TWI381054B - 一種鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法及該方法所使用之引子對 - Google Patents

Description

一種鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法及該方法所使用之引子對

本發明係關於一種植物品種鑑別方法，特別係關於一種可於番石榴植株產生果實前，利用本發明設計之專一性引子對達到快速且準確的鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法。

番石榴(Psidium guajava L.)又名芭樂、拔仔及那拔等，為桃金孃科(Mytaceae)番石榴屬(Psidium )之多年生常綠喬木或灌木，原產於熱帶美洲，主要分布於熱帶及亞熱帶地區。番石榴目前栽培面積約7,500公頃，為本省重要經濟果樹。番石榴依果肉顏色主要可分為紅色和非紅色等種類，臺灣目前市面上販售的品種如珍珠拔、水晶拔等，或製果汁用的如白拔及中山月拔等，均屬於非紅肉的番石榴種類，然早期山野中散見的所謂土拔仔或現在農民零星栽培的所謂紅心拔等則屬於紅肉的番石榴種類。果肉顏色影響番石榴的外觀、口感、營養及利用性，如紅色果肉的番石榴含有類胡蘿蔔素，包括茄紅素(lycopene)與少量的葉黃素(lutein)、β-胡蘿蔔素(β-carotene)及玉米黃質(β-cryptoxanthin)，故紅肉特性為番石榴育種者極有興趣的一個果實性狀。

過去育種者在針對番石榴果肉顏色進行選育時，因為從番石榴的植株形態及未成熟果實外觀無法判斷果肉的顏色，播種後必須育苗直到植株成熟可以結果時，才能得知果肉顏色為何，若能找到一種簡單且準確快速的鑑定方法，在苗期就預知果肉的顏色，將可以節省選種期間所花費的管理人力、時間和成本。

因此，研發一簡單、準確且可快速的鑑別具紅色果肉番石榴之方法係番石榴育種上非常實用的技術。

本發明係提供一種鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法，可於一番石榴在產生果實之前快速且準確的鑑別該番石榴是否具有紅色果肉，以提高育種效率及降低種植成本。

本發明的次一目的係提供一種鑑別具紅色果肉番石榴之引子對，可快速且準確的鑑別一番石榴是否具有紅色果肉。

為達到前述發明目的，本發明所運用之技術內容如下：此發明為一種鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法及該方法所使用之引子對，該方法包含下列步驟：提供待測番石榴DNA；使用一專一性引子對SEQ ID NO：3與SEQ ID NO：8進行聚合酶連鎖反應，再利用限制酶切割聚合酶連鎖反應產物，以產生的切割片段鑑別紅色果肉番石榴基因型；使用一第一專一性引子對SEQ ID NO：7與SEQ ID NO：10及一第二專一性引子對SEQ ID NO：7與SEQ ID NO：11進行聚合酶連鎖反應，分析該聚合酶連鎖反應產物，如此即可有效鑑別出紅色果肉番石榴基因型。

為達本發明之上述及其他目的，使本發明的特徵及優點能更明顯易懂，以下即利用本發明之較佳實施例，配合所附圖式作詳細說明。本發明所使用之各種名詞定義如下：

1、本發明所述之「八氫茄紅素合成酶(phytoene synthase)」以下簡稱為PSY，係指類胡蘿蔔素生合成的第一個酵素，其基因於果實成熟期會大量表達，與果肉顏色的呈現有關。

2、本發明所述之「單一核苷酸多型性(Single Nucleotide Polymorphisms)」以下簡稱為SNP，係指DNA序列上發生單一核苷酸鹼基的變異，包括基因組上單一鹼基的改變或特定核苷酸位置的插入或缺失。

3、本發明所述之「限制酶切割擴增片段多型性序列(cleaved amplified polymorphic sequences)」以下簡稱為CAPS，其係利用聚合酶連鎖反應所擴增片段上針對某一限制酶切位的有無而產生的多型性。

4、本發明所述之「單一核苷酸擴增多型性(single nucleotide-amplified polymorphism)」標記，以下簡稱為SNAP，其係利用於3’端的核苷酸與擬擴增模版上具SNP處互補的基因座專一性引子加以變更，使該引子在離其3’端四個鹼基的範圍內(如於與SNP的鹼基互補者的前一個核苷酸)設計為無法與模版鹼基結合之核苷酸，以增加引子的專一性及對SNP的區別能力。

本發明為一種鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法及該方法所使用之引子對，首先介紹如何找到造成番石榴紅色與非紅色果肉差異的關鍵基因PSY ，然後介紹如何利用該PSY 基因的序列及在該PSY 基因上發生SNP的位點選擇適當限制酶進行CAPS分析，及設計SNAP引子，用以有效鑑別出具紅色果肉的番石榴基因型。

一、鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法所使用引子對之設計

第一步驟為設計退化性引子對。首先由美國國家生物資訊中心基因資料庫(NCBI GenBank)搜尋從果實所分離到的PSY 基因序列，從中選取木瓜、玉米、柑橘、甜椒及番茄果實專一性之PSY 基因序列，利用Clustal W進行多序列比對，再從比對結果所找到之PSY 高度保守區設計退化性引子對。

第二步驟為抽取紅色或非紅色果肉的番石榴葉片DNA及其果實的RNA以合成cDNA。本發明供試材料均採自於屏東科技大學番石榴果園，紅色果肉的番石榴係含66-90、1-4、1-11、2-6、2-7、2-18及36-12共7個品系，另取紅色果肉與非紅色果肉番石榴雜交後代係含66-90×M3及1-4×水晶拔共2個品系，其果肉也呈紅色；而非紅色果肉的番石榴係含M3、珍珠拔、泰國拔、水晶拔、圓葉無籽拔、大蒂頭、梨仔拔、中山月拔及白拔共9個品種(系)。將上述18種番石榴依序編號為1至18號，利用Murray和Thompson(1980)及Saghai-Maroof等(1984)的CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide)法，進行該紅色果肉及非紅色果肉番石榴品種(系)幼嫩葉片的基因組DNA抽取純化，以下稱為紅色果肉番石榴基因組DNA及非紅色果肉番石榴基因組DNA；另萃取紅色果肉及非紅色果肉番石榴果實的RNA，依據Clontech使用說明書進行該紅色果肉及非紅色果肉番石榴cDNA之合成，以下稱為紅色果肉番石榴cDNA及非紅色果肉番石榴cDNA。

第三步驟為以第一步驟中由PSY 基因保守區設計的退化性引子對進行聚合酶連鎖反應。以該高度保守區設計之退化性引子對分別為一正向引子GuPSYF：GHGAAGTWTGYGCHGAGTATG(SEQ ID NO:1)與一反向引子GuPSYR：ACATAWGCTCTCTTBGTGAAGTT(SEQ ID NO:2)，再以該紅色果肉及非紅色果肉番石榴cDNA作為模版，進行聚合酶連鎖反應，以增幅紅色果肉及非紅色果肉番石榴之PSY 基因片段並加以選殖。所選殖之PSY 基因片段經由定序與NCBI資料庫比對確認該增幅之基因片段確為PSY 基因片段。

第四步驟為進一步取得該紅色果肉及非紅色果肉番石榴PSY 基因3’端序列。利用第三步驟退化性引子對選殖所得之PSY 基因片段序列設計3’端RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)之引子對PSY3GSP1：TGAAGGAGCAGATAAAGCGGGCAAGG(SEQ ID NO：3)及PSY3GSP2：ACAAGCAGATCCTGGACGCCATCGAA(SEQ ID NO：4)，以該紅色果肉及非紅色果肉番石榴cDNA作為模版，搭配SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)提供之UPM(Universal Primer Mix)及NUP(Nested Universal Primer)的引子對進行巢式聚合酶連鎖反應(nested PCR)，增幅所得之序列經選殖再由定序與序列比對，確認該序列為PSY 基因3’端序列。

第五步驟為進一步取得該紅色果肉及非紅色果肉番石榴PSY 基因5’端序列。利用第三步驟退化性引子對選殖所得之PSY 基因片段序列設計5’端RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)之引子對PSY5-2:GGAGTGATGTGTGCGGCGTTCGGTC(SEQ ID NO：5)及PSY5-1:ATCCTTCCTCTCCTAGCATCTTCG(SEQ ID NO：6)，以該紅色果肉及非紅色果肉番石榴cDNA作為模版，搭配SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)提供之UPM(Universal Primer Mix)及NUP(Nested Universal Primer)的引子對進行巢式聚合酶連鎖反應(nested PCR)，增幅所得之序列經選殖再由定序與序列比對，確認該序列為PSY 基因5’端序列。

第六步驟為進一步取得該紅色果肉及非紅色果肉番石榴PSY 基因全長序列。根據前述已定序之PSY 基因3’端序列及PSY 基因5’端序列，設計end-to-end的聚合酶連鎖反應引子，包括(1)PSYF：GTTACTGATGACACCGGAGCGCAG(SEQ ID No：7)，該引子包含紅色果肉與非紅色果肉番石榴PSY 基因5’端轉譯起始密碼，(2)PSYR1：TGGTCACGCTCATCCATCTGTTG(SEQ ID No：8)，該引子包含紅色果肉番石榴PSY 基因3’端轉譯終止密碼，及(3)PSYR2：AGCAGCAGCTACGCCATCACTG(SEQ ID No：9)，該引子包含非紅色果肉番石榴PSY 基因3’端轉譯終止密碼，然後以紅色果肉番石榴cDNA作為模版，取引子對PSYF及PSYR1進行紅色果肉番石榴PSY 基因的end-to-end聚合酶連鎖反應，另也以非紅色果肉番石榴cDNA作為模版，取引子對PSYF及PSYR2進行非紅色果肉番石榴PSY 基因的end-to-end聚合酶連鎖反應，分別將二段增幅所得之序列經選殖、定序與序列比對後，確認其序列均為PSY 基因cDNA開放解讀區(open reading frame)序列，稱為PgPSY1 基因，然由序列比對中發現紅色果肉番石榴與非紅色果肉番石榴二者所選殖到的PgPSY1 基因cDNA開放解讀區序列長度不同，分別為804bp與654bp，為區別起見，將紅色果肉番石榴的PgPSY1 基因稱為PgPSY1-1 (SEQ ID NO：15)，而將非紅色果肉番石榴的PgPSY1 基因稱為PgPSY1-2 。

本發明另取該紅色果肉番石榴基因組DNA作為模版，加入引子對PSYF及PSYR1，另取非紅色果肉番石榴基因組DNA作為模版，加入引子對PSYF及PSYR2，分別進行end-to-end聚合酶連鎖反應，經增幅所得之PSY 基因組DNA全長於選殖後，經由定序與序列比對確認得知此二增幅產物分別為該紅色果肉番石榴PgPSY1-1 基因組DNA全長及該非紅色果肉番石榴PgPSY1-2 基因組DNA全長。紅色果肉番石榴PgPSY1 -1 及非紅色果肉番石榴之PgPSY1-2 基因組DNA序列經由end-to-end聚合酶連鎖反應，分別增幅得1,312bp(SEQ ID NO：16)與1,162bp的基因組DNA全長。

第七步驟為分析紅色果肉與非紅色果肉番石榴二者PSY 基因的差異。由上述六個步驟已取得紅色果肉(PgPSY1-1 )及非紅色果肉(PgPSY1 -2)番石榴PSY 基因的基因組DNA全長序列及cDNA開放解讀區全長序列，據此即可比對PgPSY1-1 與PgPSY1-2 二者的差異。

利用軟體分析紅色果肉番石榴PgPSY1-1 及非紅色果肉番石榴PgPSY1-2 之基因組DNA全長序列與cDNA開放解讀區序列，發現PgPSY1-1 與PgPSY1-2 的基因序列之間同質性相當高，DNA結構上皆具有四個外顯子(exon)與三個內插子(intron)。該紅色果肉番石榴PgPSY1-1 基因具有804bp開放解讀區，可轉譯出267個胺基酸，該非紅色果肉番石榴PgPSY1-2 基因具有654bp開放解讀區，可轉譯出217個胺基酸。將PgPSY1-1 與PgPSY1-2 開放解讀區序列進行比對分析，發現二者在第654鹼基位置存在一個SNP，屬於無意義突變，即PgPSY1-1 基因在此位置的鹼基為C ，而PgPSY1-2 在此位置的鹼基則轉變為A ，導致基因在胺基酸的轉譯由絲胺酸(TC G)轉變為終止密碼(TA G)，該轉變使得非紅色果肉番石榴轉譯的PSY蛋白質胺基酸序列縮短，可能因而影響其PSY的功能，造成類胡蘿蔔素無法順利合成而呈現非紅色果肉。

第八步驟為針對發生SNP的位置設計(A)與(B)專一性引子對。該(A)專一性引子對：由第七步驟得知PgPSY1-1 基因開放解讀區第654鹼基位置的C於PgPSY1-2 基因中轉變為A，也得知該SNP位置相對於PSY 基因全長位於該基因近3’端，於是本發明係利用前述第四步驟中進行3’端RACE所使用之引子PSY3GSP1(SEQ ID NO：3)作為一正向引子，並以第六步驟中含PgPSY1-1 基因3’端轉譯終止密碼之引子PSYR1(SEQ ID No：8)作為一反向引子，進行聚合酶連鎖反應，得一含有SNP的聚合酶連鎖反應產物，再利用限制酶切割聚合酶連鎖反應產物，以產生的切割片段鑑別紅色果肉番石榴基因型。該(B)專一性引子對：針對PgPSY1-1 基因上第654鹼基位置的C，設計一含有與其互補之G的專一性反向引子PsySNAP-C(SEQ ID NO：10)，且於該專一性反向引子PsySNAP-C之3’端前一個鹼基的位置再設計一無法與模版互補之G，以增加反向引子的專一性，然後搭配第六步驟中含5’端轉譯起始密碼之專一性正向引子PSYF(SEQ ID No：7)，此為第一專一性引子對；另針對PgPSY1-2 基因上開放解讀區第654鹼基位置的A，設計一含有與其互補之T的專一性反向引子PsySNAP-A(SEQ ID NO：11)，且於該專一性反向引子PsySNAP-A之3’端前一個鹼基的位置再設計一無法與模版互補之G，以增加反向引子的專一性，然後搭配第六步驟中含5’端轉譯起始密碼之專一性正向引子PSYF(SEQ ID No：7)，此為第二專一性引子對，使該二專一性引子對經聚合酶連鎖反應後能專一性增幅得聚合酶連鎖反應產物，分析該聚合酶連鎖反應產物，即可有效鑑別出紅色果肉番石榴品種及基因型。

由以上結果得知，本發明有鑑於番石榴果肉的顏色會因為PSY 基因的差異而有所不同，即紅色果肉番石榴PSY 基因PgPSY1-1 可正常轉譯出類胡蘿蔔素生合成的第一個酵素PSY，進而順利形成紅色果肉的番石榴；反之，非紅色果肉番石榴PSY 基因PgPSY1-2 因為開放解讀區第654鹼基位置轉變為A ，使該密碼所代表的胺基酸由絲胺酸(TCG)轉變為終止密碼(TA G)，導致其PSY蛋白質較紅肉者為短，可能因而造成PSY功能上的缺失，進而形成非紅色果肉的番石榴，故該發生SNP的位置，為一有效鑑別番石榴果肉顏色的依據。故本發明係利用該發生SNP之鹼基的差異，設計(A)專一性引子對及(B)專一性引子對，分別用以發展CAPS及SNAP標記來鑑別紅色果肉番石榴基因型。以下分別敘述本發明如何以CAPS及SNAP標記的方法，及其專一性引子對來鑑別紅色果肉番石榴及其基因型。

二、本發明第一實施例-鑑別紅色果肉番石榴基因型之CAPS方法

本發明利用紅色果肉番石榴PgPSY1-1 與非紅色果肉番石榴PgPSY1-2 (以下簡稱為PgPSY1-1 及PgPSY1-2 )序列上SNP的位點來區別紅色果肉與非紅色果肉番石榴果實特徵上的差異，該SNP的位置係指PgPSY1-1 基因開放解讀區第654鹼基位置的C於PgPSY1-2 基因中轉變為A，據此設計CAPS標記，該CAPS之鑑別方法係包含一樣本提供步驟S1、一聚合酶連鎖反應步驟S2、一限制酶切割步驟S3及一判斷步驟S4，藉由S1至S4這些步驟流程，以快速且準確的鑑別紅色果肉番石榴及其基因型。

請參照第1圖所示，本發明第一實施例以CAPS鑑別紅色果肉番石榴基因型其步驟如下：

一樣本提供步驟S1：提供待測番石榴DNA。本發明供試材料係採自屏東科技大學番石榴果園，紅色果肉的番石榴品系係含66-90、1-4、1-11、2-6、2-7、2-18及36-12共7個品系，另取紅色果肉與非紅色果肉番石榴雜交後代(其果肉顏色亦為紅色)係含66-90×M3及1-4×水晶拔共2個品系；而非紅色果肉的番石榴品種(系)係含M3、珍珠拔、泰國拔、水晶拔、圓葉無籽拔、大蒂頭、梨仔拔、中山月拔及白拔等共9個品種(系)，將上述18種番石榴依序編號為1至18號，採集上述18種品種(系)番石榴的幼嫩葉片，進行基因組DNA之抽取純化。

一聚合酶連鎖反應步驟S2：以上述該18種番石榴之基因組DNA作為模版，取本發明設計之(A)專一性引子對：PSY3GSP1(SEQ ID NO：3)與PSYR1(SEQ ID NO：8)進行聚合酶連鎖反應。取18支0.2ml聚合酶連鎖反應之反應管，將其編號為1至18號以對應步驟S1所述之18種已知果肉為紅色及非紅色的番石榴品種(系)，本發明係選擇於各反應管中均先加入17μl無菌水、2.5μl的聚合酶緩衝溶液(10X buffer)、2μl的2.5mM dNTP Mixture(dATP、dCTP、dGTP及dTTP)、1μl的μM PSY3GSP1引子、1μl的μM PSYR1引子、0.5μl的1u/μl Super-Therm DNA聚合酶，然後反應管依編號1至18號分別各加入1μl前述步驟S1中編號1至18號之番石榴DNA作為模版，該DNA濃度係選擇為100ng/μl，而各管反應液之最終體積為25μl。

將反應液混合均勻後，置入一熱循環反應器內進行DNA增幅放大反應，該反應條件為起始於92℃至95℃變性3至5分鐘後，再於92℃至95℃的變性溫度反應30至60秒、於57℃至63℃之煉合反應溫度反應30至60秒及於70℃至75℃的延長溫度反應30至60秒，且DNA變性、煉合及延長之循環數為10至50循環，再以70℃至75℃之延長溫度反應5至10分鐘，最後保存於4℃下；而本發明較佳聚合酶連鎖反應條件係選擇為起始於94℃變性2分鐘後，再於94℃的變性溫度反應30秒、於60℃之煉合反應溫度反應30秒及於72℃的延長溫度反應30秒，且94℃變性30秒、60℃煉合30秒及72℃延長30秒之循環數為35循環，再以72℃的延長溫度反應7分鐘，最後將聚合酶連鎖反應產物保存於4℃。

一限制酶切割步驟S3：取得S2步驟18種已知果肉為紅色及非紅色的番石榴品種(系)之聚合酶連鎖反應產物後，以一限制酶Alu I進行切割。由於SNP的差異，造成PgPSY1-2 開放解讀區第654鹼基位置的C 轉變為A ，使得在PgPSY1-1 原本的C GCT序列片段在PgPSY1-2 序列中轉變為一段核苷酸序列A GCT，而該段核苷酸序列AGCT能被限制酶Alu I辨識並進行切割，所以本發明即利用該SNP位置設計CAPS，以鑑定紅色果肉與非紅色果肉番石榴品種及其基因型。

取18支1.5ml反應管，將其編號為1至18號，各反應管中均先分別加入10μl步驟S2所得編號1至18號之聚合酶連鎖反應產物、2μl的限制酶反應緩衝溶液(10X reaction buffer)、2μl的BSA(50μg/ml)及6μlAlu I(1u/μl)(Promega)，使反應液總體積為20μl。

將反應液混合均勻後，置入一恆溫箱內進行限制酶切割反應，該反應條件為35℃至40℃的限制酶切割溫度反應0.5至2.5小時；而本發明之較佳反應條件係選擇37℃限制酶切割溫度反應2小時，產生經限制酶切割反應後之切割片段。

一判斷步驟S4：取步驟S3之限制酶切割反應後之切割片段，以4%瓊脂凝膠進行電泳分析判斷番石榴果肉顏色。本發明之紅色果肉番石榴之鑑別結果如第3圖所示，M為50bp DNA階梯標誌，編號1~9為紅色果肉番石榴品系，編號10~18為非紅色果肉番石榴品種(系)，依編號1~18分別為66-90、1-4、1-11、2-6、2-7、2-18、36-12、66-90×M3、1-4×水晶拔、M3、珍珠拔、泰國拔、水晶拔、圓葉無籽拔、大蒂頭、梨仔拔、中山月拔及白拔。其電泳分析結果如第3圖所示，並摘要如下表一：

編號1至9號的紅色果肉番石榴品系及編號10至18號非紅色果肉番石榴品種(系)經本發明之(A)專一性引子對PSY3GSP1(SEQ ID NO：3)與PSYR1(SEQ ID NO：8)進行聚合酶連鎖反應之後，均可得一257bp的DNA片段(SEQ ID NO:12)，接著再利用限制酶Alu I進行辨識切割該聚合酶連鎖反應產物上之AGCT該段核苷酸序列，結果如第3及4圖所示。若經限制酶切割反應得一第一切割片段組合為62bp、69bp與126bp三個切割片段，則判斷為「是」紅色果肉番石榴，因為PgPSY1-1 同質結合基因型之紅色果肉番石榴擴增序列上有二段AGCT核苷酸序列，亦即有二個Alu I限制酶切割部位，故可產生三個切割片段，於表一PgPSY1-1 欄中以「＋」表示之，且該紅色果肉番石榴為PgPSY1-1 同質結合基因型，其外觀性狀為紅色果肉之番石榴；若經限制酶切割反應得非該第一切割片段組合，則判斷為「不是」紅色果肉番石榴，於表一PgPSY1-1 欄中以「-」表示之。若經限制酶切割反應得一第二切割片段組合為36bp、62bp、69bp與90bp四個切割片段，則判斷為「是」非紅色果肉番石榴，因為PgPSY1-2 同質結合基因型之非紅色果肉番石榴擴增序列上有三段AGCT核苷酸序列，亦即有三個Alu I限制酶切割部位，故可產生四個切割片段，於表一PgPSY1-2 欄中以「＋」表示之，且該非紅色果肉番石榴為PgPSY1-2 同質結合基因型；若經限制酶切割反應得非該第二切割片段組合，則判斷為「不是」非紅色果肉番石榴，於表一PgPSY1-2 欄中以”-”表示之。較特別的是紅色果肉與非紅色果肉番石榴的雜交後代編號8之66-90×M3與編號9之1-4×水晶拔，其為PgPSY1-1/PgPSY1-2 異質結合基因型之紅色果肉番石榴，擴增序列經限制酶切割反應得一第三切割片段組合為36bp、62bp、69bp、90bp及126bp五個切割片段，因為該PgPSY1-1/PgPSY1-2 異質結合基因型之紅色果肉番石榴同時具有PgPSY1-1 基因與PgPSY1-2 基因，故經限制酶切割擴增序列所得之切割片段包含了PgPSY1-1 紅色果肉番石榴之切割片段與PgPSY1-2 非紅色果肉番石榴之切割片段，所以可產生五個切割片段，於表一PgPSY1-1 與PgPSY1-2 欄中均以「＋」表示之，該二品系之番石榴為PgPSY1-1/PgPSY1-2 異質結合基因型，且其外觀性狀為紅色果肉的番石榴。

由本發明第一實施例結果得知，利用聚合酶連鎖反應擴增紅色果肉與非紅色果肉番石榴之PSY 基因片段，配合CAPS方法中限制酶能辨識基因上特定序列差異的特性，可以快速準確鑑定PgPSY1-1 同質結合基因型之紅色果肉番石榴及PgPSY1-1/PgPSY1-2 異質結合基因型之紅色果肉番石榴品種、果肉顏色及其基因型。

三、本發明第二實施例-鑑別紅色果肉番石榴基因型之SNAP方法

本發明利用紅色果肉番石榴PgPSY1-1 與非紅色果肉番石榴PgPSY1-2 (以下簡稱為PgPSY1-1 及PgPSY1-2 )序列上發生SNP的位點來區別紅色果肉與非紅色果肉番石榴果實特徵上的差異，亦即利用PgPSY1-1 基因開放解讀區第654鹼基位置的C於PgPSY1-2 基因中轉變為A此SNP的位點設計SNAP引子對，該利用SNAP之鑑別方法係包含一樣本提供步驟S5、一聚合酶連鎖反應步驟S6、一判斷是否為紅色果肉番石榴步驟S7、一提供紅色果肉番石榴DNA作為模版步驟S8、一聚合酶連鎖反應步驟S9及一判斷紅色果肉番石榴基因型步驟S10，藉由S5至S10這些步驟流程，以快速且準確的鑑別紅色果肉番石榴及其基因型。

請參照第2圖所示，本發明第二實施例以SNAP鑑別紅色果肉番石榴基因型其步驟如下：一樣本提供步驟S5：提供待測番石榴DNA。本發明供試材料與第一實施例步驟S1之番石榴來源、品種(系)及DNA抽取純化方式相同，供試材料均採自於屏東科技大學番石榴果園，包括紅色果肉番石榴與非紅色果肉番石榴共18種不同基因型之番石榴，依序編號為1至18號，採集上述18種番石榴的幼嫩葉片，進行基因組DNA之抽取純化。

一聚合酶連鎖反應步驟S6：以上述18種紅色果肉與非紅色果肉番石榴之DNA作為模版，利用本發明之(B)專一性引子對之第一專一性引子對即PSYF(SEQ ID NO:7)與PsySNAP-C(SEQ ID NO：10)進行聚合酶連鎖反應。取18支0.2ml聚合酶連鎖反應之反應管，將反應管分別編號為1至18號以對應步驟S5中所述之18種已知果肉為紅色及非紅色的番石榴品種(系)，本發明第二實施例係於各反應管中均先加入17μl無菌水、2.5μl的聚合酶緩衝溶液(10X buffer)、2μl的2.5mM dNTP Mixture(dATP、dCTP、dGTP及dTTP)、0.5μl的1u/μl Super-Therm DNA聚合酶及第一專一性引子對包括1μl的10μM PSYF(SEQ ID NO：7)與1μl的10μM PsySNAP-C(SEQ ID NO：10)，然後依編號1至18號分別各加入1μl步驟S5編號1至18號之番石榴DNA(100ng/μl)作為模版，使各管反應液之最終體積為25μl，其反應結果於第5與6圖示中以“C”表示之。

將上述反應液混合均勻後，置入一熱循環反應器內進行DNA增幅放大反應，該反應條件為起始於92℃至95℃變性3至5分鐘後，再於92℃至95℃的變性溫度反應30至60秒、於57℃至63℃之煉合反應溫度反應30至60秒及於70℃至75℃的延長溫度反應30至60秒，且DNA變性、煉合及延長之循環數為10至50循環，再以70℃至75℃之延長溫度反應5至10分鐘，最後保存於4℃下；而本發明之較佳聚合酶連鎖反應條件係選擇為起始於94℃變性4分鐘後，再進入一溫度重覆循環，該溫度重覆循環為95℃的變性溫度反應30秒、於62℃之煉合反應溫度反應45秒及於72℃的延長溫度反應45秒，如此DNA變性、煉合及延長之循環重覆30次，再以72℃的延長溫度反應7分鐘，最後保存於4℃。

一判斷是否為紅色果肉番石榴步驟S7：取得步驟S6之聚合酶連鎖反應產物後，以1%瓊脂醣凝膠電泳分析該利用本發明之第一專一性引子對PSYF(SEQ ID NO:7)與PsySNAP-C(SEQ ID NO：10)經聚合酶連鎖反應增幅後的DNA片段，以判斷番石榴果肉顏色。本發明之紅色果肉番石榴之鑑別結果如第5與6圖所示，M為100bp DNA階梯標誌，編號1~9為紅色果肉番石榴品系如第5圖所示，編號10~18為非紅色果肉番石榴品種(系)如第6圖所示，依編號1~18分別為66-90、1-4、1-11、2-6、2-7、2-18、36-12、66-90×M3、1-4×水晶拔、M3、珍珠拔、泰國拔、水晶拔、圓葉無籽拔、大蒂頭、梨仔拔、中山月拔及白拔。

其電泳分析結果摘要如下表二：

表二、以SNAP標記分析番石榴果肉顏色

由第5圖、第6圖與表二可得知，針對該PgPSY1-1 基因開放解讀區第654鹼基上的差異所設計之該第一專一性引子對只能經聚合酶連鎖反應進行增幅該PgPSY1-1 基因，而得一約1,176bp(SEQ ID NO：13)的聚合酶連鎖反應產物，如第5圖中於C標示下可見一聚合酶連鎖反應產物，則該番石榴樣本判斷為「是」紅色果肉番石榴，因為該第一專一性引子對中的PsySNAP-C(SEQ ID NO：10)是針對該PgPSY1-1 基因開放解讀區第654鹼基上的C設計一G與其互補之引子，故只會增幅PgPSY1-1 基因，於表二中以「＋」表示之；若一番石榴樣本經聚合酶連鎖反應增幅後，如第6圖中於C標示下未見該聚合酶連鎖反應產物，則該番石榴樣本判斷為「不是」紅色果肉番石榴，於表二中以「-」表示之。如此，透過該第一專一性引子對便可準確鑑定出該待測番石榴是否為紅色果肉番石榴。

完成該步驟S5、S6及S7後，另進行S8至S10步驟可進一步鑑定出該紅色果肉番石榴之基因型：一提供紅色果肉番石榴DNA作為模版步驟S8：由上述步驟S5、S6及S7已經可判斷出那些是紅色果肉番石榴之品種(系)，接下來利用已確認是紅色果肉番石榴之DNA作為模版，進行聚合酶連鎖反應。

一聚合酶連鎖反應步驟S9：取已確認「是」紅色果肉番石榴品系之DNA作為模版，利用本發明之(B)專一性引子對之該第二專一性引子對即PSYF(SEQ ID NO:7)與PsySNAP-A(SEQ ID NO:11)，該第二專一性引子對係針對PgPSY1-2 上SNP之A設計一含有T與其互補之PsySNAP-A反向引子，故該第二專一性引子對經聚合酶連鎖反應，可增幅PgPSY1-2 基因片段，藉此判斷該紅色果肉番石榴是否為PgPSY1-1/PgPSY1-2 異質結合基因型。取9支0.2ml聚合酶連鎖反應之反應管，反應管分別編號為1至9號，該反應管編號乃對應測試步驟S8中已確認「是」紅色果肉番石榴之品系，各反應管中均先加入17μl無菌水、2.5μl的聚合酶緩衝溶液(10X buffer)、2μl的2.5mM dNTP Mixture(dATP、dCTP、dGTP及dTTP)、0.5μl的1u/μl Super-Therm DNA聚合酶，然後依編號1至9號分別各加入1μl前述步驟S8中已確認「是」紅色果肉番石榴品系之DNA作為模版，再分別加入第二專一性引子對，包括1μl的10μM PSYF(SEQ ID NO:7)與1μl的10μMPsySNAP-A(SEQ ID NO:11)，使各管反應液之最終體積為25μl，其反應結果於第5圖示中以「A」表示之。

將反應液混合均勻後，置入一熱循環反應器內進行DNA增幅放大反應，該反應條件為起始於92℃至95℃變性3至5分鐘後，再於92℃至95℃的變性溫度反應30至60秒、於57℃至63℃之煉合反應溫度反應30至60秒及於70℃至75℃的延長溫度反應30至60秒，且DNA變性、煉合及延長之循環數為10至50循環，再以70℃至75℃之延長溫度反應5至10分鐘，最後保存於4℃下；而本發明之較佳聚合酶連鎖反應條件係選擇為起始於94℃變性4分鐘後，再進入一溫度重覆循環，該溫度重覆循環為95℃的變性溫度反應30秒、於62℃之煉合反應溫度反應45秒及於72℃的延長溫度反應45秒，如此DNA變性、煉合及延長之循環重覆30次，再以72℃的延長溫度反應7分鐘，最後保存於4℃下。

一判斷紅色果肉番石榴基因型步驟S10：取得步驟S9之聚合酶連鎖反應產物後，以1%瓊脂凝膠電泳分析該利用本發明之第二專一性引子對PSYF(SEQ ID NO:7)與PsySNAP-A(SEQ ID NO：11)經聚合酶連鎖反應增幅後的DNA片段，以判斷紅色果肉番石榴之基因型究竟為PgPSY1-1 同質結合基因型或PgPSY1-1/PgPSY1-2 異質結合基因型，只有PgPSY1-1/PgPSY1-2 異質結合基因型之紅色果肉番石榴可以被第二專一性引子對增幅出聚合酶連鎖反應產物，因為異質結合基因型者含PgPSY1-2 之基因，又第二專一性引子對中的PSySNAP-A(SEQ ID NO：11)是針對PgPSY1-2 上SNP之A設計一T與其互補之反向引子，故只會增幅PgPSY1-2 基因。

本發明之紅色果肉番石榴基因型之鑑別結果如第5圖所示，M為100bp DNA階梯標誌，編號1-9為已判斷是紅色果肉番石榴之品系，依編號分別為66-90、1-4、1-11、2-6、2-7、2-18、36-12、66-90×M3及1-4×水晶拔品種。

其電泳分析結果摘要如下表三：

由第5圖與表三可得知，針對該PgPSY1-2 基因開放解讀區第654鹼基上的差異而設計之第二專一性引子對只能經聚合酶連鎖反應增幅該PgPSY1-2 基因，而得一約1,177bp(SEQ ID NO：14)的聚合酶連鎖反應產物，所以PgPSY1-2 基因只能被引子對PsySNAP-A(SEQ ID NO:11)與PSYF(SEQ ID NO:7)經聚合酶連鎖反應得一聚合酶連鎖反應產物，如第5圖中於A標示下可見一聚合酶連鎖反應產物，則該番石榴樣本判斷為「是」異質結合基因型之紅色果肉番石榴，因為只有PgPSY1-1/PgPSY1-2 異質結合基因型之紅色果肉番石榴內含PgPSY1-2 之基因，可以被該第二專一性引子對增幅出聚合酶連鎖反應產物，於表三中以「＋」表示之，該紅色果肉番石榴為PgPSY1-1/PgPSY1-2 異質結合基因型，且其外觀性狀為紅色果肉番石榴；如第5圖之A標示下未見此聚合酶連鎖反應產物，則判斷為「不是」異質結合基因型之紅色果肉番石榴，於表三中以「-」表示之，亦即其為PgPSY1-1 同質結合基因型，且其外觀性狀為紅色果肉番石榴。

紅色果肉番石榴編號8之66-90×M3與編號9之1-4×水晶拔經第一專一性引子對PsySNAP-C(SEQ ID NO：10)與PSYF(SEQ ID NO：7)增幅可得聚合酶連鎖反應產物，再經第二專一性引子對PsySNAP-A(SEQ ID NO：11)與PSYF(SEQ ID NO：7)增幅也可得聚合酶連鎖反應產物，因該二品系之紅色果肉番石榴內同時含二種基因，為PgPSY1-1/PgPSY1-2 異質結合基因型之紅色果肉番石榴，故可以同時被該第一專一性引子對與該第二專一性引子對經聚合酶連鎖反應幅增，於第5圖之C及A標示下都可見其聚合酶連鎖反應產物，於表二與表三中皆以「＋」表示之。而編號1至7之紅色果肉番石榴，因為只能被該第一專一性引子對增幅產生聚合酶連鎖反應產物，所以為PgPSY1-1 同質結合基因型之紅色果肉番石榴。

由此得知，本發明之SNAP標記方法可以利用紅色果肉或非紅肉果肉番石榴PSY 基因上SNP之核苷酸轉變，快速準確的鑑定紅色果肉與非紅色果肉番石榴品種及其基因型。

由上述結果得知，番石榴果實中PSY 基因的開放解讀區發生SNP，係指PSY 基因DNA序列上發生單一核苷酸鹼基之間的變異，即紅色果肉番石榴開放解讀區第654鹼基的C在非紅色果肉番石榴轉變為A，該SNP的轉變造成非紅色果肉番石榴之PSY 基因產物縮短，因而影響到類胡蘿蔔素生合成的過程及其形成，使得果肉呈現非紅色；反之紅色果肉番石榴之PSY 基因產物正常，故類胡蘿蔔素生合成能順利進行，使果肉呈現紅色。故本發明利用該SNP的位置設計並使用CAPS與SNAP的標記，均能快速且準確的鑑別紅色果肉番石榴品種或其基因型。

本發明之一種鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法，係利用本發明針對PSY 基因序列設計專一性引子對，再配合可分辨其上SNP之限制酶進行CAPS分析，或利用SNP設計SNAP標記進行鑑定，可於番石榴幼苗、植株產生果實之前快速且準確的鑑別該番石榴是否為紅色果肉及其基因型，具有降低種植成本及提高育種效率的功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示其原理、引子對設計及測試方式，然本發明擬保護的範圍並非僅止於此，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，依據上述實施例進行相關更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

第1圖：本發明之第一實施例以CAPS鑑別紅色果肉番石榴基因型流程圖。

第2圖：本發明之第二實施例以SNAP鑑別紅色果肉番石榴基因型流程圖。

第3圖：本發明之第一實施例以CAPS鑑別紅色果肉和非紅色果肉番石榴品種(系)DNA的結果電泳圖。

第4圖：本發明之第一實施例之限制酶切位及切割片段大小標示圖。

第5圖：本發明之第二實施例以SNAP鑑別紅色果肉番石榴品種(系)DNA的結果電泳圖。

第6圖：本發明之第二實施例以SNAP鑑別非紅色果肉番石榴品種(系)DNA的結果電泳圖。

<110> 國立屏東科技大學

<120> 鑑別紅色果肉番石榴之方法及其引子對

<160> 16

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)...(21)

<400> 1

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(23)

<400> 2

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(26)

<400> 3

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(26)

<400> 4

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(25)

<400> 5

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(24)

<400> 6

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(24)

<400> 7

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(23)

<400> 8

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(22)

<400> 9

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(25)

<400> 10

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(25)

<400> 11

<210> 12

<211> 257

<212> DNA

<213> Psidium guajava L.

<220>

<221> gene

<222> (1)..(257)

<400> 12

<210> 13

<211> 1176

<212> DNA

<213> Psidium guajavaL.

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1176)

<400> 13

<210> 14

<211> 1177

<212> DNA

<213> Psidium guajava L.

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1177)

<400> 14

<210> 15

<211> 804

<212> DNA

<213> Psidium guajava L.

<220>

<221> gene

<222> (1).. (804)

<400> 15

<210> 16

<211> 1312

<212> DNA

<213> Psidium guajava L.

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1312)

<400> 16

Claims (24)

1. 一種鑑別紅色果肉番石榴基因型之專一性引子對，係用以增幅八氫茄紅素合成酶，該專一性引子對具有一正向引子及一反向引子，該正向引子係由SEQ ID NO：3所示之核苷酸序列所構成，而該反向引子係由SEQ ID NO：8所示之核苷酸序列所構成。
2. 一種鑑別紅色果肉番石榴之方法，其包含下列步驟：(a)樣本提供步驟：提供一待測番石榴之DNA步驟；(b)聚合酶連鎖反應步驟：使用申請專利範圍第1項所述之該專一性引子對，並以該步驟(a)之待測番石榴DNA作為模版進行聚合酶連鎖反應，產生一聚合酶連鎖反應產物；(c)限制酶切割步驟：於該步驟(b)之聚合酶連鎖反應產物中加入可辨識核苷酸序列AGCT之一限制酶，並調整至該限制酶適合的切割溫度下進行酶切，產生一限制酶切割產物；及(d)判斷步驟：判斷該步驟(c)之限制酶切割產物中是不是含有一第一切割片段組合或一第三切割片段組合，該第一切割片段組合為具有62bp、69bp及126bp之切割片段，該第三切割片段組合為具有36bp、62bp、69bp、90bp及126bp之切割片段，若判斷為「是」，則該待測番石榴為紅色果肉番石榴；若判斷為「不是」，則該待測番石榴不是紅色果肉番石榴。
3. 依申請專利範圍第2項所述之鑑別紅色果肉番石榴基 因型之方法，其中該步驟(b)聚合酶連鎖反應之變性溫度為92℃至95℃。
4. 依申請專利範圍第2項所述之鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法，其中該步驟(b)聚合酶連鎖反應之煉合反應溫度為57℃至63℃。
5. 依申請專利範圍第2項所述之鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法，其中該步驟(b)聚合酶連鎖反應之延長溫度為70℃至75℃。
6. 依申請專利範圍第2項所述之鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法，其中該步驟(b)聚合酶連鎖反應之變性時間為30至60秒。
7. 依申請專利範圍第2項所述之鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法，其中該步驟(b)聚合酶連鎖反應之煉合時間為30至60秒。
8. 依申請專利範圍第2項所述之鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法，其中該步驟(b)聚合酶連鎖反應之延長時間為30至60秒。
9. 依申請專利範圍第2項所述之鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法，其中該步驟(b)聚合酶連鎖反應之循環數為10至50個循環。
10. 依申請專利範圍第2項所述之鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法，其中該步驟(c)中所使用之限制酶為Alu I。
11. 依申請專利範圍第2項所述之鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法，其中該步驟(d)中，該限制酶切割產物中只含有該第一切割片段組合，則該待測番石榴為同質結合 基因型之紅色果肉番石榴。
12. 依申請專利範圍第2項所述之鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法，其中該步驟(d)中，該限制酶切割產物中含有該第三切割片段組合，則該待測番石榴為異質結合基因型之紅色果肉番石榴。
13. 依申請專利範圍第2項所述之鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法，其中該步驟(c)中所使用之限制酶的限制酶切割溫度為35℃至40℃。
14. 依申請專利範圍第2項所述之鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法，其中該步驟(c)中所使用之限制酶的反應時間係為0.5至2.5小時。
15. 一種鑑別紅色果肉番石榴基因型之專一性引子對，係用以增幅八氫茄紅素合成酶，該專一性引子對包含一第一專一性引子對及一第二專一性引子對，該第一專一性引子對由SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：10所示之核苷酸序列所構成，該第二專一性引子對由SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：11所示之核苷酸序列所構成。
16. 一種鑑別紅色果肉番石榴之方法，其包含下列步驟：(a)樣本提供步驟：提供一待測番石榴之DNA步驟；(b)聚合酶連鎖反應步驟：使用申請專利範圍第15項所述之該第一專一性引子對，並以該步驟(a)之待測番石榴DNA作為模版進行聚合酶連鎖反應，產生一聚合酶連鎖反應產物；及(c)判斷是否為紅色果肉番石榴步驟：判斷該步驟(b)中是不是能增幅獲得該聚合酶連鎖反應產物，若判斷為 「是」，則該待測番石榴為紅色果肉番石榴，若判斷為「不是」，則該待測番石榴不是紅色果肉番石榴。
17. 依申請專利範圍第16項所述之鑑別紅色果肉番石榴之方法，其中完成該步驟(c)後，另進行(d)提供紅色果肉番石榴DNA作為模版步驟：以該步驟(g)中判斷為「是」紅色果肉番石榴之DNA作為模版；(e)聚合酶連鎖反應步驟：使用申請專利範圍第15項所述之該第二專一性引子對，並以該步驟(d)之紅色果肉番石榴DNA作為模版進行聚合酶連鎖反應，產生一聚合酶連鎖反應產物；及(f)判斷紅色果肉番石榴基因型步驟：判斷該步驟(e)是否增幅獲得該聚合酶連鎖反應產物，若判斷為「是」，則該待測番石榴為異質結合基因型之紅色果肉番石榴，若判斷為「否」，則該待測番石榴為同質結合基因型之紅色果肉番石榴。
18. 依申請專利範圍第16或17項所述之鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法，該聚合酶連鎖反應之變性溫度為92℃至95℃。
19. 依申請專利範圍第16或17項所述之鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法，該聚合酶連鎖反應之煉合反應溫度為57℃至63℃。
20. 依申請專利範圍第16或17項所述之鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法，該聚合酶連鎖反應之延長溫度為70℃至75℃。
21. 依申請專利範圍第16或17項所述之鑑別紅色果肉番石 榴基因型之方法，該聚合酶連鎖反應之變性時間為30至60秒。
22. 依申請專利範圍第16或17項所述之鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法，該聚合酶連鎖反應之煉合時間為30至60秒。
23. 依申請專利範圍第16或17項所述之鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法，該聚合酶連鎖反應之延長時間為30至60秒。
24. 依申請專利範圍第16或17項所述之鑑別紅色果肉番石榴基因型之方法，該聚合酶連鎖反應之循環數為10至50個循環。