KR101754804B1 - 식물 병 저항성을 증가시키는 BrCP3 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물 병 저항성을 증가시키는 배추 유래 시스테인 프로테아제 3를 암호화하는 BrCP3 유전자 및 이의 용도에 관한 것에 관한 것으로, BrCP3의 전장 cDNA를 분리하여 상기 유전자를 과발현시킨 형질전환 벼가 한국형 흰잎마름병균에 대하여 우수한 저항성을 보임을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 BrCP3 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 조절을 통해 식물 병에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체를 개발할 수 있으며, 이는 작물의 상품성 및 생산성 증대에 기여할 수 있다.

Description

식물 병 저항성을 증가시키는 BrCP3 유전자 및 이의 용도{BrCP3 gene with improved resistance to plant disease and uses thereof}

본 발명은 식물 병 저항성을 증가시키는 BrCP3 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

식물은 병원체의 공격에 대한 인식이나 내부 면역반응을 활성화시키는데 있어 복잡한 기작을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 식물과 병원체는 각기 적응성과 감염성의 관계를 통해 공진화를 해왔다. 이러한 현상은 병원체와 기주식물의 공격과 방어가 이펙터(avr 유전자)와 저항성 유전자(R 유전자) 간의 관계로 나타난다. 병원체는 감염을 통한 기주식물체 내에서의 성공적인 증식과 효율적인 기생을 위해 식물의 이중 방어체계를 무너뜨려야 한다. 1차 방어시스템을 통해 식물은 기본 방어체계를 유도하는 PRRs(Patterns recognition receptors)를 사용하여 병원균의 MAMP(Microbe-associated molecular patterns)를 인식한다. 그러나 이런 1차 방어 체계는 분비성 이펙터에 의해 붕괴되며, 이후 이 분비성 이펙터는 식물 내부의 R 단백질에 의해 인식되어진다. 식물의 병저항성 유전자인 R 유전자는 주로 수용체 단백질을 암호화하고 있으며 박테리아의 감염성 Avr 유전자 산물인 분비성 단백질(elicitor)과 직접 또는 간접적으로 결합한다.

이전의 많은 연구를 통해 식물은 병원체와의 경쟁을 위해 다양한 방어 전략을 갖고 있음이 밝혀졌다. 어떤 경우에는, 식물이 병원체의 공격을 방어하기 위해 단백질 분해 기작을 활용한다. 이들 중에 시스테인 프로테아제는 노화가 진행되지 않은 정상적인 식물기관에서 전체 단백질 분해 기작의 30% 이상을 차지하며 일부의 경우 90% 이상의 비율을 차지하기도 한다. 이 계열의 단백질 분해 효소는 종자 발아, 노화, 질병 내성을 포함하여 식물의 발달 단계의 다양한 생리학적 측면에 관련되어 있다. 아직까지 식물 병에 대한 저항성 획득 기작에 있어 시스테인 프로테아제 기능은 알려진 바가 거의 없다.

흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae(Xoo))은 그람음성 박테리아로서 벼 흰잎마름병의 주요 병원체이며 전 세계적으로 벼의 박테리아성 질병의 주 원인으로 알려져 있다. 흰잎마름병균은 기주 식물체의 상처 또는 배수조직을 통해 감염되며 피복조직을 통해 증식 그리고 관다발계를 통해 이동을 한다. 분자마커 연구를 통해 얻어진 흰잎마름병균의 다양성, 분포도, 계통 및 감염성에 대한 상관관계는 흰잎마름병균의 계통정보에 대한 보다 많은 이해를 도와주었고, 또한 아시아에서 발생하는 흰잎마름병균들이 지역에 따라 서로 다른 양상을 나타낸다는 것을 확인시켜주었다. 한국형 흰잎마름병균의 계통은 필리핀(64% 차이)과 일본(58% 차이)과 계통적 차이를 보였다. 최근의 연구는 한국에서 분리된 흰잎마름병균은 다른 나라보다 유전적으로 변이가 심화된 계통으로 나타났다(Jeung et al., 2006, phytopathology 96:867-875). 따라서 이들 한국형 흰잎마름병균은 이전의 균에 비해 감염경로가 보다 다양할 것으로 예상된다. 한국형 K1 균주는 Xa1과 Xa3 유전자를 보유하고 있는 벼 품종의 확산에 의해 감소되는 추세이다. 그러나 K2와 K3는 한국에서 계속해서 증식하고 있는 상황이다. 새로운 병원체인 K3a는 2003년에 심각한 흰잎마름병 피해를 주었던 K3와 동일한 감염 양상을 보인다.

지금까지는 이러한 식물 병들을 방제하기 위해 농약을 이용한 화학적 방제법이 주로 사용되어져 왔다. 하지만 그 독성으로 인하여 병원체뿐만 아니라 주변 다른 생물에게도 해를 끼쳐 자연 생태계의 파괴를 일으키는 폐해를 가져왔다. 이러한 문제점을 해결하기 위한 방법으로 식물이 처해 있는 환경 및 생태조건을 고려하여 물리적/생물학적 방제수단을 적절히 혼용하여 농약의 사용을 줄이는 방향으로 식물 병 방제법이 바뀌어 왔으며, 이와 더불어 앞으로는 분자생물학적 방법 및 육종법 등을 이용하여 병에 대해 저항성을 가지고 있는 품종의 도입 및 개량 등을 통해 병 발생 자체를 억제하는 방법을 찾는 것이 좋다고 할 것이다.

한편, 한국등록특허 제0527285호에는 '벼 수술 특이적 발현 시스테인 프로테아제 유전자, 상기 유전자의 수술 특이적 발현 프로모터, 상기 유전자의 발현 억제를 이용한 웅성불임 도입벼의 생산방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2015-0048319호에는 '증진된 병충해 저항성을 가지는 카페인 생합성 유전자가 도입된 형질전환 벼'가 개시되어 있으나, 본 발명의 식물 병 저항성을 증가시키는 BrCP3 유전자 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 배추 유래 시스테인 프로테아제 3의 전장 cDNA를 분리하여 벼에 도입하고 이들 형질전환 벼가 한국형 흰잎마름병균에 대한 우수한 저항성을 보임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 BrCP3(Brassica rapa cysteine protease 3) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 BrCP3 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물 병 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 BrCP3 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 BrCP3 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물 병 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 식물 병 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 BrCP3 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물의 식물 병 저항성 증가용 조성물을 제공한다.

본 발명의 BrCP3 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시킨 형질전환 벼는 흰잎마름병에 대한 저항성을 증대시키므로, BrCP3 단백질 코딩 유전자의 발현 조절을 통해 식물 병에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체를 개발할 수 있으며, 이는 작물의 상품성 및 생산성 증대에 기여할 수 있다.

도 1은 배추 유래 시스테인 프로테아제 3(BrCP3)의 전장 cDNA를 포함하는 바이너리 Ti 플라스미드인 pFLCIII의 모식도이다. P35s, CaMV 35S 프로모터; pUbi-1, 옥수수 유비퀴틴-1 프로모터; Tg7 및 Tnos, 유전자 7 또는 노팔린 합성효소(nopalin synthase, nos) 유전자으로부터의 폴리아데닐레이션 신호(polyadenylation signals); HPT(hygromycin resistance gene); LB, 좌경계(left border); RB, 우경계(right border).
도 2는 BrCP3 서열 분석 결과를 나타낸다. (A) BrCP3의 염기서열과 아미노산 서열, (B) 보존 부위 및 (C) 파파인-유사 시스테인 프로테아제의 아미노산 서열을 이용한 계통분석 결과를 나타낸다.
도 3은 야생형(Gopum)과 형질전환 식물체의 다양한 기관(유식물체, 잎, 꽃, 줄기 및 뿌리)에서 BrCP3의 발현 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 6종의 형질전환 식물체 라인(BR2-4-2, BR2-6-5, BR2-6-6, BR2-6-9, BR2-9-1 및 BR2-10-1), 감수성 개체(IR24), 저항성 개체(IRBB21), 야생형(고품, Gopum)의 도열병 감염 후 14일의 감염부위 사진 및 그래프이다. 각각의 도열병균(K1, K3 및 K3a)의 감염은 1×10⁸cfu/ml의 농도로 진행하였다.
도 5는 감염 3일 후에 잎조직 0.5cm² 당 박테리아의 농도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 형질전환 식물체의 게놈 DNA를 주형으로 BrCP3와 HPT 특이적 프라이머를 사용한 PCR 결과를 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 BrCP3(Brassica rapa cysteine protease 3) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 BrCP3 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물 병 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 BrCP3 단백질의 범위는 배추(Brassica rapa)로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 식물 병에 대한 저항성을 증가시키는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 BrCP3 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 BrCP3 단백질을 암호화하는 게놈 DNA 또는 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물바이러스(예를 들면, CaMV), 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주), 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜메파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 식물 병은 특별히 제한되지 않는데, 바람직하게는 흰잎마름병, 도열병, 줄무늬잎마름병, 잎집무늬병, 검은줄오갈병, 점무늬병, 무름병, 시들음병, 혹병 및 궤양병 등 광역의 병원균에 대한 것이 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 흰잎마름병일 수 있다.

또한, 본 발명은

BrCP3 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 BrCP3 유전자를 과발현하는 단계; 및

상기 BrCP3 유전자가 과발현된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 식물 병 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 BrCP3 단백질의 범위는 전술한 바와 같다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 형질전환 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 식물 병 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

상기 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 단자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 벼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 BrCP3 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물의 식물 병 저항성 증가용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 BrCP3 단백질 코딩 유전자 또는 BrCP3 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하며, 상기 유전자를 식물체에서 과발현시켜 식물체의 식물 병에 대한 저항성을 증가시킬 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 제한되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 배추 시스테인 프로테아제 3의 분리

전체 RNA는 배추의 지부품종(Brassica rapa cv . Chiifu)의 어린 잎을 사용하여 Qiagen kit(Qiagen, 미국)로 추출하였다. 약 1㎍의 RNA를 사용하여 cDNA를 합성하였고 BrCP3의 PCR 증폭을 위해 BrCP3-특이적 프라이머 세트인 정방향 프라이머 5'-tagtgaagaaaaatgaagctcc-3(서열번호 3)과 역방향 프라이머 5'-gtgtcaccaacttcttacgc-3'(서열번호 4)를 사용하였다. PCR 증폭을 위해 95℃에서 5분 동안 변성과정 후에 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 2분의 과정을 35번 반복 후에 72℃에서 10분간 반응하였다. PCR 산물 확인을 위해 에티디움브로마이드가 포함된 1%(w/v) 아가로스젤을 이용하여 전기영동하였다. 예상된 크기의 PCR 산물은 아가로스젤에서 추출하여 Gel purification kit(Bioneer, 한국)를 사용하여 분리하였다. 정제된 PCR 산물은 pGEMT-easy 벡터(Promega, 미국) 내부로 서브클로닝을 진행하여 이후 염기서열을 분석했다.

2. 벡터의 제작과 형질전환

BrCP3의 전장 cDNA는 T4 ligase kit(Promega, 미국)를 사용하여 pBig _ sfiI 벡터(Takara, 일본)의 sfiI 부위(sfiI A, sfiI B)에 결합시켰다(도 1). 식물체에서의 과발현을 위해 BrCP3 유전자를 CaMV 35S 또는 유비퀴틴-1(ubiquitin-1) 프로모터와 NOS 터미네이터 중간에 삽입시켰다. 완성된 벡터는 식물 형질전환을 위해 아그로박테리움 튜메파시엔스 균주인 EHA105로 형질전환하였고, 형질전환 아그로박테리아는 카나마이신(50㎎/L)이 포함된 AB 배지에서 28℃ 암조건에서 배양하여 선발하였다. 형질전환된 아그로박테리아는 AAM 배지에 현탁하여 최종 농도 OD₆₀₀에서 0.01로 맞춘 후에 이후 실험에 사용하였다. 10일 동안 배양시킨 벼 종자 유래 캘러스를 아그로박테리아 현탁액에서 3분간 감염시킨 후 건조시킨 후 0.4% 젤라이트가 포함된 2N6-AS 배지에서 배양하였다. 아그로박테리아와 캘러스의 공동-배양 후(25℃, 암조건)에 각각의 캘러스는 아그로박테리아를 제거하기 위해 카베니실린(500㎎/L)이 포함된 증류수를 이용하여 세척하였다. 세척 후에 각각의 캘러스는 하이그로마이신(50㎎/L)과 카베니실린(400㎎/L)이 포함된 2N6 배지에서 32℃, 연속 광조건으로 2주간 배양하였다. 이후 증식된 캘러스는 줄기와 뿌리의 유도를 위해 MSR 배지로 옮겨주었고 캘러스에서 재분화된 식물체는 토양으로 옮겨 온실에서 재배하였다.

3. DNA 추출과 PCR

게놈 DNA 추출은 Cho 등이 보고한 방법을 변형하여 이용하였다(Crop Sci 47:2403-2417, 2007). DNA 추출 후 DNA의 순도와 농도는 NanoDrop-1000 분광광도계 (NanoDrop Technologies, Inc. 미국)를 이용하여 측정하였다. 게놈 내 BrCP와 HPT(hygromycin phosphotransferase)의 삽입 여부를 확인하기 위하여 Takara사의 ExTaq 효소와 하기 2종의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 분석을 수행하였다: 5'-GGTCGGATACGGAACAGAGA-3'(BrCP3_Fw, 서열번호 5), 5'-GGAGGCGTAACGGGAGAT-3'(BrCP3_Rv, 서열번호 6), 5'-GGATTTCGGCTCCAATGTCCTGACGGA-3'(HPT_Fw, 서열번호 7), 5'-CTTCTACACAGCCATCGGTCCAGA-3'(HPT_Rv, 서열번호 8). PCR 증폭을 위해 95℃에서 5분 동안 변성과정 후에 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초의 과정을 30번 반복 후에 72℃에서 10분간 반응하였다. PCR 산물 확인을 위해 에티디움브로마이드가 포함된 1%(w/v) 아가로스젤을 이용하여 전기영동하였다.

4. 유전자 발현 분석

형질전환 벼에서 BrCP3 유전자 발현을 확인하기 위해 형질전환 식물체와 야생형 식물체의 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 기관에서 전체 RNA를 RNeasy Mini Kit(Qiagen, 미국)를 사용하여 추출하여 기관 내 BrCP3의 발현을 조사하였다. 전체 RNA는 DNase 1 kit(Invitrogen, 미국)를 사용하여 DNA 오염을 방지하였고 SuperScript^TMⅢ Reverse Transcriptase(Invitrogen, 미국)를 사용하여 1차 DNA를 합성하였다. BrCP3 특이적인 내부 프라이머를 사용한 RT-PCR 방법을 통하여 각 기관별 유전자의 발현을 조사하였다. 액틴 유전자는 RT-PCR 반응의 표준화를 위해 사용하였다.

5. 흰잎마름병에 대한 저항성 검증

T₂ 세대의 형질전환 식물체를 온실에서 배양하여 실험에 사용하였다. 실험의 대조군을 위해 야생형인 '고품(Gopum)', 흰잎마름병 감수성 품종인 'IR24' 및 흰잎마름병 저항성 품종인 'IRBB21'를 사용하였다. 각각의 품종은 온실에서 45일간 배양하여 사용하였고 각각의 균주에 대한 감염 실험은 3회 반복을 하였다. 각각의 도열병균(한국형 K1, K3, K3a)은 고체 배지에서 2일간 배양하여 감염에 사용하였다. 배양된 흰잎마름병균은 증류수를 사용하여 1×10⁸cfu/ml의 농도로 희석하여 실험에 사용하였다. 야생형, 저항성, 감수성, 형질전환 식물체의 잎에 각각의 흰잎마름병균을 감염시킨 후 14일 동안 배양하였다. 감염성 정도는 잎의 감염부위의 길이를 측정하여 판단하였다. 감염성 정도는 standard evaluation system(SES IRRI, 1996)을 사용하여 평가하였다.

6. 박테리아 증식 분석

박테리아 증식 정도를 확인하기 위해 5일된 식물의 잎조직에 K3a 균주를 1×10⁸cfu/ml의 농도로 감염시켰으며 정확한 실험을 위해 이 과정을 3회 반복하였다. 감염 후 3일 후에 0.5cm²의 잎조직을 추출하여 70% 에탄올과 1% 락스를 이용하여 세척하고 마지막으로 멸균수로 3회 세척하였다. 각각의 조직은 100㎕의 증류수가 있는 튜브 내에서 조직을 마쇄하여 세포 추출액을 얻었다. 위에서 얻어진 세포 추출액을 10², 10⁴, 10⁶, 10⁸로 각각 희석하여 펩톤이 포함된 아가 배지에서 균을 배양하였다. 각 배지는 30℃에서 2일간 배양하였다. 이후 각각의 박테리아 균체의 개수를 측정하고 연속으로 희석한 균의 군체 개수를 환산하여 밀리리터 당 박테리아의 개수를 측정하였다.

실시예 1. BrCP3 ( Brassica rapa cysteine protease 3) 유전자의 특성 확인

배추 유래 시스테인 프로테아제 3(Brassica rapa cysteine protease 3, LOC103848250) 유전자는 염기서열 분석을 통해 60bp의 5' UTR과 170bp의 3' UTR을 포함하는 총 1,374bp의 cDNA로 구성되며 457개 아미노산을 암호화하고 있음을 확인했다(도 2A). BrCP3의 보존된 부위는 clan CA의 peptidase_C1A 서브패밀리(subfamily)와 높은 상동성을 보였다(도 2B). 이 부위는 시그널 서열을 포함하는 엔도펩티다제(endopeptidase), N 말단의 카텝신 프로펩티드 억제제 도메인(cathepsin propeptide inhibitor domain, I29) 및 C 말단에 그라눌린 도메인(granulin domain)을 갖고 있다. 파파인(Papain)은 기질 특이성을 갖고 있는 엔도펩티다제로서 주로 파파인 또는 방향족 잔기의 S2 서브사이트(subsite)에서 거대한 소수성 포켓(hydrophobic pocket)을 형성한다. 파파인에서 소수성 포켓은 기질의 P2 사이드체인(sidechain)을 수용한다. 기존에 보고된 식물의 파파인-유사 시스테인 프로테아제의 아미노산 서열을 이용한 계통 분석은 상기 시스테인 프로테아제가 RD21A와 82.49%의 상동성을 갖고 있음을 보여주었다(도 2C).

실시예 2. BrCP3 유전자의 조직 특이적 발현

벼에 도입된 BrCP3 유전자가 안정적으로 발현하는지 확인하기 위해 RT-PCR 방법을 사용하였다. 도입된 유전자는 과발현을 위해 CaMV 35S 또는 유비퀴틴-1 프로모터를 사용하였기 때문에 실제 전신발현이 일어나는지 확인하는 과정이 중요하다. 이를 위해 형질전환 식물체의 유식물체, 잎, 꽃, 줄기 및 뿌리에서 BrCP3의 발현을 RT-PCR로 확인하였다(도 3).

실시예 3. 흰잎마름병균에 대한 BrCP3 형질전환 벼의 저항성 확인

BrCP3 형질전환 식물체는 흰잎마름병에 대한 향상된 저항성을 보여주었다(도 4). K1 균으로 감염시킨 형질전환체의 감염부위는 1.8에서 2.6cm로 야생형의 감염부위(평균 4.1cm)의 절반에 해당되었다. 더욱이 K1 균주에 대한 반응성은 기존의 저항성 품종인 IRBB21에서도 감수성으로 나타났다. K3 균에 대한 감염실험에서 형질전환 식물체는 0.95에서 3.10 cm의 범위로 같은 조건에서 야생형(6.52cm)와 감수성 품종인 IR24(11.62cm)에 비해 짧게 나타났고 저항성 품종인 IRBB21(2.43cm)와 비슷한 정도를 나타냈다. K3a 감염실험에서 형질전환체는 1.2에서 2.8cm로 같은 조건의 야생형(6.6cm), IRBB21(5.1cm), IR24(32.8cm)보다 짧은 범위를 나타냈다. SES 인덱스 등급(SES index rating)으로 분류했을 때 K1과 K3a 균 모두에 저항성인 것이 6개 였고, K3 균에 고도 저항성(highly resistant, HR)이 1개, 저항성(R)이 4 개, 중도 저항성(moderately resistant, MR)이 1개 나타났다. 야생형 고품은 장시간 감염시에 K1, K3, K3a에 대해 중도 저항성을 나타냈다.

잎 내의 박테리아(K3a)의 정량 분석을 통해 BrCP3가 실질적으로 저항성에 관여한다는 것을 밝혀내었다(도 5). 연속적인 세포 내 추출물의 희석액 배양 실험에서 10⁶의 배양에서 가장 적절한 수의 균체가 확인되었다. 반면 10²과 10⁴의 배양에서는 균체의 개수를 확인하기 어려울 만큼 자랐으며 10⁸의 배양에서는 매우 적은 수의 균체가 확인되었다. BrCP3 형질전환체의 단위조직당 박테리아의 수는 0.97 ×10⁸로 나타났으며 야생형 고품에서는 2.31×10⁸, 저항성 품종인 IRBB21에서는 1.78 ×10⁸, 감수성 품종인 IR24에서는 9.05×10⁸로 나타났다. 흰잎마름병에 대한 형질전환체를 대상으로 한 감염 실험결과 BrCP3의 과발현은 벼 흰잎마름병에 대한 저항성을 확인하였다.

실시예 4. 형질전환 식물체의 특성 확인

형질전환 식물체의 유전자 도입을 확인하기 위하여 삽입된 유전자인 BrCP3와 항생제 저항성 유전자인 HPT 유전자의 특이 프라이머를 디자인하여 게놈 DNA를 대상으로 PCR을 수행하였다. 6종의 형질전환체 라인인 BR2-4-2, BR2-6-5, BR2-6-6, BR2-6-9, BR2-9-1 및 BR2-10-1에서 BrCP3와 HPT 유전자가 모두 발현되는 것을 확인하였다(도 6). 이 중 3종의 라인에 대하여 포장에서의 형태적, 농업적 분석을 실시하였다. 적당한 생장 단계에서의 분얼(productive tiller), 초장(plant height), 수장(panicle length), 간장(culm length)를 포함하는 분석 요소를 측정하여 평가하였다. 그 결과 대부분의 형질전환체가 야생형 고품과 동일한 표현형을 나타냈다(표 1).

라인	분얼	초장(cm)	수장(cm)	간장(cm)
BR2-4-2	11.2±3.49	106.96±4.31	21.8±1.23	81.92±4.17
BR2-6-5	10±2.64	109.6±2.31	21.4±1.57	86.48±5.65
BR2-6-6	10.6±0.54	108.72±1.79	20.96±1.03	79.96±6.07
BR2-10-1	10.2±1.78	104.96±4.58	21.28±1.18	77.64±2.40
고품(Gopum)	9.67±1	107.93±1.10	20±1.11	78.66±3.18

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> BrCP3 gene with improved resistance to plant disease and uses thereof <130> PN15277 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1615 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 1 gatctttcat catcttttct tcttctccaa agaaaaatag tgaagaaaaa tgaagctcct 60 taactcagct accgtgatcc tcttcttagc gatgatcgtg gtatcatcag cgatggatat 120 gtcaatcatt tcctacgaca aaaaccacca caccgtctct tccagaagcg atgtcgaagt 180 ttcaagactg tacgaggagt gggtagtgaa acacgggaag gctcagaatt ctcttacaga 240 gaaagatcga cggttcgaga tctttaaaga caacctccgc ttcatagacg aacacaacgg 300 gaagaatctt agttacagat tgggtcttac gaagttcgcg gatctcacta acgatgagta 360 tagatccatg tacctcgggt ctaggctcaa gaggaaagcc acgaagacta gccttcgcta 420 cgaggcgcgt gtaggtgacg ctatcccgga gagcgttgac tggaggaagg aaggtgccgt 480 ggctgaggtc aaagatcagg gaagctgcgg gagttgttgg gcgttttcaa ccatcggagc 540 agtggagggc ataaacaaga tcgtgacagg agacttaata tccttgtctg aacaagaatt 600 ggttgattgt gacacttcat acaatgaagg ttgtaacgga ggtctcatgg actatgcttt 660 tgagttcatt ataaaaaacg gcggaatcga tacagaggaa gattatcctt acaagggtgt 720 tgacggacgt tgtgaccaga ccagaaaaaa cgctaaagtt gttacaatcg attcatatga 780 ggatgtgccg gctaacagcg aagaatcatt aaagaaagca ctttctcacc aaccaatcag 840 cgtcgccatt gagggtggtg gtcgtgcgtt ccagctctat gattcgggta tattcgatgg 900 aatttgtgga acagatctag accacggagt tgtggcggtc ggatacggaa cagagaatgg 960 caaagactat tggattgtga aaaactcatg gggaacaagt tggggagaga gcggatacat 1020 aaggatggag cgcaacattg cgtcttcagc aggaaaatgt ggaatcgctg ttgagccttc 1080 ttatccgatc aagaatggcc aaaacccacc aaaccctgga ccttcacctc catctcccgt 1140 tacgcctccg acccaatgtg acagttacta cacatgtcct gagagcaaca cttgttgttg 1200 tctttttgat tatggaaagt attgccttgc ttggggatgt tgcccactag aagcagccac 1260 atgttgtgat gacaactata gttgctgccc tcacgagtac cccgtttgtg accttgatca 1320 gggaacttgt ttaatgaaca agaacagtcc gttcagtatc aaggccataa agcgcaagcc 1380 cgcaacacca ttctggtcac agagcaggaa gaacattgcg taagaagttg gtgacactgc 1440 acatttgttt cttcagagag aattctgact catatgagca agagatatct gaagagattt 1500 gtcaaattat tgtatgttgt tgtttatgac ataaggatac ataaaaatgc agctgttggg 1560 tattgtgtat atattaaaaa ccataagttg cttttagtcc aaaaaaaaaa aaaaa 1615 <210> 2 <211> 457 <212> PRT <213> Brassica rapa <400> 2 Met Lys Leu Leu Asn Ser Ala Thr Val Ile Leu Phe Leu Ala Met Ile 1 5 10 15 Val Val Ser Ser Ala Met Asp Met Ser Ile Ile Ser Tyr Asp Lys Asn 20 25 30 His His Thr Val Ser Ser Arg Ser Asp Val Glu Val Ser Arg Leu Tyr 35 40 45 Glu Glu Trp Val Val Lys His Gly Lys Ala Gln Asn Ser Leu Thr Glu 50 55 60 Lys Asp Arg Arg Phe Glu Ile Phe Lys Asp Asn Leu Arg Phe Ile Asp 65 70 75 80 Glu His Asn Gly Lys Asn Leu Ser Tyr Arg Leu Gly Leu Thr Lys Phe 85 90 95 Ala Asp Leu Thr Asn Asp Glu Tyr Arg Ser Met Tyr Leu Gly Ser Arg 100 105 110 Leu Lys Arg Lys Ala Thr Lys Thr Ser Leu Arg Tyr Glu Ala Arg Val 115 120 125 Gly Asp Ala Ile Pro Glu Ser Val Asp Trp Arg Lys Glu Gly Ala Val 130 135 140 Ala Glu Val Lys Asp Gln Gly Ser Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser 145 150 155 160 Thr Ile Gly Ala Val Glu Gly Ile Asn Lys Ile Val Thr Gly Asp Leu 165 170 175 Ile Ser Leu Ser Glu Gln Glu Leu Val Asp Cys Asp Thr Ser Tyr Asn 180 185 190 Glu Gly Cys Asn Gly Gly Leu Met Asp Tyr Ala Phe Glu Phe Ile Ile 195 200 205 Lys Asn Gly Gly Ile Asp Thr Glu Glu Asp Tyr Pro Tyr Lys Gly Val 210 215 220 Asp Gly Arg Cys Asp Gln Thr Arg Lys Asn Ala Lys Val Val Thr Ile 225 230 235 240 Asp Ser Tyr Glu Asp Val Pro Ala Asn Ser Glu Glu Ser Leu Lys Lys 245 250 255 Ala Leu Ser His Gln Pro Ile Ser Val Ala Ile Glu Gly Gly Gly Arg 260 265 270 Ala Phe Gln Leu Tyr Asp Ser Gly Ile Phe Asp Gly Ile Cys Gly Thr 275 280 285 Asp Leu Asp His Gly Val Val Ala Val Gly Tyr Gly Thr Glu Asn Gly 290 295 300 Lys Asp Tyr Trp Ile Val Lys Asn Ser Trp Gly Thr Ser Trp Gly Glu 305 310 315 320 Ser Gly Tyr Ile Arg Met Glu Arg Asn Ile Ala Ser Ser Ala Gly Lys 325 330 335 Cys Gly Ile Ala Val Glu Pro Ser Tyr Pro Ile Lys Asn Gly Gln Asn 340 345 350 Pro Pro Asn Pro Gly Pro Ser Pro Pro Ser Pro Val Thr Pro Pro Thr 355 360 365 Gln Cys Asp Ser Tyr Tyr Thr Cys Pro Glu Ser Asn Thr Cys Cys Cys 370 375 380 Leu Phe Asp Tyr Gly Lys Tyr Cys Leu Ala Trp Gly Cys Cys Pro Leu 385 390 395 400 Glu Ala Ala Thr Cys Cys Asp Asp Asn Tyr Ser Cys Cys Pro His Glu 405 410 415 Tyr Pro Val Cys Asp Leu Asp Gln Gly Thr Cys Leu Met Asn Lys Asn 420 425 430 Ser Pro Phe Ser Ile Lys Ala Ile Lys Arg Lys Pro Ala Thr Pro Phe 435 440 445 Trp Ser Gln Ser Arg Lys Asn Ile Ala 450 455 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tagtgaagaa aaatgaagct cc 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gtgtcaccaa cttcttacgc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggtcggatac ggaacagaga 20 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggaggcgtaa cgggagat 18 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggatttcggc tccaatgtcc tgacgga 27 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cttctacaca gccatcggtc caga 24

Claims (9)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 유비퀴틴-1(ubiquitin-1) 프로모터, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 BrCP3 단백질을 코딩하는 유전자 및 NOS(nopaline synthase) 터미네이터를 포함하는 재조합 벡터로 벼 식물세포를 형질전환시켜 BrCP3 유전자를 과발현하는 단계; 및
   상기 BrCP3 유전자가 과발현된 벼 식물세포로부터 벼 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 흰잎마름병 저항성이 증가된 형질전환 벼 식물체의 제조 방법으로서,
   상기 형질전환 벼 식물체의 유식물체, 잎, 꽃, 줄기 및 뿌리에서 BrCP3 유전자가 발현되고,
   상기 형질전환 벼 식물체의 분얼(productive tiller), 초장(plant height), 수장(panicle length) 및 간장(culm length)이 야생형 벼 식물체와 동일한 표현형을 나타내며,
   흰잎마름병균 K1 균으로 감염시킨 형질전환 벼 식물체의 감염부위는 1.8cm 내지 2.6cm로 야생형의 감염부위인 4.1cm에 비해 짧은 범위를 나타내고, 흰잎마름병균 K3 균으로 감염시킨 형질전환 벼 식물체의 감염부위는 0.95cm 내지 3.10cm로 야생형의 감염부위인 6.52cm에 비해 짧은 범위를 나타내며, 흰잎마름병균 K3a 균으로 감염시킨 형질전환 벼 식물체의 감염부위는 1.2cm 내지 2.8cm로 야생형의 감염부위인 6.6cm보다 짧은 범위를 나타내는 것을 특징으로 하는 흰잎마름병 저항성이 증가된 형질전환 벼 식물체의 제조 방법.
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