KR101955075B1

KR101955075B1 - 식물 병 저항성을 증가시키는 OsCYP71 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101955075B1
Application number: KR1020160176549A
Authority: KR
Inventors: 조용구; 마아존; 송재영
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2016-12-22
Publication date: 2019-03-06
Also published as: KR20180073087A

Abstract

본 발명은 식물 병 저항성을 증가시키는 벼(Oryza sativa) 유래의 OsCYP71(Oryza sativa cytochrome P45071) 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 벼 유래의 OsCYP71 유전자를 도입한 형질전환 벼가 흰잎마름병에 우수한 저항성을 가지는 것을 확인하였으며 OsCYP71 유전자를 이용하여 병충해 저항성 품종을 육성할 수 있으므로 결과적으로 작물의 수확량 증대 등 경제성에 크게 기여할 수 있을 것이다.

Description

식물 병 저항성을 증가시키는 OsCYP71 유전자 및 이의 용도{OsCYP71 Gene Enhancing Pathogen Resistance of Plant and Uses Thereof}

본 발명은 식물 병 저항성을 증가시키는 벼(Oryza sativa) 유래의 OsCYP71(Oryza sativa cytochrome P45071) 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

숙주(host) 시스템에 침입하는 병원체는 보통 방어활성을 이끄는 고유의 신호 네트워크를 방해한다. Xanthomonas 종은 T2S, T5S 및 T3S 시스템 단백질 (AhvrXa7, AvrXa10, PthX06 및 PthX07)로 알려진 주요 병원성 이펙터와 같은 다른 단백질 분비 시스템의 조합을 이용함으로써 손상되지 않고 침입하려고 한다. 그러나 다수의 Xa 저항성 유전자가 LAMP 수용체 키나아제 유전자인 Xa21 및 Xa3/Xa26의 경우와 같이 PAMP 또는 작동체(effectors)의 효율적인 인식에 참여하는 것으로 보고되었다. WKRY 매개 면역의 경우, 병원균의 침입은 종종 내생 신호 분자 살리실산의 조절로 이어지며, 결국 전신 획득 저항성을 일으킨다. OsWRKY45는 Pseudomonas syringae에 대한 내성을 증가시키는 pathogenesis-related(PR) 유전자의 발현을 유도하는 것으로 보고되었다. 17개 과(families)로 분류되는 PR 단백질은 병원체 감염 후 그들의 활성화가 축적된 후 식물체에서 전신 취득 저항성의 지표로 빈번하게 사용되어왔다. 벼의 PR 유전자 발현은 Xanthomonas에 대한 발달상에서 조절되는 Xa21 매개 저항성과 상관관계가 있으며 도열병균(Magnaporthe grisea)에 대한 반응의 또 다른 보고에 따르면, 시토크롬 P450(CYP) 효소는 다양한 화합물의 산화적 분해에 관여하며 다양한 화학반응을 나타내는 heme-containing mono-oxygenases의 슈퍼 패밀리이다. 그것은 식물, 동물, 박테리아 및 곰팡이에 널리 분포되어있는 대규모 유전자군이다.

일반적으로 식물에서, 여러 생합성 반응에서 P450은 지방산 복합체, 식물 호르몬, 2차 대사 산물, 리그닌, 다양한 방어 화합물 및 신호 분자 등을 유도하는 기능을 한다. 신진 대사 과정에서의 이런 역할 때문에, 식물 P450 단백질과 전사체는 화학, 발달, 생물학적 및 환경적 신호에 반응하는 여러 가지 생화학적 경로에 대한 하류보고(downstream reports)의 역할을 할 수 있다.

P450 유전자군의 일부 구성원은 복제를 억제하는 소랄렌 유도체, 미세소관 형성 및 세포 분열을 억제하는 모노테르펜 인돌 알칼로이드 및 곰팡이, 박테리아 및 곤충에서의 프로테아제 및 산화 효소를 억제하는 DIMBOA를 포함하는 식물 방어 화합물의 합성을 유도한다. 다수의 이차 화합물의 히드록실화에서 그 기능 때문에, 식물 P450은 전례없는 수준으로 중복 및 분기한다. 벼 게놈 시퀀싱의 완성은 수백 개의 기능성 P450 및 유전자를 데이터베이스에서 분류할 수 있다. Interpro와 같은 단백질 서열 분석 및 데이터베이스에는 특히 모델 생물체에서의 P450 단백질만이 기록되어 있다. 벼에서만 약 980개가 기록되어 있고, 애기장대에는 711개, 인간은 438개, 제브라 피쉬는 258가지가 존재한다. 그러나 특히 벼에서 P450 단백질의 많은 목록이 있음에도 불구하고 기능적 연구가 부족하다. 일부는 과(family) 수준으로만 명명되어 있고, 분류의 복잡성으로 인하여 아과(subfamilies)에 할당된 항목에 대해서는 개시된 바가 없다.

대한민국 등록특허(0001) KR 10-1571067

비특허문헌(0001) Schuler MA. (1996) Plant cytochromeP450 monooxygenases. Crit. Rev. Plant Sci. 15:235-84

이에 본 발명자들은 벼(Oryza sativa) 유래의 OsCYP71(Oryza sativa cytochrome P45071) 유전자가 과발현되는 돌연변이 식물체가 흰잎마름병에 강한 저항을 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼(Oryza sativa) 유래의 OsCYP71(Oryza sativa cytochrome P45071) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsCYP71 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물체의 병 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 OsCYP71 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 병 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 병 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 OsCYP71 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물체의 병 저항성 증가용 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 OsCYP71 유전자의 발현이 증가되어 병 저항성이 증가된 돌연변이 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명은 벼 유래의 OsCYP71 유전자를 도입한 형질전환 벼가 흰잎마름병에 우수한 저항성을 가지는 것을 확인하였으며, OsCYP71 유전자를 이용하여 병충해 저항성 품종을 육성할 수 있으므로 결과적으로 작물의 수확량 증대 등 경제성에 크게 기여할 수 있을 것이다.

도 1은 pCAMBIA1300 벡터를 제작하기 위한 도면이다: (A) OsCYP71 삽입한 벡터 pCAMBIA1300를 제작하기 위한 모식도, (B) 삽입된 OsCYP71 유전자 확인한 결과.
도 2는 OsCYP71(KY366226)의 시퀀스를 분석한 결과를 나타낸 도면이다: (A) OsCYP71 시퀀스, (B) 시토그롬 P450 효소인 premnaspirodiene oxygenase를 암호화하는 유전자 예측한 결과.
도 3은 OsCYP71(KY366226)의 계통분석 및 구조분석한 결과를 나타낸 도면이다:(A) 다른 식물 종에서 CYP71의 다른 구성원과 OsCYP71의 계통 발생 관계, (B) OsCYP71 아미노산 서열과 다른 식물 종의 밀접한 관련 단백질의 배열.
도 4는 OsCYP71 단백질의 N 말단(1-70AA)에서 신호 펩티드를 예측하기 위한 SIgnalIP의 그래픽 출력한 결과를 나타낸 그래프이다: (A) Position = Position in the input sequence, 뉴런 네트워크는 입력 시퀀스의 각 위치에 대해 세 가지 출력 점수(C, S 및 Y)를 나타내며, C-score는 신호 펩티드 절단 지점을 다른 모든 것과 구별, S-score는 신호 펩티드가 없는 위치의 단백질과 단백질로부터 성숙 부분의 위치와 신호 펩타이드 내의 위치를 구별, Y-score는 결합 절단 펩티드 점수를 나타냄, (B) Window Position = Average hydropathy of amino acid, Kyte-Doolittle 소수성 플롯으로, 점수가 1.8보다 큰 피크(빨간색 선)는 막관통 단백질(transmembrane) 위치, 그래프의 x 축에 표시된 window position 값은 아미노산 평균 소수성.
도 5는 OsCYP71 과발현 식물의 분자 특성을 나타낸 도면이다: (A) OsCYP71의 존재에 대한 게놈 PCR 분석 결과, (B) TaKMan 실시간 PCR을 사용하여 분석한 T0 OsCYP71 과발현 벼의 수 NC=negative control, PC=double copy positive control.
도 6은 OsCYP71의 mRNA 발현을 나타낸 도면과 그래프이다: (A) 다른 기관, (B) Dongjin(감수성)의 다른 성장 단계, (c) Xoo strain K2에 감염된 후 Dongjin과 Jinbaek에서 OsCYP71의 전사 수준, 관측 시간 : 0, 1, 4, 8, 24 및 48 hpi.
도 7은 Xoo에 대한 OsCYP71 과발현 식물 스크리닝한 결과를 나타낸 그래프와 사진이다: (A) 감염 후 8, 12, 16일에 측정한 형질 전환 식물 및 대조군 식물의 병진전곡선(Disease progress curve), (B) 감염 후 16일에 측정한 형질 전환 식물과 대조군 식물의 표현형.
도 8은 Xoo K2 균주가 접종된 형질 전환 및 야생형 식물에서의 OsPR 유전자 (PR1a, b, c)의 전사 수준을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

식물은 리그닌, UV 보호제, 색소, 방어 화합물, 지방산, 호르몬 및 신호 전달 분자의 합성에서 시토크롬 P450을 이용한다. 데이터베이스에 벼의 P450에 대한 많은 분류가 되어 있음에도 불구하고, 그 기능 연구는 부족하며 지금까지 벼의 P450이 질병의 면역에 관여하는 증거는 없었고, 대부분은 쌍떡잎 식물의 다른 시스템을 기반으로 연구가 진행되었다. 이에 본 발명자는 벼에서 시토크롬 P450 (OsCYP71)을 분리하고, 기능획득변이(gain-of-function) 기술을 이용하여 유전자를 스크린하여 OsCYP71 유전자 과발현 형질전환체를 육성하여 벼 흰잎마름병에 대한 이 유전자의 기능을 살펴본 결과 병원체내성(pathogen resistant, PR) 유전자의 활성과 P450 매개 면역에서 저항성 정도를 확인하였다, 구체적으로, Xanthomonas oryzae pv oryzae 유도된 microarray 데이터 세트에서 동정한 Oryza sativa cytochrome P45071(OsCYP71)을 클로닝하였으며, full-length cDNA는 한국형 흰잎마름병 K2에 감수성인 모품종 동진의 게놈에 과발현시켜 흰잎마름병에 저항성이 있음을 확인하여 병에 저항성을 나타내는 유전자임을 알아냈다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 OsCYP71 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsCYP71 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물체의 병 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래 OsCYP71 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 OsCYP71 단백질을 코딩하는 유전자이다.

본 발명의 "OsCYP71 유전자"는 Xanthomonas oryzae pv. oryzae K2 균계에 의해 서로 다르게 발현된 cDNA microarray 데이터로부터 OsCYP71 (Genbank accession number KY366226)를 동정하였으며, KY366226는 heme-iron binding 및 산소환원효소 활성에 관여하는 Premnaspirodiene oxygenase계인 Cytochrome P450 효소를 암호화하므로 아미노산 서열의 계통발생학 분석 결과, CYP71속의 P450군 단백질과 근연 관계를 나타내어 OsCYP71이라 명명하였다. P450은 염기서열의 제2차 및 제3차 구조적 보존을 유지하는 서로 다른 유전자군에 의해 암호화되므로(Schuler and Werck- Reichhart 2003) 3가지 신호 펩타이드 예측 방법을 사용하기 위해 N-말단에서의 신호 펩타이드 염기서열 결여를 지속적으로 관측하였으며, 이는 막관통 단백질 또는 비분비성 단백질일 것으로 예상된다. 이는 막단백질의 특성인 인지질 2중층에 통합된 무극성 아미노산의 존재를 의미하는 소수성 구역에서의 양성 value peak를 제공한다. Schuler (1996)에 따르면 대부분의 전형적인 식물 P450은 소포체 막 및 시토졸의 단백질 잔기에서 신호 N-말단 막관통 나선 정박 단백질과 함께 위치한다.

본 발명의 상기 OsCYP71 유전자는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 OsCYP71 유전자 cDNA 서열은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E.coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 상기 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983, J. Mol. Biol., 166:557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 병 저항성은 벼 흰잎마름병에 대한 저항성인 것일 수 있고, 바람직하게는 벼 흰잎마름병균 Xanthomonas oryzae pv. Oryzae (K2)에 의한 벼 흰잎마름병에 대한 저항성일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, Xoo에 고도의 저항성을 나타내는 진백벼를 통하여 유전자를 동정하였으며, 흰잎마름병에 감수성을 나타내는 모품종 동진벼에서 과발현을 유도하였다. Nipponbare를 기준으로 진백벼의 염기 서열 Clustal alignment 분석을 실시한 결과, 트립토판(TGG)의 알지닌(CGG)으로의 변이를 유도하는 단일 염기 다형성이 발견되었다.

상기 OsCYP71을 기능을 밝히기 위하여 기능획득변이(Gain-of-function)된 유전자의 기능 검증은 유전체의 공평한 기능 탐사를 위한 효과적인 기술이다. 본 발명에서는 single copy의 OsCYP71 과발현체를 만들어냈으며 전신발현 35S 프로모터를 이용한 hygromycin phosphotransferase(hpt)를 과발현체 선발 마커로 사용하였다. 모품종에서의 유전자 시공간 발현 분석 결과, OsCYP71은 뿌리, 잎, 지엽에서만 발현하는 조직특이성을 나타냈다. 또한, 최대분얼기 및 이삭형성초기 동안 높은 전사율을 나타내었으며 이는 발달 시기에 조절되어짐을 의미한다. 생육 초기에는 발현이 미흡하나 생육 성숙기에 발현이 증가하는 Xa21-Xoo pathosystem 모델에 대해 같은 전사 발현 특성이 보고되었다(Ponciano et al. 2007). OsCYP71은 Xoo 접종 후 4시간에서 8시간 사이에 최고 발현을 기록하며 초기 반응단계에 결정적인 관련성이 있음을 확인하였다.

OsCYP71 과발현체에서 감염률의 감소가 분명하게 발생하였으며 OsCYP71가 Xoo에 부분저항성을 가지며, 부분적으로 Xoo에 반해 premnaspirodiene oxygenase의 억제 역할을 나타냄을 의미한다. 이 효소는 강력한 항진균성 phytoalexin인 solavetivone을 발생시키는 다양한 sesquiterpene 기질의 특이적 수산화를 촉진시킨다고 보고되어진다(Takahashi et al. 2007). 이 성분군은 Phytophthora infestans의 균사 생장을 억제하는 것으로 알려졌으며(Engstorm et al. 1999), Rhizoctonia solani(Yao et al. 2003), Fusarium oxysporum의 포자 발아(Yokose et al. 2004) 및 Staphylococcus aureus과 Bacillus substilis의 생장(Kuroyanagi et al. 1999)도 억제하는 것으로 나타났다.

본 발명에서 "PR 유전자"는 저항성이 검정된 수많은 식물체에서 전신성 유전자 마커로써 자주 사용된다(Mitsuhara et al. 2007). 본 연구팀은 real-time PCR에 의한 전사 수준의 OsCYP71 매개 면역력에서 PR 유전자의 관련성을 추론하였으며, PR1 유전자 군의 OsPR1a, OsPR1b 및 OsPR1c를 선발하였다. 3개 유전자는 CYP71-1에서는 모두 발현이 유도된 반면 CYP71-2에서는 OsPR1c만 발현을 나타내는 등 2개 형질전환 계통에서 서로 다른 전사 발현을 나타내었다. Xoo 접종에 대한 2개 과발현 계통의 형태적인 양상을 확인한 결과, 형질전환체 간의 PR 유전자 발현 수준에서의 차이점은 OsCYP71에 의해 생성된 저항성과 연관이 있는 것으로 보여진다. Alexander et al. (1993)에 따르면 PR1a는 담배에서 oomycete 감염을 억제시키는 단백질을 암호화하는 것으로 나타났으며, 벼에서 OsPR1a 및 OsPR1b은 도열병 균류에 반하여 유도되는 것으로 나타났다(Jwa et al. 2001). 대사활성 단계에서의 P450 역할로 인해 식물 P450 단백질 및 전사요소는 서로 다른 생화학 경로에 대한 downstream reporter로써 작용할 수 있으며(Schuler and Werck-Reichhart 2003), 비록 유효성에 대한 광범위한 유전적 분석이 요구되어지나 본 연구를 통하여 OsCYP71은 OsPR 단백질과 같은 downstream defense 관련 유전자의 조절인자로써 역할을 할 수 있을 것으로 예상하였다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 OsCYP71 유전자는 전술한 바와 같다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 병 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의종자를 제공한다. 상기 식물체는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 단자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 벼이다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 OsCYP71 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물체의 병 저항성 증가용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하며, 상기 유전자는 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 병 저항성을 증가 시킬 수 있는 것이다.

아울러, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 OsCYP71 유전자의 발현이 증가되어 병 저항성이 증가된 돌연변이 식물체를 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 재료 및 방법

<1-1> OsCYP71 유전자 분리

Total RNA는 RNAiso Plus 추출 시약(Takara Bio Inc. Tokyo, Japan)을 이용하여 자포니카 진백벼의 어린 잎으로부터 추출하였다. cDNA 합성은 Superscript Ⅲ First-Strand cDNA Synthesis Kit(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 합성하였고 이 cDNA는 타켓 유전자 OsCYP71을 증폭하는데 사용하였다. 사용된 프라이머는 (FW) ATGGACGAGCTCTTCTACCAGTC(서열번호 3), (RV) CTAATTGGCAGAGACCACAGGGA(서열번호 4)를 사용하였다. PCR 조건은 denaturation은 95℃에서 5분, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 2분을 35주기를 반복하며, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다. PCR 산물은 1% agarose gel에서 전기영동하였다. 예상 밴드 사이즈의 증폭산물을 gel 정제 kit를 사용하여 분리하였다. 정제된 PCR산물은 pGEMT-easy 벡터(Promega, Madison, USA) 안에 sub-클로닝 하였고, sequence 분석은 Macrogen Inc.에 의뢰하였다.

<1-2> 벡터 제작 및 벼 형질전환

OsCYP71의 full-length cDNA는 T4 ligase kit(Promega, Madion, USA)를 사용하여 pCAMBIA1300 벡터의 KpnⅠ와 XbaⅠ부위에 ligation 하였다. pCAMBIA1300 벡터는 Agrobacterium EHA105에 형질전환하였고, 28℃ 암조건에서 3일 동안 50mg/L kanamycin이 함유된 AB 고체 배지에서 배양하였다. 배양된 아그로박테리움을 AAM 배지에 현탁하였다. 10일 배양된 벼 종자 캘러스는 아그로박테리움 현탁액에 담가 접종하였다. 접종된 캘러스를 2N6-AS 고체 배지에 옮겼다. 25℃ 암조건에서 2일 동안 배양하였고, 캘러스는 500mg/L carbanicillin이 함유된 멸균수에서 세척하였다. 그 캘러스를 건조하고 50mg/L hygromycin, 400mg/L carbanicillin이 함유된 2N6배지에 32℃ 광조건에서 2주간 배양하였다. 급증한 캘러스는 줄기와 뿌리를 유도하기 위해 MSR 배지에 옮겨주었다. 재분화된 식물체들은 토양으로 옮겨 심었고 2주동안 온실에서 순화시켰다.

<1-3> DNA 추출과 genomic PCR

형질전환체의 타겟유전자를 확인하기 위해 Genomic DNA를 cho et al(2007)의 방법으로 추출하였고, OsCYP71 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR 분석을 수행하였으며 다음과 같은 조건에서 유전자를 증폭하였다. 95℃에서 5분간 denaturation 후 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초를 30 cycle이 되도록 설정하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분간 처리되도록 하였다. PCR 산물은 ethidium bromide로 염색된 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 UV로 확인하였다.

<1-4> TaqMan qPCR을 이용한 copy 수 분석

TaqMan^® 시약(Applied Biosystems, CA USA)을 이용하여형질전환체의 copy 수 분석을 수행하였다. qPCR 반응액은 2 반복으로 ABI7900HT(Applied Biosystem, CA USA) 기기를 이용하여 진행되었다. 반응조건은 다음과 같다: 95℃에서 10분간 enzyme activation, 95℃에서 15초간 denaturation, 그리고 60℃에서 60초간 annealing. 증폭 후, 데이터 파일은 CopyCaller^® Software v2.0 (Applied Biosystem, CA USA)을 이용하여 분석하였다. 각 실험 샘플에서 타겟하는 염기서열의 카피수는 상대값 C_T(ΔΔC_T)를 이용한 relative quantitation(RQ)에 의해 결정되었다. 이 방법은 타겟유전자와 reference 염기서열의 서로 다른 CT 값을 측정하여 실험샘플의 ΔCT 값과 타겟 염기서열의 2 copy로 알려진 샘플로 기준을 잡아 비교하였다. Copy 수는 상대 측정치 2배로 측정되었다.

<1-5> 발현량 분석

OsCYP71 유전자 발현을 확인하기 위해, 흰잎마름병 저항성 품종(진백)과 모품종(동진)에 흰잎마름병을 접종 후 다른 기관별, 성장 단계별 및 시간별로 Total RNA를 추출하였다.

벼 조직은 뿌리, 줄기, 잎집(leaf sheath), 잎, 지엽(frag leaf)으로 나누어 샘플링하였고, 성장 단계별로 3엽 유묘기(3-leaf stage seedling), 최대분얼기(maximum tillering)의 식물체, 이삭초기(panicle initiation)단계에서도 샘플링하였다.

Pathogenesis-related(PR1a, PR1b, PR1c) 유전자의 발현량을 확인하기 위하여, 형질전환체와 모품종을 Xoo에 감염시킨후 잎조직을 샘플링하였다. total RNA 추출 및 cDNA를 합성하여 OsCYP71-특이 프라이머((FW) ATGGACGAGCTCTTCTACCAGTC(서열번호 3), (RV) CTAATTGGCAGAGACCACAGGGA(서열번호 4))를 이용하여 qRT-PCR을 실행하였다.

<1-6> 흰잎마름병 선별검사

형질전환 T0 식물체를 온실에서 순화시킨 후 28일 후에 논으로 이식하였다. 식물체는 접종하기 전까지 8주 동안 생육하였다. 박테리아 현탁액은 Xanthomonas oryzae pv. Oryzae (K2) 을 peptone sucrose agar(PSA) 배지에서 48시간 동안 키우고 1 ⅹ10⁸cfu/ml (Nino et al. 2015) 농도로 희석하여 사용하였다. 식물체의 접종은 전엽처리법을 이용하였고 T₀식물체로부터 식물체당 5개 잎에 접종하여 반복실험 하였다. 대조구 품종은 모품종이자 감수성 품종인 동진을 사용하였고 저항성 품종은 진백벼를 이용하였다. 상처 길이는 접종 후 8일, 12일, 16 일차에 cm 단위로 측정하였다. 상처의 길이는 기준평가 시스템(SES IRRI, 1996)을 기반으로 측정하였다. 0.0 ~ 5.0 cm(저항성, R), 5.1 ~ 10.0 (약간의 저항성, MR), 10.1 ~ 15.0 (약간 감수성), ≥15.1 (감수성, S).

<1-7> OsCYP71의 AA염기서열의 In silico 분석

타겟 유전자의 염기서열은 NCBI 데이터베이스를 기반한 BLAST 프로그램을 이용하여 확인하였다. 추정되는 OsCYP71과 다른 CYP71 유전자의 alignment는 ClustalX 프로그램(Thompson et al. 1997)을 이용하여 수행하였다. 계통수는 MEGA 프로그램 v7.0에서 1000개의 부트스트랩으로 neighbor-joining(NJ) 방법을 사용하여 구축하였다.

< 실시예 2> OsCYP71의 시퀀스 , 계통 발생 및 구조 분석

OsCYP71(KY366226)의 시퀀스, 계통분석, 구조분석을 통해 1,530 bp의 ORF를 가지며 이는 509개의 아미노산을 암호화하며 이 아미노산은 56.50223 kDA의 분자량과 9.2397의 이론적 등전점을 가진다(도 2A). 계통분석은 다중서열배치에 근거하였으며 보존영역 단백질에 대한 분석은 시토그롬 P450 효소인 premnaspirodiene oxygenase를 암호화하는 유전자라는 것을 예측하였다(도 2B). 유전자 온톨로지를 통해 이 유전자의 기능이 산화환원과 헴철 결합에 관여함을 분석하였다.

KY366226의 아미노산의 추론은 스마트 블라스트 분석을 통해 Oryza branchyantha 종으로 상대적으로 먼 관계의 CYP71 유전자인 XP006660483.1와 높은 상동성(88%)을 보였다. 계통수(도 3A)는 CYP71의 3개의 군집으로 분류되었다. KY366226는 XP004981824.1 (S. italica), ACM69384.1 (P. praecox), XP 002441847.1 (S. bicolor), NP 001146497.1 (Z. mays), OEL32185.1 (D. oligosanthes), CDM81270.1 (T. aestivum), BAJ89686.1 (H. vulgare subsp. vulgare)가 포함된 다른 식물 종에서 CYP71 유전자의 분류되지 않은 그룹에 영향을 받는다. 두 번째 군집은 CYP71D에 해당되는 단백질로 구성되며 동시에 CYP71A와 CYP71B관련 단백질도 2번 군집에 구성된다. KY366226으로부터 더 밀접한 관계에 있는 CYP71 단백질 분류는 위에서 언급한 유전자로 벼의 시토그롬 P450 71 (OsCYP71)이다. 아미노산 서열의 군집분석을 통해 다른 식물종에서 또 다른 CYPY7유전자와의 상동성을 보였다. 동기검사를 통해 시토그롬 P450 효소 가운데 높은 보존되는 단백질의 C-말단에 위치하는 시스테인 헴철 항체 특징에 대한 검증을 하였다(도 3B). N-terminal 신호 펩티드의 측정은 3가지의 예측기법으로 Phobius, PrediSi, SignalIP이며 이를 이용하여 분석했다. 모든 예측에서 OsCYP71는 신호 펩티드를 포함하지 않았으나 이 단백질은 막전위 또는 비 분비와 개연성이 있다. OsCYP71의 소수성 정도에 대한 질량분석에서 Kyte-Doolittle 정도는 알파-나선 횡단 막의 양적수치에서 최대치를 나타낸다. 이 소수성 아미노산 사슬 영역은 인산기와 연관되어 있다.

< 실시예 3> OsCYP71 과발현 형질전환 벼의 세대 증식

OsCYP71의 cDNA 전체를 CaMV 35S 프로모터가 과발현을 조절하는 pCAMBIA1300내로 삽입했다(도 1A). 재조합 아그로박테리움 (EHA105)을 이용하여 벼의 캘러스에 접종했다. 이후 조직배양실에서의 선발과정과 재분화체를 유도하여 얻어진 식물체를 온실로 이식하였다. 목표유전자의 삽입 여부를 확인하기 위해 genomic PCR을 수행하였다(도 5A). 두 개의 대조군을 사용한 TaqMan qRT-PCR을 통해 단일 copy 개체를 확보하였으며(OaCYP71-1, OaCYP71-2)(도 5B) 이를 이용하여 표현형 분석을 위해 시험포장에 이식하였다.

<실시예 4> OsCYP71의 시공간적 발현

Real-time PCR 분석으로 벼 조직별로 OsCYP71 유전자의 발현량을 확인한 결과 이 유전자가 조직 특이적임이 확인하였다(도 6A).

그 결과 잎, 지엽, 뿌리에서 발현이 높은 것을 확인했고 반면 줄기와 잎집에서는 거의 발현이 확인되지 않았다. 발현 양상은 생육단계별로 차이를 보였으며 발현이 높은 단계는 최고분얼기와 유수분화기를 포함하는 후반 생육단계였으며 발아 초기 및 3 엽기에서는 발현이 낮은 것을 확인하였고(도 6B), 동진(감수성 품종)과 진백(저항성 품종)에서 OsCYP71의 발현은 Xoo 균주 K2의 접종에 의해 조절되므로 거의 동일한 양상을 보였으며 저항성 품종인 진백에서 가장 높은 발현을 보였으며 부분적으로 접종 후 4시간과 8시간에 가장 높은 발현을 보이는 것을 확인하였다(도 6C).

<실시예 5> OsCYP71는 흰잎마름병 저항성을 분석

병변의 길이를 관찰 시간과 비교할 경우 흰잎마름병을 처리한 식물체마다 뚜렷한 경향이 나타났다. 저항성 품종인 진백(Jinbek)은 질병진행률곡선(area under the disease progress curve, AUDPC)에서 질병 진행률이 가장 낮았고, OsCYP71-1과 OsCYP71-2 형질전환체 순이었다. 이들 형질전환체는 감수성인 모품종 동진벼보다 질병진행률이 낮았다. 접종 16일 후에 2개의 형질전환체들의 병반 길이는 동진벼와 비교시 현저히 감소하였다(표 1, 도 7B). 특히, 동진벼의 평균 병반 길이는 19cm인 반면 OsCYP71-1 형질전환체는 8cm 병반 길이를 보이는 것을 확인하였다.

Lines	Mean±SD	SES(Index)
Dongjin	19.0±1.66	S
Jinbaek	1.0±0.04	R
OsCyp71-1	8.0±1.27	MR
OsCYP71-2	12.0±0.86	MS

< 실시예 6> OsCYP71 매개 면역에 PR 유전자 관련성 분석

병원성 관련(PR) 유전자의 전사 조절은 OsCYP71 매개 저항성에서 Xoo에 의해 유도되었을 가능성이 높으므로 3개의 PR 유전자들(PR1a, PR1b, PR1c) 발현량은 OsCYP71-1 형질전환체(중도저항성)에서 모두 상승했지만, OsCYP71-2 형질전환체(중도감수성)에서는 PR1c 유전자만이 발현되었다(도 8). 전반적인 패턴을 살펴보면, 형질 전환 식물체에서 PR 유전자의 발현 수준의 차이는 OsCYP71에 의해 부여된 저항성의 크기와 상관관계가 있었다. 이들 PR 유전자들은 모품종 동진에서는 활성화 되지 않는 것을 확인하였다.

전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 겹합된 형태로 실시될 수 있다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> OsCYP71 Gene Enhancing Pathogen Resistance of Plant and Uses Thereof <130> PN1612-469 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1530 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggacgagc tcttctacca gtcgctgctg ctgtcggtgg cggccgtgac ggtgctgcag 60 ctgctgaagc tgctcctggt gcggcatcgc cgtccccgga cgccgccggg gccgtggcgg 120 ctgccggtga tcggcagcat gcaccacctg gtgaacgtgc tcccgcaccg caagctgcgg 180 gagctcgcgg cggtgcacgg cccgctgatg atgctgcagc tcggggagac gccgctggtg 240 gtggccacct ccaaggagac ggcgcgcgcg gtgctcaaga cccacgacac caacttcgcg 300 acgcggcccc ggctgctcgc cggcgagatc gtcggctacg agtgggtcga catcctcttc 360 tccccctccg gcgactactg gcgcaagctc cgccagctct gcgccgccga gatcctcagc 420 cccaagcgcg tcctctcctt ccgtcacatc agggaagacg aggtgatgat gcgtgtaaac 480 gagatccgcg cggcggggcc gacgacgccg gtgaacctga gcgtgatgtt ccacagcgtc 540 accaacagca tcgtgtcgcg ggcggcgttc gggaagaaga ggaagaacgc ggcggagttc 600 ctggcggcca tcaagtccgg cgtcggcctc gccagcggct tcaacatccc cgacctcttc 660 ccgacatgga cggggatcct cgccacggtc accggcatga agcgcagcct ccgggccatc 720 tacacgacgg tggacggcat cctcgaggag atcatcgccg agaggaaggg catccgcgac 780 gagaagatca gcggcggcgc ggagaacgtc gacgagaacc tcgtggacgt gctcatcggc 840 ctccagggga aaggtggctt cggattccac cttgacaaca gtaaaatcaa ggctatcatc 900 ctggacatgt ttgccggagg aacggggaca tcggcgtcgg ccatggagtg ggggatgtcg 960 gagctgatgc ggaacccctc cgtgatgaaa aaactacaag cagaaatccg cgaagtgctc 1020 cgagggaagg cgacggtgac cgaggccgac atgcaagcag gcaacctccg ttacctgaag 1080 atggtgatca gggaggcgct acggctgcac ccaccggcgc ctcttctagt gccgagggag 1140 agcatcgacg tgtgcgagct cgacgggtac acgatccctg ccaaatcacg cgttatcatc 1200 aacgcgtggg cgataggacg cgaccccaag tactgggata atcctgagga gttcaggcca 1260 gaacggttcg aggatggaac cctcgacttc acgggaagca actatgagtt catccctttc 1320 ggctctggcc ggaggatgtg ccccggtttc aactatggcc tcgcaagcat ggagctcatg 1380 tttacgggtc ttctctacca cttcgaccgg tcgctaccgg agggtgtaaa tgaggtggac 1440 atggcggagg cgccaggcct cggggttcgc cgccgctcgc cactgatgct gtgcgccacc 1500 ccgtttgtcc ctgtggtctc tgccaattag 1530 <210> 2 <211> 509 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Asp Glu Leu Phe Tyr Gln Ser Leu Leu Leu Ser Val Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Val Leu Gln Leu Leu Lys Leu Leu Leu Val Arg His Arg Arg Pro 20 25 30 Arg Thr Pro Pro Gly Pro Trp Arg Leu Pro Val Ile Gly Ser Met His 35 40 45 His Leu Val Asn Val Leu Pro His Arg Lys Leu Arg Glu Leu Ala Ala 50 55 60 Val His Gly Pro Leu Met Met Leu Gln Leu Gly Glu Thr Pro Leu Val 65 70 75 80 Val Ala Thr Ser Lys Glu Thr Ala Arg Ala Val Leu Lys Thr His Asp 85 90 95 Thr Asn Phe Ala Thr Arg Pro Arg Leu Leu Ala Gly Glu Ile Val Gly 100 105 110 Tyr Glu Trp Val Asp Ile Leu Phe Ser Pro Ser Gly Asp Tyr Trp Arg 115 120 125 Lys Leu Arg Gln Leu Cys Ala Ala Glu Ile Leu Ser Pro Lys Arg Val 130 135 140 Leu Ser Phe Arg His Ile Arg Glu Asp Glu Val Met Met Arg Val Asn 145 150 155 160 Glu Ile Arg Ala Ala Gly Pro Thr Thr Pro Val Asn Leu Ser Val Met 165 170 175 Phe His Ser Val Thr Asn Ser Ile Val Ser Arg Ala Ala Phe Gly Lys 180 185 190 Lys Arg Lys Asn Ala Ala Glu Phe Leu Ala Ala Ile Lys Ser Gly Val 195 200 205 Gly Leu Ala Ser Gly Phe Asn Ile Pro Asp Leu Phe Pro Thr Trp Thr 210 215 220 Gly Ile Leu Ala Thr Val Thr Gly Met Lys Arg Ser Leu Arg Ala Ile 225 230 235 240 Tyr Thr Thr Val Asp Gly Ile Leu Glu Glu Ile Ile Ala Glu Arg Lys 245 250 255 Gly Ile Arg Asp Glu Lys Ile Ser Gly Gly Ala Glu Asn Val Asp Glu 260 265 270 Asn Leu Val Asp Val Leu Ile Gly Leu Gln Gly Lys Gly Gly Phe Gly 275 280 285 Phe His Leu Asp Asn Ser Lys Ile Lys Ala Ile Ile Leu Asp Met Phe 290 295 300 Ala Gly Gly Thr Gly Thr Ser Ala Ser Ala Met Glu Trp Gly Met Ser 305 310 315 320 Glu Leu Met Arg Asn Pro Ser Val Met Lys Lys Leu Gln Ala Glu Ile 325 330 335 Arg Glu Val Leu Arg Gly Lys Ala Thr Val Thr Glu Ala Asp Met Gln 340 345 350 Ala Gly Asn Leu Arg Tyr Leu Lys Met Val Ile Arg Glu Ala Leu Arg 355 360 365 Leu His Pro Pro Ala Pro Leu Leu Val Pro Arg Glu Ser Ile Asp Val 370 375 380 Cys Glu Leu Asp Gly Tyr Thr Ile Pro Ala Lys Ser Arg Val Ile Ile 385 390 395 400 Asn Ala Trp Ala Ile Gly Arg Asp Pro Lys Tyr Trp Asp Asn Pro Glu 405 410 415 Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asp Gly Thr Leu Asp Phe Thr Gly 420 425 430 Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Met Cys Pro 435 440 445 Gly Phe Asn Tyr Gly Leu Ala Ser Met Glu Leu Met Phe Thr Gly Leu 450 455 460 Leu Tyr His Phe Asp Arg Ser Leu Pro Glu Gly Val Asn Glu Val Asp 465 470 475 480 Met Ala Glu Ala Pro Gly Leu Gly Val Arg Arg Arg Ser Pro Leu Met 485 490 495 Leu Cys Ala Thr Pro Phe Val Pro Val Val Ser Ala Asn 500 505 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsCYP71 forward primer <400> 3 atggacgagc tcttctacca gtc 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsCYP71 reverse primer <400> 4 ctaattggca gagaccacag gga 23

Claims

서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼(Oryza sativa) 유래의 OsCYP71(Oryza sativa cytochrome P45071) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 벼 캘러스에 형질전환시켜 OsCYP71 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 벼의 흰잎마름병 저항성을 증가시키는 방법.
삭제
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 OsCYP71 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 벼 캘러스에 형질전환시켜 OsCYP71 유전자를 과발현하는 단계; 및
상기 형질전환된 벼 캘러스를 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 흰잎마름병 저항성이 증가된 형질전환 벼의 제조방법.
삭제
제3항의 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 흰잎마름병 저항성이 증가된 형질전환 벼.
제5항에 따른 벼의 형질전환된 종자.
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 OsCYP71 유전자를 유효성분으로 포함하는 벼의 흰잎마름병 저항성 증가용 조성물.
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 OsCYP71 유전자의 발현이 증가되어 흰잎마름병 저항성이 증가된 돌연변이 벼.
삭제
제8항에 따른 벼의 형질전환된 종자.