KR101478112B1

KR101478112B1 - 흑반병 저항성을 증가시키는 고구마 ＩｂＯｒ-Ｉｎｓ 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101478112B1
Application number: KR1020130113346A
Authority: KR
Inventors: 곽상수; 이행순; 김선하; 박성철; 정재철
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2012-10-12
Filing date: 2013-09-24
Publication date: 2014-12-31
Also published as: KR20140047528A

Abstract

본 발명은 흑반병 저항성을 증가시키는 고구마 유래의 IbOr - Ins 유전자 변이체 및 이의 용도에 관한 것으로, 고구마 유래의 IbOrange 유전자에 특정 염기서열을 인위적으로 삽입한 IbOr - Ins 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 고구마 식물체는 흑반병에 대해 강한 저항성을 나타내므로, IbOr - Ins 유전자 변이체를 이용하여 곰팡이 및 진균에 의해 발생하는 병해에 내성을 갖는 식물체를 개발할 수 있다.

Description

흑반병 저항성을 증가시키는 고구마 ＩｂＯｒ-Ｉｎｓ 유전자 및 이의 용도 {IbOr-Ins gene increasing black rot resistance from Ipomoea batatas and uses thereof}

본 발명은 흑반병 저항성을 증가시키는 고구마 IbOr - Ins 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 고구마 유래의 IbOrange 유전자에 특정 염기서열을 인위적으로 삽입한 IbOr - Ins 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 IbOr - Ins 유전자 변이체를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 흑반병 저항성을 증가시키는 방법, 상기 IbOr - Ins 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 IbOr - Ins 유전자 변이체를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 흑반병 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 및 상기 IbOr - Ins 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 흑반병 저항성 증가용 조성물에 관한 것이다.

고구마 (Ipomoea batatas L. Lam)는 매년 135백만 톤 이상 생산되는 대표적인 뿌리작물로서 다양해진 식생활 변화와 생활수준의 향상으로 기능성 식품에 대한 소비자의 요구가 증대되면서 새로운 건강식품으로서 재조명 되고 있다. 고구마 잎과 잎자루는 비타민 B와 C, 칼슘, 철 등 보통의 곡물에 없는 성분을 함유하고 있으며 다양한 폴리페놀을 함유하고 있어 채소로서의 이용가치가 높고, 고구마 저장뿌리는 수분을 제외한 대부분이 에너지공급원인 탄수화물로 좋은 에너지원이 된다.

고구마는 1990년대 이후 아그로박테리움 공동배양을 통한 형질전환이 시도되었고, 정단 및 측아 분열조직으로부터 배 발생 배양세포 유도 및 체세포배 발생을 통한 식물체 형질전환 및 재분화 시스템을 발전시켜왔다 (Lim et al ., Mol Breeding 19, 227-239, 2007). 최근 고구마의 항산화효소 유전자 SOD (superoxide dismutase)와 APX (ascorbate peroxidase)를 발현시켜 내냉성, 내건성 등 환경 스트레스에 내성을 지닌 형질전환 고구마와 NDPK2를 과발현시켜 복합환경 스트레스에 내성을 지닌 고구마와 감자가 개발되었다 (Kim et al ., Mol Breeding 24, 233-244, 2009). 그러나 아직 카로티노이드, 안토시아닌, 폴리페놀과 같은 저분자 항산화 물질을 고생산하는 고구마는 보고된 바가 없다. 따라서 복합 스트레스 내성을 가지고 저분자 항산화 물질까지 고생산하는 작물 개발은 21세기 인류가 당면한 식량, 에너지, 환경문제를 해결하는데 기여할 수 있을 것으로 사료된다.

고구마의 대표적인 병충해로서 고구마 바구미 (weevil)와 흑반병은 고구마에 심각한 피해를 준다. 이처럼 식물은 세균, 곰팡이, 곤충 및 바이러스와 같은 다양한 병원균에 의해 병에 걸릴 수 있으며, 식물병 발생에 의해 전체 작물 생산량의 12% 정도가 감소한다. 식물 형질전환을 이용하여 식물병을 방제하기 위한 시도로서 바이러스 외피 단백질 (coat protein) 및 바실러스 튜린지엔시스 (Bacillus thuringiensis)로부터 분리한 살충성 단백질 (insecticidal protein)의 발현을 통해 바이러스와 곤충을 방제하고자 하는 시도가 있었다. 그러나 박테리아나 곰팡이가 일으키는 병에 대한 방제는 스트렙토마이신 같은 항생제 및 구리를 포함하는 농업 화학물질 같은 살균제에 국한되어왔다. 최근 보리의 티오닌 (thionin) 유전자를 고구마에서 과발현시킨 경우 흑반병에 저항성을 보인다는 연구 결과가 발표되었으나, 아직까지 고구마 유래의 유전자를 이용하여 식물병을 방제하기 위한 시도는 미흡한 수준이다 (Muramoto N. et al ., Plant Cell Rep . 31(6):987-997, 2012).

전 세계적으로 고구마 생산량에 큰 손실을 주는 주요한 병해 중 하나인 흑반병 (black rot; Ceratocystis fimbriata Ellis & Halst)은 곰팡이가 일으키는 병해로서 저장뿌리에 많이 발생하여 생산량뿐만 아니라 상품성에 큰 영향을 미친다. 병원균은 후막포자, 분생포자 또는 자낭포자를 형성하고, 균사의 형태로 땅속이나 병든 저장뿌리에서 월동하여 다음해에 1차 전염원이 되며, 바람에 날린 분생포자에 의하여 2차 전염이 일어난다. 이 병원균은 보통 병든 괴근에서 묘로, 묘에서 본포로 전반하여 병을 일으키는데, 토양 내에 존재하는 거세미의 유충, 풍뎅이 등의 곤충 또는 동물에 의한 식흔 부위에서 발병이 잘된다. 이 병의 감염은 10~34℃에서 일어나며, 발병 최적온도는 23~27℃이다. 이 병은 씨 고구마뿐만 아니라 생육기에도 발생하는 고구마의 병해로서 병증은 어린모·줄기·저장뿌리에 나타나며, 어린모의 줄기가 흑변하고 병증이 심해지면 잎이 황변한다. 특히, 피해가 심한 곳은 저장뿌리이며, 병원균이 침입하면 덩이뿌리의 표면에 원형의 병반이 나타나고, 속에도 흑변이 일어나 저장뿌리가 썩게 된다. 발병된 저장뿌리를 가축사료로 쓰면 가축이 중독증세를 일으키므로 사료로 써서는 안 된다. 방제법으로는 저항성 품종을 재배하거나 씨 고구마를 살균제로 소독하여 재배하는 방법이 있으나 방제가 쉽지 않다 (Clark, C. A. et al., APS press, 6:74, 1988).

한편, 한국공개특허 제2011-0138290호에는 '생물적 및 비생물적 스트레스에 대한 증가된 저항성을 나타내는 유전자 도입 식물 및 이를 생산하는 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0990330호에는 '고구마 유래의 카로티노이드 축적에 관련된 IbOrange 유전자'가 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이 흑반병 저항성을 증가시키는 고구마 IbOr - Ins 유전자 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 고구마 유래의 카로티노이드 축적에 관련된 IbOrange 유전자에 특정 염기서열을 인위적으로 삽입한 IbOr - Ins 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터를 형질전환시킨 고구마 식물체를 제조하였고, 형질전환 식물체가 야생형 식물체에 비해 흑반병에 대한 저항성이 증가하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 고구마 유래의 IbOrange 유전자에 특정 염기서열을 인위적으로 삽입한 IbOr - Ins 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 IbOr - Ins 유전자 변이체를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 흑반병 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 IbOr - Ins 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 IbOr - Ins 유전자 변이체를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 흑반병 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 흑반병 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 IbOr - Ins 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 흑반병 저항성 증가용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 고구마 유래의 IbOrange 유전자에 특정 염기서열을 인위적으로 삽입한 IbOr - Ins 유전자 변이체가 형질전환된 식물체는 흑반병에 대해 강한 저항성을 나타내므로, IbOr - Ins 유전자 변이체를 이용하여 곰팡이에 의해 발생하는 흑반병 및 다른 진균들에 의해 발생하는 병해에도 내성을 갖는 식물체를 개발할 수 있으며, 작물의 생산성 증대에도 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 고구마 유래의 IbOrange 유전자에 특정 염기서열을 인위적으로 삽입한 IbOr - Ins 유전자 변이체를 포함하는 식물 발현 벡터를 나타낸 것이다.
도 2는 IbOr - Ins 유전자 변이체를 과발현시킨 고구마 잎에 흑반병 포자 현탁액을 접종한 후 병징의 발달을 나타낸 것이다 (Szm: 야생형 대조구 식물체, EV: 빈 벡터로 형질전환된 대조구 식물체, #1 및 #15: IbOr - Ins 유전자 과발현 식물체).
도 3은 고구마 유래의 IbOrange 유전자 변이체인 IbOr - Ins 유전자 변이체를 과발현시킨 고구마 저장뿌리에서 흑반병 포자 현탁액 접종 후 병징의 발달을 나타낸 것이다. (Szm: 비형질전환 대조구 식물체, EV: 빈 벡터로 형질전환된 대조구 식물체, #1, #15: IbOr-Ins 유전자 과발현 식물체).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 고구마 유래의 IbOrange 유전자에 특정 염기서열을 인위적으로 삽입한 IbOr-Ins 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 IbOr -Ins 유전자 변이체를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 흑반병 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명에서는 상기 고구마 유래의 IbOrange 유전자의 아미노산 서열 내의 133번째 아미노산에 KSQNPNL 아미노산을 삽입하여 IbOr - Ins 유전자 변이체를 제조하였으나, 흑반병에 대한 저항성을 증가시킬 수 있는 변이체이면 특별히 제한되지 않는다. 상기 고구마 유래의 IbOrange 유전자에 특정 염기서열을 인위적으로 삽입한 IbOr - Ins 유전자 변이체는 고구마의 카로티노이드 축적에 관련되며, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 IbOr - Ins 유전자 변이체 서열은 재조합 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 재조합 벡터는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 벡터, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다.

IbOr - Ins 유전자 변이체 각각의 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-DNA 영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 (binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터 또는 Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성 (constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제 (NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터, 파세올린 (phaseoline) 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트 (glyphosate) 또는 포스피노트리신 (phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신 (kanamycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol), G418, 블레오마이신 (Bleomycin)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이며, 더욱 바람직하게는 고구마이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법 (Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol . Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법 (Shillito R.D. et al., 1985 Bio / Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미 주사법 (Crossway A. et al., 1986, Mol . Gen . Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법 (Klein T.M. et al ., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 (EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 고구마 유래의 IbOrange 유전자에 특정 염기서열을 인위적으로 삽입한 IbOr - Ins 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 IbOr - Ins 유전자 변이체를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 흑반병 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

상기 IbOr - Ins 유전자 변이체는 IbOrange 유전자에 KSQNPNL 아미노산을 삽입하여 제조되었으며, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같다.

상기 식물체는 고구마, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두, 애기장대 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수 수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 고구마이다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 고구마 유래의 IbOrange 유전자에 특정 염기서열을 인위적으로 삽입한 IbOr - Ins 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 흑반병 저항성 증가용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 IbOr - Ins 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환함으로써 식물체의 흑반병 저항성을 증가시킬 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. IbOr - Ins 유전자 변이체의 클로닝

IbOr - Ins 유전자 변이체를 클로닝하기 위하여 고구마 유래의 IbOrange 유전자를 주형으로 오버랩핑 (overlapping) PCR을 수행하여 IbOrange 유전자의 특정 염기서열에 인위적인 돌연변이를 수행하였다. IbOrange 유전자가 코딩하는 아미노산 서열 내의 133번 아미노산부터 -KSQNPNL-로 추정되는 염기서열을 삽입하기 위하여 PCR 프라이머를 제작하였다. 염기서열은 정방향 프라이머 (5'- gaaaagcaagaaaataaacttaaatcccagaaccctaac -3' (서열번호 2) 및 역방향 프라이머 5'- aagatttgcggatgtcaggttagggttctgggatttaag -3' (서열번호 3)이다. 이를 이용하여 약 921bp의 PCR 산물을 얻어 pGEM-T-vector에 클로닝한 후 서열 분석을 통하여 133번 아미노산부터 -KSQNPNL-로 삽입된 돌연변이를 확인하였다. Clontech의 advantage2 중합효소를 이용하여 PCR을 수행하였고, 예상 크기의 PCR 산물을 pGEMTeasy 클로닝 벡터 (Promega)를 이용하여 클로닝한 후, 서열 분석하여 전체 염기서열을 확인하였다. 이 cDNA 유전자의 이름을 IbOr - Ins (서열번호 1)라고 명명하였다. 본 발명의 IbOr - Ins 유전자의 전체 길이는 924 bp로 307개의 아미노산을 코딩하고 있다.

Invitrogen의 gateway 발현 시스템을 이용하기 위해 IbOr - Ins 유전자 변이체의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 5' 말단에 어댑터 서열 (대문자 표기)을 각각 추가하였다. 염기서열은 정방향 프라이머 5'- CAAAAAAGCAGGCTNNatggtatattcaggtagaatcttgtcgctc -3' (서열번호 4) 및 역방향 프라이머 5'- CAAGAAAGCTGGGTNttaatcaaatgggtcaattcgtgggtcatg -3' (서열번호 5)이다. 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였고, 예상 크기의 PCR 산물을 pGEMTeasy 클로닝 벡터 (Promega)를 이용하여 클로닝한 후, 서열 분석하여 전체 염기서열을 확인하였다. IbOr - Ins 유전자가 클로닝되어 있는 pGEMTeasy 벡터를 BP 반응시켜 유전자를 pDONR207 벡터에 클로닝하였다. 이후 pDONR207와 식물발현 벡터인 pGWB11 벡터를 LR 반응으로 클로닝한 IbOr - Ins 유전자의 식물발현 벡터를 제작하였다 (도 1).

실시예 2: IbOr - Ins 유전자 변이체로 형질전환된 고구마 잎의 흑반병 저항성

대조구인 야생형 고구마 신자미와 빈 벡터 및 IbOr - Ins를 각각 형질전환한 고구마의 정단부에서 3~4번째 잎을 흑반병 포자 현탁액 (1 x 10⁵spores/ml)에 2분 동안 침지한 후 습윤한 상태로 26℃ 광 조건에서 배양하였다. 흑반병 포자 현탁액 처리 7일 후의 잎에 나타나는 병징의 변화는 image J 프로그램으로 측정하였으며, 전체 잎 면적에서 병징이 나타난 면적을 뺀 나머지 녹색 부분의 잎 면적을 계산하였다. 그 결과 대조구인 신자미와 빈 벡터를 형질전환한 신자미 잎의 경우 부분적 및 전체적으로 노란색 병반이 나타났으나, IbOr - Ins 형질전환체들은 병징이 나타나지 않았다 (도 2).

실시예 3: IbOr - Ins 형질전환 고구마 저장뿌리에서 흑반병 저항성

대조구인 신자미와 빈 벡터 및 IbOr-Ins를 형질전환한 고구마의 저장뿌리에 지름 1cm의 펀치를 이용하여 상처를 내어 흑반병 포자 현탁액 (1 X 10⁵spores/ml)을 100ul씩 접종하여 습윤한 상태로 26℃ 암조건에서 배양하였다. 처리 전 및 처리 후 4일 후에 상처부위에 나타나는 병징의 변화를 관찰하였다. 그 결과 대조구인 신자미와 빈 벡터를 형질전환한 신자미의 경우 접종부위부터 수침상의 흑반병반이 많이 진전됨을 확인하였으나 형질전환체들은 병징이 대조구와 비교하여 진전되지 않았다 (도 3).

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> IbOr-Ins gene increasing black rot resistance from Ipomoea batatas and uses thereof <130> PN13312 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 924 <212> DNA <213> Ipomoea batatas <400> 1 atggtatatt caggtagaat cttgtcgctc tcgtcctcca cgacgccgtt tcatctctcc 60 acttcgccgt tccacagttc ccggtatcat ctccatggaa ggctcaaatc cagagtcaga 120 ttgcgtccta tggccgccga tgccgattcc tcctcctttt cttcatccgt cgacaccgaa 180 gcacccgata aaaacgcagc cgggttttgt attatagaag ggcctgagac agtgcaggac 240 tttgctcaaa tggaattgaa agaaattcaa gacaatattc ggagtcgccg gaataaaata 300 tttttgcata tggaagaggt tcgtaggctg agagtacagc aacgaattaa gaatgctgag 360 cttgggattc ttaatgaaaa gcaagaaaat aaacttaaat ccccgaaccc taacctgaca 420 tccgcaaatc ttaaacaata ttatgccact tgtttctctc tcatagccgg agttatgctt 480 tttggcggac tgctagcacc tactttggaa ctaaaattgg gcttaggagg tacatcgtac 540 gctgatttca ttcgcagcat gcaccttccg atgcaattaa gtgatgtgga ccccattgtg 600 gcgtccttct ccggtggagc agtcggggta atctctgcct tgatggtagt tgaaataaac 660 aatgtgaaac agcaggagca taagaggtgc aagtactgtt taggaacagg gtatcttgca 720 tgtgctcgct gttcaagcac tggatcacta gtccttatcg aacctgtctc cacagttaat 780 cgtggagatc agccactatc accacctaaa acagaaagat gcacaaactg ctcgggttca 840 gggaaggtca tgcgccctac atgtctttgt actgggatgg ctatggcaag cgagcatgac 900 ccacgaattg acccatttga ttaa 924 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 gaaaagcaag aaaataaact taaatcccag aaccctaac 39 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 aagatttgcg gatgtcaggt tagggttctg ggatttaag 39 <210> 4 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 caaaaaagca ggctnnatgg tatattcagg tagaatcttg tcgctc 46 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 caagaaagct gggtnttaat caaatgggtc aattcgtggg tcatg 45

Claims

서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 고구마 유래의 IbOrange 유전자에 특정 염기서열을 인위적으로 삽입한 IbOr - Ins 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 IbOr - Ins 유전자 변이체를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 흑반병 저항성을 증가시키는 방법.
서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 고구마 유래의 IbOrange 유전자에 특정 염기서열을 인위적으로 삽입한 IbOr - Ins 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 IbOr - Ins 유전자 변이체를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 흑반병 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
제2항의 방법에 의해 제조된 흑반병 저항성이 증가된 형질전환 식물체.
제3항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
제3항에 있어서, 상기 식물체는 고구마 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
제3항에 따른 형질전환 식물체의 종자.
서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 고구마 유래의 IbOrange 유전자에 특정 염기서열을 인위적으로 삽입한 IbOr - Ins 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 흑반병 저항성 증가용 조성물.