KR101611428B1

KR101611428B1 - 가뭄 저항성 ＯｓＤＷ２ 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101611428B1
Application number: KR1020140052483A
Authority: KR
Inventors: 변명옥; 문석준; 한세연; 윤혜진; 김범기; 윤인선; 김둘이; 신동진
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2014-04-30
Filing date: 2014-04-30
Publication date: 2016-04-12
Also published as: KR20150125799A

Abstract

본 발명은 가뭄 저항성 OsDW2 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 벼에서 분리한 OsDW2 유전자를 형질전환한 식물체가 가뭄 저항성 증진에 효과가 있는 것을 확인하여 이를 이용하여 가뭄에 강한 식물체를 생산하는데 이용할 수 있다.

Description

가뭄 저항성 ＯｓＤＷ２ 유전자 및 이의 용도{OsDW2 gene for enhancing drought resistance and their uses}

본 발명은 가뭄 저항성 벼 유전자인 OsDW2(Oryza sativa Drought response WD domain 2) 및 이의 용도에 관한 것이다.

유비키틴 프로티아좀시스템(ubiquitin/26S proteasome system, UPS)은 단백질의 분해를 통해서 세포의 생리 과정을 조절한다. UPS 기질은 E1, E2, E3효소와 함께 분해할 타겟 단백질을 다중 유비키틴 체인에 결합시킨다. 다중유비키틴에 결합한 타겟 단백질은 26S 프로티아좀에 의해 분해된다.

고등식물은 이동이 불가하기 때문에 그들의 일생동안 다양한 환경 요인들인 가뭄, 고염(high salt), 중금속, 냉해, 열충격 및 오존과 같은 스트레스에 직면하게 된다. 이러한 비생물학적 스트레스는 작물의 생장과 발달의 제한 요인이 되며 이들 스트레스 중에서 수분 부족은 작물생산 감소의 주요 원인으로 여겨지는 가장 심각한 환경 요인이다. 세계적으로 물의 소비는 계속적으로 증가되어 왔으며, 깨끗한 물의 이용가능성은 인간뿐만 아니라 고등식물에게 또한 중요한 문제가 될 수 있다. 식물은 단기적 또는 장기적인 물부족에 대해 내성을 증가시키기 위해 신호 네트워크 경로를 조절하거나 스트레스-반응성 유전자들을 유도하는 등의 다양한 방어 전략을 작동시킨다. 이러한 수분 스트레스에 대한 세포적 또는 유전적 방어 메카니즘은 널리 알려져 있다(Shinozaki and Yamaguchi-shinozaki, 2007). 그러나 아직까지 고등식물에 있어서 스트레스에 대한 내성이나 민감성에 관여하는 스트레스-관련 유전자들의 생물학적 기능들에 대한 지식은 여전히 부족한 상태다. 그러므로 작물의 생산성을 증가시키기 위해 스트레스 반응 유전자들에 대한 기능 연구가 중요하다.

이에, 본 발명자들은 식물 유래의 가뭄 저항성을 가지는 유전자를 탐색하였으며, 가뭄 저항성 벼 유전자인 OsDW2(Oryza sativa Drought response WD domain 2)을 발견하였다. 따라서 OsDW2 유전자를 이용한 가뭄 저항성을 가지는 형질전환 벼는 갑작스러운 지구의 기후 변화에 적절이 대응할 수 있는 재해 저항성 작물이며, 안정적으로 작물 생산을 가능하므로 유용하게 이용될 것이다.

본 발명의 목적은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 벼 유래의 OsDW2(Oryza sativa Drought response WD domain 2) 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 가뭄 저항성 증진용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하여 OsDW2 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 가뭄 저항성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환되어 가뭄 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 벼(Oryza sativa L.) 유래의 OsDW2(Drought response WD domain 2) 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 가뭄에 대한 저항성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼 유래의 OsDW2(Oryza sativa Drought response WD domain 2) 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 OsDW2 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 백터를 이용한 가뭄 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환되어 가뭄 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 가뭄에 대한 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

벼 유래의 OsDW2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 가뭄 저항성 증진용 재조합 벡터로 형질전환된 식물체는 생육상태는 변화시키지 않고 가뭄저항성을 증진시킬 수 있으므로 환경재해저항성 작물을 개발에 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 OsDW2(LOC_Os08g44010)의 유전자 구조(A) 및 아미노산 서열(B)를 나타낸 도이다.
도 2는 OsDW2 과발현 형질전환 벡터인 pGA2897-OsDW2를 나타낸 도이다.
도 3은 OsDW2 유전자의 조직별 발현 패턴을 나타난 도이다:잎 초(Sheath), 잎 몸(Blade), 마디(Node), 분얼(Tiller), 꽃(Flower) 및 뿌리(Root).
도 4는 노던 분석법을 이용한 OsDW2 과발현 형질전환체의 삽입유전자 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 OsDW2 과발현 형질전환체의 가뭄저항성을 검정한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 벼 유래의 OsDW2(Oryza sativa Drought response WD domain 2) 단백질을 제공한다.

본 발명에 따른 OsDW2 단백질의 범위는 벼(Oryza sativa)로부터 분리된 서열번호 2의 아미노산으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

또한, 본 발명은 상기 OsDW2 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자 또는 이의 상동 유전자는 단백질로 암호화된다.

상기 "상동 유전자"란 서열번호 1의 염기서열과 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 유전자로서 본 발명의 OsDW2 유전자와 실질적으로 동질의 기능을 나타내는 유전자를 말한다. 서열 상동성은 당업계에 공지된 방법으로 분석될 수 있다. 상기 유전자는 WD 도메인(domain)을 포함한다. 본 발명의 유전자는 OsDW2 단백질을 암호화하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 OsDW2 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게 도 2에 기재된 pGA2897-OsDW2 벡터일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부,소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다.

본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E.coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae),곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 벼(Oryza sativa L.) 유래의 OsDW2(Drought response WD domain 2) 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 가뭄 저항성 증진용 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하여 OsDW2 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 가뭄 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 벼(Oryza sativa L.) 유래의 OsDW2(Drought response WD domain 2) 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 가뭄 저항성 증진용 재조합 벡터로 형질전환되어 가뭄 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 상기 형질전환 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 가뭄에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

아울러, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 벼(Oryza sativa L.) 유래의 OsDW2(Drought response WD domain 2) 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 가뭄에 대한 저항성 증진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에서, 상기 OsDW2 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 본 발명의 조성물은 유효 성분으로서 벼 유래의 OsDW2 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 가뭄에 대한 저항성을 증가시킬 수 있는 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 가뭄저항성 유전자 선발

애기장대에서 WD 도메인을 지니고 있는 dwd 유전자그룹 중에서 At1g76260 유전자가 녹아웃(knockout)된 변이체는 식물 스트레스호르몬인 ABA에 과민한(hypersensitive) 반응을 보이며 가뭄에 저항성을 보였다. 애기장대 At1g76260 유전자의 벼 동족체(homologue)인 LOC_Os08g44010를 동진벼에서 크로닝하여 염기서열을 분석하고 구조를 비교한 결과 도 1에 나타난 바와 같이 DWD 도메인을 지닌 유전자임을 확인하였다.

< 실시예 2> 형질전환 식물체 제작 및 선발

OsDW2 유전자를 상시 발현하도록 유비퀴틴 프로모터(ubiquitin promoter)의 조절을 받도록 벡터 pGA2897/OsDW2를 제작하여(도 2) A. tumefaciens LBA4404에 감염시켜 벼(품종:동진벼)에 형질전환하였다. 형질전환된 31종의 클론을 얻었다. 상기에서 얻어진 OsDW2 형질전환체들을 대상으로 구조 유전자 부위가 삽입되었는지의 여부를 확인하기 위하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 독립적으로 재분화된 31개의 식물체로부터 분리된 게놈(genomic) DNA를 주형으로, 유전자 특이적(specific) 프라이머(정방향(Forward): 5'-ATGCAGGGCGGATCTAGC-3'(서열번호 3), 역방향(Reverse): 5'-TCATTTTCTCTGCAAGTAGGGCTTGAC-3'(서열번호 4)) 이용하여 중합효소연쇄반응을 실시하였다.

< 실시예 3> OsDW2 유전자의 기관별 발현 패턴 조사

OsDW2 유전자의 조직별 발현 패턴을 분석하기 위해 동진벼의 잎 초(Sheath), 잎 몸(Blade), 마디(Node), 분얼(Tiller), 꽃(Flower) 및 뿌리(Root) 조직으로부터 전체 RNA를 분리하였다. 각 기관으로부터 분리된 RNA를 이용하여 Clontech사의 cDNA EcoDry Premix kit을 이용하여 cDNA을 합성하였다. 각 기관별로 합성된 cDNA을 주형으로 하여 RT-PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 2분간 변성(denaturation) 시킨 후, 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초의 반응시간을 주여 총 28 사이클을 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다. 반응된 PCR 산물은 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동하여 발현 여부를 확인하였다.

그 결과, 벼의 잎 초(Sheath), 잎 몸(Blade), 마디(Node), 분얼(Tiller), 꽃(Flower) 및 뿌리(Root) 조직에서 OsDW2 유전자가 발현됨을 확인하였으며 특히 마디부분과 화기부분에서 발현이 증폭되었다(도 3).

< 실시예 4> 벼 형질전환체 발현확인

OsDW2 과발현 형질전환체들을 대상으로 삽입유전자의 발현 유무를 조사하기 위해 OsDW2 유전자를 프로브(probe)로 사용하여 노던(Northern) 분석을 실시하였다.

구체적으로, 동진벼와 과발현 형질전환체로부터 전체 RNA를 분리하였고, 분리된 RNA는 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 정량 한 후 20㎍의 RNA를 1.2% 아가로스 겔(포름알데히드(formaldehyde) 18.5ml, 10×Mops buffer 9ml)상에서 전기영동 하였다. 전기영동한 겔은 멸균수에 30분간 2번, 10×SSC 버퍼(Tri-sodium citrate 8.8g, NaCl 17.5g per liter, pH7~8)에 30분간 1번 워싱한 후, 10×SSC 버퍼를 트렌스퍼 버퍼로 캐펄레리 트렌스퍼(capillary transfer) 방법을 통해 HybondN+ 막으로 옮겼다. 옮긴 RNA는 UV-crosslinker로 멤브레인에 고정되었고, 65℃에서 15분간 혼성화 완충버퍼(1% BSA, 1mM EDTA, 7% SDS, 0.5M NaHPO4, pH7.2)로 전혼성화(pre-hybridization)를 하였다. 전혼성화 버퍼를 제거한 후, 혼성화는 65℃에서 하루동안 ³²P로 표지된 OsDW2 유전자에 특이적인 프로브가 포함된 혼성화 버퍼에서 수행되었다. 멤브레인은 0.1% SDS가 포함된 2×SSC 버퍼로 65℃에서 10분간 워싱하고, 0.1% SDS가 포함된 1×SSC 버퍼로 65℃에서 10분간 2번 반복하여 워싱하였다. 워싱된 멤브레인은 BAS 필름을 이용하여 1일 감광시킨 후 현상하였다.

그 결과, #4, #10, #24, #29번 라인에서 OsDW2 유전자의 발현이 가장 높게 관찰되었고 #6, #13, #30번 라인은 발현이 중간 정도였으며, #23라인은 발현이 약한 것을 확인하였다(도 4).

< 실시예 5> 형질전환 벼의 가뭄저항성 분석

온실조건에서 OsDW2 과발현 형질전환체의 가뭄저항성을 조사하였다.

구체적으로, 대조군과 OsDW2 과발현 형질전환체의 외형적인 농업적 특성들은 거의 유사한 것으로 조사되었다. 잎의 형태와 잎의 크기도 거의 유사함을 관찰할 수 있었다. 비생물학적 스트레스 중 하나인 한발(drought stress)에 대한 OsDW2 과발현 형질전환 식물체의 표현형을 조사하였다.

과발현 형질전환체를 항생제가 첨가된 배지에서 선발을 한 후, 대조군(동진)과 함께 수도용 상토에 각각 20개체씩 옮겨 심어 온실조건에서 3주간 생육시켰다. 식물체가 건조 처리를 시작한지 약 12일 후부터 스트레스를 받기 시작하여 15일경부터 대조군과 OsDW2 과발현 형질전환체가 건조에 대하여 저항성 정도의 차이를 보였다. 건조 스트레스 처리 후 20일경에 재관수를 실시하여 식물체의 회복력을 관찰하였다.

그 결과, #4, #10 및 #13번 라인의 과발현 형질전환체가 대조군에 비해 건조 스트레스에 강한 표현형을 보여주었고, #6번 라인의 과발현 형질전환체는 다른 형질전환체 라인에 비해 다소 약한 건조 저항성 표현형을 보여주었다. #4 및 #10번의 과발현 형질전환체 라인은 유전자 발현도 강하고 가뭄저항성도 잘 나타나는 것을 확인하였다(도 5).

<110> republic of Korea <120> OsDW2 gene for enhancing drought resistance and their uses <130> P14R12D0067 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1056 <212> DNA <213> Oryza sativa L. <400> 1 atgcagggcg gatctagcgg catcgtctac ggcggcctca agtaccaggc gcggtgcatc 60 gccgacgtgc gcgcggccgc cgggtcgacc accttcctcg ccggaaccct cagtctcaag 120 gaggagaacg aggtgcacct gatccggttt tcaccggcgg agagcgagct ggtgtgcgac 180 gggctgttct accatccaaa cgagatctgg gaccttaagt cttgcccctt cgatcatagg 240 gtcttctcca cagtctacac gtctggcgag ggctatggtg catctgtttg gaagatcccg 300 gagctgcacg ggcagtcgaa ttcgccgcca cttgagcagc ttttcacgct tgatgagcac 360 acgggcaaaa taagatgtgt tctctggtgg ccactaggga agcacgacaa gttaattagt 420 attgatgaca gaaatatttt cctctggaat atagatgcat caaataagtc agccaaggtg 480 atgcaaaagg ggtctgctga catgcttccc aatttacgtg gtggatcttg ggatccacac 540 gatcacaatt caattgctgc aattactgat tcctcacttc actgctggga tctccgttct 600 atgaagaaat caaatgcaat tgagcatgcg cattttcggg atgtggatta taaccccaag 660 aaacagcact taattacaac agcagaggat gaatttggta tccgtttgtg ggatctcaga 720 atgcttaagt atcctctgaa gaatctccct gggcattcgc attggacatg ggctgttcgg 780 cacaatcctg agcatgacca gttgattctg agtgctggaa cagattcaac tgtcaatttg 840 tggtttgcta aagttggcac tgatgactca ggacctgaaa gtcctcctgg ttcacccaca 900 agagaagaag aaccattact aagttcatac actgattatg aagatagcat atacggtatt 960 gcatggagct cccatgatcc gtcattattt gcttctttat cttatgacgg aagggttgtt 1020 ttagaatcag tcaagcccta cttgcagaga aaatga 1056 <210> 2 <211> 351 <212> PRT <213> Oryza sativa L. <400> 2 Met Gln Gly Gly Ser Ser Gly Ile Val Tyr Gly Gly Leu Lys Tyr Gln 1 5 10 15 Ala Arg Cys Ile Ala Asp Val Arg Ala Ala Ala Gly Ser Thr Thr Phe 20 25 30 Leu Ala Gly Thr Leu Ser Leu Lys Glu Glu Asn Glu Val His Leu Ile 35 40 45 Arg Phe Ser Pro Ala Glu Ser Glu Leu Val Cys Asp Gly Leu Phe Tyr 50 55 60 His Pro Asn Glu Ile Trp Asp Leu Lys Ser Cys Pro Phe Asp His Arg 65 70 75 80 Val Phe Ser Thr Val Tyr Thr Ser Gly Glu Gly Tyr Gly Ala Ser Val 85 90 95 Trp Lys Ile Pro Glu Leu His Gly Gln Ser Asn Ser Pro Pro Leu Glu 100 105 110 Gln Leu Phe Thr Leu Asp Glu His Thr Gly Lys Ile Arg Cys Val Leu 115 120 125 Trp Trp Pro Leu Gly Lys His Asp Lys Leu Ile Ser Ile Asp Asp Arg 130 135 140 Asn Ile Phe Leu Trp Asn Ile Asp Ala Ser Asn Lys Ser Ala Lys Val 145 150 155 160 Met Gln Lys Gly Ser Ala Asp Met Leu Pro Asn Leu Arg Gly Gly Ser 165 170 175 Trp Asp Pro His Asp His Asn Ser Ile Ala Ala Ile Thr Asp Ser Ser 180 185 190 Leu His Cys Trp Asp Leu Arg Ser Met Lys Lys Ser Asn Ala Ile Glu 195 200 205 His Ala His Phe Arg Asp Val Asp Tyr Asn Pro Lys Lys Gln His Leu 210 215 220 Ile Thr Thr Ala Glu Asp Glu Phe Gly Ile Arg Leu Trp Asp Leu Arg 225 230 235 240 Met Leu Lys Tyr Pro Leu Lys Asn Leu Pro Gly His Ser His Trp Thr 245 250 255 Trp Ala Val Arg His Asn Pro Glu His Asp Gln Leu Ile Leu Ser Ala 260 265 270 Gly Thr Asp Ser Thr Val Asn Leu Trp Phe Ala Lys Val Gly Thr Asp 275 280 285 Asp Ser Gly Pro Glu Ser Pro Pro Gly Ser Pro Thr Arg Glu Glu Glu 290 295 300 Pro Leu Leu Ser Ser Tyr Thr Asp Tyr Glu Asp Ser Ile Tyr Gly Ile 305 310 315 320 Ala Trp Ser Ser His Asp Pro Ser Leu Phe Ala Ser Leu Ser Tyr Asp 325 330 335 Gly Arg Val Val Leu Glu Ser Val Lys Pro Tyr Leu Gln Arg Lys 340 345 350 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> specific primer forward <400> 3 atgcagggcg gatctagc 18 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> specific primer reverse <400> 4 tcattttctc tgcaagtagg gcttgac 27

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 벼 유래의 OsDW2(Oryza sativa Drought response WD domain 2) 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 가뭄 저항성 증진용 재조합 벡터.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 벼(Oryza sativa L.) 유래의 OsDW2(Drought response WD domain 2) 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 가뭄 저항성 증진용 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하여 OsDW2 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 가뭄 저항성을 증가시키는 방법.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 벼(Oryza sativa L.) 유래의 OsDW2(Drought response WD domain 2) 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 가뭄 저항성 증진용 재조합 벡터로 형질전환되어 가뭄 저항성이 증진된 형질전환 식물체.
제 3항에 따른 형질전환 식물체의 형질전환된 종자.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 벼(Oryza sativa L.) 유래의 OsDW2(Drought response WD domain 2) 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 가뭄에 대한 저항성 증진용 조성물.