KR20090132248A - 고구마 유래의 카로티노이드 축적에 관련된ＩｂＯｒａｎｇｅ 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 카로티노이드 축적에 관련된 고구마 유래 IbOrange 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 IbOrange 유전자 증폭용 프라이머 세트에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, IbOrange 유전자를 통하여 카로티노이드 함량을 높임으로써 기능성 향상뿐만 아니라 환경 스트레스에 내성이 강한 식물체를 개발할 수 있을 것으로 기대된다.

카로티노이드, 고구마, orange 유전자, 프라이머

Description

고구마 유래의 카로티노이드 축적에 관련된 ＩｂＯｒａｎｇｅ 유전자{IbOrange gene involved in carotenoid accumulation from Ipomoea batatas}

본 발명은 카로티노이드 함량이 높은 신황미 품종 고구마 유래의 orange 유전자에 관한 것으로, 보다 상세하게는 카로티노이드 생합성에 관련된 유전자의 발현을 조절하여 카로티노이드의 생산을 증대시키고 chromoplast (유색체 또는 잡색체)에서의 카로티노이드 축적에 관여하는 단백질 및 이를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

고구마(Ipomoea batatas L. Lam)는 비교적 척박한 땅에도 재배가 가능할 뿐만 아니라 헥타르당 생산량이 약 30톤으로 높아 식량과 가축사료로 이용되는 대표적인 뿌리작물이다. 특히 고구마는 건물중의 약 70%가 전분으로 이루어져 주정의 원료작물로 오래전부터 이용되었으며, 바이오에탄올 생산을 위한 친환경 대체에너지작물로 최근 재조명되고 있다.

최근 급속한 산업화와 인구증가에 의해 지구규모의 환경문제와 식량문제가 제기되고 있어 사막화지역, 공해지역, 추운 지역 등 조건 불리한 지역에서도 잘 자라는 환경재해 내성 농작물 개발이 활발히 이루어지고 있다. 특히 조건 불리 지역 에 적합한 산업용 고구마를 개발하기 위하여 분자육종에 의한 환경재해 내성 형질전환 고구마 연구가 시도되고 있다 (Lim et al. Mol Breeding 19, 227-239, 2007).

세계보건기구 (WHO)는 전 세계 1억 명 이상의 어린이들이 비타민A의 부족으로 고생하고 있으며 이로 인해 매년 50만 명 이상의 어린이들이 실명하고 있다고 발표하였다. 베타카로틴은 비타민A의 전구체로서 영양강화제, 식품보조제의 생리활성 기능을 가지고 있어 식품에서의 카로티노이드 축적에 관한 대사공학 연구는 영양학적 가치를 높이기 위한 필수 연구 대상이라 할 수 있다. 베타카로틴은 높은 항산화활성을 가진 물질로서 생리활성 기능뿐 아니라 식물 자체의 산화 스트레스에 대한 방어 기작에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며 최근 카로티노이드 생합성이 식물호르몬의 하나인 ABA에 의해 영향을 받는 것이 밝혀짐으로써 이들 항산화 물질과 환경 스트레스에 대한 연구의 필요성이 대두 되었다.

한편 미국 코넬대학의 Lu 등은 꽃양배추에서 돌연변이가 일어난 Orange 유전자가 chromoplast 내에서 카로티노이드의 축적에 관여함을 발표하였다 (Lu S et al. 2006 Plant Cell. 18:3594-3605, 2006).

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 카로티노이드 함량이 높은 신황미 고구마 품종으로부터 orange 유전자를 클로닝하였고, 대장균에서의 재조합 단백질 생성을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 카로티노이드 축적에 관련된 고구마 유래 IbOrange 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한, IbOrange 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한, IbOrange 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명은 또한, IbOrange 유전자 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 신황미 고구마 유래 orange 단백질 및 유전자는 건조 스트레스와 식물 방어 기작에 관련되는 ABA, 에테폰, 메틸 자스모네이트, 살리실산 등의 식물 호르몬에 의해 발현이 강하게 유도되는 것을 확인하였다. 따라서, IbOrange 유전자를 통하여 카로티노이드 함량을 높임으로써 기능성 향상뿐만 아니라 환경 스트레스에 내성이 강한 식물체를 개발할 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 카로티노이드 축적에 관련된 고구마 (Ipomoea batatas) 유래 IbOrange 단백질을 제공한다.

본 발명에 따른 IbOrange 단백질의 범위는 신황미 품종 고구마로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

또한, 본 발명은 상기 IbOrange 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 IbOrange 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, IbOrange 유전자는 multigene 패밀리로서 고구마 내에 상동성(homologous) 유전자들이 많이 존재하는데, 본 발명의 IbOrange 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 IbOrange 유전자뿐만 아니라, IbOrange 유전자의 multigene 패밀리도 포함할 수 있다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 IbOrange cDNA 유전자의 전체 길이는 942 bp의 cDNA가 313 아미노산을 코딩하고 있다 (도 1 참고). 아미노산 배열로 예측한 등전점 (pI)과 분자량 (Mw)은 각각 8.46 과 34.4 kDa 이다. 유전자를 데이터베이스에서 블라스트한 결과, chaperone으로 알려진 DNA J 단백질의 일종으로 다른 Orange 단백질에서 잘 보존되어있는 시스테인이 반복되는 CxxCxGxG의 반복 모티브를 가지고 있다.

본 발명의 IbOrange 유전자는 미색 고구마인 율미, 자색 고구마인 신자미, 황색 고구마인 신황미의 모든 품종에서 발현되는 것을 확인하였다 (도 4 참고). IbOrange 유전자는 식물체 전반에 걸쳐 고르게 발현되고 특히 잎 (leaf) 과 실뿌리(fibrous root)에서 강하게 발현되는 양상을 보였다 (도 5 참고).

본 발명의 IbOrange 유전자는 ABA, 에테폰, 메틸 자스모네이트, 또는 살리실산 등의 식물 호르몬에 의해 발현이 강하게 유도될 수 있다. 본 발명의 IbOrange 유전자는 ABA를 처리했을 때 잎에서는 뚜렷한 변화가 없으나 뿌리에서 36시간 후에 IbOrange 유전자가 강하게 발현하는 것을 보여주었다. 에테폰(ethephone)을 처리한 경우에는 잎과 뿌리에서 처리 후 36시간에 IbOrange 유전자의 발현이 유도되는 것을 보여주는데, 특히 잎에서 보다 강하게 발현되는 것을 알 수 있었다. 메틸 자스모네이트의 처리시에는 잎의 경우 처리 후 12시간부터 IbOrange 유전자의 발현이 강하게 유도되어 36시간까지 지속되는 것을 보여주었고 뿌리에서는 24시간부터 약 하게 증가하다가 36시간에 강하게 발현되는 것을 보여주었다. 살리실산을 처리하였을 때는 잎과 뿌리 전반에 걸쳐 큰 변화는 없으나 잎에서 처리 후 12시간부터 36시간까지 IbOrange 유전자의 발현이 약하게 증가하는 것을 볼 수 있었다 (도 6 참고).

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 IbOrange 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 대장균 발현 벡터이다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E. coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클 린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 상기 숙주세포는 바람직하게는 대장균이다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 또한, IbOrange 유전자 증폭용 프라이머 세트를 제공한다. 상기 프라이머 세트는 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.

상기 프라이머 세트는 서열번호 3의 서열 내의 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 서열 내의 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트로 이루어질 수 있다.

상기 프라이머 세트는 바람직하게는, 서열번호 3의 서열 내의 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상, 28개 이상, 29개 이상, 30개의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 서열 내의 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상, 28개 이상, 29개 이상, 30개의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트일 수 있다.

상기 프라이머 세트는 가장 바람직하게는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라 이머 세트로 이루어질 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

< 실시예 1> 고구마 IbOrange 유전자의 클로닝 , 염기서열 분석 및 유연관계 분석

고구마 (Ipomoea batatas (L.) Lam) 품종 신황미 식물체의 잎에서 QIAGEN사의 RNeasy Mini Kit를 이용하여 total RNA를 분리하였다. Invitrogen의 RT-PCR용 SuperScript III First-Strand Synthesis System을 이용하여 first cDNA를 합성하였다. Orange 유전자를 분리하기 위해, TIGR Plant Transcript Assemblies의 웹사이트 (http://plantta.tigr.org/)에서 꽃양배추의 Orange 유전자를 가지고 블라스 트한 결과 고구마와 가까운 나팔꽃 (Ipomoea nil)의 EST 클론으로부터 Orange 유전자와 비슷한 염기서열을 갖는 클론을 찾았고 이 유전자로부터 고구마에서 orange 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머를 제작하였다. 프라이머 서열은 하기와 같다: 정방향 프라이머 (5'-atggtatattcaggtagaatcttgtcgctc-3'; 서열번호 3)와 역방향 프라이머 (5'-ttaatcaaatgggtcaattcgtgggtcatg-3'; 서열번호 4). 프라이머의 염기서열에는 Invitrogen의 gateway 발현 시스템을 이용하기 위해 상기 프라이머의 5' 말단에 어댑터 서열 (대문자)을 각각 추가하였다. 염기서열은 정방향 프라이머 (5'-CAAAAAAGCAGGCTNNatggtatattcaggtagaatcttgtcgctc-3'; 서열번호 5)와 역방향 프라이머 (5'-CAAGAAAGCTGGGTNttaatcaaatgggtcaattcgtgggtcatg-3'; 서열번호 6)이다. Clonetech 사의 advantage2 중합효소를 이용하여 PCR을 수행하였고, 예상 크기의 PCR 산물을 pGEMeasy 클로닝 벡터 (Promega)를 이용하여 클로닝한 후, 시퀀싱하여 전체 염기서열을 확인하였다. 이 cDNA 유전자의 이름을 IbOrange cDNA라고 명명하였다.

IbOrange cDNA 유전자의 전체 길이는 942 bp의 cDNA가 313 아미노산을 코딩하며, N-말단에 플라스티드 타겟의 시그널 펩티드를 가지고 있다 (도 1). 유전자를 데이터베이스에서 블라스트한 결과 chaperone으로 알려진 DNA J 단백질의 일종으로 다른 Orange 단백질에서 잘 보존되어있는 시스테인이 반복되는 CxxCxGxG의 반복 모티브를 가지고 있다. 본 발명의 IbOrange의 코딩 부분의 아미노산 서열과 다양한 식물 종의 Orange 사이의 유연관계를 Blast X와 ClustalW 프로그램(http://plant.pdrc.re.kr/gene/align/ClustalW.html)를 이용하여 조사한 결과, 나팔꽃 (Ipomoea nil)의 putative orange 유전자와 97%의 가장 높은 상동성을 보였으며, 그외에도 토마토 (Lycopersicon esculentum)의 putative orange 유전자, 포도 (Vitis vinifera) 유전자, 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 At5g61670 유전자, 꽃양배추 (Brassica oleracea var. botrytis)의 유전자와 73~80%의 상동성을 보였다 (도 2 및 도 3).

< 실시예 2> IbOrange 유전자의 고구마 품종별, 조직별 발현 분석

본 발명의 IbOrange 유전자의 고구마 품종별, 조직별 발현 양상을 분석하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. QIAGEN사의 RNeasy Mini Kit를 이용하여 total RNA를 분리하고 Invitrogen 사의 RT-PCR 용 SuperScript III First-Strand Synthesis System을 이용하여 first cDNA를 합성하였다. 사용된 프라이머의 염기서열은 (정방향: 5'-atcttgtcgctctcgtcctccacgacgccg-3'(서열번호 7), 역방향: 5'-cgtgggtcatgctcgcttgccatagccatc-3'(서열번호 8))이다.

그 결과, IbOrange 유전자는 미색 고구마인 율미(Ym), 자색 고구마인 신자미(Jm), 황색 고구마인 신황미 (Hm)의 모든 품종에서 발현되는 것을 확인하였다 (도 4). 또한, 식물체의 조직별 분석에서 IbOrange 유전자는 식물체 전반에 걸쳐 고르게 발현되고, 특히 잎 (leaf) 과 실뿌리(fibrous root)에서 강하게 발현되는 양상을 보였다 (도 5). 따라서, IbOrange 유전자는 품종 여부에 관계없이 식물체 전반에 걸쳐 고르게 발현되는 유전자임을 알 수 있었다.

< 실시예 3> 다양한 식물 호르몬 처리에 의한 IbOrange 유전자의 발현 분석

본 발명의 IbOrange 유전자의 건조 스트레스와 식물 방어 기작에 관련되는 ABA, 에테폰, 메틸 자스모네이트, 살리실산 등의 식물 호르몬에 의한 발현 양상을 조사하기 위해, 각 호르몬의 처리 후 시간대 (0, 12, 24, 36, 48 시간) 별로 상기 실시예 1과 2에서 수행한 방법으로 RNA를 분리한 후 cDNA를 각각 합성하였다. 상기 실시예 2에서 사용한 IbOrange 유전자 특이적 프라이머로 RT-PCR를 수행하였다. 그 결과, IbOrange 유전자는 다음과 같은 발현 양상을 보였다. ABA; 잎에서는 뚜렷한 변화가 없으나 뿌리에서 36시간 후에 IbOrange 유전자가 강하게 발현하는 것을 보여준다. 에테폰; 잎과 뿌리에서 처리 후 36시간에 IbOrange 유전자의 발현이 유도되는 것을 보여주는데, 특히 잎에서 보다 강하게 발현되는 것을 알 수 있다. 메틸 자스모네이트; 잎의 경우 처리 후 12시간부터 IbOrange 유전자의 발현이 강하게 유도되어 36시간까지 지속되는 것을 보여주고 있고 뿌리에서는 24시간부터 약하게 증가하다가 36시간에 강하게 발현되는 것을 보여준다. 살리실산; 잎과 뿌리 전반에 걸쳐 큰 변화는 없으나 잎에서 처리 후 12시간부터 36시간까지 IbOrange 유전자의 발현이 약하게 증가하는 것을 볼 수 있었다 (도 6).

일반적으로 건조 스트레스 하에서는 식물호르몬인 ABA의 양이 증가하며 ABA가 건조에 대응하여 식물의 기공 개폐를 조절하는 것으로 알려져 있다. 한편 카로티노이드는 ABA의 전구물질로서 건조 스트레스에 의한 ABA의 증가는 카로티노이드의 증가와 직접적인 관련이 있을 것으로 생각된다. 따라서 본 실험에서의 ABA 처리에 의한 IbOrange 유전자의 발현증가는 건조 스트레스와 IbOrange와의 상관관계를 잘 보여주고 있다.

< 실시예 4> IbOrange 유전자의 대장균 발현을 통한 단백질 생성 확인

IbOrange 유전자가 실제로 원하는 크기의 단백질을 생성하는지를 확인하기 위해, IbOrange 유전자의 코딩부분을 pDONR207 벡터에 클로닝하여 히스티딘 친화성 태그 (histidine affinity tag)와 글루타치온-S-트랜스퍼라아제 (GST) 융합 단백질이 있는 발현벡터 pDEST 17과 pDEST 15에 도입하였다. 이 발현 벡터를 대장균 발현균주 (BL21 DE3)에 형질전환하여 IPTG로 orange 단백질의 발현을 유도하였다. 대장균의 단백질을 추출하여 SDS-PAGE 젤 분석을 통하여 확인한 결과, 34kDa의 히스티딘 태그가 붙어 있는 재조합 단백질과 57kDa의 GST-융합 단백질의 생성을 확인할 수 있었다 (도 7). 따라서, 본 발명에서 클로닝된 IbOrange 유전자가 orange 단백질을 코딩하는 유전자임을 다시 한번 확인시켜 주었다.

그러므로, 본 발명의 IbOrange 유전자를 통하여 카로티노이드 함량을 높임으로써 기능성 향상뿐만 아니라 환경 스트레스에 내성이 강한 식물체 개발에 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 본다.

도 1은 본 발명의 고구마 (품종 신황미) 유래 IbOrange 유전자의 염기서열과 이로부터 추론한 아미노산 서열을 나타낸 그림이다. 밑줄 친 부분은 plastid localization signal 이며, 전체 942 bp의 cDNA가 313 아미노산을 코딩하고 있다.

도 2는 본 발명의 고구마 (Ipomoea batatas) IbOrange 유전자의 추론된 단백질의 아미노산 서열과 여러 식물(나팔꽃,토마토, 포도, 콩, 대두, 목화, 애기장대, 꽃양배추, 단수수, 옥수수, 벼, 보리)의 orange 유전자 아미노산 서열을 비교한 그림이다.

도 3은 본 발명의 IbOrange 유전자의 추론된 단백질의 아미노산 서열과 여러 식물(나팔꽃,토마토, 포도, 콩, 대두, 목화, 애기장대, 꽃양배추, 단수수, 옥수수, 벼, 보리)의 orange 유전자 사이의 유연 관계를 나타낸 그림이다.

도 4는 고구마 품종별로 본 발명의 IbOrange 유전자가 발현하는 양상을 RT-PCR을 수행하여 전기영동한 사진이다. Ym; 율미, Jm; 신자미, Hm; 신황미.

도 5는 고구마의 부위별로 본 발명의 IbOrange 유전자가 발현하는 양상을 RT-PCR을 수행하여 전기영동한 사진이다. L, leaf (잎); S, stem (줄기); storage roots (저장뿌리); fibrous roots (실뿌리); thick pigmented roots (굵은 뿌리).

도 6은 고구마 잎과 뿌리에 식물호르몬인 ABA, 에틸렌의 전구물질인 에테폰, 메틸 자스모네이트(MeJA), 살리실산(SA)를 처리 후 0, 12, 24, 36, 48 시간째 본 발명의 IbOrange 유전자의 발현양상을 RT-PCR을 수행하여 전기영동한 사진이다.

도 7은 대장균을 이용하여 IbOrange 유전자의 재조합 단백질 생산을 보여주 는 단백질 전기영동 사진이다. 레인 1; His-tag를 갖는 가용성 IbOrange, 레인 2; His-tag를 갖는 불용성 IbOrange, 레인 3; GST-tag를 갖는 가용성 IbOrange, 레인 4; GST-tag를 갖는 불용성 IbOrange.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> IbOrange gene involved in carotenoid accumulation from Ipomoea batatas <130> PN08125 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 942 <212> DNA <213> Ipomoea batatas <400> 1 atggtatatt caggtagaat cttgtcgctc tcgtcctcca cgacgccgtt tcatctctcc 60 acttcgccgt tccacagttc ccggtatcat ctccatggaa ggctcaaatc cagagtcaga 120 ttgcgtccta tggccgccga tgccgattcc tcctcctttt cttcatccgt cgacaccgaa 180 gcacccgata aaaacgcagc cgggttttgt attatagaag ggcctgagac agtgcaggac 240 tttgctcaaa tggaattgaa agaaattcaa gacaatattc ggagtcgccg gaataaaata 300 tttttgcata tggaagaggt tcgtaggctg agaatacagc aacgaattaa gaatgctgag 360 cttgggaatc ttaatgaaaa gcaagaaaat aaacttccga attttccttc gttcattcct 420 tttttgcctc ctctgacatc cgcaaatctt aaacaatatt atgccacttg tttctctctc 480 atagccggag ttatgctttt tggcggactg ctagcaccta ctttggaact aaaattgggc 540 ttaggaggta catcgtacgc tgatttcatt cgcagcatgc accttccgat gcaattaagt 600 gatgtggacc ccattgtggc gtccttctcc ggtggagcag tcggggtaat ctctgccttg 660 atggtagttg aaataaacaa tgtgaaacag caggagcata agaggtgcaa gtactgttta 720 ggaacagggt atcttgcatg tgctcgctgt tcaagcactg gatcactagt ccttatcgaa 780 cctgtctcca cagttaatcg tggagatcag ccactatcac cacctaaaac agaaagatgc 840 acaaactgct cgggttcagg gaaggtcatg tgccctacat gtctttgtac tgggatggct 900 atggcaagcg agcatgaccc acgaattgac ccatttgatt aa 942 <210> 2 <211> 313 <212> PRT <213> Ipomoea batatas <400> 2 Met Val Tyr Ser Gly Arg Ile Leu Ser Leu Ser Ser Ser Thr Thr Pro 1 5 10 15 Phe His Leu Ser Thr Ser Pro Phe His Ser Ser Arg Tyr His Leu His 20 25 30 Gly Arg Leu Lys Ser Arg Val Arg Leu Arg Pro Met Ala Ala Asp Ala 35 40 45 Asp Ser Ser Ser Phe Ser Ser Ser Val Asp Thr Glu Ala Pro Asp Lys 50 55 60 Asn Ala Ala Gly Phe Cys Ile Ile Glu Gly Pro Glu Thr Val Gln Asp 65 70 75 80 Phe Ala Gln Met Glu Leu Lys Glu Ile Gln Asp Asn Ile Arg Ser Arg 85 90 95 Arg Asn Lys Ile Phe Leu His Met Glu Glu Val Arg Arg Leu Arg Ile 100 105 110 Gln Gln Arg Ile Lys Asn Ala Glu Leu Gly Asn Leu Asn Glu Lys Gln 115 120 125 Glu Asn Lys Leu Pro Asn Phe Pro Ser Phe Ile Pro Phe Leu Pro Pro 130 135 140 Leu Thr Ser Ala Asn Leu Lys Gln Tyr Tyr Ala Thr Cys Phe Ser Leu 145 150 155 160 Ile Ala Gly Val Met Leu Phe Gly Gly Leu Leu Ala Pro Thr Leu Glu 165 170 175 Leu Lys Leu Gly Leu Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Phe Ile Arg Ser 180 185 190 Met His Leu Pro Met Gln Leu Ser Asp Val Asp Pro Ile Val Ala Ser 195 200 205 Phe Ser Gly Gly Ala Val Gly Val Ile Ser Ala Leu Met Val Val Glu 210 215 220 Ile Asn Asn Val Lys Gln Gln Glu His Lys Arg Cys Lys Tyr Cys Leu 225 230 235 240 Gly Thr Gly Tyr Leu Ala Cys Ala Arg Cys Ser Ser Thr Gly Ser Leu 245 250 255 Val Leu Ile Glu Pro Val Ser Thr Val Asn Arg Gly Asp Gln Pro Leu 260 265 270 Ser Pro Pro Lys Thr Glu Arg Cys Thr Asn Cys Ser Gly Ser Gly Lys 275 280 285 Val Met Cys Pro Thr Cys Leu Cys Thr Gly Met Ala Met Ala Ser Glu 290 295 300 His Asp Pro Arg Ile Asp Pro Phe Asp 305 310 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 3 atggtatatt caggtagaat cttgtcgctc 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 4 ttaatcaaat gggtcaattc gtgggtcatg 30 <210> 5 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 5 caaaaaagca ggctnnatgg tatattcagg tagaatcttg tcgctc 46 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 6 caagaaagct gggtnttaat caaatgggtc aattcgtggg tcatg 45 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 7 atcttgtcgc tctcgtcctc cacgacgccg 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 8 cgtgggtcat gctcgcttgc catagccatc 30

Claims (8)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 고구마 (Ipomoea batatas) 유래의 IbOrange 단백질.
2. 제1항의 IbOrange 단백질을 코딩하는 유전자.
3. 제1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
4. 제1항에 있어서, 상기 유전자는 ABA, 에테폰, 메틸 자스모네이트, 또는 살리실산에 의해 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는 유전자.
5. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
6. 제5항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
7. 제6항에 있어서, 대장균인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
8. 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어진, IbOrange 유전 자 증폭용 프라이머 세트.

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