根以及厚的色素根。
图6表示由RT-PCR测定的本发明的IbOrange基因的表达类型以及用植物激素(诸如ABA、乙烯磷(即乙炔的前体)、茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA))处理的甘薯的叶和根的电泳并且在处理后的0、12、24、36或48小时进行RT-PCR。
图7表示该蛋白质的电泳结果，其表明，泳道1，在大肠杆菌中的IbOrange的重组蛋白的产生；泳道2，具有His-tag的可溶的IbOrange；泳道3，具有His-tag的不可溶的IbOrange；以及泳道4，具有GST-tag的不可溶的IbOrange。
本发明的最佳实施方式
为实现上述本发明的目的，本发明提供源自甘薯(Ipomoeabatatas)的IbOrange蛋白质，其与类胡萝卜素累积相关。
本发明IbOrange蛋白质的范围包括，从“Shinwhangmi”甘薯中分离的具有SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的蛋白质以及所述蛋白质的功能等价物。术语“功能等价物”指的是，氨基酸残基添加、取代或缺失的产物，其具有与SEQ ID NO：2的氨基酸序列的至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％、更为优选地至少95％的同源性的氨基酸序列，因此表现为具有与SEQ ID NO：2所示的蛋白质基本上相同生理活性的蛋白质。
进一步地，本发明提供编码上述IbOrange蛋白质的基因。本发明的基因包括编码IbOrange蛋白质的基因组DNA和cNDA。优选地，本发明的基因可以包含由SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列。另外，鉴于IbOrange基因对应于多基因家族并且具有包含在甘薯中的各种同源基因，本发明的IbOrange基因不仅可以包括具有SEQ ID NO：1所表示的核苷酸序列的IbOrange基因也包括IbOrange基因的多基因家族。
进一步地，本发明的范围也包括该核苷酸序列的突变体。特别地，上述基因可以含有具有与SEQ ID NO：1的核苷酸序列的至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％、更为优选地至少95％的同源性的核苷酸序列。所述针对特定的聚核苷酸的“序列同源性％”通过比较对齐的两个序列的比较区域来确定。鉴于此，在比较区域中的部分聚核苷酸可以包含相比于与所述两个序列的最优比对相关的参考序列(没有任何添加或缺失)的添加或缺失(即间隔)。
本发明的全长IbOrange cDNA有942bp组成且其编码313个氨基酸残基(见图1)。依据氨基酸序列计算，等电点(pl)和分子量(Mw)分别为8.46和34.4kDa。采用基因BLAST分析，发现其携带有包含重复半胱氨酸残基的CxxCxGxG的重复基序，该重复基序在其它公知为DnaJ蛋白的orange蛋白质中被很好地保留，其为一种分子伴侣。
可以确定的是本发明的IbOrange基因在包括Yulmi(灰白色甘薯)、Shinjami(紫色甘薯)和Shinwhangmi(黄色甘薯)在内的各种甘薯中表达(见图4)。具体而言，IbOrange基因通常在整株植物中表达，而其在叶子和须根中更强地表达(见图5)。
本发明IbOrange基因的高表达能够通过诸如ABA、乙烯磷、茉莉酸甲酯、水杨酸等的植物激素来诱导。尽管在已经用ABA处理的叶子中没有显著的变化，IbOrange基因在处理后36小时的根中表达较高。对于用ethephone处理而言，IbOrange基因的表达在处理后36小时的叶和根中被诱导。尤其地，在叶子中的表达更高。对于用茉莉酸甲酯处理而言，在处理后12小时的叶子中诱导的IbOrange基因表达较高，保持该高水平36小时。在根中，该表达在处理后的24小时开始增强，并且在36小时时达到最高水平。对于用水杨酸处理而言，在叶子和根中均无显著的变化。然而，在处理后12小时至36小时的期间内IbOrange基因的表达稍微增强(见图6)。
进一步地，本发明提供含有本发明的IbOrange基因的重组载体。所述重组载体优选地为重组大肠杆菌表达载体。
术语“重组体”表示一种细胞，其复制异源核苷酸或表达核苷酸、多肽、异源多肽或由异源核苷酸编码的蛋白。重组细胞能够表达在天然状态的细胞中不存在的基因或基因片段，其形式为正义或反义。另外，如果所述基因通过人工方法被修饰且重引入该细胞，则重组细胞能够表达在自然状态中存在的基因。
本文所使用的术语“载体”指被转运到细胞的DNA片段和核苷酸分子。载体能够用于复制DNA并且能独立地在宿主细胞中被复制。术语“转运系统(delivery system)”和“载体”通常互换地使用。术语“表达载体”指含有所需编码序列和其它适合的核苷酸序列的重组DNA分子，其对于在特定宿主有机体中的操纵相关的编码序列的表达是必要的。
本发明的载体能够被构建为一般用于克隆或表达的载体。另外，本发明的载体能够构建为以原核细胞或真核细胞作为宿主的的载体。例如，当本发明的载体是表达载体且以原核细胞作为宿主时，其一般包括强启动子，该强启动子能够促进转录(例如，pLλ启动子)trp启动子、lac启动子、T7启动子、tac启动子等等)、用于启动转录的核糖体结合位点、以及用于转录/翻译的终止序列。当大肠杆菌被作为宿主细胞应用时，在大肠杆菌中的色氨酸生物合成中所涉及的启动子和操纵子区以及噬菌体λ(即pLλ启动子)的左侧启动子能够作为调节位点使用。
同时，能够在本发明中使用的载体能够通过使用质粒(实例：pSC101、ColE1、pBR322、pUC8/9、pHC79、pGEX系列、pET系列以及pUC19)、噬菌体(实例：λgt4·λB、λ-Charon、λΔz1以及M13等等)或病毒来构建，其典型地在相关领域中应用。
同时，当本发明的载体为表达载体且具有真核细胞作为载体，能够使用源自哺乳动物基因组(实例：金属硫蛋白)的启动子或源自哺乳动物病毒(实例：腺病毒后期启动子、痘苗病毒、7.5K启动子、SV40启动子、细胞巨化病毒以及HSV的tk启动子)的启动子。一般包括作为转录终止序的聚腺苷酸序列。
本发明的载体可以包括耐抗生素基因，其典型地在相关领域作为选择标记使用。其实例包括耐以下抗生素的基因：氨比西林、庆大霉素、卡比青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素或四环素等等。
本发明进一步提供用本发明的重组载体转化的宿主细胞。对于宿主细胞而言，任何相关领域的技术人员具有能够使用本发明的载体的稳定且持续克隆和表达的能力。其实例包括：包括大肠杆菌JM109、大肠杆菌BL21、大肠杆菌RR1、大肠杆菌LE392、大肠杆菌B、大肠杆菌X 1776、大肠杆菌W3110、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)等的芽孢杆菌属(Bacillus sp.)菌株，包括鼠伤寒沙门菌、粘质沙雷菌和各种假单胞菌属(Pseudomonas sp.)等等的肠杆菌及菌株。优选地宿主细胞是大肠杆菌。
另外，当真核细胞用本发明的载体转化，可使用酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)、昆虫细胞、人细胞(例如CHO(中国仓鼠卵巢)细胞株、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN以及MDCK细胞株)等等作为宿主细胞。
当宿主细胞是原核细胞，可采用以下方法将本发明的载体转运到宿主细胞：CaCl2方法(Cohen，S.N.等，Proc.Natl.Acac.Sci.USA，9：2110-2114(1973))、Hanahan方法(Hanahan，D.，J.Mol.Biol.，166：557-580(1983))或电穿孔法(Dower，W.J.等，Nucleic.Acids Res.，16：6127-6145(1988))等等。另外，当宿主细胞是真核细胞，能够通过以下方法将载体引入宿主细胞：显微注射法(Capecchi，M.R.，Cell，22：479(1980))、磷酸钙沉淀法(Graham，F.L.et al.，Virology，52：456(1973))、电穿孔法(Neumann，E.等，EMBO J.，1：841(1982))、脂质体介导转染法(Wong，T.K.等，Gene，10：87(1980))、二乙氨基乙基葡聚糖处理法(Gopal，Mol.Cell Biol.，5：1188-1190(1985))或基因轰击法(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.，87：9568-9572(1990))等等。
本发明进一步提供用于IbOrange基因的扩增的引物对。该引物对由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4表达的寡核苷酸组成。
该引物对可以由包括以下的引物对组成：至少一种选自由具有包括在SEQ ID NO：3的序列中的20个或更多的连续核苷酸的片段组成的寡核苷酸组成的组的寡核苷酸，以及至少一种选自由具有包括在SEQ ID NO：4的序列中的20个或更多的连续核苷酸的片段组成的寡核苷酸组成的组的寡核苷酸。
优选地，该引物对可以由包括至少一个选自由寡核苷酸组成的组的寡核苷酸的引物对组成，该寡核苷酸由包含在SEQ ID NO：3序列中的具有21或更多、22或更多、23或更多、24或更多、25或更多、26或更多、27或更多、28或更多、29或更多、30或更多个连续核苷酸组成，以及该引物对还可以由包括至少一个选自由寡核苷酸组成的组的寡核苷酸的引物对组成，该寡核苷酸由包含在SEQ ID NO：4序列中的具有21或更多、22或更多、23或更多、24或更多、25或更多、26或更多、27或更多、28或更多、29或更多、30或更多个连续核苷酸组成。
最优选地，本引物对可以由具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的引物对组成。
根据本发明，术语“引物”表示与需复制的核苷酸链互补的单链寡核苷酸，并且其能够作为用于引物增长产物的合成的起始点而起作用。上述引物的长度和顺序应该满足增长产物的合成的启动所需要的条件。根据本发明，作为引物使用的寡核苷酸可以包括核苷酸类似物，例如，磷硫酰、烷基磷硫酰或核酸肽或者插入试剂。
参照一下实施例对本发明进一步详细地说明。然而，其仅是对本发明具体地示例性说明而决不是通过这些实施例来对本发明的范围进行限制。
实施例
<实施例1>甘薯IbOrange基因的克隆，核苷酸序列和基因相似性分析
使用QIAGEN的RNeasy Mini Kit从甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam，Shinwhangmi种)的叶中分离总RNA。进一步采用Invitrogen的用于RT-PCR的SuperScript III第一链合成系统合成第一cDNA。为了分离Orange基因，基于TIGR植物转录组学(Plant Transcript Assemblies)提供的网站(http://plantta.tigr.org/)，采用花椰菜的Orange基因进行BLAST分析。结果，从与甘薯具有遗传相似性的牵牛花(Ipomoeanil)的EST克隆中，发现与Orange基因具有相似核苷酸序列的克隆。通过使用该基因，产生用于克隆来自甘薯的Orange基因的引物。该基因的序列如下：正向引物(5′-atggtatattcaggtagaatcttgtcgctc-3′；SEQ ID NO：3)和反向引物(5′-ttaatcaaatgggtcaattcgtgggtcatg-3′；SEQ ID NO：4)。接头序列(粗体)在各个引物的5’端与引物的核苷酸序列相连接，以便能够使用由Invitrogen提供的gateway expression system。所得的核苷酸序列如下：正向引物(5′-
atggtatattcaggtagaatcttgtcgctc-3′；SEQ ID NO：5)和反向引物(5′-
ttaatcaaatgggtcaattcgtgggtcatg-3′；SEQ ID NO：6)。使用Clonetech提供的advantage2聚合酶进行PCR。在使用pGEMeasy克隆用载体(Promega)克隆具有所需尺寸的PCR产物后，通过序列测定来确定整个核苷酸序列。所得cDNA被命名为IbOrange cDNA。
IbOrange基因的cDNA全长为942bp，编码313个氨基酸并且在N’端具有信号肽靶向质粒(图1)。根据数据库的基因BLAST比对结果，发现存在具有重复半胱氨酸的CxxCxGxG的重复基序，其是一种已知为伴侣分子的且在其它orange蛋白中保存的DnaJ蛋白。通过使用BlastX和ClustalW(http://plant.pdrc.re.kr/gene/align/ClustalW.html)确定在来自本发明的IbOrange的编码序列的氨基酸序列和各种植物种的Orange基因间的基因相似性。结果发现，牵牛花(Ipomoea nil)具有最高的同源性。另外，番茄(Lycopersicon esculentum)、葡萄基因(Vitis vinifera)、拟南芥的At5g61670基因和花椰菜基因(Brassicaoleracea var.botrytis)被发现具有73％至80％的序列同源性(图2和图3)。
<实施例2>在甘薯的不同品种和组织中的IbOrange基因的表达分析
为了分析本发明的IbOrange基因在甘薯的不同种类和组织中的表达图谱，进行RT-PCR。特别地，使用来自QIAGEN的RNeasy Mini Kit来分离中RNA，使用来自Invitrogen的用于RT-PCR的SuperScript IIIFirst-Strand Synthesis System来合成第一cDNA。使用的引物的核苷酸序列如下：(正向引物：5′-atcttgtcgctctcgtcctccacgacgccg-3′(SEQ ID NO：7)，反向引物：5′-cgtgggtcatgctcgcttgccatagccatc-3′(SEQ ID NO：8))。
结果发现，IbOrange基因已经在所有检测过的种类中表达，包括Yoolmi(Ym)，即灰白色甘薯，Shinjami(Jm)，即紫色甘薯，以及Shinwhangmi(Hm)，即黄色甘薯(图4)。进一步地，根据对植物的不同的组织的分析，发现IbOrange基因已经普遍在植物中全部表达，而在植物的叶子和须根中表达较高(图5)。因此，了解到IbOrange基因为在植物(而不是仅在特定种中)中同种地表达的基因。
<实施例3>用各种植物激素处理后的IbOrange基因的表达分析
为了确定本发明的IbOrange基因相对于各种植物激素(诸如ABA、乙烯磷、茉莉酸甲酯、水杨酸等等，其与植物的防御机制和干旱应激有关)的表达图谱，将植物用各种所述激素处理并随后在各个时间点(即在激素处理后0、12、24、和48小时)分离RNA并用与本文实施例1和2相同的方式合成cDNA。将与IbOrange基因具有特异性，且已经在上述实施例2中使用过的引物，用于RT-PCR。结果，发现在各种激素的影响下IbOrange基因的表达图谱如下：ABA；尽管在叶子中没有显著的变化，处理后36小时在根中发现IbOrange基因表达较高，乙烯磷；对于叶子和根，在处理后36小时发现IbOrange基因表达较高，尤其在叶子中表达更高，茉莉酸甲酯；对于叶子，在处理后12小时且维持直到36小时，诱导IbOrange基因进行高表达，且对于根，该表达从12小时开始轻微地增大并在处理后36小时达到最大，水杨酸；在叶子和根中没有显著的变化，但是在处理后12小时至36小时发现IbOrange基因的表达轻微地升高(图6)。
一般来说，已知在干旱应激下，ABA(其为植物激素的一种)的量增加以便ABA能够有效地控制植物的气孔的开启或关闭，作为对干旱条件的反应。同时，尽管类胡萝卜素为ABA的前体材料，但仍相信对于干旱应激ABA的增高与类胡萝卜素的量的提高具有直接的联系。因此，如本实验所表明的，对应于ABA处理IbOrange基因的表达提高说明在干旱应激和IbOrange基因间的紧密的关系。
<实施例4>根据在大肠杆菌中IbOrange基因的表达所产生的蛋白质的特性
为了确定从IbOrange基因产生的蛋白质是否具有所需的大小，将IbOrange基因的编码区域克隆到pDONR207载体中，且随后被引入到表达载体pDEST 17和pDEST 15中，其中含有组氨酸亲和标记物和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白。用于表达的大肠杆菌(BL21DE3株)用所得的表达载体转化并且orange蛋白的表达有IPTG诱导。该蛋白从大肠杆菌分离，并随后使用SDS-PAGE分析来表明其特征。结果发现具有组氨酸标记的34kDa重组体蛋白质57kDa GST-融合蛋白被成功地表达(图7)。结果再次证明，本发明克隆的IbOrange基因确实是编码orange蛋白的基因。
综上所述，通过由IbOrange基因提高类胡萝卜素含量，预期可以培育出不仅能够提高植物的机能活性而且对环境压力具有强抵抗力的作物。
Claims (7)
1.来自甘薯（红薯）的IbOrange蛋白，其中所述蛋白由SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列组成。
2.一种编码权利要求1所述的IbOrange蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因由SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列组成。
4.包括权利要求2所述的基因的重组载体。
5.用权利要求4所述的重组载体转化的宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，其为大肠杆菌。
7.用于扩增由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成的IbOrange基因的引物对，其由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的寡核苷酸组成。
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