KR20000070886A - 형질 전환 식물을 위한 선택방법 - Google Patents

형질 전환 식물을 위한 선택방법 Download PDF

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KR20000070886A
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아이언알라스테르 도날드슨
보이센키르스텐
요르겐센키르스텐
요르스보이모르텐
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부쳐-랄슨 에이.
대니스코 에이/에스
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Abstract

세포군으로 부터 한개 이상의 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 골라내기 위한 선택방법이 개시된다. 이 방법에서는 세포군은 선택가능한 유전적으로 형질 전환된 세포와 있을 수 있는 형질 전환되지 않은 세포를 포함하여 구성된다. 각각의 선택가능한 유전적으로 형질 전환된 세포는 발현 가능한 첫번째 염기서열과 임의로 발현되는 두번째 염기서열을 포함하여 구성된다. 상기 방법에서, 배지에 구성성분 또는 그 대사 유도체가 낮은 농도로 존재할 때 그것은 선택가능한 유전적으로 형질 전환된 세포와 형질 전환되지 않은 세포 모두에게 영양분이 된다.
상기 방법에서, 배지에 구성성분 또는 그로부터와 대사유도체가 높은 농도로 존재할 때 형질 전환되지 않은 세포에게 독성을 준다. 상기 첫번째 염기 서열은 배지에 구성성분 또는 그로부터의 대사유도체가 높은 농도로 존재할 때 그것을 선택가능한 유전적으로 형질 전환된 세포를 위한 영양분으로 바꿀수 있는 유전자 산물을 암호화한다. 상기 방법은 세포군을 배지에 도입시키는 단계를 포함하여 구성되고, 상기 배지는 선택적으로 높은 농도의 성분 또는 그 대사유도체를 포함하여 구성된다. 상기 방법에서 성분 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위한 탄수화물과 질소의 공급원이다. 선택적으로 상기 방법에서 구성성분의 일부가 대사 기질로의 역할을 하고 유도기질로 바뀐다면 그 유도기질은 대사산물에 알로스테릭 효과(allosteric ellect)를 제공할 수 있다.

Description

형질 전환 식물을 위한 선택방법{SELECTION METHOD FOR TRANSGENIC PLANTS}
관심있는 염기서열(nucleotide sequence of interest, "NOI")이 형질전환에 의해 세포군으로 도입될 때, 단지 특정수의 세포만이 형질전환된다. 즉 NOI를 받아들인 다는 것은 잘 알려져 있다. 상기 세포군에서 형질 전환되지 않은 세포로 부터 이 세포들을 분리하기 위해서는 유전전적으로 형질 전환된 세포들을 확인할 필요가 있다.
선택방법을 위한 일반적인 기술에는 형질 전환된 세포가 견딜수 있는 물질을 포함하여 구성된 배지에 형질 전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포를 도입시키는 것을 포함한다. 상기 배지에서 형질전환되지 않은 세포는 생장 저해를 받고 어떤 경우에서는 죽는 반면에, 형질 전환된 세포는 살아서 생장할 수 있다.
지금까지, 식물세포군이 유전적으로 형질전환이 되었다면, 형질 전환된 세포의 선택은 전형적으로 항생물질에 대한 내성 또는 제초제에 대한 내성을 암호화하는 선택유전자를 이용해 이루어졌다. 상기 선택 유전자는 본 식물속으로 들어간 NOI에 연결되었거나 같이 도입 되어진다. 그래서 상기 두 유전자는 모든 세포군 또는 몇몇 세포속으로 들어간다.
모든 세포가 형질 전환되지 않을수도 있기 때문에 상기 세포들은 유전적으로 형질전환된 세포가 선택 유전자에 의해 내성을 갖게 되는 항생물질 또는 제초제가 포함된 배지속이나 배지위에서 배양된다. 이 배지에서, 항생물질 또는 제초제에 대한 내성 유전자를 갖지 않은 형질 전환되지 않은 세포는 생장이 억제되거나 심지어 죽기 때문에, 형질 전환된 세포는 자랄수 있고 그래서 전체 세포군으로 부터 확인될 수 있다.
항생물질 또는 제초제의 사용에 의지하는 선택방법은 많은 불편함을 겪는다. 예를들면 환경단체와 정부당국에서는 식물이나 미생물에서 항생물질에 대한 내성 그리고/또는 제초제 내성을 암호화하는 합병하는 유전자가 환경적으로 안전한지에 대한 염려를 갖고있다. 이런 염려는 폐쇄 환경에서 이용되도록, 고안되거나 의도되지 않은 미생물(예를들면 농업에 유용한 미생물)과 식용식물 또는 폐쇄 환경에서 사용되도록 고안된 그러나 그것이 폐쇄환경으로 부터 나올수도 있는 미생물에 대해 특히 중요성을 갖는다.
이러한 염려들이 입증되는 동안, 각 염려는 예를들면 식물에서 항생물질 내성 유전자 그리고/또는 제초제 내성 유전자의 사용에 대한 정부적 저항을 야기시킬 수도 있다.
그러므로 상기와 비교되는 유전적으로 형질전환된 세포 또는 이를 포함하는 유기체를 선택하는 새로운 방법을 개발하는 것이 요구되는 것이다.
본 발명은 선택방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 효소 및 선택방법에 유용한 효소를 암호화하는 염기 서열에 관한 것이다.
특히 본 발명은 유전적으로 형질전환된 세포의 선택방법, (예를들면 확인 및/또는 분리), 그 방법에 사용되는 화합물, 유전적 재료에 관한 것이다.
이하 본 발명의 실시예를 첨부도면을 참조하여 설명한다.
도 1은 대사경로의 도식도.
도 2는 대사경로의 도식도.
도 3은 대사경로의 도식도.
도 4는 염기서열의 비교를 나타낸다.
도 5는 몇개의 염기서열을 나타낸다.
도 6은 몇개의 염기서열을 나타낸다.
도 7은 PCT 반응계획의 도식도.
도 8은 플라스미드의 도식도.
도 9는 플라스미드의 도식도.
도 10은 플라스미드의 도식도.
도 11은 플라스미드의 도식도.
도 12는 플라스미드의 도식도.
도 13은 전기영동 연구의 사진 결과.
도 14는 전기영동 연구의 사진 결과.
도 15는 전기영동 연구의 사진 결과.
도 16는 전기영동 연구의 사진 결과.
도 17는 전기영동 연구의 사진 결과.
도 18는 전기영동 연구의 사진 결과.
도 19는 전기영동 연구의 사진 결과이며,
도 20은 그래프.
도 21은 그래프이며,
도 22는 플라스미드의 도식도.
도 23은 전기영동 연구의 사진 결과이고,
도 24는 전기영동 연구의 사진 결과이고,
도 25는 그래프를 나타낸다.
도 26은 전기영동 연구의 사진 결과.
도 27은 전기영동 연구의 사진 결과.
도 28은 본 발명에 따른 3가지 서열목록을 보여준다.
우선, 도 28은 본 발명에 따른 다수의 서열을 나타내는 것이 주목된다. 이점에서, SEQ ID NO.1은 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제를 암호화하는 nagB 유전자의 염기서열이다.
SEQ-ID NO.2는 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제를 암호화하는 nagB 유전자의 염기서열과 일치한다. 그러나 상기 인트론은 그 서열안에 존재한다. 때때로 SEQ ID NO.2는 nagB IV2로 불리어진다. SEQ ID NO.3는 종종 nagB로 불리어지는 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제의 아미노산 서열에 해당한다.
<구조물의 제조>
nagB의 유전자의 암호화 부위는 PCR에 의해 플라스미드 PUC nagB(Altimaro, M M, et al(1991) BBA 1076 266-272) 로 부터 증폭된다. 상위 PCR 프라이머는 BglⅡ 자리를 포함한다. 하위 PCR 프라이머는 XhoⅠ 자리를 포함한다.
이러한 효소로 PCR 산물을 절단하는 것은 플라스미드, pPS48의 붙을 수 있는 BamHⅠ 과 SalⅠ자리 사이에 DNA 조작을 직접 클로닝 할 수 있게 한다(도 22)
최종 구조물에는 2개의 CaMV35S 프로모터와 CaMV35S 터미네이터사이에 nagB 암호화 부위가 존재한다.
또한 35S 프로모터는 대장균(Bilang, et al, Gene 100 (1991) 247-250)에서 기능을 보이기 때문에 형질 전환체의 선택은 nagB 결핍 돌연변이주 IBPC S71CR의 보상실험에 의해 수행된다.
이 균주의 유전자 형은 IBPC 5321 nagB2, asnB50:Tn5, recA1, snl:Tn10 이다.
이 선택 방법은 발효가능한 탄소공급원인 n-아세틸 글루코스아민을 포함하는 배지상에서 수행된다.
nagB 암호화 부위의 증폭
프라이머:
5'(B134)(38-mer)
TAAGATCTAAACAACAACATGAGACTGATCCCCCTGAC
밑줄친 곳은 BglⅡ자리이다. 식물의 상위 부위는 굵은 볼드체로 쓰여졌다. 그리고 시작 코드는 이태릭체로 쓰여졌다.
3'-(B137)(28-mer)
ACCTCGAGCAGGGATAACAATTACAGAC
XhoⅠ 자리에는 밑줄이 그여져 있고 정지 코돈은 굵은 볼드체로 쓰여졌다. 양쪽의 프라이머는 "트리털 ON"으로 합성되었고, 12번째 단계가 다음 단계로 대치된 것을 제외하고, 공급자(Cruachem Ltd, Glasgow, UK-Brochure marked USIN-001-RO2)에 의한 그 표본은 Pharmacia NAP5컬럼에 주입되었고, 다음 단계로 500㎕의 물에 희석되고, 그 500㎕ 시료는 모여져 올리고염기의 분포를 위해 OD260이 정해졌다.
증폭반응혼합물
10㎕ Amplitaq 10x 완충액 (Mg 없음)
8㎕ 25 mM MgCl2
77㎕ 물
0.5㎕ pUC nagB 플라스미드
0.76㎕ 5'-(B134)
0.91㎕ 3'-(B137)
21㎕ dNTP 혼합액(각 2.5 mM)
0.5㎕ Amplitaq
물로서 동일부피로 조절된 하나의 프라이머 대조군 역시 측정되었다.
증폭반응조건
주기 실험군 1 실험군 2 실험군 3
1 94℃-5분 94℃-5분 94℃-5분
2-29 94℃-1.5분50℃-2분72℃-2분 94℃-1.5분55℃-2분72℃-2분 94℃-1.5분60℃-2분72℃-2분
30 94℃-1.5분50℃-2분72℃-10분 94℃-1.5분55℃-2분72℃-10분 94℃-5분60℃-2분72℃-10분
31 4℃-수집할때까지 4℃-수집할때 까지 4℃-수집할때까지
PCR은 밤새 진행되었다. 5㎕의 각 PCR 반응 혼합물은 같은 부피의 TE(tris-EDTA) pH7.5와 2㎕의 겔 적재용액과 섞였다. 각 12㎕ 혼합액은 ½TBE에서 1.2% W/V 아가로스젤 위에 올려졌고 35V에서 2시간동안 전기영동 되었다.
시료는 4㎕의 베링거 분자량 마커 Ⅲ와 Ⅳ옆에 올려졌다.
반응혼합액에서의 산물은 3가지 가열냉각 온도에서 839 염기쌍의 예측된 크기와 일치했다.
31프라이머만 갖는 대조구는 약 950 염기쌍의 인위적 밴드를 보였고, 그것은 60℃ 가열냉각 온도에서는 매우 약했고, 양방향 프라이머(5'3')반응에는 없었다.(도 23)
50℃가열 냉각온도에서 50㎕의 양쪽 프라이머(5'3')반응은 이루어졌고 PCR 산물은 Gene Clean ⅡTM(Bio 101 Inc 에 의해 공급된)를 이용해 다음 방법에 의해 정제된다.
150㎕ NaⅠ 혼합액에 15㎕의 Glass Milk 가 첨가되었다. 그 혼합액은 섞어 얼음위에 5분동안 세워 두었고 그런후에 최고 속도로 20초 동안 Ole Dich의 냉각된 원심분리기 (4℃)에서 원신분리 되었다.
침전물은 400㎕의 찬 New WashTM(Bio 101 Inc에 공급된)에 풀어져 3번 헹궈졌다.
그리고 원심분리를 반복했다. 침전물은 최종적으로 15㎕ TE pH7.5에 풀어서 50℃에 3분동안 놓어 두었고 Eppendorf 원심분리기를 이용해 실온에서 1분동안 원심분리 시켰다. 그 상청액은 모아져 15㎕ TEPH 7.5에 흐석되어 원심분리를 반복했다. 그 최종상청액은 우선적으로 모아졌고 총부피는 35㎕였다.
유전자가 정제된 PCR 산물은 다음 반응혼합액에서 37℃에서 18시간 동안 잘렸다.
35㎕ 유전자가 정제된 PCR 산물
5㎕ 10x Boehringer 완충액 H
5㎕ xhoⅠ 10U/㎕
5㎕ BglⅡ 10U/㎕
pPS48은 다음 방법으로 SaLⅠ과 BamHⅠ으로 순차적으로 잘려준비되었다.
아래 열거된 반응혼합액은 37℃에서 4시간 동안 반응했다.
5㎕ pPS48
5㎕ 10x Boehringer 완충액 H
35㎕ 물
5㎕ SalⅠ 50U/㎕
DNA는 위에 묘사된 유전자 정제 방법을 이용한 혼합액으로 부터 정제되었다. SalⅠ으로 잘린 플라스미드는 최종 부피가 30㎕ TE pH 7.5였다.
다음 반응 혼합액은 37℃에서 4시간 동안 반응했다.
35㎕ SalⅠ으로 잘린 pPS48
5㎕ 10x Boehringer 10x 완충액 B
그리고 원심분리를 반복했다. 침전물은 최종적으로 15㎕ TE pH7.5 에 풀어서 50℃에 3분동안 놓아두었고, Eppendorf 원심분리기를 이용해 실온에서 1분동안 원심분리 시켰다. 그 상청액은 모아져 15㎕ TEpH 7.5에 희석되어 원심분리를 반복했다. 그 최종상청액은 우선적으로 모아졌고 총 부피는 35㎕였다.
유전자가 정제된 PCR 산물은 다음 반응 혼합액에서 37℃에서 18시간 동안 잘렸다.
35㎕ 유전자가 정제된 PCR 산물
5㎕ 10x Boehringer 완충액 H
5㎕ XhoⅠ 10U/㎕
5㎕ BglⅡ 10U/㎕
pP548은 다음 방법으로 SalⅠ과 BamHⅠ으로 순차적으로 잘려 준비되었다.
아래 열거된 반응혼합액은 37℃에서 4시간 동안 반응했다.
5㎕ pPS48
5㎕ 10x Boehringer 완충액 H
35㎕ 물
5㎕ SalⅠ 50U/㎕
DNA는 위에 묘사된 유전자 정제 방법을 이용한 혼합액으로 부터 정제되었다. SalⅠ으로 잘린 플라스미드는 최종 부피가 30㎕ TE pH 7.5였다.
다음 반응 혼합액은 37℃에서 4시간 동안 반응했다.
35㎕ SalⅠ으로 잘린 pPS48
5㎕ 10x Boehringer 10x 완충액 B
10㎕ 물
5㎕ BamHⅠ 50 U/㎕
10㎕의 젤 적제 용액을 SalⅠ/BamHⅠ으로 잘린 pPS48과 XhoⅠ/BglⅡ로 잘린 PCR 산물(각 50㎖)에 첨가되었다. 그 혼합액은 ㎖Ⅸ TAE(triacetic acid and EDTA)안의 1.2% w/v 아가로오스 젤 위에 20㎕의 베링거 분자량 마커Ⅲ와 평행하게 올려졌다. 35V에서 1시간 동안 전기영동이 수행되었다. 그 결과는 도 24에 나타내었다.
SSalⅠ/BamHⅠ으로 잘린 pPS48(B600 염기쌍)과 XhoⅠ/BglⅡ로 잘린 PCR산물(839 염기쌍)에 일치하는 밴드는 잘려 Eppendorf튜브에 넣어져 무게가 측정되었다.
1g/㎤의 밀도를 고려해, 각각의 잘린밴드에 3배의 NaⅠ용액이 첨가되었고 그 시료는 50℃에서 5분동안 가열되었다. 그 튜브의 내용물은 섞인후 50℃에서 5분간 더 반응하였다. 15㎕의 Glass milk가 첨가되고 그 용액은 다시 써ㄲ여 5분동안 얼음위에 놓여졌다. Glass milk는 침전되고 위에 묘사된 유전자 정제방법에 의해 행해진것처럼 400㎖의 New Wash 혼합액은 16℃에서 20시간 동안 반응했다.
6㎕ XhoⅠ/BglⅡ으로 잘린 PCR산물
5㎕ SalⅠ/BamHⅠ/Bgl으로 잘린 pPS48
4㎕ 5xBRL 연결완충액
4㎕ 물
1㎕ T4 리가아제(BRL)
LB TET에 5㎖의 대장균 IBPC571CR 배양은 저염 배지 (1%트립톤, 0.5%효모추출액, 0.5%Nacl)를 이용해 만들어졌다.
전지적으로 준비된 다른 물질을 받아즐이기 쉬운 대장균(글루코스아민 디아미나아제가 결핍된)주(IBPC 571CR(IBPC571CR=IBPC5321 nagB2, asnB50:Tn5, recA1,sal:Tn10)는 아래와같이 준비되었다.
1. 밤새 배양된 5㎖중 2㎖배양액을 250rpm의 쉐이커상에서 미리 37℃까지 데워진 500㎖저염 LB TET배양액(1%트립신, 0.5%효모추출액, 0.5%NaCl, 10㎍ ㎖ 테트라싸이클린, pH는 맞추지 않았고 2.5ℓ플라스크에 배양되었다)에 접종하였다. 동등한 배양액은 생장의 진행을 구성하기 위한 시료 채취를 위해 설정됐다.
양쪽 배양액을 37℃세이크에 되돌렸다.
2. 생장곡선은 구성되어 (도25를 보라) A600 이 0.5에 이르는 시간을 예측하는데 이용되었고 그 시각의 배양액은 즉시 얼음위로 옮겨진후 차가운방(4℃)에 30분동안 놓여졌다.
3. 배양액은 2개의 무균의 500㎖ Beckman 원심분리병에 똑같이 나누었고 JA10로터로 4℃ 5000rpm에서 15분간 원심분리됐다.
4. 침전물은 총 500㎖의 찬( 4℃)증류수에 다시 풀어서, 3단계처럼 원심분리하기전에 원심분리병에 똑같이 나누었다.
5. 침전물은 총 300㎖의 찬( 4℃)증류수에 다시풀어서, 원심분리병에 똑같이 나누어 단계3을 다시 반복하였다..
6. 세포는 10㎖ 찬() 10% V/V 무균의 글리세롤에 다시풀어 뚜껑이 달린 두 Falcon튜브에 똑같이 나누어 Sorvall SM24 로터로 4℃ 6000rpm에서 15분간 원심분리하였다.
7. 펠릿을 총 1㎖의 찬( 4℃)무균의 10%v/v 글리세롤에 다시현탁시켰다.
시료는 위에서 언급된 연결 혼합물을 가지고 수행할 일렉트로포레이션을 위해 취해졌고, 그 나머지는 nunc cryo튜브에 205㎕씩 나뉘어 액체 질소에 얼려졌다.
전기형질전환
1. 1㎕의 연결 혼합액을 찬 일렉트로포래이션 흡수관에서 40㎕의 찬 증류수와 40㎕의 준비된 IBPC571CR으로 혼합하여 얼음위에 1분간 놓아두었다.
2. Biorad 유전자 펄스장치는 25㎌, 2.48㎸, 200w로 설정하였다.
3. 1단계로 부터의 흡수관은 전극표면 접촉에 의한 유독가스를 제거하기 위해 잘 닦아 장치에 장착했다.
4. 시료는 펄스되었고(4.5mS), 그 흡수관은 즉시 꺼내져 가능한 빨리 1㎖의 SOC를 첨가하였다.
5. 흡수관의 내용물은 뚜껑달린 Falcon튜브로 옮겨져 250rmp의 쉐이커에서 37℃ 1시간동안 배양되었다.
6. 5단계의 Falcon 튜브의 내용물은 eppendorf튜브에 옮겨져 13000g에서 30분동안 원심분리되었다. 그 상청액은 제거되고 침전물은 1㎖의 증류수에 다시 풀어졌다.
7. 6단계에서 얻은 박테리아 현탁액의 다음양을 1% w/v N-아세틸 글루코스아민, 10㎕/㎖ 테트라싸이클린, 50㎍/㎖엠피실린을 포함하는 McConkey 최소배지(Difco)에 뿌려주었다.
희석되지 않은 액 100㎕
형질 전환된 현탄액 50㎕+물 50㎕
형질 전환된 현탄액 10㎕+물 90㎕
그 배지는 37℃에서 22시간동안 배양되었다.
희석되지 않은 액을 접종한 배지에선 2개의 양성 세포집락을 골라 1% w/v N-아세틸 글루코스아민, 10㎕/㎖테트라싸이클린, 50㎕/㎖엠피실린을 포함하는 신선한 McConkey 최소배지(Difco)에 뿌려주었다.
이 배지는 37℃에서 22시간동안 배양되었다.
2차 배양으로부터 분리된 세포집락은 10㎍/㎖ 테트라싸이클린, 100㎍/㎖ 엠피실린을 가진 TB에 5㎖의 배양액을 접종하는데 이용되었고 250rpm의 쉐이커에서 37℃ 16시간동안 배양되었다.
이 배양액 전체는 모아졌고, 소량의 플라스미드는 Qiagen spin 컬럼을 이용해 공급자의 지시에 따라 준비되었다.
다음의 제한 효소 절단은 양 플라스미드에 모두 행해졌다.
1㎕ 10x 베링거 완충액 H
5㎕ 물
3㎕ 플라스미드
1㎕ PstⅠ 10 U/㎕
1㎕ 10x 베링거 완충액 B
5㎕ 물
3㎕ 플라스미드
1㎕ HindⅢ 50 U/㎕
1㎕ 10x 베링거 완충액 M
5㎕ 물
3㎕ 플라스미드
1㎕ SphⅠ 10 U/㎕
위의 반응 혼합액은 37℃에서 2시간동안 반응했다. 2㎕의 젤 적재용액이 첨가되고, 각 전체양은 베링거 분자량 마커 Ⅲ과 Ⅵ가 나란이 있는 1% w/v 아가로우스 젤에 놓여졌다. 전기영동은 1/2 TBE완충액에서 35V로 2시간동안 행해졌다. 그결과는 도 26에 있다.
미니프렙 A와 B는 pPS48의 35S 발현 카세트안에 nagB암호화 부위의 연결로 생기는 동일한 제한효소 패텬을 보인다.
PstⅠ 절단은
pPS8의 MCS(다중 클로닝자리)와 nagB암호화 부위안의 634 염기쌍 자리에서 일어난다.
암호화 되지않은 5'PCR 프라이머의 상위 부위와 nagB 암호화 부위를 갖는 pPS48의 MCS의 일부는 658염기쌍의 PstⅠ절편을 설명한다.
어떤 삽입도 갖지 않는 전체 발현 카세트를 자르는 HindⅢ절단은 970염기쌍이고 합병된 nagB PCR산물 (840염기쌍)은 같은 크기로 관찰됐다 -810염기쌍.
게다가 2.65kb의 다른 밴드는 pPS48로부터 1810염기쌍 절편을 제거했을때와 일치한다.
4.45kb의 일직선상의 손상되지 않은 구조를 갖는 pPS48 MCS안의 SphI절단은pPS48에 전체nagB PCR산물을 클로닝한것과 일치한다. 잘리지 않은 플라스미드가 존재해 생기능 흐린 밴드의 존지는 불완전한 절단에 의한 것이다.
다음 제한 효소 혼합액은 37℃에서 6시간동안 반응한후 4℃에 두었다.
15㎕pPS48 nagB miniprepA
1㎕ 물
2㎕ 베링거 10x 완충액 B
2㎕ HindⅢ 50U/㎕
pPS48 nagB의 HindⅢ 제한효소절단은 4㎕의 젤 적재용액과 섞여 20㎕의 베링거 분자량 마커Ⅲ과 함께 TAE 완충액안의 1% 아가로우즈 젤에서 35V, 1시간동안 전기 영동되었다. 그 결과는 도 27에 보인다.
1810염기쌍의 HindⅢ 절편은 젤로부터 절단되어 유전자 정제Ⅱ를 이용해 위에 언급된 방법대로 정제되었다.
정제된 절편은 식물 형질전환 벡터에 연결되었다.(이벡터는 후에 농의된다)
35S 발편 카세트 옆의 nagB 암호화 부위를 포함하는 pPS nagB로 부터의 1810 염기쌍 HinⅢ절편은 pVictor Ⅳ GNG에 연결되었다. 그 결과물인 플라스미드(pVictor Ⅳ GNG nagB)는 도표 12에 있다.
그 구조는 아그로박테리움 투메파시엔스(학명)를 형질존환시키는데 사용되었다. 형질전환체는 액체 배지와 비교할때 한천 배지에서 훨씬더 잘 자라는 것이 밝혀졌다. 적당한 형질전환체 대조구와 비교해보면, 이것은 nagB 유전자가 있기 때문이라고 생각된다. pVictor Ⅳ GNG nagB의 존재에 대한 아그로박테리움 투메파시엔스(학명)의 민감성의 경향은 박테리아가 액체 배지의 낮은 삼투압을 견딜수 있게하는 박테리아 세포벽의 빠른 회복으로 부터 생기는 것 같다. 그러므로 본 발명의 바람직한 측면은 nagB유전자가 식물 게통으로 합병된후에 발현되는 동안, 박테리아 형질전환체에서 nagB의 역발현을 막는 것이다.
사용된 전략은 유전자의 암호화 부위(Vancanneyt, Cet al(1990) Mol Gen Genet 220:245-250)에 Ⅳ2 인트론을 삽입시켜, 아그로박테리움 투메파시엔스(학명)안의 베타-글루쿠로니다아제(uidA)에 결합되는 것으로 알려졌다. nagB속으로 결합되는 IV2 인트론의 결합자리는 MET70과 ASP72코든 사이에서 선택되며, 그겄은 VAL VAL THR PHE ASN MET ASP GLU TYR(Natarajan and Datta Assis(1993) 268 pp 9206-9241)와 비교되는 매우 보존된 부위안에 있다. 이 연결부위는 식물 인트론의 유사서열로 확인되었다. (Shapiro, MB & Senapathy, P(1987)NAR 15 7155-7174). nagB에 Ⅳ2 인트론을 삽입시키기 위해 선택된 방법은 SOE(겹쳐진 부위의 연결)PCR이다. 프라이머와 반응조건은 "OLIG04"프로그램을 이용해 고안되었다.(National Bioscience Inc)
PCR프라이머
다음의 프라이머가 사용되었다:
Primer 1(B507)29MER
TGCAGAGATCTAAACAACAACATGAGACT
여기에서 HindⅢ자리는 굵은 볼드체로 씌였다: 식물 상위 보존 서열은 밑줄그어졌다:
그리고 시작 코돈은 이탤릭체로 씌였다.
Primer2(B506)34MER
TAGAAGCAGAAACTTACCATGTTGAAGGTGACAA
여기에서 Ⅳ2 인트론은 볼드체로 씌였다; nagB서열은 이탤릭체로 씌였다.;
그리고 밑줄2은 위치는 MET70을 나타낸다.
Primer3(B508)34MER
TTGTCACCTTCAACATGGTAAGTTTCTGCTTCTA
여기에서 Ⅳ2 인트론은 볼드체로 씌였다; nagB서열은 이탤릭체로 씌였다.;
그리고 밑줄2은 위치는 MET70을 나타낸다.
Primer 4(B509)34MER
AGACCGACATATTCGTCCTCCACATCAACAAATT
여기에서 Ⅳ2 인트론은 볼드체로 씌였다; nagB서열은 이탤릭체로 씌였다.;
그리고 밑줄2은 부위는 TYR73 GLV72 ASP71을 나타낸다.
Primer 5(B510)34MER
AATTTGTTGATGTGCAGGACGAATATGTCGGTCT
여기에서 Ⅳ2 인트론은 볼드체로 씌였다; nagB서열은 이탤릭체로 씌였다.;
그리고 밑줄2은 부위는 ASP71 GLV72 TYR73을 나타낸다.
Primer6(B511)27MER
CATGCCTCGAGCAGGGATAACAATTAC
여기에서 nagB3' 비번역 부위는 이탤릭체로 씌였다. 정지코든은 밀줄그어졌다.
그리고 XhoⅠ자리는 볼트체로 씌여졌다.
위의 올리고 프라이머 모드는 "트리틸-ON"을 이용해 합성되었고 "C.O.P"카트리지를 이용해 정제되었다.(앞을보라)
다음 3개의 잘린조각은 PCR에 의해 합성되었다.
조각 1.
식물 상위 부위와 붙어있는 nagB 암호화 부위의 염기서열 1-234를 증폭시켜 얻었고 5' 말단의 BglⅡ는 3'말단 Ⅳ2 인트론의 염기서열 1-17과 겹친다.
(반응1)
조각2
5' 말단 nagB 암호화 부위의 염기서열 218-224와 겹치는 부분과
3' 말단 nagB 암호화 부위의 염기서열 235-251와 겹치는 부분과 붙어있는 Ⅳ2 인트론(189BP)을 증폭시켜 얻었다.(반응2)
조각 3
5' 말단 Ⅳ2의 염기서열172-189과 3'말단 XhoⅠ자리와 붙어있는 암호화 부위의 염기서열 235-801과 nagB 정지코돈을 증폭시켜 얻었다.
(반응3)
반응1:
73/69/65㎕ 물
4/8/12㎕ MgCl225mM
0.5㎕ pPS48 nagB
5㎕ 프라이머1(B507)4 pmole/㎕
5㎕ 프라이머2(B507)4 pmole/㎕
2㎕ dNTP 혼합액(각 2.5mM)
0.5㎕ Amplitaq
반응2:
73/69/65㎕ 물
4/8/12㎕ MgCl225mM
0.5㎕ pUC,GUS 인트론
5㎕ 프라이머3(B508)
5㎕ 프라이머4(B509)
2㎕ dNTP 혼합액(각 2.5mM)
0.5㎕ Amplitaq
반응3:
73/69/65㎕ 물
4/8/12㎕ MgCl225nM
0.5㎕ pPS48 nagB
5㎕(B510)프라이머5
5㎕프라이머(B511)
2㎕ dNTP 혼합액(각 2.5mM)
0.5㎕ Amplitaq
주기 반응 1 과 3 반응 2
1 94℃-5분 94℃-5분
2-29 94℃-1.5분58℃-1분72℃-2분 94℃-1.5분50℃-1분72℃-2분
30 94℃-1.5분58℃-1분72℃-10분 94℃-1.5분50℃-1분72℃-10분
31 4℃- 수집될때까지 4℃-수집될때까지
상기 반응은 밤새 수행되었다.
PCR 산물은 각 반응 혼합액 2㎕에 8㎕의 물과 2㎕의 젤 적재 완충액(0.25% 브로모페놀 블루/0.25% 자일렌 씨아놀 FF/30% 물속 글리세롤)이 첨가되어 TAE완충액안 2% 아가로오스 젤에 전체량을 올려 35V에서 약 2시간동안 전기영동 시켰다. 시료는 베링거 DNA분자량 마커 Ⅵ와 같이 전기영동되었다.
그 결과는 도13에 있다. 도14는 도 13과 같은 젤이고 잘린 밴드의 위치를 보여준다.
젤에서 산물의 이동은 예상한 분자량과 일치한다.
(반응1 : 251염기쌍, 반응2: 223염기쌍, 반응3: 628염기쌍)
2mM Mg Cl2에서 수행된 각 반응 시료 50㎕에 10㎕의 젤 적재 완충액이 첨가되었고, TAE 완충액안의 2% w/v 아가로오스 젤위에서 35V, 약 2시간 동안 전기 영동되어 분리되었다.
밴드는 잘렸고, Eppendorf 튜브에 젤 절편을 넣어, 액체 질소에 얼렸다가 37℃에서 5분간 녹여, Millipove ultrafree MC filtration튜브에 넣어 13000g에서 5분동안 원심분리시켰다.
여과액속 DNA 13000g 에서 5분동안 원심분리한 후에 1/10 부피의 아세테이트와 2배의 찬 에탄올로 침전시켰다.
침전된 DNA를 70% w/V의 찬 에탄올로 씻어 말린후, 10㎕TE에 다시 녹였다.
PCR후에 관찰된 밴드가 인위적이지 않음을 확인하기 우해, 한방향 프라이머만든 대조구 반응도 함께 측정되었다.
이 대조구 반응은 양방향 프라이머가 든 반응과 비교되었다. 각 시료에 8㎕의 물과 2㎕의 완충액을 첨가해 TAE완충액안 2% w/v 아가로오스 젤에 전체량을 올려 35V에서 약 2시간동안 전기영동시켰다.
본 연구의 결과는 도 15에 있다.
도표 15에 보이는 것과같이 한방향 프라이머만 든 대조구에서는 어떤 인위적인 밴드도 나타나지 않았다.
절편 1과 2를 결합시키는 것은 다음의 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행되었다.
51㎕ 물
8㎕ MgCl225mM
10㎕ Mg없는 Amplitaq 10x 완충액
1㎕ 절편1
8㎕ 절편2
5㎕ 프라이머 1(B507)4 pmoles/㎕
5㎕ 프라이머 4(B509)4 pmoles/㎕
2㎕ dNTP 혼합액(각 2.5mM)
0.5㎕ Amplitaq 완충액(Perkin Elmer)
이 결합 반응은 다음 온도 프로그램에 의해 밤새 진행되었다.
온도프로그램
주기 결합반응(절편 1&2)
1 94℃-5분
2-29 94℃-1.5분54℃-1분72℃-2분
30 94℃-1.5분54℃-1분72℃-10분
31 4℃- 수집될때까지
후에 이용할 더 많은 산물을 제공하기 위해 반응 2는 반복되었고, 위와 병행하여 수행되었다.
각 RCR반응의 시료 6㎕에 24㎕물과 6㎕젤 적재 완충액(Amplitaq 완충액-Perkin Elmer에 의해 제공)을 첨가했다. 각 혼합액의 전량은 TAE완충액 안의 2% w/v아가로오즈 젤에 실려, 35V에서 약 2시간 동안 전기 영동되었다. 그 결과는 도16에 있다.
결합된 산물의 이동은 예상했던 440bp에 매우 근접했다.
절편 1과 2가 결합된 산물의 시료 2x 50㎕는 전기 영동되었고, DNA는 위에 기술한 것과 같은 방법으로 밴드로 부터 분리되었다.
그 결과는 도표 17에 보인다.
이미 결합된절편 1과 2를 절편3과 결합시키는 것은 다음 PCR반응 혼합액에의해 수행되었다.
67㎕ 물
10㎕ Mg 없는 Amplitaq 10x 완충액
8㎕ MgCl225mM
1㎕ 결합된 절편 1과 2
2㎕ 절편3
5㎕ 프라이머 1(B 507) 4 pmoles/㎕
5㎕ 프라이머 6(B 511) 4 pmoles/㎕
2㎕ dNTP 혼합액 (각 2.5 mM)
0.5㎕ 혼합액 완충액
결합 반응은 담의 온도 프로그램에 의해 밤새 진행되었다.
주기 낮은 가열냉각 온도 높은 가열냉각 온도
1 94℃-5분 94℃-5분
2-29 94℃-1.5분56℃-1분72℃-2분 94℃-1.5분60℃-1분72℃-2분
30 94℃-1.5분56℃-1분72℃-10분 94℃-1.5분60℃-1분72℃-10분
31 4℃- 수집될때까지 4℃-수집될때까지
프라이머 1 또는 프라이머 6마톤 한쪽 방향 프라이머 대조구는 낮은 가열냉각 온도에서 수행되었다.
PCR 반응은 위에 기술한 것과 같은 방법으로 전기영동되어 분석되었다.
결합반응은 예상했던 분자량 1034bp와 잘일치하는 밴드를 생산했다. 프라이머 6을 가진 대조구 또한 산물을 생산했지만 이것보다 조금 컸고 프라이머 5만톤 대조구는 훨씬 작은 산물을 생산했다.
흥미롭게도, 높은 가열 냉각 온도 60℃에서 지저분한 밴드는 줄지 않고 오히려 증가했다.
이미 결합된 절편 1과 2에 절편 3을 결합한 산물은 절편 1,2,3의 정제를 위해 위에 기술한 것과 같은 방법으로 전기영동되어 분리되었다. 그 밴드는 젤에서 잘려 유전자 정제 Ⅱ를 이용하여 정제되었다.
그후에 전기영동은 수행되었고 그 결과는 도 19에 있다.
클로닝과 염기서열 분석
nagB PCR 증폭 산물과 IV2 인트론을 갖는 nagB는 결합되어 T-과잉부위와 연결된 pT7Blue(Novagen)의 ECORV 자리에 삽입되었다. 형질전환체의 청/백 선택방법은 50㎍/㎖의 엠피실린을 포함하는 LB 배지위에서 행해졌다.
배지위에 50㎕ X-gal(20mg/㎖ 디메칠설포사이드)을 뿌려 무균의 laminar flow bench에서 말렸다. 하얀 세포집락의 DNA를 준비해 ECORV/XbaⅠ과 DstⅠ으로 잘라 확인했다. 형질전환체 플라스미드는 Quiagen(Quiagen)을 이용해 대규모로 준배되었고 이 DNA는 염기 서열분석을 위해 사용디었다.
말단 염기서열 분석(Thermal sequencing)
말단 기서열 분석은 다음 프라이머(Phavmacra)를 이용해 수행되었다.
5'플루오로세인-d[CAG CGT TGT AAA ACG ACG GCC AGT]-3'
5'플루오로세인-d[CAG GAA ACA GCT ATG AC]-3'
사용된 시약은 열에 안정한 폴리머라아제, 써모 시쿼나아제 (Amersham Life Science)를 제외하고는 자동해독 1000 염기서열 분석 용구 (Pharmacia)로 부터 얻어졌다.
0.5-1㎍의 플라스미드 DNA를 2㎕의 물과 섞었다. 반응 혼합액은 다음과 같이 준비되었다.
형광마커(1-2 pmol) 1㎕
플라스미드 DNA 5㎕
A,C,G or T 시약 2㎕
시료는 95℃까지 가열되어 즉시 다음 온도 프로그램을 25회 반복하였다.
95℃ 30초
60℃ 30초
Autoread 1000 염기서열 분석용구(Pharmacia)를 이용한 서열분석
nagB에 상보적인 염기서열인 다음 프라이머는 자동해동 1000 염기서열 분석용구(Pharmacia)를 이용해 합성되었다.
206-222 GCTTTAAGCACGTTGTC
225-209(rev) GGTGACAACGTGCTTAA
719-703(rev) TTTGCGACGCGAGTGTC
431-415(rev) TATTCGTCCTGCACATC
플라스미드 주형의 농도는 약 20㎍/㎕로 맞추었다. 프라이머 가열냉각은 다음 반응 혼합액안에서 수행되었다.
주형 DNA 10㎕
프라이머 (1-2 pmol) 2㎕
열냉각 완충액 2㎕
증류수 1㎕
가열냉각 혼합액은 흔들어 섞어 짧게 원심분리하여 65℃에서 10분동안 반응시킨다. 그런 후에 실온에서 45분동안 식혀 짧게 원심분리하였다.
각 가열냉각 온도의 반응액에 2㎕의 플루오르-dATP 표지 시약을 섞었다. 2㎕의 희석된 T7 DNA 폴리머라아제(4U/㎕)가 첨가되어 37℃에서 10분동안 반응되었다. 다음의 프라이머 표시 반응에 있어, 그 혼합액은 1㎕의 확장 완충액과 3.5㎕의 디메틸 설포싸이드가 첨가될 때 37℃에서 유지되었다.
각 5.4㎕의 프라이머 표지 반응 혼합액에 즉시 3㎕의 염기혼합물 (A, C, G 와 T)이 첨가되어 37℃에서 5분동안 반응되었다. 반응은 5㎕의 정지용액을 첨가함으로써 종결되었다.
전기영동
두가지 염기서열분석 반응의 전기영동은 Pharmacia ALF 자동해독 염기서열 분석기를 이용하여 수행되었다. 시료는 90℃에서 2분간 가열된 후 염기서열분석 젤에 8㎕씩 올려졌다.
식물 발현 카세트에 nagB 구조물의 연결과 식물 형질전환 벡터로의 클로닝
pT7Blue안의 nagB와 IV2 인트론을 포함하는 nagB는 정확한 핵산 서열을 보이는 염기서열 분석에 의해 확인되었다. 이것은 pT7Blue 에서 BalⅡ/xhoⅠ 절편으로 잘려 BamHⅠ/SalⅠ으로 잘린 pPS48을 갖는 CamV 35S 발현 카세트에 직접 클로닝되었다(도 8). IV2 인트론을 갖는 nagB 구조물은 잘련, 위와 같은 방법으로 pDB22의 루비스코 소단위 프로모터와 노팔린 신싸아제 터미네이터 사이에 클로닝되었다. 이런 방법으로 발현 카세트에 연결된 nagB 구조물은 근접한 프로모터, 터미네이터와 함께 pPS48과 pDB22로 부터 HindⅢ 절편으로 잘려 pVictor IVGNG의 유일한 HindⅢ 자리로 연결되었다.
IV2 인트론을 가진 nagB 암호화 부위를 포함하는 플리스미드는 CaMV 35S 발현 카세트에 연결되었고 pVictor IV GNG E35S nagB IV2로 명명되었다(도 10).
IV2 인트론을 가진 nagB 암호화 부위를 포함하는 플라스미드는 루비스코 소단위 프로모터/노팔린 신싸아제 발현 카세트에 연결되었고 pVictor IV GNG rbc nagB IV 2로 명명되었다(도 11).
변형된지 않은 nag B방호화 부위를 포함하는 plasmid는 CaMV 35S 발현 카세트에 연결되었고, pVictor IV GIVG E355 nagB로 명명되었다.(도표 12)
독성연구
투여량-반응곡선 guar 외식편에 대한 글루코스아민의 독성을 연구하기 위해, 형질전환되지 않은 guav 자엽 외식편을 이용해 0~5.0 g/ℓ 범위의 글루코스아민으로 투여량-반응 곡선을 만들었다. 외식편의 발아에 대한 영향은 글루코스아민의 독성을 결정하기 위해 사용되었다.(도표 20)
guar 외식편을 다음과 같이 얻어졌다. Guar 증자는 100ml의 Tween 80pr용액 두방울이 첨가된 pH 7.0의 2.5% 소디움 하이포클로라이트 용액으로 소독되었다.
종자는 이용액에서 25분동안 휘저어진후 증류수로 5번 행궈졌다.
종자는 발아 배지(4.43g/ℓ M SMO(Sigma M68 99), 20g/ℓ의 슈크로즈 8.0g/ℓ의 한천, KOH로 pH 5.8로 맞춤)에 심어졌고, 12시간/12시간 낮/밤 체계로 25℃에서 11-13일 동안 놓아 두었다.
약 2mm의 배축을 포함하는 자엽은 묘목으로 부터 제거되어 이실험과 형질전환 실험을 위한 외식편으로 사용되었다. 자엽은 다양한 농도의 글루코스아민이 포함된 선택 배지에 놓여졌다.
선택배지
3.2g/ℓ 갬브로그 B5 (Sigma G5893)
20g/ℓ 슈크로오즈
1.0 mg/ℓ 벤질라미노 퓨린
0.05 mg/ℓ 지베렐락 에시드(GA3)
1.0 μM 실버 티오설페이트
1.0 mg/ℓ NiCl2, 6H2O
0.5 mg/ℓ 2-(p-클로로페녹시)-2-메탈프로피오닉 메시드
30 mg/ℓ 쎄포타싸임
30 mg/ℓ 설박탐(Betamaze)
0-5g/ℓ D-글루크스아민, HCl (실험에 의한)
pH 5.7
3주후에, 다양한 농도의 글루코스아민을 포함하는 배지에서 발아하는 외식편의 백분율이 측정되었고, 그결과는 도표 20에 있다.
글루코스아민의 독성에 영향을 미치는 요소
알맞은 선택조건을 찾기 위해, 글루코스아민의 독성에 영향을 주는 몇가지 요소에 대해 연구했다.
우선, 슈크로오즈가 선택배지내에서 여러가지 농도 (5-40g/ℓ)로 실험되었다.
도표21의 결과는 높은 농도의 슈크로오즈가 관찰된 식을 세포에 대한 글루코스아민의 독성효과를 줄인다는 것을 보여준다. 글루코오스 프럭토오즈 말토오즈 만노오즈와 같은 당류 또한 글루코스아민의 효과에 영향을 미칠것으로 기대된다.
다음으로, 선택배지내의 갬브로그 B5염의 농도 효과는 글루코스아민(3.0g/ℓ)의 존재하에 실험되었다. 우리는 배지내의 탄소량을 줄이기 위해 이염의 용도를 연구하였다.
그결과는 다음과 같다:
선택배지내 갬브로그 B5염(g/ℓ) guar외식편에 대한 발아율(%)
3.2 17.4
2.4 9.1
1.6 6.2
선택배지내의 갬브로그 B5염을 50% 줄이면 글루코스아민이 없을때 발아율에 중요한 효과를 미치지 못한다는 것은 주목할 만한다.
그러므로, 글루코스아민의 효과와 글루코스아민 선택방법을 이용한 형질전환 실험의 산울에 영향을 미치는 선택 배지를 다양하게 변화시킬수 있다.
형질전환 연구
다음 예는 선택적 시약으로 글루코스아민을 포함하는 배지에서 형질전환 guar(싸이몹시스 테트라고노로바)발아와 같은 형질전환 세포를 제공하는 수단으로 대장균 E Coli nag B 유전자를 이용할수 있음을 보여준다.
형질 전환된 구아 (Guar)
구아 자엽 외식편의 형질전환은 도표 10의 플라스미드를 가진 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404를 이용해 Joersbo와 okkels(PCT/DK95/00221)의 방법에 따라 수행되었다.
형질전환된 발아체의 선택은 위에 언급한 다양한 농도의 글루코스아민, 슈크로오즈 갱브로그 B5염이 든 선택배지를 사용해 수행되었다.
4주후에 발아체는 모아졌고, 모든 외식편은 신선한 선택배지(같은 조성)로 옮겨진후 또 4주후에 마지막 발아체가 모아졌다.
발아체는 모아진 후에 조직화학적 분석을 이용해 베타-글루쿠로니다아제(GUS)활성을 분석했다.(Jefferson et al, 1987, EMBO J 6: 3901-3907). GUS-양성 발아체외수는 아래표에 기입되었다.
슈크로오즈(g/ℓ) 글루코스아민(g/ℓ) B5-염(g/ℓ) GUS-양성발아체의 수
10 2.5 3.2 2
20 2.5 2.4 1
20 3.0 2.4 1
그리하여, 형질전환 발아체는 다른 농도의 글루코스아민 슈크로오즈, 그리고 갬브로그 B5염을 가진 선택배지에서 얻어졌고, 이것은 다양한 선택배지는 중요한 의미를 가지며, 형질전환 발아체를 선택하는데 유용하다는 것을 보인다.
형질전환 감자
감자 형질전환에 대한 일반적 설명은 우리의 특허청구 PCT/EP96/03053, PCT/EP96/03052와 PCT/EP94/01082에 있다(각내용은 참고서적에 포함되었다).
본연구를 위해 다음 방법이 사용되었다.
폴라스미드 제조
헬퍼 vir 플라스미드 pRAL4404(Hoekema et al, 1983 Nature 303 pp 179-180)를 포함하는 아그로박테리움 투메파시엔느 LBA 4404는 100g1-1리팜피신과 500mg 1-1스트렙토마이신 설페이트를 포함하는 YMB한천 배지(K2HPO43H2O 660 mg 1-1, MgSo4200mg 1-1, NaCl 100 mg 1-1, 마니톨 10 g 1-1, 효모추출액 400 mg 1-1, 0.8% w/v 한천, pH 7.0)위에서 배양되었다.(pVICTOR IV GNG E35S nagB IV2 또는 pVICTOR IV GNG rbc nagB IV2 또는 pVICTOR IV GNG E35S nagB)를 이용한 형질전환은 Holters et al(1978 Mol Gen Genet 163 181-187) 의 얼림-녹임 방법을 이용해 수행되었고, 형질전환체는 100mg 1-1리팡피신과 500mg 1-1스토렙토마이신과 50mg 1-1젠타마이신 설페이트를 포함하는 YMB 한천 배지위에서 선택되었다. nagB 유전자가 들어있지 않은 대조구 구조물을 이용한 형질전환도 같은 방법으로 수행되었다.
식물의 형질전환
Solanum tuberosum의 변종 Saturna의 발아체 배양은 Linsmair 와 Skoog(1965 Physiol Plant 18 100-127)에 의해 기술된 것 처럼 2μM 실버 티오설 페이트를 포함한 Murashige Skoog 기본염(Sigma M6899)(Murashige and Skoog, 1965, Physiol Plant 15 473-497), 영양분, 비타민을 포함하는 LS 한쳔 배지위에서 유지되었다.
배양은 25℃에서 16시간 광주기를 갖고 이루어졌다.
약 40일후에, 2차 배양이 수행되었고, 그 발아체는 약 8mm 길이의 한마디 조각으로 잘렸다.
약 40일 생장한 (5-6cm길이) 발아 배양체는 8mm의 마디간 조각으로 잘렸다. 그리고/또는 잎은 떼어 잎의 중앙 옆맥에 2-4개의 작은 흠집을 내었다.
그런후에, 이것은 pVICTOR IV GNG E35S nagB IV2 or pVICTOR IV GNG rbc nagB IV2 or pVICTOR IV GNG E35S nagB(A660= 0.5, 경도길이 1cm)로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스가 포함된 액체 LS 배지에 놓여졌다. 실온에서 30분동안 배양한후 그 조각들은 멸균된 거름종이 위에서 말려진 후 LS 한천 배지(0.8% w/v에 2ㅡㅎ 1-12,4-D 와 500㎍ 1-1트랜스-지아틴이 포함된)위로 옮겨졌다. 이 외식편은 액체 LS 배지로 적신 거름종이와 천으로 덮여져 25℃에서 3일동안 놓아 두었다. 그런 후에 그 조각은 800mg 1-1카베니실린이 포함된 액체 LS 배지로 행궈 1mg 1-1트랜스-지아틴, 100mg 1-1지베렉릭 에시트(GA3), 슈크로오즈(eg 7.5g 1-1)가 포함된 LS 한천 배지위로 옮겨졌다. 이 한천 배지는 선택적으로 글루코스아민(예를들면 2.5g1-1)을 포함할수 있다.
이 조각들은 발아되었고, 새로운 발아는 3-4개월 동안 지속되었다.
이 새로생긴 싹은 0.002 mM STS(Silthiosulfat)과 한천(8g/ℓ)으로 구성된 LS 기질위에서 유지되었다. 원하면 카베니실린(800mg/ℓ)을 첨가할수 있다.
형질전환된 식물은Hodal, L. et al. (Pl. Sci.(1992), 87:115-122) 에 따라, 같이 도입된 베타-글루쿠로니 다아제 유전자에 대한 GVS 분석을 행함으로써 확인 될수도 있다.
선택적으로, 새로 생긴 발아체의 바뀐 유전자형은 NPTⅡ분석(Radke, S. E. et al, Theor. Appl. Genet.(1988), 75: 685-694) 또는 (Wang et al(1993, NAR 21 pp 4153-4154)에 따른 PCR 분석을 행함으로써 확인 될수도 있다.
그 발아체(약 2-3cm 길이)는 토양으로 이식되어 생장실(21℃, 16시간 빛조사 200-400 uE/㎡/sec)에 놓아 두었다.
식물이 잘 생장하면 온실로 옮겨 괴경이 형성될때까지 길러 식물의 윗부분을 관찰한다.
수확
감자는 약 3-6개월 후에 수확되어 분석된다.
형질 전환된 발아체는 그 기질에 글루코스아민을 넣어줌으로서 형질전환되지 않은 발아체로부터 구별될수 있다. 발아체의 수확후에, 형질전환된 발아체는 발아배지에 높은 농도의 글루코스아민을 넣어줌으로써 선택될수 있다. 형질전환된 발아체는 글루코스아민을 이용하는 능력을 가지므로 생존할수 있다.
형질전환체의 분석
nagB의 합병을 확인하기 위해, 유전자상의 DNA는 Dellaporta et al(1983 Plant Mol Biol Rep 1 19-21의 방법에 의해 분리될수 있고, 이 DNA 시료는 EcoRI으로 잘려 0.8%w/v 아가로오스젤에서 전기영동되어 서던 블라팅(Southern, 1975 J Mol Biol 98 503-517)에 의해 하이본드 N+막 (Amevsham)에 옮겨졌다. nagB의 암호화 부위에 대한 프로브(Probe)는 Feinberg and Vogelstein(1983 Anal Bioch 137 266-267)의 방법후에32P-표지 프로브의 무작위적 합성에 대한 주형으로 사용될수 있다. 그리고 나서 높은 제한 조건(65℃, 0.1 x SSc)에서 서던 블랏(Souther blots)에 결합되었다.
7.5g/ℓ의 슈크로오즈를 포함하여 구성되는 배지를 이용한 결과는 다음 표에 있다.
글루코스아민(g/ℓ) NH4/NO3(g/ℓ) 외식편당 형질전환된 면적수 형질전환된 발아체수 형질전환빈도(%)(형질전환된 발아체수/시작외식편)
2 1650 0 0 0
2 1298 0.025 0 0
2.5 1650 0 0 0
2.5 1189 0 0 0
3 1650 0 0 0
3 1093 0 0 0
0 1650 1.08 3 7.5
0 1298 2.73 6 15
0 1189 2.50 12 30
0 1093 1.40 12 30
글루코스아민(g/ℓ) 외식편당 형질전환된 면적수 형실전환된 발아체 형질전환빈도(형질전환된 발아체수/시작외식편)
0 5.4 12 24
1 3.8 1 2
2.5 0 0 0
5 0 0 0
7.5 0 0 0
10 0 0 0
상기결과는 nagB 유전자가 형질 전환된 감자 세포를 위한 선택 체계를 제공함을 보인다.
부가적으로, 다음의 연구는 형질전환된 감자가 상기 선택을 확신하기 위해 글루코스아민을 포함하여 구성되는 배지에 노출될수 있음을 보였다.
또한, 그 결과는 몇몇 예에서 VH4HO3의 양을 줄이는 것이 글루코스아민에 덜 독성을 준다는 것을 보였다. 그러나, 형질전환의 견지에서 볼때, NH4NO3의 농도를 낮추는 것은 삽입된 유전자의 효율을 증가시킨다.
형질전환된 옥수수
도입
1983년 형질전환 식물 생산의 첫번째 발표(Leemans, 1993 Biotechnology 11 s22)이래로 특히 쌍자엽 농작물을 포함한 형질전환 식물 생산에 대한 많은 발표가 있어왔다.
최근까지 형질전환된 단자엽 농작물의 성공적인 생산에 대한 보고는 거의 없었다.
단자엽에 있어서 이런 상대적으로 느린 발견은 2가지 이유때문이다.
첫째로, 1980년대 초반까지는, 단자엽식물의 배양된 세포와 조직으로부터의 식물의 효과적인 증식이 매우 어려웠다. 궁극적으로 이 문제는 미성숙한 그리고 배형성 조직으로부터의 외식편을 배양함으로써 해결되었고, 식물 생장 조절인자를 포함하는 영양배지위에서의 형태발생 잠재성이 보유되었다.
두번째로 단자엽식물은 아그로박테리움 투메파시엔스의 자연상의 숙주가 아니다.
이것은 쌍자엽 식물에서는 그 자연상의 벡터인 아그로박테리움 투메파시엔스를 이용한 기술을 성공적으로 발전시켰지만 단자엽 식물에서는 오랫동안 불가능했음을 의미한다.
그럼에도 불구하고, 이제 다음과 같은 방법을 이용한 옥수수의 성공적인 형질전환과 번식력 있는 형질전환 식물을 생산하는 것이 가능해졌다.
(1) Silicon Carbide Whiskers; (2) Particle Bombardment; (3) PEG 처리한 원형질에 의한 DNA 유입; 또는 (4) 조직의 일렉트로포레이션에 의한 DNA 유입 각 방법은 -이것은 (1995 Euphtytica 85 pp 75-80)에 의해 요약되었다- 본 발명에 따른 inter alia 형질전환 옥수수를 준비하기 위해 사용될수 있다.
특히, particle Gun 방법은 단자엽식물의 형질전환에 성공적으로 이용되었다.
그러나, EP-A-0604662는 단자엽식물을 형질전환시키는 다른 방법을 보고하고 있다. 그 방법은 슈퍼 2중 백테를 포함하는 아그로박테리움으로 퇴화를 거친 단자엽 식물의 배양된 형질전환 조직을 포함하여 구성된다. 이벡터는 선택수단으로 하이그로마이신-내성 유전자를 이용한다.
형질전환 식물의 생산은 하이그로마이신 선택을 이용해 규명되었다. 이 방법은 본 발명에 따른 inter alia 형질전환된 옥수수를 준비하기 위해 사용될수 있다.
EP-A-0604662의 방법에 이어지는 EP-A-0672752는 퇴화되지 않은 비성숙배에 대해 보고하고 있다. 이러한 견지에서 하이그로마이신-내성과 PPT-내성 유전자 모두는 선택 수단으로 이용되었고 PPT는 10%이상의 독립된 형질전환 식물을 생산하게 한다. 이 방법은 본 발명에 따른 inter alia 형질전환된 옥수수를 준비하는데 사용될수 있다.
지금까지, 형질전환 옥수수는 동종 번식 계역 A188과 같은 쉽게 배양할수 있는 변종으로부터 성공적으로 생산할 수 있는 것 처럼 보였다. 이런 견지에서 Ishida et al(1996 Nature Biotechnology 14 pp 745-750)의 설명을 보라. 이 연구자들에 의해 기술된 방법은 본 발명에 따른 inter alia 형질전환 옥수수를 준비하기 위해 사용될수 있다.
Vasil (1996 Nature Biotechnology 14 pp 702-703) 은 옥수수의 형질전환에 대해 더 자세한 요약문을 발표했다.
예를들어 particle Gun을 이용한 형질전환으로 형질전환된 옥수수를 준비할수도 있지만, 본발명을 위해서는 다음의 실험 방법이 요구된다.
플라스미드 제조
헬퍼 vir 플라스미드 pRAL4404(Hoekema et al, 1983 Nature 303 pp 179-180)를 포함하는 아그로박테리움 투메파시엔느 LBA 4404는 100g1-1리팜피신과 500mg 1-1스트렙토마이신 설페이트를 포함하는 YMB한천 배지(K2HPO43H2O 660 mg 1-1, MgSo4200mg 1-1, NaCl 100 mg 1-1, 마니톨 10 g 1-1, 효모추출액 400 mg 1-1, 0.8% w/v 한천, pH 7.0)위에서 배양되었다.(pVICTOR IV GNG E35S nagB IV2 또는 pVICTOR IV GNG rbc nagB IV2 또는 pVICTOR IV GNG E35S nagB)를 이용한 형질전환은 Holters et al(1978 Mol Gen Genet 163 181-187) 의 얼림-녹임 방법을 이용해 수행되었고, 형질전환체는 100mg 1-1리팡피신과 500mg 1-1스토렙토마이신과 50mg 1-1젠타마이신 설페이트를 포함하는 YMB 한천 배지위에서 선택되었다. nagB 유전자가 들어있지 않은 대조구 구조물을 이용한 형질전환도 같은 방법으로 수행되었다.
외식편의 분리와 배양
예를들어, 1.5-2.5mm 사이의 옥수수 계열 A188의 미성숙한 배는 분리되어, 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA 4404와 같이 N6-A5에서 25℃ 조명아래에 2-3일 동안 배양되었다. 그런후에 배는 250mg/ℓ의 세포탁싸임이 포함된 증류수로 헹궈져, 250mg/ℓ 세포탁싸임과 100mg/ℓ농도까지의 글루코스 아민이 이 포함된 LS 배지로 옮겨졌다.(그 배지는 이후로 LSSI라 부른다)
형질전환 식물의 선택을 위한 조건
외식편은 3주동안 LSS1 배지에서 배양된후 글루코스아민과 세포탁싸임이 포함된 LS 배지로 옮겨졌다. 이 배지위에서 3주후에, 녹색 발아체는 분리되었고 GUS 활성을 측정하기 위해 시험되었다.
GUS 양성 발아체의 뿌리내림
GUS 양성 발아체는 뿌리내림을 위해 2mg/ℓ의 MS 배지에 옮겨졌다. 이 배지위에서 4주동안 배양된후, 묘목은 환경 순응을 위해 멸균된 토양이 든 화분으로 옮겨졌다.
고찰
본 연구에서 효소 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제를 암호화하는 유전자의 암호 부위는 식물 발현 카세트에 옮겨져 삽입되었다. 이 유전자는 식물 형질전환에 유용한 선택 수단을 제공하고, 상기 선택수단은 형질전환되지 많은 세포에서 형질 전환된 세포를 골라낼수 있게 한다. 이러한 견지에서, 식물에서의 이 효소 발현은 외부에서 공급된 글루코스아민의 대사가 억제되는 것을 감소시킬수 있고 이것은 형질전환된 세포에 탄수화물과 질소의 공급원으로 이롭게 작용할수 있다. 심지어 글루코스아민은 배양배지에서 감소된 슈크로오즈와 암모늄염을 보충하는데에도 이용될수 있다. 오늘날, 상기 선택 체계는 자가조절의 부가된 잇점을 갖는다고 믿어지고 있다. 글루코스아민은 헥소키나아제의 기질로 작용할 뿐아니라, N-아세틸틸 글루코스 아민-6-포스페이트 축적의 결과로 담단백질 합성을 유도하는 경로를 빠르게 포화시킨다. 익서은 차례로 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제를 활성화시키고, 외부로 부터 공급된 글루코스아민의 공급이 멈춰질때 그 활성은 감소될것이다.
그리하여, 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제는 특히 탄소자체 보다 식물 생장에 휠씬 더 제한을 주는 질소 공급원을 제공할수 있는 것과 같이 널리 이용될수 있는 유용한 선택수단을 제공한다.
부가적으로, 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제는 탄소와 질소 공급원으로 제공되는 것과 같이 널리 이용될수 있는 더 유용한 선택 수단을 제공한다.
그리고 우리는 몇몇 식물에서는 슈크로오즈와 글루코스아민의 양 사이에 어떤 상호작용이 있음을 알아냈다. 이러한 견지에서 볼때, 우리의 선행된 연구는 몇몇 식물 세포에서는 슈크로오즈 농도가 감소할때, 글루코스아민이 형질전환되지 않은 세포에 휠씬 더 독성이 있다는 사실을 보여준다.
이것은 배지의 성분은 형질전환된 세포와 식물에게 휠씬 더 이로운 선택조건을 제공하도록 선택될수 있다는 것을 의미한다.
요약
본 발명은 세포군으로 부터 하나이상의 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 골르기 위한 선택 방법뿐만 아니라 상기 방법에 필요한 구조물, 벡터, 플라스미드, 세포와 유기체에 관한 것이다. 게다가 구조물, 벡터, 플라스미드, 세포와 유기체는 상기 방법을 이용해 준비되었다. 상기 방법에서 세포군은 선택가능한 유전적으로 형질 전환된 세포의 형질전환되지 않은 세포를 포함하여 구성된다.
각 선택가능한 유전적으로 형질 전환된 세포는 발현가능한 첫째 영기서열과 선택적으로 발현하는 두번째 염기서열을 포함하여 구성된다. 상기 방법에 있어 그 구성성분과 그로부터의 대사 유도체는 배지에 낮은 농도로 존재할때 선택가능한 유전적으로 형질 전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포 모두에게 영양분이 된다. 상기 방법에 있어; 그 구성성분과 그로부터의 유도체는 배지에 높은 농도로 존재할때 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포에는 그렇지 않지만 형질 전환되지 않은 세포에 독성을 보인다. 첫째 염기서열은 그 구성 성분과 대사 유도체가 배지에 높은 농도로 존재할때 그것을 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포의 영양분으로 바꿀수 있는 유전자 산물을 암호화 한다. 상기 방법은 그 구성성분과 대사 유도체가 높은 농도로 들어있는 배지에 세포군을 도입시키는 단계를 포함하여 구성된다. 상기 방법에 있어 그 구성성분 또는 대사 유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위한 탄수화물과 질소의 공급원이다. 선택적으로 상기 방법에 있어, 그 구성성분의 일부가 대사 기질로 작용하고 대사적으로 유도기질로 바뀐다면, 그 유도 기질은 유전자 산물에 대해 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 제공할수 있다.
본 발명의 다른 변형은 그 기술에 숙련된 사람에게는 분명히 이해될 것이다.
본 발명의 제 1 견지에 의하면, 세포군으로 부터 한개 이상의 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 서택하는 방법이 제공되며,
상기 세포군은 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 있을 수 있는 형질전환되지 않은 세포를 포함하여 구성되며;
상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포 각각은 발현가능한 첫째 염기서열과 임의로 발현가능한 두번째 염기서열을 포함하여 구성되며;
배지내에 저농도로 존재할 때 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포 모두에게 대한 영양분이며;
상기 성분과 그 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 상기 형질전환되지 않은 세포에 대하여 독성을 보이며;
상기 첫째 염기서열은 상기 구성성분과 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 그것을 상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위한 영양분으로 변환시킬 수 있는 유전자 산물을 암호화하며;
상기 선택방법은 상기 세포군을 배지에 도입하는 단계를 포함하며, 상기 배지는 임의로 상기 구성성분 또는 그 대사유도체를 고농도로 포함하며;
그리고 상기 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위해 탄수화물과 질소 모두의 공급원이거나;
혹은 상기 성분의 일부가 대사 기질로서 작용하고 대사적으로 유도기질로 변환된다면 그 유도기질은 유전자산물에 대하여 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 제공할 수 있다.
본 발명의 제 2 견지에 의하면, 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 있을 수 있는 형질전환되지 않은 세포를 포함하여 구성되는 세포군과 배지를 포함하여 구성되는 조성물이 제공되며,
상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포 각각은 발현가능한 첫째 염기서열과 임의로 발현가능한 두번째 염기서열을 포함하여 구성되며;
배지내에 저농도로 존재할 때 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포 모두에게 대한 영양분이며;
상기 성분과 그 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 상기 형질전환되지 않은 세포에 대하여 독성을 보이며;
상기 첫째 염기서열은 상기 구성성분과 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 그것을 상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위한 영양분으로 변환시킬 수 있는 유전자 산물을 암호화하며;
상기 배지는 임의로 상기 구성성분 또는 그 대사유도체를 고농도로 포함하며; 그리고 상기 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위해 탄수화물과 질소 모두의 공급원이거나;
혹은 상기 성분의 일부가 대사 기질로서 작용하고 대사적으로 유도기질로 변환된다면 그 유도기질은 유전자산물에 대하여 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 제공할 수 있다.
본 발명의 제 3 견지에 의하면, 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 있을 수 있는 형질전환되지 않은 세포를 포함하여 구성되는 세포군이 제공되며,
상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포 각각은 발현가능한 첫째 염기서열과 임의로 발현가능한 두번째 염기서열을 포함하여 구성되며;
배지내에 저농도로 존재할 때 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포 모두에게 대한 영양분이며;
상기 성분과 그 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 상기 형질전환되지 않은 세포에 대하여 독성을 보이며;
상기 첫째 염기서열은 상기 구성성분과 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 그것을 상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위한 영양분으로 변환시킬 수 있는 유전자 산물을 암호화하며;
그리고 상기 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위해 탄수화물과 질소 모두의 공급원이거나;
혹은 상기 성분의 일부가 대사 기질로서 작용하고 대사적으로 유도기질로 변환된다면 그 유도기질은 유전자산물에 대하여 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 제공할 수 있다.
본 발명의 제 4 견지에 의하면, 발현가능한 첫째 염기서열과 임의로 발현가능한 두번째 염기서열을 포함하여 구성되는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포가 제공되며,
배지내에 저농도로 존재할 때 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포 모두에게 대한 영양분이며;
상기 성분과 그 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 상기 형질전환되지 않은 세포에 대하여 독성을 보이며;
상기 첫째 염기서열은 상기 구성성분과 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 그것을 상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위한 영양분으로 변환시킬 수 있는 유전자 산물을 암호화하며;
그리고 상기 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위해 탄수화물과 질소 모두의 공급원이거나; 혹은 상기 성분의 일부가 대사 기질로서 작용하고 대사적으로 유도기질로 변환된다면 그 유도기질은 유전자산물에 대하여 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 제공할 수 있다.
본 발명의 제 5 견지에 의하면, 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 생성하기 위하여 형질전환되지 않은 세포를 유전적으로 형질전환시키는 구조물이 제공되며,
상기 구조물은 발현가능한 첫째 염기서열과 임의로 발현가능한 두번째 염기서열을 포함하여 구성되며;
배지내에 저농도로 존재할 때 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포에 대한 영양분이며;
상기 성분과 그 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 상기 형질전환되지 않은 세포에 대하여 독성을 보이며;
상기 첫째 염기서열은 상기 구성성분과 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 그것을 상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위한 영양분으로 변환시킬 수 있는 유전자 산물을 암호화하며;
그리고 상기 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위해 탄수화물과 질소 모두의 공급원이거나; 혹은 상기 성분의 일부가 대사 기질로서 작용하고 대사적으로 유도기질로 변환된다면 그 유도기질은 유전자산물에 대하여 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 제공할 수 있다.
본 발명의 제 6 견지에 의하면, 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 생성하기 위해 형질전환되지 않은 세포를 유전적으로 형질전환하는 구조물을 포함하는 벡터가 제공되며,
상기 구조물은 발현가능한 첫째 염기서열과 임의로 발현가능한 두번째 염기서열을 포함하여 구성되며;
배지내에 저농도로 존재할 때 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포 모두에게 대한 영양분이며;
상기 성분과 그 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 상기 형질전환되지 않은 세포에 대하여 독성을 보이며;
상기 첫째 염기서열은 상기 구성성분과 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 그것을 상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위한 영양분으로 변환시킬 수 있는 유전자 산물을 암호화하며;
그리고 상기 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위해 탄수화물과 질소 모두의 공급원이거나; 혹은 상기 성분의 일부가 대사 기질로서 작용하고 대사적으로 유도기질로 변환된다면 그 유도기질은 유전자산물에 대하여 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 제공할 수 있다.
본 발명의 제 7 견지에 의하면, 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 생성하기 위하여 형질전환되지 않은 세포를 유전적으로 형질전환시키는 구조물을 포함하는 플라스미드가 제공되며,
상기 구조물은 발현가능한 첫째 염기서열과 임의로 발현가능한 두번째 염기서열을 포함하여 구성되며;
배지내에 저농도로 존재할 때 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포에 대한 영양분이며;
상기 성분과 그 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 상기 형질전환되지 않은 세포에 대하여 독성을 보이며;
상기 첫째 염기서열은 상기 구성성분과 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 그것을 상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위한 영양분으로 변환시킬 수 있는 유전자 산물을 암호화하며;
그리고 상기 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위해 탄수화물과 질소 모두의 공급원이거나; 혹은 상기 성분의 일부가 대사 기질로서 작용하고 대사적으로 유도기질로 변환된다면 그 유도기질은 유전자산물에 대하여 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 제공할 수 있다.
본 발명의 제 8 견지에 의하면, 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포을 포함하는 유기체가 제공되고,
상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포는 발현가능한 첫째 염기서열과 임의로 발현가능한 두번째 염기서열을 포함하여 구성되며;
배지내에 저농도로 존재할 때 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포에 대한 영양분이며;
상기 성분과 그 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 상기 형질전환되지 않은 세포에 대하여 독성을 보이며;
상기 첫째 염기서열은 상기 구성성분과 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 그것을 상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위한 영양분으로 변환시킬 수 있는 유전자 산물을 암호화하며;
그리고 상기 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위해 탄수화물과 질소 모두의 공급원이거나; 혹은 상기 성분의 일부가 대사 기질로서 작용하고 대사적으로 유도기질로 변환된다면 그 유도기질은 유전자산물에 대하여 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 제공할 수 있다.
본 발명의 제 9 견지에 의하면, 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 생성하기 위하여 유전적으로 형질전환시키는 구조물을 포함하는 구조물 및 배지를 포함하는 키트(kit)가 제공되며,
상기 발현가능한 첫째 염기서열과 임의로 발현가능한 두번째 염기서열을 포함하여 구성되며;
배지내에 저농도로 존재할 때 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포 모두에게 대한 영양분이며;
상기 성분과 그 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 상기 형질전환되지 않은 세포에 대하여 독성을 보이며;
상기 첫째 염기서열은 상기 구성성분과 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 그것을 상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위한 영양분으로 변환시킬 수 있는 유전자 산물을 암호화하며;
상기 배지는 임의로 상기 구성성분 또는 그 대사유도체를 고농도로 포함하며; 그리고 상기 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위해 탄수화물과 질소 모두의 공급원이거나; 혹은 상기 성분의 일부가 대사 기질로서 작용하고 대사적으로 유도기질로 변환된다면 그 유도기질은 유전자산물에 대하여 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 제공할 수 있다.
본 발명의 제 10견지에 따르면 본 발명의 상기 언급된 견지를 포함하여 구성되거나 상기 견지로 부터 준비된 식물 또는 식물세포가 제공된다.
본 발명의 제 11 견지에 따르면, 이종(heterologous)효소 그리고/또는 그것을 암호화하는 염기서열을 포함하여 구성된 식물 또는 식물세포가 제공되며, 상기 이종효소는 글루코스아민-6-포스페이트 다아미나아제 이다.
본 발명의 이러한 견지는 매우 유익하다. 이점에 있어서, 효소 그자체가 몇몇 형질전환된 세포 (예를들면 감자세포)를 선택하는 수단으로 작용할 뿐아니라 게다가 그것은 제한된 질소효용의 조건하에 당단백의 대사에 이로운 영향을 준다. 후자의 예는 대기중 질소를 고정시킬 수 있는 미생물(예를들면 박테리아)과 공생관계가 성립되기 전에, 콩과 식물이 발아할때 종자 당단백을 이용하는 것이다. 이 경우, 당단백질은 N-아세틸-글로코스아민 그리고 글루코스아민-6-포스페이트, 그리고 글루코스아민-6- 포스페이트 디아미나아제에 의해 프럭토오즈-6-포스페이트로 바뀔것이다.
본 발명의 제 12 견지에 따르면, 본 발명의 상기 언급된 견지를 포함하여 구성되거나 상기 견지로 부터 제조된 식료품 또는 음식이 제공된다.
본 발명의 각 견지에서, 대사기질은 바람직하게는 형질전환된 세포에 의해 대사적으로 유도기질로 변환되는 것이 바람직하다.
상기 성분 또는 그 대사산물이 배지에 존재할 때, 상기 성분 또는 그 대사유도체는 대부분의 형질전환된 세포의 대부분에 결정적으로 영향을 미치지 않는 양으로 존재한다.
바람직하게는, 구성성분 또는 그로부터의 대사산물이 배지내에 존재할 때 그것은 대부분의 형질전환된 세포에게 결정적으로 영향을 주지 않는 양으로 존재하는 것이 좋다.
더 바람직하게는, 구성성분 또는 그 대사산물이 배지내에 존재할 때 그것은 모든 형질전환된 세포에게 결정적으로 영향을 주지않는 양으로 존재하는 것이 좋다.
본 방법의 일 실시예에서 상기배지는 높은 농도의 상기 구성성분 또는 그 대사산물을 포함하여 구성된다. 그러나, 다른 실시예에서, 배지는 반드시 높은 농도의 구성성분 또는 그 대사산물을 포함하여 구성될 필요는 없다.
다른 견지에서, 우리는 놀랍게도 어떤 경우에 있어서는 배지가 본 발명에 따른 상기 구성성분 또는 그 대사산물의 어떠한 첨가도 포함할 필요가 없다는 것을 발견했다.
예를들어 이 놀라운 발견은 형질전환 감자에서 관찰되었고, 본 발명에 따르면 상기 식물은 (본 발명에 논의된 것처럼) nagB 유전자를 포함하는 세포를 포함하여 구성된다. 이와 관련하여, 이미 존재하는 글루코스아민 그리고 글루코스아민-6-포스페이트의 양(고유의 양을 포함하여)은 충분히 높다.
특별한 배양배지에 식물을 노출시킨 결과를 볼때, 정상 식물에서는 고유의 글루코스아민-6-포스페이트의 양이 그 생장을 파괴할 만큼 충분히 독성이 있는 반면, 형질전환된 감자세포는 어떤 고유의 글로코스아민-6-포스페이트를 대사할 수 있다.
그리하여 본 발명의 다른 견지는 아래내용을 포함한다;
형질 전환되지 않은 세포에서 유전적으로 형질전환된 세포를 골라내기 위한 선택수단으로서의 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제의 용도
형질전환되지 않은 세포에서 유전적으로 형질전환된 세포를 골라내기 위한 선택수단을 제공하는 글루코스아민-6-포스페이트 다아미나아제를 암호화 하는 유전자의 용도
형질 전환되지 않은 세포에서 유전적으로 형질전환된 세포를 골라내기 위한 선택수단을 제공하는 유전자; 상기 유전자는 NCIMB 40852 또는 NCIMB 40853 또는 NCIMB 40854 에서 얻을 수 있다.
형질 전환되지 않은 세포에서 유전적으로 형질전환된 세포를 골라내기 위한 선택수단을 제공하는 NCIMB 40852 또는 NCIMB 40853 또는 NCIMB 40854 로부터 얻을 수 있는 유전자의 용도
NCIMB 40852 또는 NCIMB 40853 또는 NCIMB 40854
본 발명의 부가적 견지는 아래 내용을 포함한다;
유전자 사이(특히 암호화 부분)에 적어도 한개의 인트론(intron)이 삽입하여 원핵생물에 존재할 때 원핵생물에 잠재적으로 해로운 유전자 또는 유전자 산물을 불활성화시키는 방법, 그로인한 유전자 또는 유전자 산물의 불활성화.
원핵생물에 존재할 때 원핵생물에게 잠재적으로 해로울 수도 있는 유전자를 포함하여 구성되어진 원핵생물, 그러나 상기 유전자는 원핵생물에서 상기 유전자 또는 그로부터의 산물을 불활성화시키는 적어도 한개의 인트론을 포함하여 구성된다. 특히 상기 인트론은 유전자의 암호화 부분에 존재한다.
본 발명의 이러한 부가적 견지에서, 바람직하게는 적어도 한개의 인트론이 유전자의 보존 부위에, 바람직하게는 암호화 부위안의 보존부위에, 삽입된다.
효소 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제는 2-아미노-2-디옥시-D-글루코스-6-포스페이트 케톨 이소머라아제 (아민기를 제거하는)라고도 불릴수 있다. 이 효소는 효소 컴미션 EC 5.3.1.10를 갖는다.
상기 견지에서, "형질 전환되지 않는 세포에서 유전적으로 형질전환된 세포를 고르기 위해서" 라는 문구는 예를들면 "한개 이상의 형질 전환되지 않은 세포로 부터 유전적으로 형질 전환된 세포를 고르기 위해서" 라고 표현할 수 있다.
그리하여 본 발명의 한 견지에 따르면, 배지안의 세포군으로 부터 적어도 하개의 유전적으로 형질전환된 세포를 고르기 위한 선택 시스템이 제공되며, 상기 최소 한개의 유전적으로 형질전환된 세포는 형질전환되지 않은 세포에 독성이 있는 정도로 배지에 존재할 때 적어도 한개의 형질전환된 세포를 위한 영양분으로 바꿀수 있는 유전자 산물을 암호화하는 염기서열로 형질전환된다. 상기 언급된 성분은 형질전환된 세포를 위한 질소와 탄수화물의 공급원을 제공하고, 상기 언급된 구성성분은 대사기질로 작용하고, 최소한 한개의 대사산물은 유전자 산물에 대해 알로스테릭 효과를 갖는다. 본 발명은 또한 이 시스템에 유용한 효소와 염기를 제공한다.
바람직하게는 상기 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 형질전환된 세포를 위한 탄수화물과 질소 모두의 공급원이고; 상기 성분의 일부가 대사기질로 작용하고, 대사적으로 유도기질로 전환되면 그 유도기질은 유전자 산물에 대해 알로스테릭 효과를 제공할 수 있다.
바람직하게는 상기 구성성분은 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포에게 탄수화물과 질소의 공급원을 제공할 수 있다.
바람직하게는 상기 성분 또는 그 대사 유도체는 아민기를 포함한다.
바람직하게는 상기 성분은 글루코스아민이다.
바람직하게는 형질전환 되지 않은 세포에 독성이 있는 성분의 대사 유도체는 포스페이트기 및/또는 그렇지 않으면 정상 세포에 의해 유용하게 이용될 수도 있는 포스페이트기에 의해 형성된다. 선택적으로 또는 부가적으로, 형질전환되지 않은 세포에 독성이 있는 구성성분의 유도체는 그렇지 않으면 정상세포에 의해 유용하게 이용될 수 있는 인산기의 격리에 책임을 갖는다.
바람직하게는 형질전환되지 않은 세포에 독성이 있는 성분의 대사유도체는 아민기를 포함하여 구성된다.
바람직하게는 형질 전환되지 않은 세포에 독성이 있는 구성성분의 대사 유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포에 탄수화물과 질소의 공급원을 제공할 수 있다.
바람직하게는 형질 전환되지 않은 세포에 독성이 있는 구성성분의 대사 유도체는 글루코스아민-6-포스페이트이다.
바람직하게는 상기 유도 기질은 인산기 그리고/또는 아민기를 포함하여 구성된다.
바람직하게는 상기 유도 기질은 N-아세틸-글루코스아민-6-포스페이트이다.
바람직하게는 첫째 염기서열은 인트론을 포함하여 구성된다.
바람직하게는 상기 유전자 산물은 효소이다.
바람직하게는 상기 효소는 당단백질(glycoprotein) 전구체를 변형시킬 수 있다.
바람직하게는 상기 효소는 당단백질 전구체를 탈아민화시킬 수 있다.
바람직하게는 상기 효소는 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제이다.
바람직하게는 상기 효소는 미생물에서 얻을 수 있는 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제이다.
바람직하게는 상기 효소는 박테리아에서 얻을 수 있는 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제이다.
바람직하게는 상기 효소는 대장균에서 얻을 수 있는 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제이다.
바람직하게는 상기 효소 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제는 SEQ ID NO.3에서 볼 수 있는 아미노선 서열을 갖거나 그변종, 유사종, 또는 2조각이다.
바람직하게는 상기 효소 글루코스아민-6-포스페이이트 디아미나아제는 SEQ ID NO.1 에서 보이는 염기서열 또는 변종, 유사종 또는 그 조작이거나 상기 염기서열에 결합하는 보상적인 서열, 또는 SEQ ID NO. 2에서 보이는 염기서열, 또는 그 변종, 유사종 또는 그 조작이거나 상기 염기서열에 결합하는 보상적인 서열에 의해 암호화되어진다.
바람직하게는 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제 또는 그것을 암호화하는 유전자는 NCIMB 40852, NCIMB 40853, NCIMB 40854 에서 얻을 수 있다.
바람직하게는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포는 시험관에서 배양되거나 생체내에 존재한다.
바람직하게는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 식물세포이다.
바람직하게는 두번째 염기서열은 존재하고 상기 두번째 염기서열은 관심있는 염기서열을 암호화한다.
바람직하게는 상기 식물은 인간과 동물에게 음식으로 제공될 수 있다.
바람직하게는 상기 식물 (또는 상기 세포를 포함한 그 일부)은 단자엽이거나 (콩과를 포함하는) 쌍자엽이다.
바람직하게는 상기 식물 (또는 상기 세포를 포함한 그 일부)은 구아(guar), 감자, 옥수수중 어느 하나이다.
그러므로 본 발명은 형질전환된 세포에 선택적 잇점을 제공함으로서 관심있는 ("NOI") 염기서열이 결합되어진 세포와 같은 유전적으로 형질전환된 세포를 골라내는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 항생물질이나 제초제에 내성을 암호화하는 염기서열을 선택수단으로 포함하는 유전적으로 형질전환된 식물의 준비에 의존하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 예를들어, 많은 NOIs로 형질전환 됐거나 전환될 세포들을 준비하는게 바람직하다면 본 발명의 방법은 종래의 선택방법과 함께 사용될 수도 있다.
또한 본 발명의 선택방법은 예를들어, 많은 NOIs로 형질전환됐거나 형질전환될 세포들을 준비하는게 바람직하다면, WO 93/05165 (참고문헌에 실린내용) 그리고/또는 94/20627 (참고문헌에 실린 내용)에 기술된 것과 같은 필요한 한개 이상의 다른 선택방법과 같이 사용될 수 있다.
부가적으로, 본 발명의 선택방법은 예를들어 많은 NOIs로 형질전환된 세포들을 준비하는 것이 바람직하다면 필요한 본 발명에 따른 한개이상의 다른 선택방법과 같이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 선택방법의 조합의 유용함은 결국 매우 효과적인 다중 스크린 기술에서 기인한다. 위에서 거론한 것처럼 배지안의 구성성분 또는 대사유도체는 선택성을 지닌다. 게다가, 어떤 경우에는 배지에 구성성분 또는 그 대사 유도체를 첨가할 필요가 없을 수도 있다. 본 발명의 이러한 두 견지 모두는 두 스크리닝 단계를 포함하여 구성되는 혼합된 선택 방법에서 사용될수도 있다. 이러한 견지에서, 실시예에 으해, 본 발명의 선택방법을 이용하는 첫번째 스크린에서의 배지는 구성성분이나 그 대사 유도체를 첨가하지 않은 것이다. 첫번째 스크린에서, 선택가능한 형질전환된 세포는 대다수의 형질 전환되지 않은 세포중에서 선택될 수 있다. 형질전환되지 않은 세포는 첫번째 스크린에서 우연히 이월될 수도 있고, 그런후에 두번째 스크린이 수행된다. 두번째 스크린에서 선택된 세포군은 본 발명에 따라 두번째 선택방법을 받는다. 그러나 상기 구성성분 또는 그 대사유도체는 바람직하게는 높은 농도로 배지안에 존재한다.
두번째 스크린에서, 오직 형질전환된 세포만 살아남을 것이다.
그러므로 본 발명의 이러한 종합된 견지로, 본 발명의 초기 견지의 세포군은 미리 선택된 (미리 스크린된) 세포군일 수도 있고, 상기 세포군은 본 발명에 따른 것처럼 한개 이상의 선택방법에 의해 우선 선택되었다.
본 발명의 이러한 종합된 견지는 선택적으로 세포군으로부터 한개이상 선택 가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 고르는 선택방법으로 표현될 수 있다. 상기 세포군은 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 있을 수 있는 형질전환되지 않은 세포를 포함하여 구성되고,
본 발명의 제 2 견지에 의하면, 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 있을 수 있는 형질전환되지 않은 세포를 포함하여 구성되는 세포군과 배지를 포함하여 구성되는 조성물이 제공되며,
상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포 각각은 발현가능한 첫째 염기서열과 임의로 발현가능한 두번째 염기서열을 포함하여 구성되며;
배지내에 저농도로 존재할 때 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포 모두에게 대한 영양분이며;
상기 성분과 그 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 상기 형질전환되지 않은 세포에 대하여 독성을 보이며;
상기 첫째 염기서열은 상기 구성성분과 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 그것을 상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위한 영양분으로 변환시킬 수 있는 유전자 산물을 암호화하며;
상기 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위해 탄수화물과 질소 모두의 공급원이거나; 혹은 상기 성분의 일부가 대사 기질로서 작용하고 대사적으로 유도기질로 변환된다면 그 유도기질은 유전자산물에 대하여 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 제공할 수 있으며,
상기 방법은 상기 세포군을 배지에 도입한 후 형질 전환되지 않은 세포에서 최소한 형질전환된 세포 일부를 선택한 다음, 이어서 그 형질전환된 세포 최소부분을 고농도의 성분 혹은 그 대사유도체를 포함하는 배지에 도입하는 단계를 포함한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 유전자나 유전자 산물, 구성성분이나 그 대사유도체를 포함하지 않는 제 1 배지, 구성성분이나 그 대사유도체를 고농도로 함유한 제 2 배지와 같은, 본 발명의 결합된 견지에 유용한 조성물 및 키트를 포함한다.
게다가, 본 발명의 선택방법은 다른 선택방법과 함께 사용되어질 수 있다. 상기 다른 선택방법은 본 발명에 따르는 하나 이상의 선택방법과 WO 93/05163 그리고/또는 WO 94/20627에 나오는 것같은 항생제 또는 제초제 내성이 의존하는 하나 이상의 선택방법과의 조합이다.
WO 93/05163 그리고/또는 94/20627의 선택방법에서 만나오즈-6-포스페이트 이소머라아제(E.C. 5.3.2.8)를 암호화하는 대장균의 manA 유전자가 선택가능한 지표로 사용된다.
이 선택지표는 만노오즈가 존재할 때 양성 선택을 보이는 솔라넘 투베로숨(Solanum tuberosum)의 형질전환에 알맞다. 더 자세히보면, manA의 암호부위를 CaMv 35S 발현카세트에 연결시켰다. 그리고 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium trmefaciens)에 의해 매개되는 식물 형질전환을 위한 벡터에 삽입시켰다. 만노오즈에 대한 선택과 카나마이신(kana mycin)선택을 비교하면, 상기 벡터 또한 카나마이신 내성을 위한 유전자, nptⅡ를 포함한다. 형질전환 세포를 가려내기 위해 그 구조는 조직화학적 지표인 베타-글루쿠로니다아제, uidA를 포함한다. manA 유전자의 안전한 결합은 서던 블라팅에 의해 보여진다.
이 구조를 가지고, 만노오즈에 대해 선택된, 형질전환된 식물로부터의 추출액은 대조구 식물보다 만노오즈-6-포스페이트 이소머라아제에 대해 500배나 높은 활성을 보인다. 형질전환된 세포에서 manA의 발현은 형질전환된 세포를 위한 탄수화물의 공급원으로 역할을 하는 반면 만노오즈에 의해 주로 야기되는 대사마비를 경감시킨다. 이런 효과는 겹쳐져 형질전환 세포에 유리하게 결핍 선택압을 부과시키고 그것은 매우 낮은 빈도로 형질전환체를 회복시키게 한다. 만나오즈에 대한 선택후에, 형질전환을 보이는 세포의 생장율은 카나마이신에 대해 선택된 생장의 약 2배이다. 만노오즈에 대해 선택된 형질전환체는 괴경으로 부터 증식하는 식물의 3세대를 거쳐 안정함이 입증됐다.
그러므로 본 발명의 초기 견지의 세포군은 미리 선택된 세포군일 수 있고, 상기 세포군은 본 발명에 따른 한개 이상의 방법과 한개 이상의 다른 선택방법에 으해 우선 선택되어 졌다.
부가적으로, 또는 선택적으로, 본 발명의 선택방법에 따라 선택된 형질전환된 세포는 본 발명에 따른 한개 이상의 선택방법 그리고/또는 한개 이상의 다른 선택방법에 이용될 수 있다.
또한 본 발명은 형질전환된 세포가 본 발명의 선택방법에 의해 선택될 수 있게 하는 발현체계를 제공한다. 그 발현체계는 본 발명의 첫째 염기서열을 발현하거나 발현 가능하게 한다. 그 발현체계는 한개이상의 벡터, 구조물 플라스미드, 세포 또는 유기체일 수도 있다.
또한 세포가 NOI로 형질전환되면 그 발현체계는 그 NOI를 포함하여 구성될 것이다. 선택적으로 그 NOI는 다른 벡터; 구조물, 플라스미드 세포 또는 유기체내에나 위에 첫번째 염기서열로 존재할 수도 있다. 바람직하게는 NOI는 같은 벡터, 구조물, 플라스미드, 세포, 또는 유기체에 첫번째 염기서열로 존재한다.
세포가 하나 이상의 서로 다른 선택방법을 위해 하나 이상의 NOIs의 하나이상의 다른 유전자로 형질 전환 되었다면 (본 발명의 의한 다른 선택방법 그리고/또는 알려진 선택방법), 그 다른 염기서열은 같은 벡터, 구조물, 플라스미드, 세포, 또는 유기체에 첫번재 염기서열로 존재할수도 있다. 바람직하게는 그런 다른 염기서열은 같은 벡터, 구조물, 플라스미드, 세포 또는 유기체에 첫번째 염기서열로 존재한다. 이것은 실험자가 많은 NOIs 등과 같은 것으로 형질전호나된 세포를 쉽게 준비하고 쉽게 선택하게 한다.
"세포"라는 용어는 본 발명의 방법을 이용하여 확인되고 골라낼 수 있는 각각의 유전적으로 형질전환된 세포의 어떠한 세포 형태에 대해서도 언급될 것이다. 그런 세포에는 식물세포, 동물세포, 그리고 박테리아, 곰팡이, 효모등과 같은 미생물이 포함된다. 또한 "세포라는 용어에는 세포막은 있지만 세포벽은 없는 원핵생물도 포함시킨다는 것을 의미한다. 본 발명의 선택방법이 다른 세포 유형에도 사용될 수 있다고 에상되는 반면, 본 방법은 특히 유전적으로 형질전환된 식물세포에 알맞다는 것이 밝혀졌다.
"세포군"이라는 용어는 유전적으로 형질전환될 수 있고, 상기로부터 형질전환된 세포를 확인하고, 유전적으로 형질전환되지 않는 세포로부터 유전적으로 형질전환된 세포를 분리할 수 있는 어떤 세포 집단을 언급한다. 예를들어 세포군은 조직, 기관 또는 그 일부가 될수도 있고, 미생물 세포의 배양과 같은 기질위의 각 세포군, 용액이나 현탁액속의 세포군, 전체식물과 같은 전체유기체가 될수도 있다.
"선택"이라는 용어는 본 발명의 방법을 이용하여 형질전환되지 않은 세포로부터 유전적으로 형질전환된 세포를 확인하고/또는 골라내는 과정을 언급한다.
"형질전환되지 않은 세포에 독성이 있다"는 용어는 형질전환 되지 않은 세포의 생장을 방해할 뿐아니라 그로부터 야기되는 죽음을 포함한다.
"배지"라는 용어는 선택적 생장이득과 같은 선택적 이들을 형질 전환된 세포에 제공할 수 있는 어떤 배지도 포함한다. 에를들면, 배지는 전형적인 생장 배지의 성분을 포함하여 구성될 수도 있으나 상기 배지의 성분은 단지 형질전환된 세포만 선택적으로 자랄수 있능 양이다. 본 발명의 실시예에서, 그 배지는 본 발명에 따라, 바람직하게는 높은 농도의 구성성분 또는 그 대사 전구체를 포함하여 구성될 것이다.
이러한 견지에서 첨가된 구성성분 또는 첨가된 전구체에서 유도된 성분 또는 그 대사산물은 낮은 농도로 존재할 때 형질전환되지 않은 세포에 영양분이 된다. 그리고 상기 구성성분 또는 그 대사 산물이 높은 농도로 존재할 때 형질 전환되지 않은 세포에 독성이 있다.
바람직하게는, "낮은 농도"란 용어는 O㎛이상 25㎛이하를 의미한다. 전형적으로 바람직한 낮은 농도의 예는 μ-molar 범위안에 있다.
바람직하게는, "높은 농도"라는 용어는 적어도 25㎛에서 100㎛(어떤 경우엔 더 높다)까지를 의미한다. 전형적으로 바람직한 높은 농도의 예는 milli-molar범위에 있다.
"영양분"이라는 용어는 유지 그리고/또는 생장 그리고/또는 생식등에 유용한 에너지나 분자를 직접적 또는 간접적(즉 대사산물을 통해)으로 제공할 수 있는 물질을 포함한다.
예를들어 그 용어는 형질전환된 세포가 자라고 증식하고 또는 생명을 유지할 수 있게 하는 대사경로에서 이롭게 대사하고/또는 이롭게 이용될 수 있는 물질을 포함한다.
"유전적으로 형질 전환된"이란 용어는 재조합 DNA 기술을 이용한 형질전환을 포함한다.
"배지에 새포군을 도입시키는"이란 용어는 배지에 세포군을 첨가하거나 또는 그 역을 의미한다.
만일 구성성분의 일부가 대사기질로 작용하고 대사적으로 유도기질로 전환되어, 상기 유도기질이 유전자 산물에 알로스테릭 효과를 제공하면, 대사적 전환은 1단계 대사 전환과정이 될 수 있거나 다단계 대사전환 과정이 될수도 있다.
본 발명의 구성성분은 그 대사 전구체로부터 유도될 수도 있다.
"형질전환되지 않은 세포"란 용어는 본 발명에 따르는 첫번째 염기서열을 포함하여 구성되지 않는 세포를 말한다. 그 용어는 유전적으로 형질전환된 세포가 2개의 다른 첫번재 염기 서열을 포함하여 구성될 때, 다른 첫번째 염기서열을 포함하여 구성되지 않는 세포를 포함한다. 또한 그 용어는 미리 형질전환된 어떤 세포를 포함하고 상기 미리 형질전환된 세포는 본 실험에 따른 첫번째 염기서열을 포함하지 않거나 형질전환된 세포처럼 같은 수의 첫번재 염기서열을 포함하여 구성된다.
매우 바람직한 실시예에서, 첫번째 염기서열은 자연스러운 환경에서 있는 것은 아니다. 이러한 견지에서 볼때, 첫번째 염기서열은 세포나 유기체에 원래 존재하는 것은 아닐 수도 있다(즉, 외부에서). 게다가, 첫번째 염기서열은 세포나 유기체네 원래 존재할 수 있으나, 상기 첫번째 염기서열은 그것과 다른 프로모터와 연결되어 졌다.
첫번째 염기서열은 DNA 또는 RNA 일 수도 있다. 바람직하게는, 첫번째 염기서열은 DNA이다. 더 바람직하게는, 첫번째 염기서열은 재조합 DNA이다.
마찬가지로, 두번째 염기서열은 DNA 또는 RNA 일수도 있다. 바람직하게는 두번째 염기서열은 DNA이다. 더 바람직하게는 두번째 염기서열은 재조합 DNA이다.
"관심있는 염기서열"(즉 "NOI")란 용어는 유전적으로 형질전환된 세포를 생산하기 위해 본 세포속에 결합시키는 어떤 바람직한 염기서열을 의미한다. 염기서열을 식물, 미생물 그리고 동물에 도입시키는 것은 널리 실행되어지고 있고, 본 발명의 선택방법을 사용해 선택될 수 있는 염기서열에 대해 한계가 없다고 믿고 있다.
본 발명의 방법을 사용해, 단지 항생제 내성 그리고/또는 제초제 내성에 의지하는 선택방법이 가진 상기 언급된 불리함 없이, 유전적으로 형질전환된 세포내에 있는 NOI의 존재를 결정할수도 있다.
NOI는 관심있는 어떤 유전자와 같은 관심있는 어떤 염기서열일 수 있다.
NOI는 본 세포나 유기체에 원래 존재하거나 외부에서 들어온 어떤 염기서열 일수도 있다. NOI의 전형적 예는 동화와 이화과정을 변형시키는 효소와 단백질을 암호화하는 유전자를 포함한다. NOI는 병원에 내성을 주거나 증가시키는 물질을 암호화 할 수도 있다. NOI는 심지어 관련된 조직에 존재하는 전사체의 발현을 변형시키기 위한 상보가닥 구조일 수도 있다. NOI는 심지어 동물과 인가에 이로운 화합물을 암호화할 수도 있다. NOI의 예는 한개 이상의 펙티나아제, 펙틴, 디폴리머라아제, 폴리갈락투로나아제, 펙테이트라이아제, 펙틴라이아제, 람노-갈락투로나아제, 헤미셀룰라아제, 엔도-베타-글루카나아제 아라비나아제, 또는 에스테라이제, 또는 그 조합물 뿐아니라 그 상보가닥 서열을 암호화하는 염기서열을 포함한다.
NOI는 음식이나 농작물에 영양학적 가치를 주는 단백질을 암호화 할수도 있다.
전형적인 예는 안티-뉴트리티브 팩터의 형성을 방해할 수 있는 식물 단백질과 더 바람직한 아미노산 조성(예를들면, 형질전환되지 않은 식물보다 높은 라이신조성)을 갖는 식물 단백질을 포함한다.
NOI는 심지어 키모신, 타우마틴, 알파-갈락토시다아제와 같은 음식물 소화에 사용될 수 있는 효소를 암호화 할수도 있다. NOI는 페스트톡신, 파타틴 또는 알파-알밀라아제 같은 상보가닥 전사체, ADP-글루코오스 피로포스폴릴라아제 (예를들어 EP-A-0455316을 보라), 프로테아제 상보가닥, 글루카나아제 또는 유전상의 베타 1,4-엔도글루카나아제 중 어느하나를 암호화 할 수 있다.
NOI는 심지어 특별한 유전자의 인트론을 포함하여 구성되거나 암호화할 수도 있다. 여기에서, 인트론은 본래의 방향 또는 상보적 가닥 방향일 수 있다. 후자의 예에서, 특별한 유전자는 베타-1,4-엔도글루카나아제를 암호화하는 DNA일 수 있다.
NOI는 PCT 특허출원 PCT/EP96/01009 의(참고문헌에 수록) 주제인 아라비노푸라노시다아제 효소를 암호화하는 염기서열일 수도 있다.
NOI는 PCT 특허출원 PCT/EP94/01082 의(참고문헌에 수록) 주제인 ADD-글루코스피로포스포릴라아제 효소를 암호화하는 염기서열중 하나 일수도 있다.
NOI는 PCT 특허출원 PCT/EP94/03397 의(참고문헌에 수록) 주제인 알파-글루칸라이아제 효소를 암호화하는 염기서열중 하나일 수도 있다.
NOI는 PCT 특허출원 PCT/EP96/01008 에(참고문헌에 수록) 기술된 글루카나아제 효소를 암호화하는 염기서열중 하나일 수도 있다.
또한 NOI는 퍼미아제(permease) 또는 화합물을 운반하는 다른 운반요소 또는 그 전구체 또는 세포막을 지나 형질전환된 세포내로 들어가는 그 대사 유도체를 암호화 할수도 있다.
같이 도입된 염기서열은 세포속에 화합물이 축적되는 것을 가속화시키는 대신 구성성분 또는 그 전구체 또는 그 대사유도체를 선택적으로 원형질막 또는 액포 또는 소포체 같은 일정부분으로 향하게 할 수도 있다.
한개 이상의 NOI가 존재할 수도 있다.
NOI는 본 발명에 따른 첫번째 염기서열과 함께 도입될 수 있다.
"함께 도입됐다"라는 용어는 두 염기서열이 서로 짝을 이루거나, 그렇지 않으면 같이 도입될 수도 있다는 의미이다. 그런방법으로, 세포에 함께 도입된 첫번째 염기서열의 존재는 NOI가 세포속으로 도입됐음을 보여준다. 즉 첫번째 염기서열이 도입됐음을 보이면 NOI 또한 도입되었을 가능성이 상대적으로 높아진다. 두 염기서열은 같은 유전자적 구조일 수도 있고 같은 벡터에 의해 도입될 수도 있다.
또한 여기에 기술된 방법은 첫번째 염기서열이 함께 도입되었을 때나 NOI가 독립적으로 도입되었을 때도 사용될 수 있다. 예를들어 이것은 두 유전자의 합병과 세포속에 많은 MOI 복제물의 합병을 위해 같은 박테리아를 이용해 실행될 수 있다. 그로인해 첫째 염기서열의 발현을 보인 세포는 NOI를 포함하여 발현할 가능성이 상대적으로 높다.
도입된 첫째 염기서열과 임의의 NOI가 형질전환된 세포에서 발현되기 위하여, 상기 첫째(염기서열 그리고/또는 NOI를 포함하는 유전자적 구조물들은 반드시 필요한 것은 아니지만, 전형적으로 염기서열의 발현을 가능하게 하는 조절서열을 포함한다.(예를들면, 알려진 프로모터와 전사 터미네이터). 그래서, 상기 첫째 염기서열은 전형적으로 프로모터와 결합될 것이고, 그것은 구조적 또는 조절적 프로모터 일 수 있고, 또한 NOI는 전형적으로 구조적 또는 조절적 프로모터와 결합될 수 있다.
위에 언급한 것처럼, 바람직하게는 본 발명의 유전자 산물은 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제(EC 5.3.1.10)란 효소이다. 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제를 암호화 하는 유전자는 대장균같은 식물이 아닌 유기체로 부터 얻을 수도 있다.
그런 유전자의 예로 nagB 유전자가 알려져 있다. 이 유전자는 Rogers, MJ. 등에 의해 얻어져 염기서열이 밝혀졌다((1988 Gene 62:197-207). 그러나, 이들은 nagB 유전자가 식물에서 발현될 수 있다는 것을 제안하지 않았고, 한정된 선택방법에 이용되게 두었다. 선택적으로, 글루코스아민-6-포스페이트 디아민나아제는 발아된 콩과 식물과 같은 식물로부터 얻을 수도 있다. 그런 연구의 예는 Verqa. LA((1968) Plant & Cell Physiol 9:1.12)에 의해 보고되었으나 이 저자는 어떠한 염기서열에 대한 정보도 보고하지 않았다.
첫째 염기서열 그리고/또는 NOI는 한개 이상의 인트론을 포함하여 구성된다. 특히 첫째 염기서열 그리고 1 또는 NOI가 NOI를 증식시키거나 세포를 형질전환시키는 수단으로 이용하는 박테리아의 전체나 일부에 악영향을 미치는 유전자 산물을 암호화 한다면, 유전자 산물은 그 박테리아 안에서 불활성화 되는 것이 매우 바람직하다. 박테리아내의 유전자 산물을 선택적으로 불활성시키는 한 방법은 첫째 염기서열 또는 NOI의 염기서열 속에 한개 이상의 인트론을 삽입시키는 것이다. 이 인트론은 박테리아안에서 전사후에는 제거되지 않지만 예를들어 식물등의 안에서 제거될 것이다.
매우 바람직한 실시예에서, 첫째 염기서열 그리고/또는 NOI가 적어도 한개의 인트론을 포함하여 구성되면 그 적어도 한개의 인트론은 첫째 염기서열 또는 NOI의 매우 보존적인 부위에 존재한다. 여기서 "인트론"이란 용어는 일반적으로 암호화 부위에 있다가 그로부터 제거되는 염기서열을 의미한다.
우리는 이것이 특히 적어도 한개의 인트론이 유전자의 보존부위에 삽입되었을 때, 더 특별히는 적어도 한개의 인트론이 유전자의 암호화 부위의 보존 부위에 삽입되었을 때, 박테리아 같은 원핵생물에 잠재적으로 해로운 유전자나 유전자 산물은 적어도 한개의 인트론이 유전자 속에 삽입됨으로써 진핵생물 안에서 불활성화 될 수 있다는 것을 최초로 밝히고 제안하는 것임을 확신한다.
그래서 본 발명은 또한 유전자속에 적어도 한개의 인트론을 삽입함으로써 불활성화되는 유전자나 그 유전자 산물이 원핵생물안에 존재할 때 원핵생물에게 잠재적으로 악영향을 주는 유전자나 유전자 산물을 불활성화 시키는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 또한 본 발명은 유전자속에 적어도 한개의 인트론이 삽입되므로써 불활성화되는 유전자나 그 유전자 산물이 원핵생물내 존재할 때 원핵생물에게잠재적으로 악영향을 미칠 수 있는 유전자나 유전자 산물을 불활성화 시키는 방법을 제공한다. 상기 적어도 한개의 인트론은 유전자의 보존부위에 삽입된다.
선택적으로 발현되는 것에 있어서; 본 발명의 이견지는 원핵생물에 잠재적으로 악영향을 주는 유전자나 그 산물을 원핵생물에 잠재적으로 악영향을 주지 않는 변형된 유전자나 그 산물로 바꾸는 것을 포함하여 구성되는 과정과 잠재적으로 악영향을 주는 유전자속에 적어도 한개의 인트론을 삽입하는 과정과 그런 방법으로 변형된 유전자가 형성되는 것을 포함하여 구성되는 과정에 관심이 있다. 바람직하게는 상기 적어도 한개의 인트론은 유전자의 보존부위에 삽입되고, 더 바람직하게는 상기 적어도 한개의 인트론은 유전자의 암호화 부위의 보존부위에 삽입된다.
또한 본 발명은 원핵생물에 존재할 때 원핵생물에 잠재적으로 악영향을 미칠 유전자를 포함하여 구성되어지는 원핵생물을 제공한다. 그러나 상기 유전자는 원핵생물에서 적어도 한개의 인트론, 그로인해 불활성화되는 유전자, 또는 그 산물을 포함하여 구성된다.
바람직하게는, 또한 본 발명은 원핵생물에 존재할 때 원핵생물에 잠재적으로 악영향을 미칠 유전자를 포함하여 구성되어지는 원핵생물을 제공한다. 그러나 상기 유전자는 원핵생물에서 적어도 한개의 인트론, 그로인해 불활성화되는 유전자, 또는 그 산물을 포함하여 구성된다. 바람직하게는 상기 적어도 한개의 인트론은 유전자의 보존부위에 삽입되고, 더 바람직하게는 상기 적어도 한개의 인트론은 유전자의 암호화 부위의 보존부위에 삽입된다.
또한 본 발명은 그런 변형된 유전자의 발현으로 부터 얻을 수 있는 산물을 포함하여 구성된다.
본 발명의 이 특별한 견지의 매우 바람직한 실시예에서 SEQ ID NO.2로 나타낸 염기서열, 변종, 유사종 또는 그 조각 또는 그에 상보적인 염기서열이 제공된다. 이 염기서열은 nagB 유전자의 암호화 부위(SEQ ID NO.1을 보라)에 대응되고, 상기 인트론은 그 서열안에 존재한다.
또한 본 발명은 이 염기서열을 발현하거나, 이것을 포함하여 구성되는 구조물, 벡터, 플라스미드 또는 형질 전환된 유기체(또는 기관 또는 조직 또는 그 세포)를 포함한다.
또한 본 발명은 염기서열이 염기서열을 발현시키는 프로모터에 연결되어 조절받을때 SEQ ID NO.2에 보이는 염기서열, 또는 변종, 유사종 또는 그조각 또는 그에 상보적인 서열을 포함한다. 이러한 견지에서, 프로모터는 세포 또는 조직 특이적 프로모터일 수 있다.
예를들어, 유기체가 식물이면 프로모터는 종자, 줄기, 싹, 뿌리, 그리고 잎 조직중 어떤 하나 이상에서 염기 서열의 발현에 영향을 미치는 어떤 것이 될 수 있다.
"프로모터"라는 용어는 일반적으로 유전자 발현에 대한 Jacob-Mond설에 보이는 RNA 폴리머라아제 결합부위와 같은 의미로 사용된다.
부가적으로 프로모터는 알맞은 균주에서 발현을 확실히하고 증가시키는 한개 이상의 특징을 갖는다. 예를들면 그 특징은 Pribnow Box 또는 TATA bOX 같은 보조된 부위일 수 있다. 심지어 프로모터는 본 발명의 염기서열 발현이 정도에 영향을 주는 (유지, 증가, 감소시키는) 다른 서열들을 포함할 수도 있다. 에를들어 적당한 다른 서열은 Sh1-인트론 또는 ADH 인트론을 포함한다. 다른 서열은 온도 화학물질, 빛, 또는 자극 유도요소와 같은 유도 요소를 포함한다.
또한 전사와 번역을 증가시키는 적당한 요소가 존재할 수 있다. 후자 요소의 예는 TMV 5' 신호 서열이다(Sleat Gene 217[1987] 217-225; 와 Dawson Plant Mol. Biol. 23 [1993] 97을 보라).
본 발명의 바람직한 효소에 대한 아미노산 서열에 관련된 "변종, "유사종" 또는 "조각"이란 용어는 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나이제 활성을 갖는 최종 효소를 제공하는 염기서열에 한개 이상의 아미노산의 어떠한 치환 변이, 변형, 반환, 손실, 첨가를 포함한다.
바람직하게는 최종효소는 SEQ ID NO.3에서 보이는 같은 활성을 갖는다. 특히, "유사종"이라는 용어는 구조 그리고/또는 기능에 관한 유사성을 포함한다.
염기서열 유사성의 견지에서 보면, 바람직하게는 SEQ ID NO.3에서 보인 서열과 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%의 유사성이 있다. 더 바람직하게는 SEQ ID NO.3에서 보인 서열과 적어도 95%, 더 바람직하게는 98%의 유사성이 있다.
본 발명의 바람직한 효소에 대한 아미노산 서열과 관련된 "변종, "유사종" 또는 "조각"이란 용어는 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제 활성을 암호화 할 수 있거나 암호화하는 최종 염기서열을 제공하는 한개 이상의 아미노산의 어떠한 치환, 변이, 변형, 반환, 손실, 첨가를 포함한다. 바람직하게 그 효소는 SEQ ID NO.1 또는 SEQ ID NO.2에서 보이는 같은 활성을 갖는다.
특히 "유사종"이라는 용어는 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제 활성을 갖는 효소를 암호화 하거나 암호화 할 수 있는 최종 염기 서열을 제공하는 구조 그리고/또는 기능에서의 유사성을 포함한다. 서열유사성의 견지에서 보면, 바람직하게는 SEQ ID NO.1 또는 SEQ ID NO.2에서 보인 서열과 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90% 유사성이 있다. 더 바람직하게는 SEQ ID NO.1 or SEQ ID NO.2에서 보인 서열과 적어도 95%, 더 바람직하게는 98%의 유사성이 있다. 그러나, 바람직하게는 SEQ ID NO.2의 "변종", "유사종", "조각"은 SEQ ID NO.1에서 보인 염기 서열을 독립적으로 포함시키지는 않는다.
바람직하게는, SEQ ID NO.2의 "변종", "유사종", "조각"은 SEQ ID NO.1에서 보인 염기 서열을 포함하지만 상기 적어도 한개의 인트론이 서열안에 존재한다.
바람직하게는, SEQ ID NO.2의 "변종", "유사종", "조각"은 SEQ ID NO.1에서 보인 염기 서열을 포함하지만 상기 적어도 한개의 인트론이 서열의 보존부위에 존재한다. 바람직하게는 인트론이 보존된 아미노산 서열을 암호화하는 부위에 삽입된다.
그 보존된 아미노산 서열은 VVTFNMDEY이다.
"변종","유사종","조각"이란 용어는 염기서열의 대립유전자 변이와 유사하다.
또한 "변종"이라는 용어는 여기에 존재하는 염기서열에 결합할 수 있는 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 이런 견지에서, 바람직하게는 "변종"이란 용어는 결핍 조건(예를들면 65℃와 0.1SSC)하에서 여기에 존재하는 염기서열에 결합할 수 있는 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 또한 본 발명은 본 발명의 염기서열에 결합할 수 있는 염기서열을 포함한다.
여기에 씌여 진것처럼 "유사종"이란 용어는 "동종"이란 용어와 동등하게 사용될 수 있다. 상대적 서열유사성은 두개이상의 서열간 % 유사성을 계산하는 널리 쓰이는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 계산할 수 있다. 이런 컴퓨터 프로그램의 예는 CLUSTAL이다.
"벡터"라는 용어는 발현벡터와 형질전환벡터를 포함한다. "발현벡터"라는 용어는 생체내 또는 실험관내에서 발현가능한 구조물을 의미한다. "형질전환벡터"라는 용어는 대장균 플라스미드에서 식물의 아그로박테리움(Agarobacterium)으로와 같이 한 종에서 다른 종으로 옮겨질 수 있는 구조물을 의미한다.
"조직"이란 용어는 조직 그 자체와 기관을 포함한다.
본 발명에 관련된 "유기체"란 용어는 본 발명에 따른 효소 그리고/또는 그로부터 얻어진 산물을 암호화하는 염기서열을 포함하여 구성되는 어떤 유기체를 포함한다. 그리고/또는 본 발명에 따른 상기 염기서열은 유기체내에 존재할 때 발현될 수 있다. 바람직하게는, 그 유기체는 식물이다.
본 발명에 관련된 "유전적으로 형질전환된 유기체"란 용어는 본 발명에 따른 효소 그리고/또는 그로부터 얻어진 산물을 암호화하는 염기서열을 포함하여 구성되는 어떤 유기체를 포함한다. 그리고/또는 본 발명에 따른 상기 염기서열은 유기체내에 존재할 때 발현될 수 있다. 바람직하게는 그 염기 서열은 유기체의 게놈에 합병된다. 바람직하게는 그 형질전환된 유기체는 식물이다.
매우 바람직한 실시예에서, 형질전환된 유기체 (또는 그 일부)는 본 발명에 따르는 효소를 암호화하는 염기서열과 프로모터의 조합을 포함하여 구성되지 않고, 상기 프로모터와 염기서열은 모두 그 유기체(또는 그 일부)에 이미 존재하고, 그들의 자연환경에 존재한다. 그리하여, 이 매우 바람직한 실시예에서, 본 발명은 그것이 자연환경에 이미 존재하는 프로머터에 조절을 받을때, 자연환경에서 본 발명에 따른 이미 존재하는 염기 암호 서열은 다루지 않는다.
부가적으로, 이 매우 바람직한 실시예에서, 본 발명은, 그것이 자연환경에 존재할 때 그리고 자연환경에 이미 존재하는 염기 암호 서열에 의해 발현됐을 때 그리고 염기서열이 자연 환경에 이미 존재하는 프로모터의 조절을 받을때 본 발명에 따른 이미 존재하는 효소는 다루지 않는다. 다시 말해서 염기서열은 유기체에 이종이고/이거나 이종 프로모터에 조절을 받는 것이 바람직하다.
위에서 어급한 것과 같이, 본 발명의 방법은 특히 유전적으로 형질전환된 식물세포의 선택에 알맞고, 그로인해 근본적으로 항생제나 제초제 내성을 암호화하는 유전자를 선택하는 방법에 의지하지 않고 형질전환세포를 확인하고 분리할 수 있다.
본 발명의 선택방법은 시험관에서 세포를 골라내는데 사용될 수도 있다. 그러나 본 발명의 선택방법은 세포, 조직등으로 부터 식물과 같은 형질전환된 유기체를 선택적으로 생장시키는 것이 가능하다는 점에서 생체내에도 적용시킬 수도 있다.
본 발명의 선택방법의 생체내 용법은 어떤예에서 보듯 형질전환된 세포의 선택이 주위에 있는 형질전환되지 않은 세포에 직접 해를 주지 않은채로 이루어질 수 있기 때문에, 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포를 모두 포함하여 구성되어지는 식물 또는 식물의 일부에 행해지는 유전적 형질전환에 있어 특히 중요하다. 예를들어, 형질전환된 세포는 형질전환되지 않은 세포와 비교해 발아능력과 같은 선택적 잇점을 갖는다. 그리고, 형질전환 되지 않는 세포는 항생제나 제초제를 사용한 경우에서 처럼 해를 입거나 죽는 심각한 불리함을 겪지는 않는다.
어떤 경우에서는, 향상된 선택빈도가 요구되어질 때처럼 세포가 첫째 염기서열과 다른 선택 유전자 서열로 형질전환되는 것이 이로울 수도 있다. 이 부가적 염기서열은 본 발명에 따른 선택에 알맞는 효소 (또는 다른 단백질 또는 폴리펩타이드)을 암호화하는 부가적 유전자 일수도 있고, 알려진 선택방법을 위한 효소(또는 다른 단백질 또는 폴리펩타이드)를 암호화 하는 유전자 (예를들면 항생제 또는 제초제에 내성을 암호화하는)일 수도 있고, 또는 WO 93/05163 그리고/또는 94/20627에 묘사된 선택방법에 의한 선택에 알맞은 유전자 일수도 있다. 그리하여, 유전적으로 형질전환된 세포는 조합된 선택기술을 이용하여 선택될 수도 있다. 예를들어, 형질전환된 세포가 적어도 한 항생제 또는 제초제에 내성을 암호화 하는 유전자를 갖는다면 배지는 부가적으로 형질전환된 세포가 내성을 갖는 적어도 한개의 항생제 또는 제초제를 포함하여 구성된다.특히 우리는 본 발명의 배지가 항생제 또는 제초제 내성의 의존한 알려진 선택방법을 효율성을 감소시키지 않는다는 것을 알았다.
본 발명의 형질전환된 세포가 갖는 선택적 잇점은, 형질전환 되지 않은 세포의 입장을 고려하면, 형질전환된 세포를 형질전환되지 않은 세포로부터 쉽게 확인하고 골라지게 하는 차이점과 잇점일 수도 있다.
예를들어 이것은 형질전환된 세포가 단순한 시각적 수단에 의해 확인되게 하는 차이점이나 잇점일 수 있다. 즉 이 단순한 시각적 수단은 선택수단을 제공하는 유전자의 존재를 결정하는 독립된 분석방법의 사용을 필요로 하지 않는다.
위에 언급한 것과 같이, 본 발명의 일견지는 상기 방법에 따라 선택된 유전적으로 형질전환된 세포 특히, 식물세포 뿐만아니라 식물, 자손, 또는 유전적으로 형질전환된 세포에서 유래한 또는 유래할 수 있는 종자에 관련이 있다.
특히, 이러한 세포가 그 게놈이 선택수단으로 독소, 항생제, 또는 제초제에 대한 내성을 암호화하는 도입된 염기서열(즉 원래 갖고 있던 것이 아닌)을 포함하지 않는 유전적으로 형질전환 된 식물 세포라는 것이 종종 잇점이 된다. 위에서 설명한 것처럼 예를들어 식용식물내의 항생제 내성을 암호화 하는 합병된 유전자가 안전한지에 대한 염려가 있다.
일반적으로 본 발명의 방법에 의해 선택된 항생물질 내성에 대한 선택 유전자를 갖지 않는 유전적으로 형질전환된 식물 세포 뿐아니라 식물, 자손 그리고 그 세포로 부터 유래된 종자는 이러한 견지에서 분명히 잇점을 갖는다.
형질 전환된 세포는 이분야에서 이미 알려진 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를들면 형질전환된 세포가 형질전환된 식물 세포라면 EP-B-0470145와 CA-A-2006454를 참고 할 수도 있다.
본 발명에 따른 선택방법이 EP-B-0470145와 CA-A-2006454에 나와있지 않더라도 이들 두문서는 본 발명에 의한 형질전환된 식물세포와 형질전환된 식물을 제조하는데 적용되는 여러종류의 기술에 대한 유용한 기본적 설명을 제공한다. 이러한 몇몇 기본이 되는 기술은 다음 설명에 포함된다.
유전적으로 변형된 식물을 만드는데 있어서의 기본 원리는 삽입된 유전물질이 안전하게 유지되도록 식물 게놈에 유전정보를 삽입시키는 것이다. 유전정보를 삽입시키기 위한 몇가지 기술이 있다. 두가지 주요한 원리는 유전정보를 직접 도입시키는 것과 벡터체계를 이용해 유전정보를 도입시키는 것이다. 일반적 기술에 대한 개요는 Potrykys (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) 그리고 Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)에 발견된다.
그래서, 본 발명의 일견지는 본 발명에 따른 첫째 염기서열과 구조물을 운반하고 식물과 같은 유기체의 게놈속으로 염기서열 또는 구조물을 도입시킬 수 있는 벡터시스템에 관한 것이다.
벡터시스템은 한개의 벡터를 포함하여 구성될 수 있으나 적어도 2개의 벡터를 포함하여 구성될 수 있다. 2개의 벡터의 경우에, 그 벡터체계는 일반적으로 이중벡터 체계라고 언급된다. 이중 벡터체계는 Gynheung An et al. (1980), 이중벡터, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19에 더 자세히 기술되어 있다.
주어진 프로모터 또는 염기서열 또는 구조물로 식물 세포를 형질전환 시키기 위해 많이 사용되는 시스템은 아그로박테리움 투메파시엔스로(Agrobacterium tumen faciens)로 부터의 Ti 플라스미드, 혹은 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhi zogenes)로 부터의 Ri 플라스미드의 사용에 기초를 둔다(An et al. (1986), Plant Physiol. 81, 301-305와 Butcher D.N.et al.(1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D.S.Ingrams and J.P.Helgeson, 203-208).
몇개의 다른 Ti 와 Ri 플라스미드가 위에 묘사된 식물이나 식물세포의 구조에 알맞게 제조되어 왔다.
본 발명의 첫째 염기서열 또는 그조물은 T-DNA 말단을 둘러싸고 있는 염기서열이 파괴되는 것을 막기 위해 바람직하게는 T-DNA의 말단 서열 또는 인접한 T-DNA 서열사이의 Ti 플라스미드 속으로 삽입되어야 한다. 이러한 부위중 적어도 하나는 식물 게놈 속에 변형된 T-DNA를 삽입시키는데 필수 불가결한 것 같다.
상기 설명으로 이해된 것처럼, 유기체가 식물이라면 본 발명의 벡터 체계는 바람직하게는 식물에 감염될 때 필요한 염기서열 (예를들면 vir 유전자)과 적어도 한개의 T-DNA 말단 서열을 포함하는 것이다. 그 말단은 유전자적 구조로 같은 벡터상에 위치한다. 바람직하게는 그 벡터 체계는 아그로박테리움 투메피-시엔스 Ti 폴라스미드 또는 아그로박테리움 레조게네스 Ri 플라스미드 또는 그 유도체이고, 이런 플라스미드들은 잘 알려져 있고, 형질전환 식물을 만드는데 널리 이용되고 있어, 이런 플라스미드와 그 유도체에 기초한 많은 벡터 체계가 존재 한다.
형질 전환된 식물을 제조하는데에 있어, 본 발명의 프로모터 또는 염기서열 또는 구조물은 미생물내에서 먼저 제조될 수도 있고 그 벡터는 식물에 삽입되기 전에 미생물내에서 쉽게 복제와 증식을 할 수 있다.
유용한 미생물의 예는 대장균(E. Coli)이다. 그러나 상기 성질을 갖는 다른 미생물도 사용될 수 있다. 위에서 밝힌 것처림 벡터체계의 벡터가 대장균 안에서 제조될 때, 그것은, 필요하면, 적절한 아그로박테리움 균주로, 예를들면 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 옮겨진다.
그래서 바람직하게는 본 발명의 첫째 염기서열 또는 그조물을 품고 있는 Ti-플라스미드는 본 발명의 프로모터나 염기서열이나 구조물을 품는 아그로박테리움 세포를 얻기위해, 알맞은 아그로박테리움 균주로, 에를들면 아그로 박테리움 투메파 시엔스, 로 옮겨진다.
그 DNA는 순차적으로 변형될 식물세포로 옮겨진다.
CA-A-2006454에 보고된 것처럼, 대장균의 복제 체게와 형질전환된 세포의 선택을 가능하게 하는 선택수단을 가진 많은 클로닝벡터는 유용하다. 예를들어, 그런 벡터에는 pBR 322, 일련의 pVC, 일련의 M13 mp, pACYC 184등이 있다.
이러한 방법으로 본 발명의 프로모터 또는 염기 또는 구조물은 벡터안에 알맞은 제한 효소 자리로 도입될 수 있다. 이 플라스미드는 대장균에 형질전환 된다.
이 대장균 세포는 알맞은 영양배지에서 배양되고 그런후에 모아져 용해된다. 그런후에 플라스미드는 다음과 같은 기술중 하나에 의해 모아지고 분석된다.
서열분석, 제한효소 분석, 전기영동 과 더 나아가 생화학적-분자 생물학적 방법, 이러한 조작후에, 사용된 DNA 서열은 제한효소로 잘리거나 선택적으로 PCT 기술에 의해 증폭되고 다음 DNA 서열과 연결된다. 각 서열은 같거나 다른 플라스미드에 실리수 있다.
본 발명에 따른 첫째 염기서열과 구조물을 식물에 도입시킨 후에 DNA 서열의 보존 그리고/또는 삽입이 필요하다. 예를들면, 형질도입을 위해 식물세포의 Ti 또는 Ri 플라스미드가 사용되면 도입된 유전자의 말단처럼 Ti 와 Ri 플라스미드 T-DNA의 적어도 오른족 말단, 종종 왼쪽과 오른쪽 말단이 연결될 수도 있다. 식물세포의 형질전환을 위한 T-DNA의 용도는 깊이 연구되어졌고 EP-A-120516; Hoekema, in: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerji Kanters B.B., Alblasserdam, 1985, Chapter V; Fraley, et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4:1-46; and An et al., EMBO J.(1985) 4:277-284에 묘사되고 있다..
아그로박테리움에 의해 식물조직에 직접 감염시키는 기술은 널리 쓰여지고 있는 간단한 기술이고, Butcher D.N. et al.(1980), Tissue Culture Methods for Plandt Pathologists, eds.: D.S.ingrams and J.P.Helgeson, 203-208에 묘사되어 있다. 이 주제에 대한 자세한 설명은 Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol p1991] 42:205-225)과 Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)에 있다. 이 기술을 가지고, 식물세포의 감염은 식물의 조직이나 어떤 일부에 즉, 뿌리, 줄기의 일부, 또는 식물의 다른 부분에 대해 행해질 수 있다.
전형적으로, 첫째 염기서열 또는 그 구조물을 가지는 아그로박테리움에 의한 식물조직의 직접적인 감염으로 감염된 식물은 상처를 입게 된다. 예를들면, 식물을 칼로 자르거나, 식물을 바늘로 찌르거나, 식물을 문지르거나 해서 상처를 입히게 된다. 그리고 나서, 그 상처부위는 아그로박테리움으로 접종된다. 그리고 나서 접종된 식물 또는 식물의 일무는 알맞은 배양 배지에서 자란다.
식물세포가 만들어지면 이 세포는 아미노산, 식물 호르몬, 비타민과 같은 생장 필수요소가 공급된 알맞은 배양 배지에서 세포를 배양하는 것과 같이, 본 발명에 따른 다음의 잘 알려진 조직 배양방법에 의해 배지내에서 배양되고, 선택적으로 유지된다.
상기 배양배지는 본 발명에 따른 구성성분을 포함하여 구성된다. 유전적으로 변형된 식물속에서 형질 전환된 세포와 증식은, 예를들면 형질전환되어 발아된 것을 고르고, 알맞은 영양분, 식물호르몬 등이 포함된 배지에 발아된 것을 재배양하는 것과 같은, 식물세포의 증식, 조직 배양을 위한 알려진 방법을 이용해 수행될 수 있다.
식물 형질전환에 대한 자세한 설명은 EP-A-0449375에 있다. 형질전환 식물제조에 대한 일반적 개요를 보인 Spngstad et al. (1995 Plant Cell Tissue Organ Culture 40 pp 1-15)의 글을 참고할 수도 있다.
매우 바람직한 실시예에서, 본 발명은 형질전환된 세포를 제조하기 위해 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제를 암호화하는 발현가능한 유전자를 포함하여 구성되는 구조물을 사용하는 것이 가능하다는 발견에 기초를 두고 있고, 상기 형질 전환된 세포는 형질전환되지 않는 세포로 부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 또한 형질전환된 세포 또는 본 발명의 구조물을 포함하여 구성되는 형질 전환된 식물을 포함한다.
그래서, 매우 바람직한 실시예에서, 본 발명은 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제를 암호화 하는 발현가능한 유전자를 포함하여 구성되는 구조물 또는 형질전환된 세포를 포함하여 구성되는 형질전환된 식물을 포함한다.
본 발명의 이러한 매우 바람직한 측면을 더 자세히 설명하기 위해서 적어도 도면 1-11을 참고할 수 있다.
이와 관련하여, 낮은 농도의 글루코스아민 (전형적으로 μ-molar 농도)를 N-아세틸 글루코스아민(("NAGA")로 대사되고, 그것은 다시 N-아세틸 글루코스아민 6-포스페이트 ("NAG6P")로 대사되고, 그것은 다시 N-아세틸 글루코스아민(-포스페이트로 대사되고, 그것은 다시 UDP-N-아세틸 글루코스아민으로 대사된다. UDP-N-아세틸 글루코스아민은 당단백질의 유용한 생물학적 전구체이다(Roberts, R M.Plant Physiol, 45:263-267). 이 대사경로는 도 1에 도식적으로 나타나 있다. 그러므로 낮은 농도의 글루코스아민은 식물 세포에 영양분이다.
그러나 높은 농도의 글루코스아민(전형적으로 milli-molar 농도)는 글루코스아민-6-포스페이트("GA6P")로 대사된다. 이것은 글루코스아민이 milli-molar 농도로 제공될 때 이당의 수준이 헥소키나아제의 Km 범위에 들어가게 되기 때문이다. 이렇게 됨으로써, 인산화가 글루코스아민 6-포스페이트를 형성하게 된다. 이 대사경로는 도 1에 도식적으로 나타나 있다.
그리하여 식물세포에 micor-molar 수준의 글루코스아민을 투여하는 것은 더 대사될 수 있는 NAGA를 형성을 야기시키고; 반면에 milli-molar 수준의 글루코스아민을 투여하면 형질 전환되지 않은 세포에 해로운 GA6P의 축적을 야기시킨다(Chen-She, S(1995), nEW pHYTOLOGIST 74:383-392). 이점에서, NAGA와는 달리, GA6P는 본래의 식물세포를 위한 영양분은 아니다. 사실 GA6P의 본래의 식물세포에는 독성이 있다. 이점에서 GA6P의 존재는 식물세포를 덜 건강하게 만든다. 몇몇 예에서는, 세포는 GA6P가 식물 대사경로로 잘 들어가지 않을 때 심지어 죽을 수도 있다. 그러므로, 높은 농도에서, 글루코스아민의 대사는 형질전환되지 않은 식물세포에 독성이 있는 대사산물을 축적시킨다.
본 발명에 의하면, 우리는 GA6P가 효소적으로 식물세포에서 영향분으로 전환될 수 있음을 발견하였다. 특히, 우리는 효소 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제(nagB 유전자에 암호화되는 효소와 같은)는 식물세포에서 GA6P를 프럭토오스 6-포스페이트("F6P")로 전환시킬 수 있음을 알았다. 이 대사경로는 도 2에 도식적으로 나타나있다.
아시다시피, F6P는 Embden Meyerhof 경로의 성분이므로, 매우 유익한 생물학적 기질이다. 그러므로 높은 농도에서, 잠재적으로 독성이 있는 글루코스아민의 대사산물은 효소적으로 식물세포에 유익한 영양분으로 바뀔수 있다. 이 효소적 전환은 본 발명의 선택 방법의 일견지에 기초를 형성한다.
대장균에 의한 글루코스아민 6-포스페이트의 대사는 효소 글루코스아민 6-포스페이트 디아미나아제 (EC 5.3.1.10)에 의해 가속화 된다. 동시에 이 효소는 프럭토오즈 6-포스페이트를 형성하기 위한 탈아민화와 알도(케토오즈 이성질체화를 촉매한다(Wolfe, J B & Nakada, H I (1956) aRCH bIOCHEM bIOPHYS 64: 489-497. Wolfe J B. et al(1957) Arch Biochem Biophys 66: 333-339). 그럼에도 불구하고, 상기 효소가 선택방법의 특징으로 사용될 수 있다는 것이 종전에는 제안되지 않았고, 단지 식물세포 안에서만 발현되게 두었다.
흥미있는 것은, GA6P가 F6P로 전환되는 것이 결국 아민기를 방출시킬지라도- 아민기의 높은 축적은 식물에게 독성이 있다 - 식물세포는 해로운 영향을 받지 않는다는 것이다. 그러므로, 본 발명의 매우 바람직한 선택 방법에 있어서, 잠재적으로 독성이 있는 부산물의 방출에도 불구하고 그 방출은 전체 선택방법에 악영향을 주지는 않는다. 이 결과는 매우 놀랍다.
본 발명의 선택방법의 일견지는 부가적인 유익한 특징을 제공한다. 이점에서, NAG6P는 nagB에 의해 암호화된 효소 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나이제에 의해 GA6P가 F6P로 전환되는데에 있어 효과 (알로스테릭 효과)를 갖는다. 본 발명의 이같은 견지는 도 3에 도식적으로 나타나 있다. 이 놀라운 발견은 대장균에서 행해진 연구와 부합된다 E. coli(Calcagno, M, et al(1984) Biochim Biophys Acta 787:165-173).
그리하여 어떤 글루코스아민도 NAGA로 대사되고, 결국 차례대로 NAG6P가 되고 그런후에 NAG6P는 효소 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제에 의해 GA6P를 F6P로 전환시키거나 적어도 전환단계에 도움을 준다. 이것은 본 발명의 매우 바람직한 선택방법의 유익한 특징이다.
본 발명의 바람직한 견지에 있어, 인트론은 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제를 암호화 하는 유전자로, 특히 매우 보존된 부위로 삽입된다. 이 변형은 아그로박테링무과 같은 박테리아의 세포벽에서 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제의 악영향을 줄이거나 제거하기 위해 행해질 수 있다. 아그로박테리움은 종종 식물세포를 형질전환시키는 선택적 벡터이기 때문에, 식물에서는 아니지만 박테리아에서 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제를 불활성화 시킬 필요가 있다. 이 불활성화는 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제를 암호화하는 유전자속으로 인트론을 삽입시킴으로써 달성될 수 있다. 특히, 불활성화는 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제를 암호화하는 유전자의 보존부위에 인트론을 삽입시킴으로 달성될 수 있다.
이런 점에서, 도 4는 칸디다 알비칸스(Candida albicans) (nagⅠ 유전자)의 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제와 대장균(nagB 유전자)의 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제를 암호화하는 염기서열을 보인다. 본 연구에서, 우리는 보존된 아미노산 서열을 암호화 하는 유전자 부위안에 인트론을 삽입할을 선택하였고, 이 경우 그 아미노산 서열은 VVTFNMEDEY 이다.
또한, 도 5,6,7은 사용된 클로닝 절차를 도식적으로 나타낸다. 도 8,9,10,11은 그 결과로 생긴 플라스미드의 도식적 다이아그램을 나타낸다.
다음 시료를 부다페스트 조약에 의거, 1997년 1월 10일에 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Scotland, United Kingdom, AB2 1RY 에 있는 공인된 기탁기관인 The National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)에 기탁되었다.
1. 플라스미드 pVictorIV GNG E35S nagB IV2를 포함하는 E. coli DH5α, 기탁번호는 NCIMB40852이다.
이 플라스미드는 인트론을 가진 nagB 유전자를 포함한다.
2. 플라스미드 pVictorIV GNG rbc nagB IV2를 포함하는 E. coli DH5α, 기탁번호는 NCIMB 40853이다. 이 플라스미드는 인트론을 가진 nagB 유전자를 포함하여 구성된다.
3. 플라스미드 pVictor IV GNG nagB를 포함하는 E. coli DH5α, 기탁번호는 NCIMB 40854 이다. 이 플라스미드는 인트론을 갖지 않은 nagB유전자를 포함하여 구성된다.
그러므로 본 발명의 매우 바람직한 측면은, 발현벡터, 구조물, 유기체 및 상기와 같은 서열 또는 플라스미드를 포함하는 형질전환된 유기체를 포함하는 이들 기탁물로 부터 얻을 수 있는 본 발명에 따른 첫째 염기서열과 관련되어 있다.
또한 본 발명은 형질전환 되지 않은 세포로 부터 형질 전환된 세포를 고를 수 있게 하는 선택수단을 포함하여 구성된다. 상기 선택 수단은 각 기탁물로 부터 얻을 수 있다.
예를들어, 본 발명은 기탁번호 NCIMB 40854로 부터 얻을 수 있는 선택수단을 포함하여 구성된다. 이러한 점에서, 선택수단(즉 형질전환되지 않은 세포로 부터 형질전환된 세포를 고를 수 있게 하는 선택수단)은 아래언급된 PCR 증폭기술에 의한 기탁물로 부터 얻어질 수 있고, 다음 프라이머가 사용된다.
5'-(B134)(38-mer)
TAAGATCTAAACAACAACATGAGACTGATCCCCCTGAC
3'-(B137)(28-mer)
ACCTCGAGCAGGGATAACAATTACAGAC
또 다른 예에서, 본 발명은 형질전환되지 않은 세포로 부터 형질전환된 세포를 고를 수 있게 하는 선택수단을 포함하여 구성된다. 상기 선택수단은 기탁번호 NCIMB 40852 또는 40853 로 부터 얻을 수 있는 선택 수단이다. 이런 견지로, 그 선택수단은 아래 언급된 PCR 증폭기술에 의한 기탁술로 부터 얻어질 수 있고 다음 프라이머가 사용된다.
프라이머 1(B507) 29'MER
TGCAGAGATCTAAACAACAACATGAGACT
프라이머 6(B511) 27MER
CATGCCTCGAGCAGGGATAACAATTAC

Claims (49)

  1. 세포군으로 부터 한개 이상의 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 서택하는 방법에 있어서,
    상기 세포군은 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 있을 수 있는 형질전환되지 않은 세포를 포함하여 구성되며;
    상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포 각각은 발현가능한 첫째 염기서열과 임의로 발현가능한 두번째 염기서열을 포함하여 구성되며;
    배지내에 저농도로 존재할 때 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포 모두에게 대한 영양분이며;
    상기 성분과 그 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 상기 형질전환되지 않은 세포에 대하여 독성을 보이며;
    상기 첫째 염기서열은 상기 구성성분과 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 그것을 상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위한 영양분으로 변환시킬 수 있는 유전자 산물을 암호화하며;
    상기 선택방법은 상기 세포군을 배지에 도입하는 단계를 포함하며, 상기 배지는 임의로 상기 구성성분 또는 그 대사유도체를 고농도로 포함하며;
    그리고 상기 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위해 탄수화물과 질소 모두의 공급원이거나; 혹은 상기 성분의 일부가 대사 기질로서 작용하고 대사적으로 유도기질로 변환된다면 그 유도기질은 유전자산물에 대하여 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 제공할 수 있음을 특징으로 하는 방법.
  2. 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 있을 수 있는 형질전환되지 않은 세포를 포함하여 구성되는 세포군과 배지를 포함하여 구성되는 조성물로서,
    상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포 각각은 발현가능한 첫째 염기서열과 임의로 발현가능한 두번째 염기서열을 포함하여 구성되며;
    배지내에 저농도로 존재할 때 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포 모두에게 대한 영양분이며;
    상기 성분과 그 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 상기 형질전환되지 않은 세포에 대하여 독성을 보이며;
    상기 첫째 염기서열은 상기 구성성분과 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 그것을 상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위한 영양분으로 변환시킬 수 있는 유전자 산물을 암호화하며;
    상기 배지는 임의로 상기 구성성분 또는 그 대사유도체를 고농도로 포함하며;
    그리고 상기 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위해 탄수화물과 질소 모두의 공급원이거나; 혹은 상기 성분의 일부가 대사 기질로서 작용하고 대사적으로 유도기질로 변환된다면 그 유도기질은 유전자산물에 대하여 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 제공할 수 있음을 특징으로 하는 조성물.
  3. 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 있을 수 있는 형질전환되지 않은 세포를 포함하여 구성되는 세포군으로서,
    상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포 각각은 발현가능한 첫째 염기서열과 임의로 발현가능한 두번째 염기서열을 포함하여 구성되며;
    배지내에 저농도로 존재할 때 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포 모두에게 대한 영양분이며;
    상기 성분과 그 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 상기 형질전환되지 않은 세포에 대하여 독성을 보이며;
    상기 첫째 염기서열은 상기 구성성분과 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 그것을 상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위한 영양분으로 변환시킬 수 있는 유전자 산물을 암호화하며;
    그리고 상기 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위해 탄수화물과 질소 모두의 공급원이거나; 혹은 상기 성분의 일부가 대사 기질로서 작용하고 대사적으로 유도기질로 변환된다면 그 유도기질은 유전자산물에 대하여 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 제공할 수 있음을 특징으로 하는 세포군.
  4. 발현가능한 첫째 염기서열과 임의로 발현가능한 두번째 염기서열을 포함하여 구성되는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포에 있어서,
    배지내에 저농도로 존재할 때 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포 모두에게 대한 영양분이며;
    상기 성분과 그 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 상기 형질전환되지 않은 세포에 대하여 독성을 보이며;
    상기 첫째 염기서열은 상기 구성성분과 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 그것을 상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위한 영양분으로 변환시킬 수 있는 유전자 산물을 암호화하며;
    그리고 상기 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위해 탄수화물과 질소 모두의 공급원이거나; 혹은 상기 성분의 일부가 대사 기질로서 작용하고 대사적으로 유도기질로 변환된다면 그 유도기질은 유전자산물에 대하여 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 제공할 수 있음을 특징으로 하는 세포.
  5. 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 생성하기 위하여 형질전환되지 않은 세포를 유전적으로 형질전환시키는 구조물로서,
    상기 구조물은 발현가능한 첫째 염기서열과 임의로 발현가능한 두번째 염기서열을 포함하여 구성되며;
    배지내에 저농도로 존재할 때 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포에 대한 영양분이며;
    상기 성분과 그 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 상기 형질전환되지 않은 세포에 대하여 독성을 보이며;
    상기 첫째 염기서열은 상기 구성성분과 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 그것을 상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위한 영양분으로 변환시킬 수 있는 유전자 산물을 암호화하며;
    그리고 상기 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위해 탄수화물과 질소 모두의 공급원이거나; 혹은 상기 성분의 일부가 대사 기질로서 작용하고 대사적으로 유도기질로 변환된다면 그 유도기질은 유전자산물에 대하여 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 제공할 수 있음을 특징으로 하는 구조물.
  6. 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 생성하기 위해 형질전환되지 않은 세포를 유전적으로 형질전환하는 구조물을 포함하는 벡터로서,
    상기 구조물은 발현가능한 첫째 염기서열과 임의로 발현가능한 두번째 염기서열을 포함하여 구성되며;
    배지내에 저농도로 존재할 때 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포 모두에게 대한 영양분이며;
    상기 성분과 그 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 상기 형질전환되지 않은 세포에 대하여 독성을 보이며;
    상기 첫째 염기서열은 상기 구성성분과 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 그것을 상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위한 영양분으로 변환시킬 수 있는 유전자 산물을 암호화하며;
    그리고 상기 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위해 탄수화물과 질소 모두의 공급원이거나; 혹은 상기 성분의 일부가 대사 기질로서 작용하고 대사적으로 유도기질로 변환된다면 그 유도기질은 유전자산물에 대하여 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 제공할 수 있음을 특징으로 하는 벡터.
  7. 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 생성하기 위하여 형질전환되지 않은 세포를 유전적으로 형질전환시키는 구조물을 포함하는 플라스미드로서,
    상기 구조물은 발현가능한 첫째 염기서열과 임의로 발현가능한 두번째 염기서열을 포함하여 구성되며;
    배지내에 저농도로 존재할 때 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포에 대한 영양분이며;
    상기 성분과 그 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 상기 형질전환되지 않은 세포에 대하여 독성을 보이며;
    상기 첫째 염기서열은 상기 구성성분과 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 그것을 상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위한 영양분으로 변환시킬 수 있는 유전자 산물을 암호화하며;
    그리고 상기 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위해 탄수화물과 질소 모두의 공급원이거나; 혹은 상기 성분의 일부가 대사 기질로서 작용하고 대사적으로 유도기질로 변환된다면 그 유도기질은 유전자산물에 대하여 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 제공할 수 있음을 특징으로 하는 플라스미드.
  8. 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포을 포함하는 유기체로서,
    상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포는 발현가능한 첫째 염기서열과 임의로 발현가능한 두번째 염기서열을 포함하여 구성되며;
    배지내에 저농도로 존재할 때 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포에 대한 영양분이며;
    상기 성분과 그 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 상기 형질전환되지 않은 세포에 대하여 독성을 보이며;
    상기 첫째 염기서열은 상기 구성성분과 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 그것을 상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위한 영양분으로 변환시킬 수 있는 유전자 산물을 암호화하며;
    그리고 상기 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위해 탄수화물과 질소 모두의 공급원이거나; 혹은 상기 성분의 일부가 대사 기질로서 작용하고 대사적으로 유도기질로 변환된다면 그 유도기질은 유전자산물에 대하여 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 제공할 수 있음을 특징으로 하는 유기체.
  9. 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 생성하기 위하여 유전적으로 형질전환시키는 구조물을 포함하는 구조물 및 배지를 포함하는 키트(kit)로서,
    상기 발현가능한 첫째 염기서열과 임의로 발현가능한 두번째 염기서열을 포함하여 구성되며;
    배지내에 저농도로 존재할 때 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포 모두에게 대한 영양분이며;
    상기 성분과 그 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 상기 형질전환되지 않은 세포에 대하여 독성을 보이며;
    상기 첫째 염기서열은 상기 구성성분과 대사유도체가 배지에 고농도로 존재할 때 그것을 상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위한 영양분으로 변환시킬 수 있는 유전자 산물을 암호화하며;
    상기 배지는 임의로 상기 구성성분 또는 그 대사유도체를 고농도로 포함하며; 그리고 상기 성분 또는 그 대사유도체는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포를 위해 탄수화물과 질소 모두의 공급원이거나; 혹은 상기 성분의 일부가 대사 기질로서 작용하고 대사적으로 유도기질로 변환된다면 그 유도기질은 유전자산물에 대하여 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 제공할 수 있음을 특징으로 하는 키트(kit).
  10. 앞선 청구범위중 어느 한항에 있어서, 상기 구성성분 또는 그 대사 유도체는 선택가능한 유전적으로 형질 전환된 세포를 위한 탄수화물과 질소 모두의 공급원이며,
    상기 구성성분의 일부는 대사기질로 작용하고, 대사적으로 유도기질로 전환되고, 그후 그 유도기질은 유전자 산물에 대해 알로스테릭 효과를 제공할 수 있음을 특징으로 한다.
  11. 앞선 청구범위중 어느 한항에 있어서, 상기 구성성분은 선택가능한 유전적으로 형질 전환된 세포에게 탄수화물과 질소모두의 공급원을 제공할 수 있음을 특징으로 한다.
  12. 앞선 청구 범위중 어느 한항에 있어서, 상기 구성성분은 아민기를 포함하며, 바람직하게는 상기 구성성분은 글루코스아민임을 특징으로 한다.
  13. 앞선 청구범위중 어느 한항에 있어서, 형질 전환되지 않은 세포에 독성이 있는 상기 구성성분의 대사성 유도체는 아민기 그리고/또는 인산기를 포함하며, 바람직하게는 상기 대사성 유도기질은 글루코스아민-6-포스페이트임을 특징으로 한다.
  14. 앞선 청구범위중 어느 한항에 있어서, 상기 유도기질은 아민기 및/또는 포스페이트기를 포함하며, 바람직하게는 상기 유도기질은 N-아세틸-글루코스아민-6-포스페이트임을 특징으로 한다.
  15. 앞선 청구범위중 어느 한항에 있어서, 상기 첫째 염기서열은 인트론을 포함함을 특징으로 한다.
  16. 앞선 청구범위중 어느 한항에 있어서, 상기 유전자 산물은 효소임을 특징으로 한다.
  17. 앞선 청구범위중 어느 한항에 있어서, 상기 효소는 당단백질(glycoprotein) 전구체를 변형시킬 수 있고, 바람직하게는 상기효소는 당단백질 전구체를 탈아민화시키고, 바람직하게는 상기 효소는 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제임을 특징으로 한다.
  18. 앞선 청구범위중 어느 한항에 있어서, 상기 효소는 미생물, 바람직하게는 박테리아로부터 얻을 수 있는 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제이고, 더 바람직하게는 대장균(E. Coli)으로 부터 얻을 수 있는 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제임을 특징으로 한다.
  19. 앞선 청구범위중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제는 SEQ ID NO.3로 나타낸 아미노산 서열을 갖거나, 혹은 그 변종, 유사종, 또는 그 조각임을 특징으로 한다.
  20. 앞선 청구범위중 어느 한항에 있어서, 상기 효소 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제는 SEQ ID NO.1로 나타낸 염기서열 또는 그 변종, 유사종 또는 그 조각 혹은 그에 상보적인 염기 서열이나, SEQ ID NO.2로 나타낸 염기서열 또는 그 변종, 유사종, 또는 2조각 또는 그에 상보적인 염기서열에 의해 암호화 됨을 특징으로 한다.
  21. 앞선 청구범위중 어느 한항에 있어서, 상기 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제 또는 이를 암호화하는 유전자는 NCIMB 40852 또는 NCIMB40853 또는 NCIMB 40854 로 부터 얻을 수 있음을 특징으로 한다.
  22. 앞선 청구범위중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포는 시험관속(in vitro) 배양액에 존재함을 특징으로 한다.
  23. 앞선 청구범위중 어느 한항에 있어서, 상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포는 유기체 생체안에 존재함을 특징으로 한다.
  24. 앞선 청구범위중 어느 한항에 있어서, 상기 선택가능한 유전적으로 형질전환된 세포는 선택가능한 유전적으로 형질전환된 식물세포임을 특징으로 한다.
  25. 앞선 청구범위중 어느 한항에 있어서, 상기 두번째 염기서열이 존재하고, 그 두번째 염기서열은 관심있는 염기서열음 암호화함을 특징으로 한다.
  26. 앞선 청구범위중 어느 하나에 의한 발명으로 부터 제조되고, 인간과 동물에 식품으로 될 수 있는 식물
  27. 26항에 있어서, 상기 식물은 구아(guar), 감자 또는 옥수수중 어느 하나임을 특징으로 하는 식물.
  28. 이종 효소를 포함하여 구성되며, 그 이종효소는 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제임을 특징으로 하는 식물.
  29. 28항에 있어서, 상기효소는 박테리아에서 얻을 수 있는 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제이고, 바람직하게는 상기 효소는 대장균(E. Coli)으로부터 얻을 수 있는 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제 임을 특징으로 하는 식물.
  30. 28항 또는 29항에 있어 상기 효소 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제는 SEQ ID NO.3로 나타낸 아미노산 서열을 갖거나 또는 2 변종, 유사종, 또는 그 단편임을 특징으로 하는 식물.
  31. 28항 내지 30항중 어느 한항에 있어서, 상기 글루코스아민-6-포스페이트-디아미나아제는 SEQ ID NO.1에서 보이는 염기서열 또는 그 변종, 유사종 또는 그 조각 또는 그에 상보적인 염기서열이거나,
    SEQ ID NO.2에서 보이는 염기서열 또는 그 변종, 유사종, 또는 2 조각 또는 그에 상보적인 염기서열에 의해 암호화 됨을 특징으로 하는 식물.
  32. 28항내지 31항중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제 또는 그 효소를 암호화하는 유전자는 NCIMB 40852 또는 NCIMB 40853 또는 NCIMB 40854 로 부터 얻을 수 있음을 특징으로 하는 식물.
  33. 앞선 청구범위중 어느 한항에 의한 발명으로 부터 제조된 식품.
  34. 형질 전환되지 않은 세포로부터 유전적으로 형질전환된 세포를 고르기 위한 선택수단으로서 사용되는 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제.
  35. 형질전환되지 않은 세포로부터 유전적으로 형질전환된 세포를 선택하는 선택수단을 제공하는 글루코스아민-6-포스페이트 디아미나아제를 암호화하는 유전자.
  36. 형질전환되지 않은 세포로부터 유전적으로 형질전환된 세포를 선택하는 선택수단으로 제공되고, NCIMB 40852 또는 NCIMB 40853 또는 NCIMB 40854 로부터 얻어질 수 있는 유전자.
  37. 형질전환 되지 않은 내포로부터 유전적으로 형질전환된 세포를 선택하는 선택수단을 제공하는, NCIMB 40852 또는 NCIMB 40853 또는 NCIMB 40854 로 부터 얻어진 유전자.
  38. 원핵생물내에서 존재할 때 원핵생물에게 잠재적으로 악영향을 미치는 유전자나 유전자 산물에 최소하나의 인트론(intron)을 삽입하는, 원핵생물에 대한 유전자 또는 유전자 산물의 불활성화방법.
  39. 38항에 있어서, 최소하나의 인트론을 유전자의 보존부위로 삽입함을 특징으로 하는 방법.
  40. 원핵생물내에 존재할 때 원핵생물에게 잠재적으로 악영향을 주었을 유전자로서, 상기 유전자는 원핵생물내에서 유전자 또는 그 산물을 불활성화시키는 최소하나의 인트론을 포함하는 유전자를 포함하는 원핵생물.
  41. 40항에 있어서, 최소하나의 인트론이 유전자의 보존 부위로 삽입되었음을 특징으로 하는 원핵생물.
  42. NCIMB 40852 또는 NCIMB 40853 또는 NCIMB 40854
  43. SEQ ID NO.2 로 나타낸 염기서열 또는 변종, 유상종 또는 그 단편 또는 그에 상보적인 염기서열.
  44. 43항에 따른 염기서열을 발현하거나 이를 포함하여 구성되는 구조물
  45. 43항내지 44항에 따른 발명을 발현하거나 포함하여 구성되는 벡터
  46. 43항-45항중 어느 한항에 따른 발명을 발현하거나 포함하여 구성되는 플라스미드.
  47. 43항-46항중 어느 한항에 따른 발명을 발현하거나 포함하여 구성되는 형질전환 유기체(또는 기관 또는 조직 또는 그 세포).
  48. 47항에 있어서, 상기 형질전환 유기체는 식물임을 특징으로 하는 유기체.
  49. 본문에 기술된 바와같은 선택방법 또는 염기서열 또는 형질전환 유기체.
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