KR101376961B1 - 대두 유래의 GmC3H9 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

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이재헌
정은숙
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Abstract

본 발명은 대두 유래의 GmC3H9 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 식물체에서 대두 유래의 GmC3H9 유전자 과발현은 식물체의 염분 및 삼투 스트레스와 같은 환경 스트레스에 대한 저항성을 증가시키므로, 식물체에서 GmC3H9 유전자의 발현 조절을 통해 비생물적 환경 스트레스 저항성이 증가하여 생산성이 향상된 형질전환 식물체를 개발할 수 있다.

Description

대두 유래의 GmC3H9 유전자 및 이의 용도 {GmC3H9 gene from Glycine max and uses thereof}
본 발명은 대두 유래의 GmC3H9 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 대두 (Glycine max) 유래의 환경 스트레스 저항성 관련 GmC3H9 (Glycine max C3H-type zinc finger protein 9) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 GmC3H9 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증진시키는 방법, 상기 재조합 벡터를 이용한 야생형에 비해 환경 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 및 대두 유래의 GmC3H9 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 환경 스트레스 저항 증진용 조성물에 관한 것이다.
모든 살아있는 유기체는 일생동안 생물적 및 비생물적 스트레스에 지속적으로 노출되어 있으며, 식물은 고착성 생물체로 다양한 스트레스를 피할 수 없기 때문에 다른 생물체보다 스트레스에 더 많은 영향을 받게 된다. 이러한 식물 병원균, 한발, 고농도의 염, 저온 및 고온과 같은 다양한 환경 스트레스는 식물의 성장을 저해하고 많은 중요한 농업분야에서 수확물의 생산성을 제한하는 요소 중 하나로 작용한다. 식물이 고농도의 염, 고온, 저온 및 한발 등의 환경 스트레스에 노출되면, 식물 병, 세포 내 삼투압 불균형 또는 이온 불균형이 발생하게 되어 식물의 생장 및 광합성이 저해된다. 식물은 이러한 환경 스트레스로부터 자신을 보호하기 위해 환경 스트레스 방어 및 감응을 위한 정교한 네트워크를 발달시켰으며 (Yang Y. et al ., Genes Dev . 11, 1621-1639, 1997), 환경 자극을 빠르게 인식하고 반응하는 메커니즘을 진화적으로 발달시켜 왔다. 즉, 식물은 생육에 부적합한 환경에 처하게 되면 그들의 형태를 조절하거나 생리적 대사과정을 조절함으로써 환경에 적응하여 생존하고자 하는 경향이 있다.
식물의 성장을 저해하는 환경 스트레스 있어서 가장 가혹한 스트레스는 탈수, 고염 및 추위 등 다양한 외부 조건에 의해서 야기되는 삼투 스트레스 (osmotic stress)이다. 삼투 스트레스에 대한 저항성은 약간만 증가해도 농업 생산성과 수율에 막대한 영향을 미칠 수 있기 때문에, 삼투 스트레스에 대한 조절 기작과 이에 관련된 유전자 기능 분석에 대해 많은 연구가 진행되어 왔다. 이러한 삼투 스트레스에 적응하기 위한 기작을 이해하기 위해 특정한 스트레스에 의해 발현이 유도되는 다수의 유전자들이 분리되었고, 그 특성이 광범위하게 연구되고 있다. 그러나 삼투 스트레스에 관련된 대두 유래의 유전자에 대해서는 연구가 더 필요한 실정이다.
식물의 병 저항성 반응 또는 환경적 스트레스에 대한 내성을 가지는 식물의 방어관련 기작 연구는 지금까지 알려져 있지 않은 생체 내 기작을 규명하는 과학 기술적 가치를 지닌다. 또한 식물방어관련 유전자의 정보는 작물의 분자적 유전 육종의 직접적 재료로서 제공될 수 있을 뿐 아니라 전통적 유전 육종에도 사용될 수 있는 장점을 지니고 있다.
환경친화적 식량생산의 측면에서 병 방어 관련 다양한 유전자, 또는 이들 형질을 이용한 작물 개발은 경제적으로 중요한 병원체, 잡초, 그리고 환경적 스트레스에 의한 손실을 최소화함으로써 식량생산비용을 줄일 수 있으며, 고품질의 식량을 제공하여 농산물의 경쟁력 회복에 기여함과 동시에 신품종의 개발과 연관된 다양한 산업의 활성화에 기여할 수 있을 것이다.
한편, 한국등록특허 제0599824호에는 '콩 유래 신규 스트레스 저항성 단백질, 이를 코딩하는 유전자 및 그 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0921744호에는 '콩으로부터 분리한 고온 저항성 유도 유전자'가 개시되어 있으며, 한국등록특허 제0742194호에는 '환경 스트레스 저항성 조절 유전자를 이용하여 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 방법'이 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이 대두 유래의 환경 스트레스 저항성 관련 GmC3H9 유전자 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 대두 (Glycine max) 유래의 GmC3H9 (Glycine max C3H-type zinc finger protein 9) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 식물체에서 염분 스트레스 및 삼투 스트레스에 대한 저항성이 야생형에 비해 증진되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 대두 (Glycine max) 유래의 환경 스트레스 저항성 관련 GmC3H9 (Glycine max C3H-type zinc finger protein 9) 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 환경 스트레스 저항성 관련 GmC3H9 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 GmC3H9 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 이용한 야생형에 비해 환경 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 대두 유래의 GmC3H9 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 환경 스트레스 저항 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 대두 유래의 GmC3H9 유전자는 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증진시키므로, 식물체에서 GmC3H9 유전자의 발현 조절을 통해 환경 스트레스 저항성이 증가하여 생산성이 향상된 형질전환 식물체를 제공할 수 있다. 또한, GmC3H9 유전자를 적용시킨 경제 작물은 간척지 또는 사막화된 불모지 등 척박한 자연환경에서도 재배 환경을 극복하고 수확량을 증대시킬 수 있으므로, 농업 및 종자 산업의 발전에 유용할 것으로 기대된다.
도 1은 대두로부터 분리한 GmC3H9 유전자의 cDNA 염기서열을 나타낸다.
도 2는 GmC3H9 유전자의 cDNA 염기서열로부터 연역된 아미노산 서열을 나타낸다.
도 3은 GmC3H9 유전자의 발현 양상을 알아보기 위해, ABA (100 μM), 건조 (Dehydration), 저온 (4℃) 및 고염 (100 mM NaCl) 스트레스를 처리한 대두 잎으로부터 총 RNA를 분리하여 실시간 정량 RT-PCR을 수행한 결과이다.
도 4는 식물 형질전환용 GmC3H9 과발현 벡터의 모식도이다. GmC3H9 cDNA를 식물 형질전환용 벡터 pB2GW7에 클로닝했고, 애기장대에 형질전환에 이용하였다.
도 5는 형질전환된 애기장대 잎에서 추출한 DNA로 PCR을 수행하여 형질전환 여부를 확인한 결과 (A) 및 형질전환체 잎에서 추출한 RNA로 RT-PCR을 수행하여 GmC3H9 유전자 발현 여부를 확인한 결과(B)를 나타낸다. 각각의 프라이머로 증폭된 PCR 산물은 아가로스 겔 전기영동으로 확인되었다. WT: 대조구 (야생형 식물체), 35S-GmC3H9: GmC3H9 유전자 과발현 애기장대.
도 6은 식물체의 생장을 비교하기 위해, 발아 후 10일 된 대조구 식물체 및 GmC3H9 형질전환 식물체를 염분 스트레스 (100, 150 mM NaCl), 삼투 스트레스 (200, 300 mM 만니톨) 또는 MS 배지 조건에서 10일 동안 배양한 후 촬영한 사진이다.
도 7은 발아 후 10일 된 대조구 식물체 및 GmC3H9 형질전환 식물체를 염분 스트레스 (100, 150 mM NaCl), 삼투 스트레스 (200, 300 mM 만니톨) 또는 MS 배지 조건에서 10일 동안 배양한 후 뿌리 길이를 측정하여 비교한 그래프이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 대두 (Glycine max) 유래의 환경 스트레스 저항성 관련 GmC3H9 (Glycine max C3H-type zinc finger protein 9) 단백질을 제공한다.
본 발명에 따른 GmC3H9 단백질의 범위는 대두로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 환경 스트레스 저항성을 의미한다.
본 발명은 또한 GmC3H9 단백질의 단편, 유도체 및 유사체 (analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 GmC3H9 폴리펩티드와 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (iii) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (iv) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져 있다.
서열번호 2로 표시되는 성숙(mature) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 오직 성숙 폴리펩티드만을 암호화하는 코딩 서열; 성숙 폴리펩티드 및 다양한 부가적인 코딩 서열을 암호화하는 서열; 성숙 폴리펩티드(및 임의의 부가적인 코딩 서열) 및 넌코딩 서열을 암호화하는 서열을 포함한다.
용어 "폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 부가적인 코딩 및/또는 넌코딩 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드를 말한다.
또한, 본 발명은 본원에 기재된 것과 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 유사체, 및 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이체 또는 비자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 변이체는 치환 변이체, 결실 변이체, 및 삽입 변이체를 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 폴리뉴클레오티드의 대안(alternative)이며, 이는 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드에서 실질적인 기능 변화를 초래하지는 않는다.
본 발명의 "환경 스트레스"란 식물체의 성장 또는 생산성을 저하시키는 외부적인 요인을 말하며 크게 생물학적 스트레스 (biotic stress)와 비생물적 스트레스 (abiotic stress)로 구별된다. 생물학적 스트레스 요인은 대표적으로 병원균을 들 수 있으며, 비생물학적 스트레스 요인은 고농도의 염, 건조, 저온, 고온 및 산화 스트레스 등이 포함된다. "환경 스트레스 저항성"이란 상기와 같은 환경 스트레스에 의한 식물체의 성장 저하 또는 생산성의 저하가 억제되거나 지연되는 형질을 말한다. 본 발명에 있어서, 상기 환경 스트레스는 바람직하게는 비생물적 스트레스일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 염분 스트레스 또는 삼투 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 환경 스트레스 저항성 관련 GmC3H9 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 GmC3H9 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩 (coding) 가닥 또는 넌코딩 (non-coding) 가닥일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 기재된 서열번호 1의 염기서열과 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%의 동일성을 가지는 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 스트린전트 조건하에 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명에서, "스트린전트 조건"은 (1) 0.2 × SSC, 0.1% SDS, 60℃와 같은 더 낮은 이온강도 및 더 높은 온도하에서의 혼성화 및 세척; 또는 (2) 50%(v/v) 포름아미드, 0.1% 소혈청/0.1% Ficoll 및 42℃ 등과 같은 변성제의 존재하에 혼성화; 또는 (3) 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 단지 2개의 서열 사이에서 발생하는 혼성화를 말한다. 게다가, 혼성화가 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성은 서열번호 2 표시되는 성숙 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성과 동일하다.
본 발명의 구현예에 따라, GmC3H9 유전자는 바람직하게는 대두 유래라는 것을 이해해야 한다. 그러나, 본 발명의 구현예는 대두 GmC3H9 유전자와 높은 상동성(예를 들면, 60% 이상, 즉 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 심지어 98%의 서열 동일성)을 갖고 다른 식물로부터 유래한 다른 유전자를 또한 포함한다. 서열정렬 방법, 및 서열 동일성 또는 상동성을 결정하기 위한 수단 (예를 들면, BLAST)은 당업계에 주지되어 있다.
또한, 본 발명은 상기 GmC3H9 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명의 재조합 식물 발현 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적 (transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 바이너리 벡터는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (A. tumefaciens)의 Ti 플라스미드와 함께 존재 시 식물체를 형질전환시킬 수 있는 T-DNA의 RB (right border)과 LB (left border)을 함유하는 어떤 바이너리 벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 당업계에서 자주 사용되는 pBI101(Cat#: 6018-1, Clontech, 미국), pBIN19(Genbank 수탁번호 U09365), pBI121, pCAMBIA 벡터 등을 사용하는 것이 좋다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. "재조합 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지 (phage), 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다. 진핵세포에서 이용가능한 번역 조절 요소인 인핸서 (enhancer), 리보솜 결합 부위, 종결신호, 폴리아데닐레이션 신호 및 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 상기 발현 벡터는 당업계에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성 (constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제 (NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 (phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 유전자 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트 (glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신 (Bleomycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 인간 세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물 세포 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 식물 세포가 이용될 수 있다.
본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114. 1973), 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166:557-580. 1983) 및 전기천공 방법 (Dower, W.J. et al ., Nucleic . Acids Res ., 16:6127-6145. 1988) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479.1980), 칼슘포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456. 1973), 전기천공법 (Neumann, E. et al ., EMBO J., 1:841. 1982), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al ., Gene, 10:87. 1980), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol . Cell Biol ., 5:1188-1190. 1985), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al ., Proc . Natl . Acad . Sci ., 87:9568-9572. 1990) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
또한, 본 발명은 대두 유래의 환경 스트레스 저항성 관련 GmC3H9 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 GmC3H9 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 환경 스트레스는 염분 스트레스 또는 삼투 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 유전자의 식물로의 도입은 본 발명의 유전자를 포함하는 적합한 벡터를 사용하여 이루어질 수 있으며, 본 발명의 벡터를 식물 숙주세포 내로 운반하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 유전자총-매개 형질전환 방법 (bombardment), 아그로박테리움-매개 형질전환법, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 DEAE-덱스트란 처리법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 대두 유래의 환경 스트레스 저항성 관련 GmC3H9 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 환경 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 환경 스트레스는 염분 스트레스 또는 삼투 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함할 수 있으며, 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 식물체는 고구마, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두, 애기장대 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수 수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 애기장대일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 대두 (Glycine max) 유래의 GmC3H9 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 환경 스트레스 저항 증진용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 GmC3H9 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하며, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물체에 형질전환함으로써 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시킬 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: GmC3H9 ( Glycine max C3H - type zinc finger protein 1) 유전자의 클로닝 및 발현 분석
콩 전사인자 정보는 Soybean Transcription Factor Database 웹사이트 (http://soybeantfdb.psc.riken.jp/)를 이용하였으며, 178개 C3H-타입 징크 핑거 (zinc finger) 단백질 중 비생물적 스트레스에 의해 발현이 유도되는 후보를 선발하였다. 염기서열 분석으로 GmC3H9 유전자의 전체 염기서열을 확보하였다 (도 1). 그 중 GmC3H9 (Glyma05g36110) 유전자는 총 1,062 bp로 이루어져 있으며, 두 개의 C3H 도메인인 C-X7-C-X5-C-X3-H (114-140 aa) 및 C-X5-C-X4-C-X3-H (149-172 aa)을 갖는 징크 핑거 단백질 (353 aa)을 암호화한다 (도 2).
GmC3H9의 발현은 실시간 RT-PCR을 이용하여 분석하였다 (도 3). 분석에 이용한 대두 (Glycine max) 광안콩 종자는 농촌진흥청에서 분양받았다. 대두 종자를 발아시켜 온실에서 6주 정도 키운 후 ABA 호르몬 (100 μM ABA를 식물에 스프레이함), 가뭄 (콩잎을 상온에서 말림), 저온 (4℃) 및 고염 (100 mM NaCl) 스트레스를 처리한 잎으로부터 전체 RNA를 RNA 추출 키트 (Ambion)를 이용하여 시간별로 추출하였다. 분리된 RNA를 이용하여 실시간 RT-PCR을 다음과 같이 수행하였다. 총 RNA (2 ㎍)로 cDNA를 합성하여, 각 샘플별로 제작된 cDNA를 주형으로 하우스키핑 유전자 (housekeeing gene)인 튜불린 (tubulin) 발현 및 GmC3H9 발현을 확인하였다. 튜불린 유전자의 증폭에는 정방향 5'-튜불린 프라이머 (5'-TCATCCGACACCATCGACAATG-3': 서열번호 3) 및 역방향 3'-튜불린 프라이머 (5'-CACCAAAATAGAAGCATAAT-3': 서열번호 4)를 이용하였고, GmC3H9 유전자 증폭에는 정방향 5'-GmC3H9 프라이머 (5'-TTCTCCATTATTCAAACTGT-3': 서열번호 5) 및 역방향 3'-GmC3H9 프라이머 (5'-AAAGAACTGATTGTTGAACATCTG-3': 서열번호 6)를 이용하였다. PCR은 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초의 40회 반복 및 72℃ 7분의 조건으로 수행하였다. 그 결과 GmC3H9 PCR 산물이 염분 스트레스 처리 후에 점점 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 3).
실시예 2: GmC3H9 과발현 형질전환 식물체의 제작
GmC3H9 유전자를 애기장대에서 과발현시키기 위해서 식물 발현 바이너리 벡터를 이용하였다. 상기 실시예 1에서 분리된 GmC3H9 유전자 cDNA 전체를 주형으로하여 CACC-GmC3H9 프라이머 (5'-CACCATGATGCTTGGGGAGACCC-3': 서열번호 7) 및 CACC-GmC3H9 프라이머 (5'-TCAGCGACTGACAAGCTCCGAAAC-3': 서열번호 8)로 PCR을 수행하였다. 상기 증폭된 PCR 산물 (1,065 bp)은 pENTR 벡터 (Invitrogen)에 클로닝하여 염기서열을 확인하였다. 염기서열이 확인된 pENTR-GmC3H9 플라스미드, 과발현 형질전환용 게이트웨이 (gateway) 벡터인 pB2GW7 (Plant Systems Biology) 및 LR 리콤비나아제 (Invitrogen)를 반응시켜 35S- GmC3H9 플라스미드를 제작하였다 (도 4). 동결해동법 (freeze-thaw)을 이용하여 아그로박테리움 튜머파시엔스 C58c1 균주를 35S- GmC3H9 및 pCAMBIA1301으로 형질전환하였고, 형질전환된 아그로박테리움은 꽃 침지 방법을 통한 애기장대에 형질전환에 이용하였다. 형질전환 식물체에서 얻은 종자를 1/2 MS 선택 배지 (2% 수크로스, 바스타 25 ㎍/㎖)에서 발아시켜 형질전환 식물체를 선발하였고, 선발한 각 식물체의 종자를 채취하여 다시 발아시킨 후 생장한 식물체 잎에서 게놈 DNA를 추출하였다. 상기 게놈 DNA는 CACC-GmC3H9 프라이머 (5'-CACCATGATGCTTGGGGAGACCC-3': 서열번호 7) 및 CACC-GmC3H9 프라이머 (5'-TCAGCGACTGACAAGCTCCGAAAC-3': 서열번호 8)로 PCR을 수행하여 GmC3H9 유전자의 삽입 여부를 확인하였다 (도 5A). GmC3H9 유전자 발현은 정방향 5'-GmC3H9 프라이머 (5'-TTCTCCATTATTCAAACTGT-3': 서열번호 5) 및 역방향 3'-GmC3H9 프라이머 (5'-AAAGAACTGATTGTTGAACATCTG-3': 서열번호 6)를 이용한 PCR로 확인했다. 대조구로 야생형 애기장대 식물체 (Columbia 0)를 이용했으며, 증폭된 PCR 산물은 1% 아가로스 겔 전기영동으로 확인했다 (도 5B).
실시예 3: GmC3H9 과발현 형질전환 식물체를 이용한 염분 및 삼투 스트레스 저항성 분석
GmC3H9 과발현 형질전환 식물체의 염분 및 삼투 스트레스에 대한 저항성을 분석하기 위해, 발아 후 10일 된 유묘를 무첨가 배지, 염분 (NaCl 100 mM, 150 mM) 및 만니톨 (mannitol 200 mM, 300 mM) 첨가 배지에서 10일 동안 배양하고 식물의 생장을 비교했다 (도 6, 7). 그 결과, GmC3H9를 과발현하는 형질전환 식물체는 염분 스트레스 처리하에서 대조구 식물체에 비해 뿌리 및 잎의 생장이 우수하게 나타나는 것이 확인되었다 (도 6). 더 정확한 비교를 위해 형질전환체와 대조구 식물체의 뿌리 길이를 측정한 결과, 염분 및 삼투 스트레스 처리된 GmC3H9 과발현 형질전환 식물체는 대조구보다 뿌리 길이가 월등히 길었다 (도 7).
student t-test 통계분석 결과, 형질전환체 라인 L1은 대조구와 큰 차이가 나타나지 않았으나, 나머지 라인 L2, L3 및 L4는 대조구에 비해 생장이 우수한 것으로 나타났다. 이는 라인 간의 차이인 것으로 보인다. 상기 결과에 따라 GmC3H9 유전자의 과발현은 식물체에 염분 및 삼투 스트레스에 대한 저항성을 부여한다고 판단된다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 대두 (Glycine max) 유래의 환경 스트레스 저항성 관련 GmC3H9 (Glycine max C3H-type zinc finger protein 9) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 GmC3H9 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 염분 또는 삼투 스트레스 저항성을 증진시키는 방법.
  2. 삭제
  3. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 대두 (Glycine max) 유래의 환경 스트레스 저항성 관련 GmC3H9 (Glycine max C3H-type zinc finger protein 9) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 염분 또는 삼투 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법.
  4. 삭제
  5. 제3항의 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 염분 또는 삼투 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체.
  6. 제5항에 따른 형질전환 식물체의 종자.
  7. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 대두 (Glycine max) 유래의 환경 스트레스 저항성 관련 GmC3H9 (Glycine max C3H-type zinc finger protein 9) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 염분 또는 삼투 스트레스 저항 증진용 조성물.
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