CN112375839A - 一种与甜瓜果皮颜色相关的分子标记及其方法与应用 - Google Patents

一种与甜瓜果皮颜色相关的分子标记及其方法与应用 Download PDF

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CN112375839A CN202011447441.8A CN202011447441A CN112375839A CN 112375839 A CN112375839 A CN 112375839A CN 202011447441 A CN202011447441 A CN 202011447441A CN 112375839 A CN112375839 A CN 112375839A
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王建设
李丛丛
许昕阳
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Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Huaibei Normal University
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Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Huaibei Normal University
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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Abstract

本发明公开了一种甜瓜果皮颜色相关的分子标记及其方法与应用。本发明通过比对和分析墨绿皮和白皮甜瓜品种中CmAPRR2等位基因序列，得到该基因的一处特异性位点(G856T)并开发了特异性分子标记FC。实验证明，本发明的分子标记与甜瓜的果皮颜色性状相关，利用本发明的分子标记鉴定甜瓜果皮颜色的准确性可达100％，进一步可用于甜瓜分子标记辅助育种、基因聚合育种以及转基因育种中应用。可在甜瓜生长的任意阶段进行筛选、鉴定，效率高、特异性好、准确度高，大大节约时间和成本，对加速甜瓜果皮颜色育种具有重要意义。

Description

一种与甜瓜果皮颜色相关的分子标记及其方法与应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种甜瓜果皮颜色相关的分子标记及其方法与应用。
背景技术
甜瓜(Cucumis melo L.)为葫芦科(Cucurbitaceae)甜瓜属(Cucumis)一年生草本植物，是一种重要的园艺经济作物。甜瓜的果皮颜色、果实大小和形状等表型多样、遗传资源丰富。随着人们生活水平的提高，对甜瓜品质和多样性需求越来越高。作为甜瓜重要的外观品质性状，果皮颜色直接影响消费者对甜瓜品种的选择。因此，果皮颜色一直是育种家们的重点关注对象，培育具有各种果皮颜色的甜瓜品种以迎合市场需求是育种工作中的一项重要内容。甜瓜的果皮颜色分为白、黄、橙、绿、黄绿、墨绿、褐及多种颜色混杂或者网纹类型，而且多数甜瓜品种的果皮颜色需要到成熟后期才能完全显现出来，开展果皮颜色育种的选择周期长且成本高。因此，挖掘并克隆甜瓜果皮颜色控制基因并开发特异功能性分子标记进行果皮颜色的早期分子标记辅助选择，将大大提高育种选择效率并降低生产成本。
甜瓜的果皮颜色变异丰富，市场上的甜瓜果皮主流颜色为白色、黄色和绿色，其主要由胡萝卜素、叶绿素、类黄酮等成分及含量的变化决定，且会受光照、温度等环境的影响，而果实表面的条纹、斑点、网纹等，也会影响对果皮颜色的判断。甜瓜果皮颜色的遗传机制复杂，关于其遗传规律及相关QTLs或基因定位的研究早有报道。李德泽等研究表明，甜瓜绿皮对灰白和白皮表现为显性，黄皮对绿、白、灰白皮为不完全显性。Tadmor发现黄皮和绿皮材料杂交的F2群体中，柚皮素查尔酮含量的分离比符合孟德尔3:1的遗传定律，并证实了该色素是受单基因调控。Feder等利用F2群体基因定位并结合遗传转化方法在10号染色体上鉴定出影响白色果皮的基因CmKFB，该基因编码一个F-Box蛋白，主要通过调控柚皮苷查尔酮的形成来控制白色果皮的形成。杨光华等研究表明黄绿皮对白色果皮为显性，并通过构建遗传连锁图谱将控制果皮底色的基因定位到4号染色体409828-835625b约425kb的区间内。Oren等通过全基因关联分析以及利用“Tam Dew”和“Dulce”的重组自交系以及“Dulce”和“Noy Amid”的F3:4家系将控制甜瓜幼果果皮颜色的基因定位在4号染色体上290kb的区间内，并通过差异性分析确定CmAPRR2(MELO3C003375)基因的变异是导致果皮颜色差异的目的基因，该基因编码Two-component response regulator-like protein APRR2类转录因子。欧点点利用白色果皮和绿色果皮材料构建了六世代遗传群体，表明绿色对黄色和白色为显性，随后结合混池测序和全基因组关联分析找到控制甜瓜绿色果皮的基因MELO3C003375即CmAPRR2，并根据该基因中存在的一个13bp的碱基缺失开发了一个Indel标记，可以区分绿色果皮与非绿色果皮甜瓜。然而，该标记不能满足所有的非绿皮类型，因此，急需根据该目的基因其他变异位点开发特异性分子标记进行果皮颜色的分子标记辅助选择，以缩短甜瓜传统育种周期加快育种进程，满足甜瓜果皮颜色育种的实际需要。
发明内容
本发明的一个目的是提供检测待测甜瓜基因组中含有序列3所示的核苷酸还是含有序列4所示的核苷酸物质的用途。
本发明提供了检测待测甜瓜基因组中含有序列3所示的核苷酸还是含有序列4所示的核苷酸物质在如下1)-6)中至少一种中的应用：
1)鉴定或辅助鉴定待测甜瓜的果皮颜色基因型；
2)制备鉴定或辅助鉴定待测甜瓜的果皮颜色基因型；
3)选育携带白色果皮基因型的甜瓜品种；
4)制备选育携带白色果皮基因型的甜瓜品种的产品；
5)选育子代为白皮的甜瓜品种；
6)制备选育子代为白皮的甜瓜品种的产品；
所述果皮颜色基因型为白色果皮基因型A2A2、绿色果皮基因型A1A1或绿色果皮基因型A1A2；
所述白色果皮基因型A2A2为甜瓜基因组的2条同源染色体中均含有序列4所示的核苷酸且均不含有序列3所示的核苷酸；
所述绿色果皮基因型A1A1为甜瓜基因组的2条同源染色体中均含有序列3所示的核苷酸且均不含有序列4所示的核苷酸；
所述绿色果皮基因型A1A2为甜瓜基因组的1条同源染色体中含有序列3所示的核苷酸，另一条同源染色体中含有序列4所示的核苷酸。
本发明还提供了检测待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GG、TT或GT的物质在如下1)-6)中至少一种中的应用：
1)鉴定或辅助鉴定待测甜瓜的果皮颜色基因型；
2)制备鉴定或辅助鉴定待测甜瓜的果皮颜色基因型；
3)选育携带白色果皮基因型的甜瓜品种；
4)制备选育携带白色果皮基因型的甜瓜品种的产品；
5)选育子代为白皮的甜瓜品种；
6)制备选育子代为白皮的甜瓜品种的产品；
所述果皮颜色基因型为白色果皮基因型A2A2、绿色果皮基因型A1A1或绿色果皮基因型A1A2；
所述白色果皮基因型A2A2为甜瓜基因组的2条同源染色体中均含有序列4所示的核苷酸且均不含有序列3所示的核苷酸；
所述绿色果皮基因型A1A1为甜瓜基因组的2条同源染色体中均含有序列3所示的核苷酸且均不含有序列4所示的核苷酸；
所述绿色果皮基因型A1A2为甜瓜基因组的1条同源染色体中含有序列3所示的核苷酸，另一个条同源染色体中含有序列4所示的核苷酸。
上述应用中，所述物质均为如下1)或2)：
1)成套引物，所述成套引物的引物对满足：以甜瓜基因组DNA为模板进行PCR扩增得到的DNA片段含有序列3或序列4所示的序列，其中序列3和序列4的差异在于第174位的核苷酸是鸟嘌呤G还是胸腺嘧啶T。
具体所述成套引物由序列表中序列1所示的单链DNA分子或其衍生物个序列表中序列2所示的单链DNA分子或其衍生物；
2)含有所述成套引物的PCR试剂或试剂盒。
上述应用中，所述试剂盒还包括限制性内切酶NcoI。
本发明还有一个目的是提供一种产品。
本发明提供的产品，包括上述的物质；
所述产品具有如下1)-3)中至少一种功能：
1)鉴定或辅助鉴定待测甜瓜的果皮颜色基因型；
2)选育携带白色果皮基因型的甜瓜品种；
3)选育子代为白皮的甜瓜品种；
或，一种生物材料，其包括序列3所示的DNA分子和/或序列4所示的DNA分子；
或，所述生物材料在如下1)-3)中至少一种功能：
1)鉴定或辅助鉴定待测甜瓜的果皮颜色基因型；
2)选育携带白色果皮基因型的甜瓜品种；
3)选育子代为白皮的甜瓜品种。
本发明还有一个目的是提供如下方法。
本发明提供的一种鉴定或辅助鉴定待测甜瓜的果皮颜色基因型的方法，为如下A或B；
A所示的方法包括如下步骤：
检测待测甜瓜的基因组中含有序列3所示的核苷酸还是序列4所示的核苷酸，
若所述待测甜瓜的基因组中仅含有序列3所示的核苷酸，则所述待测甜瓜的果皮颜色基因型为绿色果皮基因型A1A1；
若所述待测甜瓜的基因组中含有序列3所示的核苷酸和序列4所示的核苷酸，则所述待测甜瓜的果皮颜色基因型为绿色果皮基因型A1A2；
若所述待测甜瓜的基因组中仅含有序列4所示的核苷酸，则所述待测甜瓜的果皮颜色基因型为白色果皮基因型A2A2；
B所示的方法包括如下步骤：
检测待测甜瓜的基因组中序列3第174位的基因型为GG、TT或GT，
若所述待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GG，则所述待测甜瓜的果皮颜色基因型为绿色果皮基因型A1A1；
若所述待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GT，则所述待测甜瓜的果皮颜色基因型为绿色果皮基因型A1A2；
若所述待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为TT，则所述待测甜瓜的果皮颜色基因型为白色果皮基因型A2A2；
所述白色果皮基因型A2A2为甜瓜基因组的2条同源染色体中均含有序列4所示的核苷酸且均不含有序列3所示的核苷酸；
所述绿色果皮基因型A1A1为甜瓜基因组的2条同源染色体中均含有序列3所示的核苷酸且均不含有序列4所示的核苷酸；
所述绿色果皮基因型A1A2为甜瓜基因组的1条同源染色体中含有序列3所示的核苷酸，另一个条同源染色体中含有序列4所示的核苷酸。
本发明提供的一种鉴定或辅助鉴定待测甜瓜或其子代果皮颜色的方法，为如下C或D；
A所示的方法包括如下步骤：
检测待测甜瓜基因组中含有序列3所示的核苷酸还是序列4所示的核苷酸，
若所述待测甜瓜的基因组中含有序列3所示的核苷酸，则所述待测甜瓜或其子代果皮是绿色，
若所述待测甜瓜的基因组中含有序列4所示的核苷酸且不含有序列3所示的核苷酸，则所述待测甜瓜或其子代果皮是白色；
B所示的方法包括如下步骤：
检测待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GG、TT或GT，鉴定或辅助鉴定待测甜瓜的子代果皮颜色为绿色还是白色；
若所述待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GG或GT，则所述待测甜瓜或其子代果皮是绿色，
若所述待测甜瓜的基因组中序列3第174位的基因型为TT，则所述待测甜瓜或其子代果皮是白色。
本发明提供的一种选育携带白色果皮基因型的甜瓜品种或选育白色果皮的甜瓜品种或选育子代为白色果皮的甜瓜品种的方法，为选育上述果皮颜色基因型为白色果皮基因型A2A2的待测甜瓜。
本发明提供的一种选育携带绿色果皮基因型的甜瓜品种或选育绿色果皮的甜瓜品种或选育子代为绿色果皮的甜瓜品种的方法，为选育上述果皮颜色基因型为绿色果皮基因型A1A1或A1A2的待测甜瓜。
上述方法中，所述检测待测甜瓜基因组中含有序列3所示的核苷酸还是序列4所示的核苷酸，或，所述检测待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GG、TT或GT的方法均为如下：
1)直接测序基因组DNA进行判断；
2)用上述成套引物扩增所述待测甜瓜，测序扩增产物，进行判断；
3)用上述成套引物扩增所述待测甜瓜，再用NcoI酶切扩增产物，检测酶切产物；
若所述酶切产物只含有116bp的片段，则所述待测甜瓜的基因组中含有序列4所示的核苷酸或所述待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为TT；
若所述酶切产物只含有139bp的片段，则所述待测甜瓜的基因组中含有序列3所示的核苷酸或所述待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GG；
若所述酶切产物含有116bp且含有139bp的片段，则所述待测甜瓜的基因组中含有序列3所示的核苷酸且含有序列4所示的核苷酸或所述待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GT。
利用所述引物对进行PCR扩增，所述FC-F和所述FC-R在反应体系中的浓度均可为0.5μmol/L。具体可采用如下反应体系进行PCR扩增：2μL Buffer、1.6μL dNTPs(四种dNTP每种的浓度均为2mmol/L)、所述FC-F和所述FC-R、1.5μL所述待测甜瓜基因组DNA(50ng/μL)、0.2
Figure BDA0002825147190000051
DNA Polymerase for PAGE，ddH2O补至20μL。Buffer和
Figure BDA0002825147190000052
DNAPolymerase for PAGE均可为北京全式金生物技术有限公司产品。
利用所述引物对进行PCR扩增时的退火温度可为59℃。利用所述引物对进行PCR扩增具体可采用如下反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。
上述引物对的扩增产物的大小为198bp，经限制性内切酶NcoI酶切，酶切体系和条件为PCR产物20μl，10×Buffer 2.5μl，NcoI酶2μl，ddH2O补至25μl，于37℃酶切4h，85℃加热10min；酶切后可成为3个片段，大小分别为23bp、59bp和116bp，或者成为2个片段，大小分别为59bp和139bp。
检测所述PCR产物的大小可通过直接测序进行，也可通过PCR产物酶切后采用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
所述甜瓜果皮颜色分子标记，也属于本发明的保护范围。
本发明中，待测甜瓜可为墨绿皮甜瓜品种蜜思源185或白皮甜瓜品种蜜思源160或其后代。
所述墨绿皮甜瓜品种蜜思源185的后代包括以墨绿皮甜瓜品种蜜思源185为亲本与其他甜瓜进行杂交和/或回交得到的各世代。
所述白皮甜瓜品种蜜思源160的后代包括以白皮甜瓜品种蜜思源160为亲本与其他甜瓜进行杂交和/或回交得到的各世代。
在本发明的实施例中，所述墨绿皮甜瓜品种蜜思源185的后代为墨绿皮甜瓜品种蜜思源185与白皮甜瓜品种蜜思源160的杂交后代。
实验证明，本发明的甜瓜果皮颜色分子标记(FC)与甜瓜的果皮颜色相关，两条染色体均为序列表中序列4所示核苷酸序列的A2A2基因型甜瓜为白皮甜瓜。利用本发明的甜瓜果皮颜色分子标记鉴定甜瓜果皮颜色的准确性可达100％，本发明的甜瓜果皮颜色分子标记进一步可用于甜瓜果皮颜色分子标记辅助育种，在甜瓜生长的任意阶段进行筛选、鉴定，效率高、特异性好、准确度高，大大节约时间和成本，对加速甜瓜果皮颜色育种具有重要意义。
附图说明
图1为甜瓜亲本及后代果皮颜色表型；A：蜜思源185成熟期果皮表型；B：蜜思源185授粉10天后果皮表型；C：蜜思源185为父本、蜜思源160为母本杂交F1表型；D：蜜思源160成熟期果皮表型；E：蜜思源160授粉10天后果皮表型；F：蜜思源185为母本、蜜思源160为父本杂交F1表型。
图2为标记FC对7个甜瓜品种的检测结果。7个甜瓜品种分别为蜜思源185、蜜思源160、蜜思源177、HP5、HP6、HP7、神州蜜；M：100bp DNA ladder。其中除去Marker外的泳道1-7分别为蜜思源185、蜜思源160、蜜思源177、HP5、HP6、HP7和神州蜜酶切前PCR扩增产物检测结果，8-14为蜜思源185、蜜思源160、蜜思源177、HP5、HP6、HP7和神州蜜PCR扩增产物NcoI酶切后产物检测结果。
图3为标记FC对亲本及其F1、F2代单株的检测结果。A：标记FC对亲本及其F1、36个白色果皮F2代单株的检测结果，P1为蜜思源185，P2为蜜思源160，F1为蜜思源185作父本、蜜思源160为母本杂交F1代，1-36为36个白色果皮F2代单株；B：标记FC对39个F2代单株的检测结果，其中1-12为白色果皮单株，13-39为墨绿色果皮单株；C：标记FC对39个墨绿色果皮F2代单株的检测结果；D：标记FC对39个墨绿色果皮F2代单株的检测结果；E：标记FC对36个墨绿色果皮F2代单株的检测结果。M：100bp DNA ladder。
图4为标记Indel对7个甜瓜品种的检测结果；其中除去Marker外的泳道1-7分别为蜜思源185、蜜思源160、蜜思源177、HP5、HP6、HP7、神州蜜。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例仅对本发明做进一步说明，并不限制本发明。实施例中如无特殊说明，所采用的实验方法，均为常规方法；所用的试剂等，均可通过商业途径得到。
下述实施例中的墨绿皮甜瓜品种蜜思源185(购于京研益农(北京)种业科技有限公司)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的白皮甜瓜品种蜜思源160(购于京研益农(北京)种业科技有限公司)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中F1代为以蜜思源185为母本、蜜思源160为父本杂交，所获得F1代；
下述实施例中F2代将上述蜜思源185和蜜思源160杂交得到F1自交后获得的F2代群体。
实施例1、甜瓜果皮颜色的遗传分析及CmAPRR2基因的变异位点检测
甜瓜蜜思源185和蜜思源160均为厚皮甜瓜品种，其中蜜思源185果实成熟后果皮颜色为墨绿皮(图1A)、蜜思源160为白皮(图1D)。授粉10天后的幼果期，蜜思源185果皮颜色为深绿皮(图1B)、蜜思源160为浅绿皮(图1E)。
以蜜思源185为父本、蜜思源160为母本杂交，所获得F1代成熟果皮颜色为墨绿色(图1C)；以蜜思源185为母本、蜜思源160为父本杂交，所获得F1代成熟果皮颜色也为墨绿色(图1F)，表明墨绿色果皮相对于白色为显性。将F1自交后获得的F2代群体共计189株分单株种植于田间，各单株分别自交，分别调查授粉10天后幼果期及成熟期果皮颜色。数据统计分析表明，幼果期果皮颜色为浅绿色果皮单株为48株，成熟期后均转为白色果皮，幼果期果皮颜色为深绿色果皮单株为141株，成熟期后均转为墨绿色果皮，因此，果皮颜色的分离比例为墨绿色：白色＝141:48，表现3:1的孟德尔遗传分离比(χ2＝0.6<3.84)，表明白色果皮性状由单隐性核基因控制。
根据已知的CmAPRR2基因控制甜瓜果皮颜色的信息，从基因组数据库中(http://cucurbitgenomics.org/)下载CmAPRR2基因(即MELO3C003375)序列信息并设计特异性引物，对两个亲本蜜思源185和蜜思源160中的该基因编码区进行测序。测序结果显示蜜思源160中的MELO3C003375基因编码区ATG下游第856位碱基由鸟嘌呤G突变为胸腺嘧啶T，导致编码谷氨酸密码子GAG突变为终止密码子TAG，致使该蛋白翻译提前终止，后面Myb-DNA结合结构域大部分缺失。推测MELO3C003375(CmAPRR2)基因G856T突变导致蜜思源185和蜜思源160中果皮颜色的差异。
实施例2、甜瓜果皮颜色特异性分子标记FC的开发、验证及检测方法的建立
一、甜瓜果皮颜色特异性分子标记FC的开发
基于蜜思源185和蜜思源160中CmAPRR2基因编码区DNA序列存在单个核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)的差异(G856T),根据CAPS标记设计原理，利用在线软件dCAPS Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)和Primer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)设计、开发了一个从甜瓜基因组中特异性扩增CmAPRR2等位基因的dCAPS标记FC，并引入一个错配碱基C形成限制性内切酶NcoI的特异酶切位点。该标记由序列1和序列2所示的核苷酸序列组成：
FC-F：CCAGGCAGGTTCAAGAAGTG(序列1)；
FC-R：CTTGAACAAATTTTCTGTGTAGCC(序列2)。
二、甜瓜果皮颜色特异性分子标记FC的应用
1、利用标记FC的引物FC-F和FC-R检测两个亲本蜜思源185和蜜思源160
1)利用CTAB方法提取两个亲本蜜思源185和蜜思源160单株幼苗叶片的基因组DNA；
2)用上述引物对FC-F和引物FC-R对两个亲本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
上述PCR扩增的反应体系如下：2μL Buffer(北京全式金生物技术有限公司AP111-03)、1.6μL dNTPs(四种dNTP每种的浓度均为2mmol/L)、0.5ulFC-F(体系中的浓度为0.5μmol/L)、0.5ul FC-R(体系中的浓度为0.5μmol/L)、1.5μL待测甜瓜基因组DNA(50ng/μL)、0.2
Figure BDA0002825147190000081
DNA Polymerase(北京全式金生物技术有限公司AP111-03)for PAGE，ddH2O补至20μL。
上述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，运行35个循环；72℃延伸5min。
采用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，检测结果如图2所示，泳道M为Marker、泳道1和泳道2分别为亲本蜜思源185和亲本蜜思源160；两个亲本均得到198bp扩增产物，片段大小无差异。
同时采用测序方法对PCR扩增产物进行验证，蜜思源185中扩增序列如序列3所示，蜜思源160中扩增序列如序列4所示。序列3与序列4的区别仅在于第174位的核苷酸为G还是T。
3)酶切
上述引物对的扩增产物经限制性内切酶NcoI酶切，酶切体系为：PCR产物20μl，10×Buffer 2.5μl，NcoI酶2μl，ddH2O补至25μl，酶切条件为37℃酶切4h，85℃加热10min。
酶切产物经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，检测结果如图2所示，泳道M为Marker、泳道1-2分别为蜜思源185、蜜思源160酶切前PCR扩增产物检测结果，8-9为蜜思源185、蜜思源160PCR扩增产物NcoI酶切后产物检测结果；可以看出，蜜思源185酶切后产物得到目的片段大小为139bp(参考marker或其产物测序)、蜜思源160酶切后产物得到目的片段大小为116bp(参考marker或其产物测序)，亲本间酶切产物存在大小差异。
2、用引物对FC-F和FC-R检测两个亲本蜜思源185、蜜思源160的F1代和189个F2代
1)利用CTAB方法提取各个单株的基因组DNA，以两亲本作为对照；
2)用引物FC-F和引物FC-R对基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR扩增的反应体系如下：2μL Buffer、1.6μL dNTPs(四种dNTP每种的浓度均为2mmol/L)、0.5ulFC-F(体系中的浓度为0.5μmol/L)、0.5ul FC-R(体系中的浓度为0.5μmol/L)、1.5μL待测甜瓜基因组DNA(50ng/μL)、0.2
Figure BDA0002825147190000091
DNA Polymerase for PAGE，ddH2O补至20μL。
上述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，运行35个循环；72℃延伸5min。
3)酶切
上述引物对的扩增产物经限制性内切酶NcoI酶切，酶切体系为：PCR产物20μl，10×Buffer 2.5μl，NcoI酶2μl，ddH2O补至25μl，酶切条件为37℃酶切4h，85℃加热10min。
酶切产物经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，检测结果如图3所示：A：标记FC对亲本及其F1和36个白色果皮F2代单株的检测结果，P1为蜜思源185，P2为蜜思源160，F1为蜜思源185作父本、蜜思源160为母本杂交F1代，1-36为36个白色果皮F2代单株；B：标记FC对39个F2代单株的检测结果，其中1-12为白色果皮单株，13-39为墨绿色果皮单株；C：标记FC对39个墨绿色果皮F2代单株的检测结果；D：标记FC对39个墨绿色果皮F2代单株的检测结果；E：标记FC对36个墨绿色果皮F2代单株的检测结果。M：100bp DNA ladder；
可以看出，48个果皮白色单株酶切产物大小为116bp一条带，与亲本蜜思源160一致，其对应白色果皮基因型为A2A2；
141个墨绿皮甜瓜单株中，45个单株酶切产物大小为139bp一条带，与亲本蜜思源185一致，其对应绿色果皮基因型为A1A1，96个单株酶切产物大小为139bp和116bp两条带，与杂交F1一致，其对应绿色果皮基因型为A1A2。
果皮颜色基因型为绿色果皮基因型为A1A2、绿色果皮基因型为A1A1和白色果皮基因型A2A2。
绿色果皮基因型为A1A1为甜瓜基因组的2条同源染色体中均含有序列3所示的核苷酸；
绿色果皮基因型A1A2为甜瓜基因组的1条同源染色体中含有序列3所示的核苷酸，另一条同源染色体中含有序列4所示的核苷酸；
白色果皮基因型A2A2为甜瓜基因组的2条同源染色体中均含有序列4所示的核苷酸。
以上实验结果表明，本发明的标记FC检测基因组中含有序列3还是序列4与甜瓜的果皮颜色基因型相关，可以用来检测甜瓜的果皮颜色基因型，或者其子代的果皮颜色。
通过检测待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GG、TT或GT，鉴定或辅助鉴定待测甜瓜的果皮颜色基因型或待测甜瓜的子代果皮是绿色还是白色；
或，通过检测待测甜瓜基因组中含有序列3所示的核苷酸还是序列4所示的核苷酸，鉴定或辅助鉴定待测甜瓜的果皮颜色基因型或待测甜瓜的子代果皮是绿色还是白色；
具体如下：
1)用于鉴定或辅助鉴定待测甜瓜的果皮颜色基因型，具体包括如下：
检测待测甜瓜的基因组中含有序列3所示的核苷酸还是序列4所示的核苷酸或者检测待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GG、TT或GT，
若待测甜瓜的基因组中仅含有序列3所示的核苷酸或，待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GG，则待测甜瓜的果皮颜色基因型为绿色果皮基因型A1A1；
若待测甜瓜的基因组中含有序列3所示的核苷酸和序列4所示的核苷酸或，待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GT，则待测甜瓜的果皮颜色基因型为绿色果皮基因型A1A2；
若待测甜瓜的基因组中仅含有序列4所示的核苷酸或，待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为TT，则待测甜瓜的果皮颜色基因型为白色果皮基因型A2A2；
2)用于鉴定或辅助鉴定待测甜瓜或其子代果皮颜色为绿色还是白色；
检测待测甜瓜的基因组中含有序列3所示的核苷酸还是序列4所示的核苷酸或者检测待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GG、TT或GT，
若待测甜瓜的基因组中含有序列3所示的核苷酸或，待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GG或GT，则待测甜瓜或其子代果皮是绿色，
若待测甜瓜的基因组中含有序列4所示的核苷酸且不含有序列3所示的核苷酸或，待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为TT，则待测甜瓜或其子代果皮是白色。
上述检测待测甜瓜基因组中含有序列3所示的核苷酸还是序列4所示的核苷酸或者检测待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GG、TT或GT的方法包括如下：
1)直接测序；
2)用标记FC的引物对扩增待测甜瓜，测序扩增产物，判断是否含有序列3所示的核苷酸或序列4所示的核苷酸或者序列3第174位的基因型为GG、TT或GT；
3)用标记FC的引物对扩增待测甜瓜(模板为甜瓜苗的基因组DNA)，再用NcoI酶切扩增产物，检测酶切产物；
若酶切产物只含有116bp的片段，则待测甜瓜的基因组中含有序列4所示的核苷酸或待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为TT；
若酶切产物只含有139bp的片段，则待测甜瓜的基因组中含有序列3所示的核苷酸或待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GG；
若酶切产物含有116bp，且含有139bp的片段，则待测甜瓜的基因组中含有序列3所示的核苷酸且含有序列4所示的核苷酸或待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GT。
实施例3、FC在甜瓜果皮颜色分子标记辅助选择种中的应用
为了开展果皮颜色基因的分子标记辅助选择育种，并验证标记FC在果皮颜色中的准确性，根据实施例2中的方法，利用FC标记对除蜜思源185、蜜思源160外的其他不同遗传背景的5份甜瓜品种进行了实际检测，其中蜜思源177(购于京研益农(北京)种业科技有限公司)、HP5(本实验室保存，记载于：马建，王建设.甜瓜全雌系调控基因g的分子标记开发与应用[J].植物遗传资源学报，2019，20(4):1080-1086)、HP6(本实验室保存，记载于：马建，王建设.甜瓜全雌系调控基因g的分子标记开发与应用[J].植物遗传资源学报，2019，20(4):1080-1086)、HP7(本实验室保存，记载于：马建，王建设.甜瓜全雌系调控基因g的分子标记开发与应用[J].植物遗传资源学报，2019，20(4):1080-1086)、神州蜜(购于格瑞特国际种苗)。
具体如下：
1、利用CTAB方法提取每份材料幼苗叶片的基因组DNA，
2、按照实施例2中的方法利用引物对FC-F和引物FC-R对5份甜瓜品种进行了PCR扩增，得到PCR扩增产物。
3)酶切
酶切产物经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，检测结果如图2所示，泳道1-7分别为蜜思源185、蜜思源160、蜜思源177、HP5、HP6、HP7、神州蜜酶切前PCR扩增产物检测结果，8-14为蜜思源185、蜜思源160、蜜思源177、HP5、HP6、HP7、神州蜜PCR扩增产物NcoI酶切后产物检测结果；4份果皮白色甜瓜蜜思源177、HP5、HP6和HP7基因型为A2A2与蜜思源160一致，1份果皮墨绿色神州蜜基因型为A1A2与F1一致。
这些数据表明，利用本发明的FC分子标记及引物FC-F和FC-R检测甜瓜果皮颜色的准确率为100％，并且可区分A1A1、A1A2和A2A2基因型。可以在甜瓜生长早期鉴定其果皮颜色，用于育种中的分子标记辅助选择，可以快速培育出白皮甜瓜新品种，大大提高育种效率。
对比例：
根据已公开专利“一个与甜瓜绿色果皮性状香相关的APRR2基因，申请号201910397822.0”中公开的一个与绿色果皮性状相关的分子标记indel可以检测区分黄色和白色果皮甜瓜材料，根据专利公开的分子标记合成引物Indel-F和Indel-R,利用CTAB方法提取品种蜜思源185、蜜思源160、蜜思源177、HP5、HP6、HP7、神州蜜叶片基因组DNA并进行PCR扩增。PCR扩增的反应体系如下：2μL Buffer、1.6μL dNTPs(四种dNTP每种的浓度均为2mmol/L)、0.5ulIndel-F(体系中的浓度为0.5μmol/L)、0.5ul Indel-R(体系中的浓度为0.5μmol/L)、1.5μL待测甜瓜基因组DNA(50ng/μL)、0.2
Figure BDA0002825147190000121
DNA Polymerase forPAGE，ddH2O补至20μL。
上述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，运行35个循环；72℃延伸5min。产物经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
检测结果如图4所示，泳道1-7分别为蜜思源185、蜜思源160、蜜思源177、HP5、HP6、HP7、神州蜜,可见公开的分子标记indel不能有效区分上述7份材料。表明，本发明的标记特异检测蜜思源185、蜜思源160、蜜思源177、HP5、HP6、HP7、神州蜜。
上述实施例仅为本发明示例性的描述，但本发明的实施方式并不受上述实施例中品种或材料的限制，其他的任何未违背本发明精神实质及原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均落入本发明的保护范围之内。
序列表
<110>北京市农林科学院 浙江省农业科学院 淮北师范大学
<120>一种与甜瓜果皮颜色相关的分子标记及其方法与应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
ccaggcaggt tcaagaagtg 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
cttgaacaaa ttttctgtgt agcc 24
<210> 3
<211> 198
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
ccaggcaggt tcaagaagtg tcccaagcat gttccacacg tctgaaacta aaaataaacc 60
atggaaattt gtgtatctga cacgaacatc atccagcctc aaatgactcg tttgtgcttc 120
gtagtttacg agattctgaa tggtatatgg tttattaggt ggactggacc ccagagctac 180
acagaaaatt tgttcaag 198
<210> 4
<211> 198
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
ccaggcaggt tcaagaagtg tcccaagcat gttccacacg tctgaaacta aaaataaacc 60
atggaaattt gtgtatctga cacgaacatc atccagcctc aaatgactcg tttgtgcttc 120
gtagtttacg agattctgaa tggtatatgg tttattaggt ggactggacc ccatagctac 180
acagaaaatt tgttcaag 198

Claims (10)

1.检测待测甜瓜基因组中含有序列3所示的核苷酸还是含有序列4所示的核苷酸物质在如下1)-6)中至少一种中的应用：
1)鉴定或辅助鉴定待测甜瓜的果皮颜色基因型；
2)制备鉴定或辅助鉴定待测甜瓜的果皮颜色基因型；
3)选育携带白色果皮基因型的甜瓜品种；
4)制备选育携带白色果皮基因型的甜瓜品种的产品；
5)选育子代为白皮的甜瓜品种；
6)制备选育子代为白皮的甜瓜品种的产品；
所述果皮颜色基因型为白色果皮基因型A2A2、绿色果皮基因型A1A1或绿色果皮基因型A1A2；
所述白色果皮基因型A2A2为甜瓜基因组的2条同源染色体中均含有序列4所示的核苷酸且均不含有序列3所示的核苷酸；
所述绿色果皮基因型A1A1为甜瓜基因组的2条同源染色体中均含有序列3所示的核苷酸且均不含有序列4所示的核苷酸；
所述绿色果皮基因型A1A2为甜瓜基因组的1条同源染色体中含有序列3所示的核苷酸，另一条同源染色体中含有序列4所示的核苷酸。
2.检测待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GG、TT或GT的物质在如下1)-6)中至少一种中的应用：
1)鉴定或辅助鉴定待测甜瓜的果皮颜色基因型；
2)制备鉴定或辅助鉴定待测甜瓜的果皮颜色基因型；
3)选育携带白色果皮基因型的甜瓜品种；
4)制备选育携带白色果皮基因型的甜瓜品种的产品；
5)选育子代为白皮的甜瓜品种；
6)制备选育子代为白皮的甜瓜品种的产品；
所述果皮颜色基因型为白色果皮基因型A2A2、绿色果皮基因型A1A1或绿色果皮基因型A1A2；
所述白色果皮基因型A2A2为甜瓜基因组的2条同源染色体中均含有序列4所示的核苷酸且均不含有序列3所示的核苷酸；
所述绿色果皮基因型A1A1为甜瓜基因组的2条同源染色体中均含有序列3所示的核苷酸且均不含有序列4所示的核苷酸；
所述绿色果皮基因型A1A2为甜瓜基因组的1条同源染色体中含有序列3所示的核苷酸，另一个条同源染色体中含有序列4所示的核苷酸。
3.根据权利要求1或2所示的应用，其特征在于：
所述物质均为如下1)或2)：
1)成套引物，所述成套引物由序列表中序列1所示的单链DNA分子或其衍生物个序列表中序列2所示的单链DNA分子或其衍生物；
2)含有所述成套引物的PCR试剂或试剂盒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述试剂盒还包括限制性内切酶NcoI。
5.一种产品，包括权利要求1-4中任一所述的物质；
所述产品具有如下1)-3)中至少一种功能：
1)鉴定或辅助鉴定待测甜瓜的果皮颜色基因型；
2)选育携带白色果皮基因型的甜瓜品种；
3)选育子代为白皮的甜瓜品种；
或，一种生物材料，其包括序列3所示的DNA分子和/或序列4所示的DNA分子；
或，所述生物材料在如下1)-3)中至少一种功能：
1)鉴定或辅助鉴定待测甜瓜的果皮颜色基因型；
2)选育携带白色果皮基因型的甜瓜品种；
3)选育子代为白皮的甜瓜品种。
6.一种鉴定或辅助鉴定待测甜瓜的果皮颜色基因型的方法，为如下A或B；
A所示的方法包括如下步骤：
检测待测甜瓜的基因组中含有序列3所示的核苷酸还是序列4所示的核苷酸，
若所述待测甜瓜的基因组中仅含有序列3所示的核苷酸，则所述待测甜瓜的果皮颜色基因型为绿色果皮基因型A1A1；
若所述待测甜瓜的基因组中含有序列3所示的核苷酸和序列4所示的核苷酸，则所述待测甜瓜的果皮颜色基因型为绿色果皮基因型A1A2；
若所述待测甜瓜的基因组中仅含有序列4所示的核苷酸，则所述待测甜瓜的果皮颜色基因型为白色果皮基因型A2A2；
B所示的方法包括如下步骤：
检测待测甜瓜的基因组中序列3第174位的基因型为GG、TT或GT，
若所述待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GG，则所述待测甜瓜的果皮颜色基因型为绿色果皮基因型A1A1；
若所述待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GT，则所述待测甜瓜的果皮颜色基因型为绿色果皮基因型A1A2；
若所述待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为TT，则所述待测甜瓜的果皮颜色基因型为白色果皮基因型A2A2；
所述白色果皮基因型A2A2为甜瓜基因组的2条同源染色体中均含有序列4所示的核苷酸且均不含有序列3所示的核苷酸；
所述绿色果皮基因型A1A1为甜瓜基因组的2条同源染色体中均含有序列3所示的核苷酸且均不含有序列4所示的核苷酸；
所述绿色果皮基因型A1A2为甜瓜基因组的1条同源染色体中含有序列3所示的核苷酸，另一个条同源染色体中含有序列4所示的核苷酸。
7.一种鉴定或辅助鉴定待测甜瓜或其子代果皮颜色的方法，为如下C或D；
A所示的方法包括如下步骤：
检测待测甜瓜基因组中含有序列3所示的核苷酸还是序列4所示的核苷酸，
若所述待测甜瓜的基因组中含有序列3所示的核苷酸，则所述待测甜瓜或其子代果皮是绿色，
若所述待测甜瓜的基因组中含有序列4所示的核苷酸且不含有序列3所示的核苷酸，则所述待测甜瓜或其子代果皮是白色；
B所示的方法包括如下步骤：
检测待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GG、TT或GT，鉴定或辅助鉴定待测甜瓜的子代果皮颜色为绿色还是白色；
若所述待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GG或GT，则所述待测甜瓜或其子代果皮是绿色，
若所述待测甜瓜的基因组中序列3第174位的基因型为TT，则所述待测甜瓜或其子代果皮是白色。
8.一种选育携带白色果皮基因型的甜瓜品种或选育白色果皮的甜瓜品种或选育子代为白色果皮的甜瓜品种的方法，为选育权利要求6中所述果皮颜色基因型为白色果皮基因型A2A2的待测甜瓜。
9.一种选育携带绿色果皮基因型的甜瓜品种或选育绿色果皮的甜瓜品种或选育子代为绿色果皮的甜瓜品种的方法，为选育权利要求6中所述果皮颜色基因型为绿色果皮基因型A1A1或A1A2的待测甜瓜。
10.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述检测待测甜瓜基因组中含有序列3所示的核苷酸还是序列4所示的核苷酸，或，所述检测待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GG、TT或GT的方法均为如下：
1)直接测序基因组DNA进行判断；
2)用权利要求3或4中所述成套引物扩增所述待测甜瓜，测序扩增产物，进行判断；
3)用权利要求3或4中所述成套引物扩增所述待测甜瓜，再用NcoI酶切扩增产物，检测酶切产物；
若所述酶切产物只含有116bp的片段，则所述待测甜瓜的基因组中含有序列4所示的核苷酸或所述待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为TT；
若所述酶切产物只含有139bp的片段，则所述待测甜瓜的基因组中含有序列3所示的核苷酸或所述待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GG；
若所述酶切产物含有116bp且含有139bp的片段，则所述待测甜瓜的基因组中含有序列3所示的核苷酸且含有序列4所示的核苷酸或所述待测甜瓜基因组中序列3第174位的基因型为GT。
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