CN104313040A - 一种明日叶查尔酮合成酶基因的序列 - Google Patents

Abstract

一种明日叶类黄酮合成途径限速酶—查尔酮合成酶基因的序列，该基因的序列具有SEQ ID NO.1中从第1-1413位所示的核苷酸序列以及SEQ ID NO.2中从第1-1194位所示的核苷酸序列，其序列编码的多肽具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。查尔酮合成酶是植物体内类黄酮代谢途径中的第一个关键酶，本发明利用同源克隆方法结合RACE技术获得的明日叶查尔酮合成酶基因可用于调控明日叶及其他植物内黄酮类化合物的合成，具有较大的经济价值和应用前景，尤其在医疗、保健领域使得明日叶能够获得更广泛的应用。

Description

一种明日叶查尔酮合成酶基因的序列

技术领域

本发明涉及的是一种植物基因工程领域的基因序列，具体涉及一种明日叶类黄酮化合物合成关键基因的查尔酮合成酶基因的DNA、cDNA开放阅读框全长序列及编码蛋白的氨基酸序列。

背景技术

明日叶，伞形科当归属草本植物，原产自日本八丈岛，因岛民多食用明日叶，均较长寿，因此明日叶又名长寿菜。明日叶具有抗癌、防止细胞老化、提高机体免疫力、抗血栓、降血压等保健功能，被誉为“21世纪的健康食品”。研究发现，明日叶富含一种特有成分查尔酮，属黄酮类化合物，而此黄酮类化合物具有很高的药用价值(药食兼用植物明日叶的研究进展及应用刘畅,王正武等，食品与药品2013,15(3)205-209)(周先丽,梁成钦,徐庆,等.明日叶的化学成分[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(3):103-105)，孟扬等在关于查尔酮抑制小鼠癌细胞的研究中证明了查尔酮的药用功能(孟扬,钟进义,孙赫.明日叶查尔酮对小鼠肝癌细胞Caspase-3和Bax蛋白表达的影响[J].癌变.畸变.突变,2011,23(1):50-53)。因此明日叶的药用及保健功能与其富含查尔酮有着必然联系。黄酮类化合物是一类重要的植物次生代谢物质，指基本母核为苯基色原酮类化合物，现在则泛指两个具有酚羟基的苯环通过中央三碳原子相互连接的一系列化合物。黄酮类化合物合成途径中，主要是由多个结构基因和调节基因来完成的，通过苯丙氨酸代谢途径，从苯丙氨酸经过三步酶促反应生成香豆酰辅酶A，再在查尔酮合成酶的作用下，与丙二酸辅酶A缩合生成查尔酮，然后在查尔酮异构酶(CHI)、二氢黄酮醇还原酶(DFR)和异黄酮合酶(IFS)等催化下合成黄酮、异类黄酮、花青素类等化合物(蒋明,曹家树.查尔酮合成酶基因[J].细胞生物学杂志,2007,29(4):525-529)。因此，查尔酮合成酶(CHS)在苯丙氨酸代谢途径中扮演着极其重要的角色，是类黄酮合成途径中的关键酶和限速酶。因此明日叶查尔酮合成酶基因CHS可应用于明日叶类黄酮化合物合成的调控。目前，国内外关于查尔酮合成酶的报道较多，主要集中在十字花科的拟南芥、禾本科的稻、玉米、豆科的大豆、苜蓿、豌豆、葡萄科的葡萄、菊科植物等，但未曾见任何公开报道伞形科当归属明日叶查尔酮合成酶基因的克隆及DNA、cDNA开放阅读框全长序列和编码蛋白的氨基酸序列，同时对于UV-C照射处理对明日叶CHS基因表达的影响和查尔酮含量调控研究也未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种明日叶查尔酮合成酶基因DNA全序列、开放阅读框ORF序列以及该基因编码的氨基酸序列，并且在获得高查尔酮含量明日叶品种中得到应用，为调控明日叶黄酮类化合物合成及在转基因植物中的应用提供有效的技术手段。

本发明的技术方案是：

一种明日叶查尔酮合成酶基因的序列，其具有SEQ ID NO.1中从第1-1413位所示的核苷酸序列以及SEQ ID NO.2中从第1-1194位所示的核苷酸序列。

进一步地，所述的序列编码的多肽具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

本发明的另一技术方案是：

一种所述的明日叶查尔酮合成酶基因在获得高查尔酮含量明日叶品种中的应用。

本发明所述的明日叶查尔酮合成酶基因CHS全长的克隆，依次通过以下步骤实现：

1)根据菊科植物查尔酮合成酶基因保守序列设计兼并引物，以明日叶叶片cDNA为模板，扩增明日叶查尔酮合成酶基因的保守区域；

2)基于获得的明日叶查尔酮合成酶基因的保守区域设计基因特异引物，进行3’、5’race克隆，分别得到明日叶CHS基因的3’、5’端序列，通过拼接得到明日叶CHS基因的ORF序列，并命名为Ak-CHS；

3)根据明日叶CHS基因ORF设计基因全长引物，以明日叶cDNA为模板进行PCR扩增，验证获得的CHS基因ORF全长序列，并以DNA为模板，以上述设计全长特异引物进行PCR扩增获得基因DNA全长。

4)根据获得的ORF序列设计Ak-CHS荧光定量引物，以actin为内参基因设计其荧光定量引物，通过UV-C照射处理明日叶叶片不同时间，以不同时间提取的明日叶叶片RNA反转录的cDNA为模板进行q-PCR，并测定不同时间明日叶叶片查尔酮提取量。

本发明具有如下的有益效果：

由于查尔酮合成酶是植物体内类黄酮代谢途径中的第一个关键酶，因此本发明提供的查尔酮合成酶基因可用于调控明日叶及其他植物内黄酮类化合物的合成，具有较大的经济价值和应用前景，尤其使得明日叶在医疗、保健领域中获得更广泛的应用。

附图说明

图1为明日叶叶片RNA电泳结果图。

图2为CHS基因3'端PCR扩增产物电泳图；

图中，M—DL2000，1—CHS基因3'端PCR扩增产物。

图3为CHS基因5'端PCR扩增产物电泳图；

图中，M—DL2000，2—CHS基因5'端PCR扩增产物。

图4为CHS基因ORF、DNA全长验证电泳图；

图中，M—DL2000，3—CHS基因ORF全长的PCR扩增产物，4—CHS基因DNA全长的PCR片扩增产物。

图5为UV-C照射处理AK-CHS基因相对表达量分析图。

图6为UV-C照射处理查尔酮提取量变化图。

图7为查尔酮含量测定标准曲线图。

具体实施方式

本发明利用同源克隆方法结合RACE技术获得明日叶类黄酮合成途径限速酶—查尔酮合成酶的基因全长序列，该基因DNA全长1413bp，含两个外显子和一个内含子，开放阅读框(ORF)全长为1194bp，编码397个氨基酸。

下面结合具体的实施例进一步阐述本发明的具体实施方式。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，详见[美]J.莎姆布鲁克(2005)编著的《分子克隆实验指南》第三版中所述的条件，或按照试剂盒制造厂商所建议的条件。实验所用的高保真Taq酶(Premix Taq)、pMD18－T载体、PrimeScript^TM1st Strand cDNA SynthesisKit反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购自TaKaRa公司，SMARTer^TMRACE cDNA AmplificationKit试剂盒购自Clontech公司，RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司，大肠杆菌DH5α由实验室保存。

实施例1

明日叶查尔酮合成酶基因的克隆，步骤如下：

1.明日叶叶片RNA的提取

a)匀浆处理：

称取50-100mg鲜嫩明日叶叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450μl RL，涡旋剧烈震荡混匀。

b)将所有溶液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12000rpm离心2-5min，小心吸取收集管中的上清至RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。

c)缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

d)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

e)DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μl RDD溶液，轻柔混匀。

f)向吸附柱CR3中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15min。

g)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

h)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

i)重复步骤h)。

j)12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

k)将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μl RNase-Free ddH₂O，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到RNA溶液，－70℃保存。

l)用1％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，明日叶叶片总RNA电泳结果见图1，由图1可以看到28S和18S清晰的两条带，且28S条带的亮度约为18S的2倍；说明R NA提取完整，无降解，满足后续试验需要，分光光度计下检测RNA浓度。

2.cDNA第一条链的合成

根据PrimeScript^TM1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明，将－70℃保存的RNA反转录合成cDNA第一条链，反转录后的cDNA保存于-20℃冰箱中备用。

3.CHS基因cDNA开放阅读框全长克隆及DNA全长的获得

a)根据菊科植物查尔酮合成酶基因保守序列设计兼并引物CHS-F、CHS-R(见下列表1)，以反转录的明日叶cDNA为模板，扩增明日叶查尔酮合成酶基因的保守区域；PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，32个循环；72℃10min；4℃保存。将回收的PCR产物连接至pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH-5α，在选择培养基上培养(氨苄青霉素)后，挑选单克隆摇菌后进行PCR检测，检测获得的阳性结果送至上海华大基因进行测序，测序获得长度为959bp的保守区域片段。

表1 本发明所用引物

b)根据获得的CHS基因保守区域片段核苷酸序列设计3’RACE扩增特异引物及巢式检验引物(见表1)，分别与3’通用引物UPM和NUP进行3’cDNA末端扩增。设计5’RACE扩增特异引物及巢式检验引物(见表1)，分别与通用引物UPM和NUP进行5’cDNA末端扩增。具体操作参照SMARTer^TMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒说明书完成。将3’RACE扩增产物(见图2)、5’RACE的扩增产物(见图3)产物纯化连接至pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH-5α，在选择培养基上培养(氨苄青霉素)后，挑选单克隆摇菌后进行PCR检测，检测获得的阳性结果送至上海华大基因进行测序。序列拼接获得CHS基因的ORF序列(SEQ ID NO.2)。设计基因全长特异引物CHS-TL-F、CHS-TL-R(见表1)，分别以反转录获得的cDNA、明日叶DNA作为PCR模板，扩增获得明日叶CHS基因全长cDNA开放阅读框及全长DNA(见图4)，PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，32个循环；72℃10min。将PCR产物回收，连接PMD-18载体，转化后通过PCR检测，将阳性检测结果送测序，将CHS基因cDNA序列测序结果与拼接获得的ORF序列比对，结果完全一致。并获得CHS基因DNA全长序列(SEQ ID NO.1)。克隆获得的明日叶CHS基因DNA全长为1413bp，cDNA全长为1194bp，编码397个氨基酸，基因分子质量为43516.1，等电点pI为6.33。通过NCBI比对明日叶CHS基因编码氨基酸序列发现，明日叶CHS基因与西芹、野胡萝卜等查尔酮合成酶基因的同源性较高，最高可达90％以上。应用软件SMART(SMART：http://smart.embl-heidelberg.de/)分析明日叶CHS基因编码蛋白的结构域，该CHS氨基酸第6至第232位为Chal_sti_synt_N(Ⅲ型聚酮合成酶)区域，第243至第392位为COG3424(BcsA，Predicted naringenin-chalconesynthase，查耳酮合成酶)区域。这两个区域均为查尔酮合成酶家族成员共有的典型结构域。

实施例2

UV-C照射处理下Ak-CHS基因的表达与查尔酮提取量测定，步骤如下：

1、根据所得Ak-CHS的ORF序列设计特异荧光定量引物分别为CHS-RT-F和CHS-RT-R(见表1)，以Actin为内参基因，根据伞形科植物的Actin保守序列设计内参基因荧光定量特异引物为CHS-actin-F和CHS-actin-R(见表1)。反应体系及步骤参照荧光定量试剂盒说明书。反应在Funglyn Biotech实时荧光定量PCR仪FTC-3000上进行，使用方法参照《Funglyn Biotech实时荧光定量PCR仪FTC-3000说明书》，反应条件为：94℃预变性30s；94℃变性5s，58℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环；72℃延伸5min。各试验均设置3次重复，求平均值。组织相对表达量利用2^-ΔΔCt法(Livak&Schmittgen，2001)和Excel软件分析数据，并使用SAS 8.1软件进行差异显著性分析。

将生长健壮，长势相似的盆栽明日叶植株在2.0kJ·m^-2·s^-1辐射剂量的UV-C(253.7nm)紫外灯下进行短期照射处理，在叶片距灯管30cm处分别处理0、1、1/2、3、5、7h，各处理设置10株重复，各个处理选取新展开叶片约1g的混合样，重复3次。液氮研磨后分别称取0.1g叶片粉末提取总RNA反转录为cDNA，作为q-PCR反应3次重复的模板，以UV-C照射0小时的材料为对照，实时荧光定量方法、引物及具体实验步骤参照上述方法，同时也提取明日叶根、叶柄、幼叶、花、果实RNA，发转录为cDNA进行q-PCR。

2、查尔酮提取量测定

准确称取5mg查尔酮标准品到50ml容量瓶中无水乙醇定容，对标准品溶液在200-400nm下进行全波段扫描，得到的吸收峰在290nm。分别取0.5ml，1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，3.0ml标准品溶液至10ml容量瓶中，无水乙醇定容得到查尔酮标准溶液。将各标准溶液在290nm下测量吸收度，重复三次，计算平均值。以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，建立质量浓度(x)和吸光度(y)之间的线性关系，绘制标准曲线，得出回归方程：y＝24.04x+0.003，R2＝0.998(1)，如图7。

再另称取上述各处理明日叶液氮研磨后粉末0.5g，重复三次，用以测定查尔酮含量。，重复三次，置于50mlEP管中，按20:1的物料比加入70％乙醇提取溶液，密封加盖，320W超声仪对明日叶中查尔酮进行辅助提取4min。提取液离心，取上清液，用2mL～3mL溶剂洗涤滤渣，合并提取液。将收集的提取液用石油醚反复萃取，去除叶绿素，将萃取后的提取液定容到10ml，取0.1ml定容后的提取液用70％乙醇定容到10ml容量瓶中得到待测液，取1ml待测液用紫外-可见光分光光度计在290nm波长下测定吸光度，并按下式公式计算查尔酮提取量：

$Q(\mathrm{mg}\·g^{-1})=\frac{C\×10\×10}{0.1\×0.5}.$

式中，C为查尔酮质量浓度/(mg/mL)，通过各待测液吸光度代入回归方程(1)计算而得。

根据各处理下CHS基因的表达量绘制CHS基因的表达量分析图(见图5)和查尔酮提取量变化图(见图6)。分析图5、图6可知，CHS基因的表达量与查尔酮提取量之间变化趋势呈现一定的相似性，说明该CHS基因与查尔酮合成相关，作为查尔酮合成酶家族的成员之一，催化查尔酮的合成，此外，荧光定量结果表明明日叶CHS基因在根、叶柄、幼叶、花、果实都有表达，且在果实和叶片中表达量最高，说明叶片中富含较多查尔酮，且该基因与植物育性有关，Meer等在构建CHS(Chalone Synthase)的反义基因构建成花粉特异性表达载体导入矮牵牛的研究中也证明CHS与植物育性有关(Meer TM,Spelt CE,Mol J NM,et al.Promoter analysis of theChalconeSynthase(ChsA)geneof petuniahybrid:A67bppromoterregiondirectsflower:specificexpression.Plant Biol,1990,15:95～109)。

Claims (3)

1.一种明日叶查尔酮合成酶基因的序列，其特征在于，具有SEQ ID NO.1中从第1-1413位所示的核苷酸序列以及SEQ ID NO.2中从第1-1194位所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的明日叶查尔酮合成酶基因的序列，其特征在于，所述的序列编码的多肽具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

3.一种权利要求2所述的明日叶查尔酮合成酶基因在获得高查尔酮含量明日叶品种中的应用。